Analisis Keragaman Genetik Tanaman Aren (Arenga pinnata Merr) di Tapanuli Selatan dengan Menggunakan Marka RAPD (Random Amlpified Polymorphic DNA)

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TANAMAN AREN (Arenga pinnata

Merr) DI TAPANULI SELATAN DENGAN MENGGUNAKAN MARKA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

TESIS

Oleh

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP 107001042

PROGRAM MAGISTER AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TANAMAN AREN (Arenga pinnata

Merr) DI TAPANULI SELATAN DENGAN MENGGUNAKAN MARKA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister dalam Program Magister Agroekoteknologi pada Fakultas Pertanian

Universitas Sumatera Utara Medan

Oleh

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP 107001042

PROGRAM MAGISTER AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

Judul : Analisis Keragaman Genetik Tanaman Aren

(Arenga pinnata Merr) di Tapanuli Selatan dengan

Menggunakan Marka RAPD (Random Amlpified

Polymorphic DNA)

Nama Mahasiswa : Mahyuni Khairiyah Harahap

NIM : 107001042

Jurusan : Agroekoteknologis

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

(DR. Ir. Lollie Agustina P. Putri, MSi)

Ketua Anggota

(Mohammad Basyuni, S Hut. MSi. PhD)

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan

(Prop. DR.Ir. Abdul Rauf, MS)

NIP : 195909171987011001 NIP : 195601221986011001 (Prof. DR. Ir. Darma Bakti, MS)

Telah diuji pada hari : Senin

Tanggal : 11 Pebruari 2013

Panitia Penguji Tesis :

Ketua : DR. Ir. Lollie Agustina P. Putri, MSi Anggota : Mohammad Basyuni, S Hut. MSi. PhD

Prof. DR. Ir. Rosmayati, MS Prof. Dwi Suryanto

ABSTRACT

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP : RAPD analysis on genetic diversity of sugar palm ( Arenga pinnata Merr) in South Tapanuli population. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and MOHAMMAD BASYUNI.

The objective of this research was to analysis genetic diversity of natural sugar palm in South Tapanuli using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

A total of 24 acessions palm sugar the populations originated from various regions in South Tapanuli, consists of West Angkola, South Angkola, Batangtoru and Sipirok. Results shoves the mean polymorphic of 31.57 %, mean of Polymorphic Information Content (PIC) was 85 %. Furthermore genetic dissimilarity coefficient and dendogram construction using DARwin 5.05 indicated that 24 acessions sugar palm populations was clustered into five groups, Suggested West Angkola acessions spreaded into group II-IV; Sipirok acessions spreaded into group II-V; South Angkola acessions spreaded into group I, III and V; and Batangtoru acessions spreaded into Group II,III and V. Study suggested that the four sites studied had a high genetic diversity.

Keywords: Arenga pinnata Merr), genetic diversity, random amplified polymorphic DNA

ABSTRAK

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP : Analisis Keragaman Genetik Tanaman Aren (Arenga pinnata Merr) Di Tapanuli Selatan dengan Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI sebagai ketua komisi pembimbing dan MOHAMMAD BASYUNI sebagai anggota komisi pembimbing

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik tanaman aren populasi alam di daerah Tapanuli Selatan berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

Sebanyak 24 aksesi aren di daerah Tapanuli Selatan, meliputi Angkola Barat, Angkola Selatan, Batangtoru dan Sipirok dianalisis keragaman genetiknya dengan menggunakan marka RAPD. Perhitungan koefisien keragaman genetik dan pembentukan dendogram dilakukan dengan bantuan program DARwin5.05. Rata – rata % polimorpik sebesar 31.57 % sedangkan untuk Polymorphic Information Content (PIC) yaitu 85 %. Hasil dendogram menunjukkan bahwa 24 aksesi aren terbagi dalam 5 kelompok. Aksesi asal Parsalakan menyebar pada kelompok 2-4. Aksesi asal Sipirok menyebar pada kelompok 2-5. Aksesi asal Napa menyebar pada kelompok 1, 3 dan 5. Aksesi asal Batangtoru menyebar pada kelompok 2, 3 dan 5. Studi ini menyatakan bahwa ke empat lokasi yang diteliti memiliki keragaman genetik tinggi.

Kata Kunci : Arenga pinnata Merr, keragaman genetik, random amplified polymorphic DNA

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Mahyuni Khairiyah Harahap dilahirkan di Pargarutan pada tanggal I Juni 1985 dari Ayanda Usman Harahap dan Zaidah Miryati Hasibuan. Penulis merupakan putri ketiga dari enam bersaudara.

Adapun pendidikan yang pernah ditempuh penulis adalah SD Negeri 142436 Padangsidimpuan lulus tahun 1998, MTs Negeri Model Padangsidimpuan lulus tahun 2001, SMU Negeri 2 Padangsidimpuan lulus tahun 2004, S-1 Pemuliaan Tanaman, Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara lulus tahun 2008. Terdaftar sebagai mahasiswa magister Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara pada tahun 2010.

Penulis pernah menjadi asisten di Laboratorium Biokimia pada periode 2006/2008 dan di Laboratorium Pemuliaan Tanaman Khusus pada periode 2007/2008, FP USU. Penulis melaksanakan Praktek Kerja Lapangan (PKL) di perkebunan kelapa sawit PTP Nusantara IV (Persero) Kebun Laras kabupaten Simalungun, Sumatera Utara pada bulan Juni-Juli 2007.

Pada saat ini penulis merupakan staf pengajar di Universitas Graha Nusantara Padangsidimpuan.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis yang berjudul “Analisis Keragaman Genetik Aren (Arenga pinnata Merr) di Tapanuli Selatan dengan Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA)”.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada ibu DR. Ir. Lollie Agustina, P.Putri, MS selaku dosen ketua komisi pembimbing dan bapak Mohammad Basyuni, S.Hut. MSi. PHd selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan membantu dalam menyusun dan menyelesaikan tesis ini, dan juga kepada para dosen dan staf pengajar mata kuliah yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan kepada penulis selama perkuliahan.

Ucapan terimakasih yang tulus dan rasa hormat penulis sampaikan kepada Ayahanda Usman Harahap dan Zaidah Miryati Hasibuan tercinta yang telah membesarkan penulis dengan segenap rasa cinta, kasih sayang dan pengertian serta pengorbanan yang tak terhingga, dan juga kepada bang Iyan, kak Ely serta Adinda Amy (Almh), Rasyid dan Rahmat yang telah mendukung penulis selama penulisan tesis ini.

Terima kasih juga kepada teman-teman di program magister Agroteknologi FP USU yang telah banyak membantu dalam perkuliahan. Tidak lupa pula penulis ucapkan terimakasih kepada semua pihak atas bantuan, saran, dukungan baik dalam pelaksaan penelitian maupun dalam penulisan tesis ini.

demi kesempurnaan tesis ini dimasa mendatang. Semoga tesis ini bermanfaat bagi kita semua, Amin.

Medan, Januari 2013

DAFTAR ISI

ABSTRACT ... i

ABSTRAK ... ii

DAFTAR RIWAYAT HIDUP ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... xi

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 3

Manfaat Penelitian ... 3

Hipotesis Penelitian ... 3

Kerangka Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA... 5

Botani Tanaman ... 5

Pemuliaan Tanaman Aren ... 7

Keragaman Genetik ... 11

Marka RAPD ... 15

METODE PENELITIAN ... 21

Tempat dan Waktu ... 21

Bahan dan Alat ... 21

PENELITIAN I : OPTIMASI DAN MODIFIKASI ... 22

Metode Penelitian ... 22

Pengambilan Sampel Daun ... 22

Tanpa Menggunakan Pasir Kuarsa dan Nitrogen Cair ... 22

Isolasi dan Pemurnian DNA ... 22

Menggunakan Pasir Kuarsa ... 23

Isolasi dan Pemurnian DNA ... 23

Menggunakan Nitrogen Cair... 25

Isolasi dan pemurnian DNA ... 25

Uji Kualitas DNA ... 26

Amplifikasi dan Genotiping... 27

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 30

Hasil ... 30

Tanpa menggunakanNitrogen Cair dan Pasir Kuarsa ... 30

Menggunakan Pasir Kuarsa ... 31

Menggunakan Nitrogen Cair ... .... 31

Pembahasan ... 32

Kesimpulan ... 35

PENELITIAN II. PEMAKAIAN MARKA RAPD UNTUK ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ... 37

Metode Penelitian... 37

Pengambilan Sampel Daun ... 37

Isolasi dan Pemurnian DNA ... 37

Uji Kualitas DNA ... 38

Uji Kuantitas DNA... 40

Amplifikasi dan Genotiping ... 40

Elektroforesis ... 41

Analisis Data... 42

Penentuan Skoring Marka RAPD ... 42

Penentuan Ukuran Pasangan Basa ... 43

HASIL DAN PEMBAHASAN... 44

Hasil... 44

Uji Kualitas DNA ... 48

Uji Kuantitas DNA... 51

Hasil PCR dengan Marka RAPD ... 52

Pembahasan... 60

KESIMPULAN DAN SARAN... 65

Kesimpulan ... 65

Saran ... 65 DAFTAR PUSTAKA

DAFTAR TABEL

1. Amplifikasi PCR-RAPD ... 28 2. Kuantitasdan Konsentrasi DNA Tanaman Aren dengan Uji UV-

Spectofotometer... 52 3. Polymorphic Information Content (PIC) pada 10 Primer RAPD ... 58

DAFTAR GAMBAR

1. Profil Genom DNA Tanpa Menggunakan N2 Cair dan Pasir Kuarsa yang Diuji melalui Gel Agarose ... 30 2. Profil Genom DNA Tanpa Menggunakan N2 Cair dan Pasir Kuarsa

yang Diuji melalui Gel Agarose... 30 3. Profil Genom DNA Menggunakan Pasir Kuarsa yang Diuji melalui

Gel Agarose ... 31 4. Profil Genom DNA Menggunakan N2 Cair yang Diuji melalui Gel

Agarose ... 31 5. Profil Pita DNA dari Ketiga Metode Modifikasi Optimasi dengan

Menggunakan Primer OPD-12 ... 32 6. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola Barat

dengan Hasil Nira 10-25 liter/hari/pohon . ... 44 7. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Sipirok dengan Hasil

Nira 20-40 liter/hari/pohon. ... 44 8. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola Selatan

dengan Hasil Nira 15-25 liter/hari/pohon ... 44 9. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Batangtoru dengan

Hasil Nira 10-15 liter/hari/pohon ... 45 10.Lilit Batang (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola ... 45 11.Lilit Batang (cm) Sampel Tanaman Aren di Daerah Sipirok. ... 45 12.Lilit Batang (cm) Sampel Tanaman Aren di Daerah Angkola Sealatan. 45 13.Lilit Batang (cm) Sampel Tanaman Aren di Daerah Batangtoru. ... 46 14.Umur Tanaman (Tahun) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola

Barat .. ... 46 15.Umur Tanaman (Tahun) Sampel Tanaman Aren di daerah Sipirok. ... 46 16.Umur Tanaman (Tahun) Sampel Tanaman Aren di Daerah Angkola

Selatan. ... 46 17.Umur Tanaman (Tahun) Sampel Tanaman Aren di Daerah

18.Ketinggian Tempat (mdpl) Sampel Tanaman Aren di Daerah Angkola

Barat. ... 47

19.Ketinggian Tempat (mdpl) Sempel Tanaman Aren di daerah Sipirok. 47

20.Ketinggian Tempat (mdpl) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola Selatan. ... 47

21.Ketinggian Tempat (mdpl) Sampel Tanaman Aren di daerah Batangtoru. ... 48

22.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 48

23.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 49

24.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 49

25.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 50

26.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 50

27.Profil Kualitas DNA Genom Aren dengan Gel Agarose 0.8 % ... 51

28.Profil Hasil PCR dengan Primer OPD-20 (atas 2-16, bawah 2-8) dan OPH-06 (bawah 1-8) dan OPN-03 (10-16) ... 53

29.Profil Hasil PCR dengan Primer OPH-06 ... 53

30.Profil Hasil PCR dengan Primer OPD-16 ... 54

31.Profil Hasil PCR dengan Primer OPN-03 ... 54

32.Profil Hasil PCR dengan Primer OPD-03 ... 54

33.Profil Hasil PCR dengan Primer OPC-12 (atas 2-16, bawah 2-8) dan OPD-03 (bawah 9-15) ... 55

34.Profil Hasil PCR dengan Primer OPD-12 (atas 2-16), OPN-03 (bawah 2-8) dan OPD-16 (bawah 10-16) ... 55

35.Profil Hasil PCR dengan Primer OPD-07 (atas 2-16, bawah 2-8) dan OPD-12 (bawah 9-15) ... 56

36.Profil Hasil PCR dengan Primer OPH-09 ... 56

37.Profil Hasil PCR dengan Primer OPI-20 ... 57

38.Faktorial Analisis (Principal Coordinate Analysis) Aksis 1 (horizontal) dan Aksis 2 (vertikal) dengan 10 Marka RAPD ... 58

39.Profil Radial Neighbour-Joining dari 24 Aksesi Aren di Daerah Tapanuli Selatan yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching . ... 59 40.Pohon Filogenetik dari 24 Aksesi Aren di Daerah Tapanuli Selatan yang

DAFTAR LAMPIRAN

1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok ... 70 2. Nilai Distance ... 72 3. Peta Lokasi Penelitian... 73

ABSTRACT

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP : RAPD analysis on genetic diversity of sugar palm ( Arenga pinnata Merr) in South Tapanuli population. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and MOHAMMAD BASYUNI.

The objective of this research was to analysis genetic diversity of natural sugar palm in South Tapanuli using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

A total of 24 acessions palm sugar the populations originated from various regions in South Tapanuli, consists of West Angkola, South Angkola, Batangtoru and Sipirok. Results shoves the mean polymorphic of 31.57 %, mean of Polymorphic Information Content (PIC) was 85 %. Furthermore genetic dissimilarity coefficient and dendogram construction using DARwin 5.05 indicated that 24 acessions sugar palm populations was clustered into five groups, Suggested West Angkola acessions spreaded into group II-IV; Sipirok acessions spreaded into group II-V; South Angkola acessions spreaded into group I, III and V; and Batangtoru acessions spreaded into Group II,III and V. Study suggested that the four sites studied had a high genetic diversity.

Keywords: Arenga pinnata Merr), genetic diversity, random amplified polymorphic DNA

ABSTRAK

MAHYUNI KHAIRIYAH HARAHAP : Analisis Keragaman Genetik Tanaman Aren (Arenga pinnata Merr) Di Tapanuli Selatan dengan Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI sebagai ketua komisi pembimbing dan MOHAMMAD BASYUNI sebagai anggota komisi pembimbing

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik tanaman aren populasi alam di daerah Tapanuli Selatan berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

Sebanyak 24 aksesi aren di daerah Tapanuli Selatan, meliputi Angkola Barat, Angkola Selatan, Batangtoru dan Sipirok dianalisis keragaman genetiknya dengan menggunakan marka RAPD. Perhitungan koefisien keragaman genetik dan pembentukan dendogram dilakukan dengan bantuan program DARwin5.05. Rata – rata % polimorpik sebesar 31.57 % sedangkan untuk Polymorphic Information Content (PIC) yaitu 85 %. Hasil dendogram menunjukkan bahwa 24 aksesi aren terbagi dalam 5 kelompok. Aksesi asal Parsalakan menyebar pada kelompok 2-4. Aksesi asal Sipirok menyebar pada kelompok 2-5. Aksesi asal Napa menyebar pada kelompok 1, 3 dan 5. Aksesi asal Batangtoru menyebar pada kelompok 2, 3 dan 5. Studi ini menyatakan bahwa ke empat lokasi yang diteliti memiliki keragaman genetik tinggi.

Kata Kunci : Arenga pinnata Merr, keragaman genetik, random amplified polymorphic DNA

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tanaman aren (Arenga pinnata Merr) adalah tanaman kehutanan dan termasuk hasil hutan non kayu yang sangat potensial untuk mengatasi kekurangan pangan. Pengelolaan hasil hutan non kayu mempunyai peranan yang cukup besar dalam perekonomian bangsa yaitu 30 juta penduduk “secara langsung mengandalkan hidupnya pada sektor kehutanan yaitu mengambil dan mengelola hasil hutan non kayu” sebagai mata pencaharian dan wadah penyerap tenaga kerja. Pengusahaan tanaman aren sebagian besar diusahakan oleh petani dan belum diusahakan dalam skala besar, karena pengelolaan tanaman belum menerapkan teknik budidaya yang baik dan menyebabkan produktivitasnya rendah (Baharuddin dkk., 2007).

Hampir semua bagian pohon tanaman aren dapat dimanfaatkan, mulai dari akar sampai tandan. Akar yang segar menghasilkan arak sebagai obat sembelit, obat disentri dan obat penyakit paru-paru. Batangnya menghasilkan sagu sebagai sumber karbohidrat bahan keperluan rumah tangga dalam pembuatan roti, soun, mie dan campuran lem. Disamping itu batang yang keras biasa digunakan bahan bangunan, jembatan, tongkat dan ijuk bahan tali/atap. Daun muda dijadikan pembungkus rokok/kelobot, daun tua sebagai atap rumah. Pelepah daun untuk tutup botol. Tulang daun dijadikan sapu dan keranjang bunga. Tandan bunga jantan sebagai penghasil nira bahan gula. Buahnya diolah menjadi bahan makanan seperti kolang kaling (Tambunan dkk., 2009).

Untuk menentukan keragaman genetik tanaman dapat didasarkan pada sifat agronomi, morfologi, biokimia dan marka molekuler. Namun penanda

molekuler dapat menunjukkan perbedaan genetik pada tingkat yang lebih rinci dan tanpa gangguan faktor lingkungan serta melibatkan teknik yang memberikan hasil keragaman genetik yang cepat. Berbagai jenis penanda molekuler berbeda potensinya dalam mendeteksi perbedaan antara individu, biayanya, fasilitas yang dibutuhkan, konsistensi dan replikasi hasil (Mohammadi dan Prasanna, 2003; Sudré dkk., 2007)

Peluang mengembangkan tanaman aren didukung oleh ketersediaan teknologi yang ada, selain itu tanaman aren mudah beradaptasi pada berbagai tipe tanah di seluruh Indonesia termasuk lahan kritis, alang-alang dan untuk program reboisasi dan konservasi hutan. Sedangkan tantangan yang perlu ditanggulangi untuk mengembangkan tanaman ini meliputi: input teknologi masih minim, perbaikan manajemen produksi, perbaikan pengolahan, pemasaran masih tradisional, diseminasi masih terbatas pada sebagian kecil petani, dan kesulitan bibit unggul.

.

Salah satu cara memperbaiki kesulitan mendapatkan bibit unggul, oleh karena itu perlu diteliti karakteristik tanaman aren di beberapa daerah untuk memperoleh tetua yang sesuai dalam program pemuliaan tanaman sehingga diperoleh bibit unggul aren. Salah satu marka molekuler yang tekniknya sederhana dan mudah serta berbiaya murah untuk analisis sidik jari DNA tanaman aren didasarkan pada jumlah, frekuensi dan distribusi alel-alel DNA berdasarkan penanda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Sejauh ini sedikit studi difokuskan pada keragaman genetik tanaman aren, oleh karena itu diperlukan adanya upaya analisis molekuler pada tanaman aren dengan menggunakan penanda RAPD.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman genetik tanaman aren populasi alam di daerah Tapanuli Selatan berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

Hipotesis Penelitian

Ada keragaman genetik populasi alam tanaman aren pada daerah Tapanuli Selatan.

Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh dengan mengidentifikasi keragaman genetik aren tersebut antara lain :

1. Diperoleh metode yang sederhana, murah dan cepat untuk isolasi DNA 2. Tersedianya informasi mengenai keragaman genetik aren dari beberapa

populasi di Tapanuli Selatan.

3. Inventarisasi plasma nutfah aren. Informasi ini bermanfaat dalam usaha program pemuliaan melalui perakitan kultivar unggul yang dilakukan secara konvensional maupun modern dengan pendekatan bioteknologi.

Kerangka Penelitian

Populasi aren (Arenga pinnata Merr) di Tapanuli Selatan (Angkola Selatan, Angkola Barat, Batangtoru, Sipirok)

Isolasi DNA

Analisis Molekuler dengan Marka RAPD

Keragaman Genetik berdasarkan Karakteristik Marka Molekuler

Diketahui Keragaman Genetik dan Hubungan Kekerabatan

TINJAUAN PUSTAKA

Botani Tanaman

Tanaman aren dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom

Divisi

Kelas

Ordo

Famili

Genus

Spesies : Arenga pinnata Merr.

Aren memiliki akar yang dapat tumbuh dalam sampai 10 m dengan akar serabut berwarna putih kekuningan dan mengandung saponin, flavonoida dan polifenol. Perakaran pohon aren menyebar dan cukup dalam, sehingga tanaman ini dapat diandalkan sebagai vegetasi pencegah erosi, terutama untuk daerah yang tanahnya mempunyai kemiringan lebih dari 20 %.

Batang aren bisa mencapai tinggi 20 m dengan diameter 30-65 cm. Tanaman ini adalah palem besar, tidak bercabang dengan batang tebal, berserat dan berbulu hitam (Effendi, 2009). Batang mengandung teras pati yang lunak dengan banyak serabut kasar dan berkayu. Struktur umum yang dimiliki pada batang, pada bagian luar terdapat epidermis yang ditutupi oleh bahan lemak alam yang sangat tahan air (kutin). Lapisan kutin disebut dengan kutikula. Pada A. pinnata, kutikulanya cukup tebal, bersifat kedap air dan gas (impermeabel). Bagian sebelah dalam epidermis terdapat korteks yang terdiri dari jaringan parenkim, kolenkim, dan sklerenkim. Di sebelah dalam korteks terdapat silinder

pusat yang berisi jaringan pembuluh yang biasa disebut ikatan pembuluh (berkas pengangkut).

Daunnya majemuk menyirip, seperti daun kelapa, panjang hingga 5 m dengan tangkai daun hingga 1,5 m. Anak daun seperti pita bergelombang hingga 7 x 145 cm. Daunnya hijau gelap di atas dan hijau keputihan dibawah karena lapisan lilin disisi bawahnya (Orwa dkk., 2009). Anak daun bentuk lanset, menyirip, pangkal membulat, ujung runcing, tepi rata dan tangkai pendek.

Bunga aren berumah satu, bunga jantan berpasangan, daun kelopak tiga, bulat telur, benang sari banyak, kepala sari bentuk jarum. Bunga betina bulat, bakal buah tiga, putik tiga, berwarna putih, mahkota terbagi tiga, kuning keputih-putihan. Bunga-bunga aren diatur dalam kelompok besar yang muncul diketiak daun, bunga jantan dan betina panjangnya hingga 2 m. Aren dapat berbunga mulai umur 6 – 12 tahun. Pembungaannya mula-mula muncul tunas bunga dari pucuk diikuti tunas berikutnya kearah pangkal batang dan umumnya berlangsung 2-5 tahun sampai pohon tersebut mati. Tipe penyerbukannya adalah menyerbuk sendiri. Musim berbunga berkisar Juni–Agustus (Tambunan dkk., 2009). Batang dari tandan bunga dapat disadap dan nira dikonsumsi sebagai tuak atau menjadi gula. Tandan bunga terakhir hampir dapat menyentuh tanah.

Buah aren termasuk kedalam buah buni, berbentuk peluru dengan ujung pesok ke dalam, ukuran garis tengah buah sekitar 4 cm, beruang 3, berbiji 3. Buah tersusun dalam untaian seperti rantai. Setiap tandan buah mempunyai 10 tangkai atau lebih dan setiap tangkai memiliki lebih kurang 50 butir buah. Waktu muda buah berwarna hijau setelah tua menjadi warna kuning kecoklatan. Daging buah warna kuning keputih putihan, lunak dan dapat menyebabkan gatal pada kulit

karena mengandung kristal kalsium oksalat yang dapat menghambat proses perkecambahan (Tambunan dkk., 2009).

Biji aren putih, kenyal, berukuran 2,5 – 3,5 cm dan lebar 2 – 2,5 cm. Kulit biji pada waktu muda warna kuning kecoklatan dan setelah tua menjadi warna hitam dan keras. Terdapat jumlah benih kering rata-rata 190 – 210 butir per kg (Orwa

Menurut Effendi (2009) tanaman aren dapat tumbuh dengan baik di dekat pantai sampai pada dataran tinggi 1200 m dpl. Tanaman aren sangat cocok pada kondisi landai dengan kondisi agroklimat beragam seperti daerah pegunungan dimana curah hujan tinggi dengan tanah bertekstur liat berpasir. Dalam pertumbuhan tanaman ini membutuhkan kisaran suhu 20-25°C, terutama untuk mendorong perkembangan generatif agar dapat berbunga dan berbuah. Sedang untuk pembentukan mahkota tanaman, kelembaban tanah dan ketersediaan air sangat diperlukan dimana curah hujan yang dibutuhkan antara 1200-3500 mm/tahun agar kelembaban tanah dapat dipertahankan.

dkk., 2009).

Pemuliaan Tanaman Aren

Sekalipun aren lebih dikenal sebagai hasil hutan non kayu, aren telah mulai dibudidayakan secara baik oleh suku Batak Toba sejak awal tahun 1900. Tanaman ini tersebar di hampir seluruh wilayah Indonesia pada berbagai kondisi agroekosistem. Penyebaran dan pertumbuhan aren umumnya berlangsung secara alamiah. Di beberapa tempat, terutama yang memiliki kebiasaan memproduksi gula atau mengkonsumsi minuman beralkohol, aren sering ditanam secara sengaja, meskipun sebagai tanaman pinggiran atau tanaman sela di antara tanaman pepohonan yang sudah ada. Para petani mengakui bahwa gula yang dihasilkan

dari nira aren sangat menolong ekonomi mereka, namun perhatian pemerintah terhadap upaya pengembangan tanaman ini sangat terbatas dan tidak konsisten. Hal yang sama dijumpai pada lembaga-lembaga penelitian, penelitian tanaman aren umumnya dilakukan secara insidentil (Allorerung, 2007).

Permintaan aren tidak hanya untuk memenuhi industri gula, namun industri bioetanol juga. Tanaman aren sangat potensial dan produktif sebagai sumber bioetanol dibandingkan tanaman lain. Selain itu produksi yang dihasilkan jauh lebih sedikit daripada bahan yang digunakan. Jagung memproduksi bioetanol sebanyak 6.000 liter per hektar per tahun, singkong 2.000 liter, biji sorgum 4.000 liter, jerami padi dan ubijalar 7.800 liter sedangkan aren memproduksi 40.000 liter ethanol per hektar per tahun. Tanaman ini juga tidak membutuhkan pemupukan dan tidak terserang hama ataupun penyakit yang mengharuskan penggunaan pestisida sehingga aman bagi lingkungan. Tidak seperti singkong dan tebu yang dipanen 3-4 bulan sekali, aren dapat dipanen sepanjang tahun (Arien, 2009).

Masalah utama pengembangan aren: input teknologi sangat minim, manajemen produksi, pengolahan dan pemasaran masih cara tradisional; diseminasi teknologi belum mencapai sebagian besar petani; dampak negatif produksi aren sebagai minuman keras. Kesulitan dalam penyediaan benih/bibit unggul. Sampai saat ini belum ada varietas yang dilepas, benih yang ada diambil dari Blok Penghasil Tinggi (BPT) yang diseleksi berdasarkan seleksi individu terbaik populasi tersebut (Effendi, 2010).

Aren diperbanyak secara generatif yaitu melalui biji dari buah yang sudah matang fisiologis. Tampaknya benih aren memiliki masa dormansi sehingga benih yang baru dipanen tidak bisa segera berkecambah. Struktur kernel biji yang keras menyebabkan biji aren relatif lambat berkecambah (Allorerung, 2007).

Sampai saat ini sumber benih tanaman aren dikembangkan secara generatif yaitu melalui biji dari pohon induk yang memiliki kriteria sebagai berikut :

Sampai saat ini tanaman aren yang tumbuh dilapangan dikategorikan dalam 2 aksesi yaitu Aren Genjah (pohon agak kecil dan pendek) dengan produksi nira antara 10 -15 liter/tandan/hari, dan Aren Dalam (pohon besar dan tinggi) dengan produksi nira 20 – 30 liter/tandan/hari. Untuk pohon induk dianjurkan adalah aksesi Dalam.

1. Batang pohon harus besar dengan pelepah daun merunduk dan rimbun.

Oleh karena itu hal yang harus diperhatikan dalam memilih dan menentukan pohon induk sebagai sumber benih yaitu pohon yang sudah berbunga baik sistem pembungaan betina maupun sistem pembungaan jantan dan sedang disadap niranya. Hal ini penting karena tanaman aren dikenal sebagai tanaman hapaksantik yaitu fase reproduktifnya membatasi pertumbuhan batang dengan daya tahan hidup mencapai 3 tahun.

Untuk mengetahui bahwa pohon induk yang telah dipilih sebagai sumber benih dari mayang betina dengan memiliki produktifitas nira yang tinggi antara 20 – 30 liter/mayang/hari, maka perlu dilakukan penyadapan nira dari mayang jantan pertama atau kedua. Sebab tidak semua mayang jantan yang keluar (9 – 11 mayang) dan tidak semua pohon mengeluarkan nira. Hal ini sangat dipengaruhi oleh proses fisiologi tanaman.

2. Pohon terpilih harus memiliki produktifitas yang tinggi.

Apabila yang disadap mayang jantan pertama atau kedua produksi niranya banyak maka pohon tersebut adalah produktif untuk pohon induk sebagai sumber benih. Pohon yang terpilih sebagi sumber benih dengan produksi nira yang banyak maka tidak dianjurkan untuk proses penyadapan untuk tandan-tandan selanjutnya secara

berturut-turut. Bila pohon induk dilakukan penyadapan terus menerus (dipaksa) maka akan menghasilkan buah yang kelihatannya utuh tetapi bijinya berkerut bahkan kempes sehingga bila ditanam menghasilkan pohon aren yang tidak baik (Maliangkay, 2009).

Keberhasilan program pemuliaan pohon memerlukan keragaman genetik yang cukup tinggi dari populasi aren yang ada sehingga seleksi yang dilakukan akan lebih optimal. Untuk keperluan ini maka konservasi ex situ aren diperlukan sebagai populasi dasar bagi kegiatan pemuliaan aren di masa mendatang. Hasil akhir yang didapatkan dari penelitian ini sebagai berikut:

1. Eksplorasi materi genetik berupa buah dan daun telah dilakukan di 4 populasi sebaran alam aren yaitu Temanggung (Jawa Tengah), Kalimantan Selatan, Sulawesi Utara dan Bengkulu (masing-masing sebanyak 22, 20, 21 dan 20 sampel).

2. Besarnya keragaman genetik dalam populasi aren masih tinggi yang ditunjukkan oleh nilai rata-rata heterozigositas harapan (He) sebesar 0.4381. Keragaman genetik total populasi rata-rata sebesar 0.4712 yang terdistribusi menjadi keragaman genetik dalam populasi sebesar 0.4381 atau 92,98% dan sisanya antar populasi sebesar 0.0331 atau 7,02 %.

3. Hubungan kekerabatan genetik antar keempat populasi aren dapat dikelompokkan menjadi 2 klaster, yaitu klaster pertama meliputi populasi Temanggung (P. Jawa) dan Kalimantan Selatan (P. Kalimantan); klaster kedua populasi Bengkulu (P. Sumatera), dan Sulawesi Utara (P. Sulawesi).

4. Pembibitan aren masih membutuhkan waktu yang cukup lama agar bibit siap tanam.

Untuk mengoptimalkan manfaat dari potensi aren ini serta untuk menjamin keberhasilan program dalam jangka panjang, perlu didukung dengan kegiatan penelitian. Aspek-aspek yang masih perlu diteliti meliputi potensi genetik, farming system, perbaikan mutu dan pengembangan aneka produk, pengaruhnya terhadap aspek lingkungan dan sosial ekonomi petani. Di samping itu, perlu upaya pengembangan sumber daya manusia petani dan kemampuan penelitian (research capacity building) (Allorerung, 2007).

Keragaman Genetik

Keragaman genetik memainkan peran yang sangat penting dalam adaptabilitas suatu spesies karena ketika lingkungan suatu spesies berubah, variasi gen yang kecil diperlukan agar spesies dapat bertahan hidup dan beradaptasi. Spesies yang memiliki derajat keragaman genetik yang tinggi pada populasinya

akan memiliki lebih banyak variasi alel yang dapat diseleksi (Elfrod dan Stansfield, 2007).

Dalam pemuliaan tanaman, keragaman genetik dalam populasi tanaman mempunyai arti yang sangat penting (Mangoendidjojo, 2003) untuk pengembangan sumber genetik yang diperlukan dalam pemuliaan tanaman (Karsinah dkk., 2002). Tingkat keragaman individu dalam populasi menggambarkan status keberadaan spesies tersebut di alam. Populasi dengan keragaman genetik yang tinggi mempunyai peluang hidup yang lebih baik karena mempunyai kemampuan yang lebih baik untuk beradaptasi dengan lingkungannya.

Variasi fenotipik secara positif terkait dengan keragaman genetik, tetapi juga tergantung pada faktor-faktor lingkungan serta pada interaksi antara genotipe

dan lingkungan (Moose dan Mumm, 2008). Jadi, menentukan keragaman genetik melalui variasi antara genotipe, kelompok genotipe, atau populasi adalah penting untuk program pemuliaan tanaman genetik.

Tenda, dkk (2010) telah meneliti keragaman genetik aren pada bulan Desember 2009 yaitu eksplorasi di desa Kandolo kecamatan Teluk Pandan dan desa Peridan kecamatan Sangkuliran, Kabupaten Kutai Timur, Propinsi Kalimantan Timur. Hasil eksplorasi diperoleh dua tipe aren yaitu aren genjah yang terdapat di desa Kandolo kecamatan Teluk Pandan dan aren Dalam yang terdapat di desa Paridan kecamatan Sangkuliran. Tipe aren genjah memiliki keragaman tinggi pada sifat tinggi batang, jumlah daun, panjang tangkai mayang jantan, panjang rangkaian mayang jantan, jumlah mayang jantan, jumlah mayang betina dan lama berproduksi per mayang. Sedangkan tipe aren Dalam memiliki keragaman tinggi pada sifat tinggi batang, panjang tangkai mayang jantan, jumlah mayang jantan, panjang tangkai mayang betina, jumlah mayang betina, produksi nira, dan lama berproduksi permayang.

Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik. Beberapa teknik penanda DNA tersebut adalah Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

Teknik marka molekuler telah banyak digunakan untuk identifikasi kultivar dari inbrida kurma (Phoenix dactylifera L.; Arecaceae) dan konservasi

keanekaragaman hayati. Isolasi kemurnian DNA adalah prasyarat untuk amplifikasi PCR dan penggunaan selanjutnya seperti sidik jari DNA dan sekuensing gen yang baru-baru ini telah dikembangkan. Untuk menghindari masalah yang berkaitan dengan pelestarian dan penggunaan nitrogen cair, digunakan pasir steril untuk menggiling daun kurma tersebut. Efek individu dan gabungan dari natrium klorida (NaCl), polivinilpirolidon (PVP) dan lithium klorida (LiCl) dengan metode cetyl trimethyl ammonium bromida (CTAB) untuk hasil DNA dari kemurnian yang cukup dan amplifikasi PCR dievaluasi dalam penelitian ini. Kehadiran LiCl dan PVP sendiri atau bersama-sama dalam buffer lisis tidak secara signifikan meningkatkan hasil dan kemurnian DNA dibandingkan dengan penambahan NaCl. Studi ini menyarankan bahwa grinding daun kurma dengan pasir steril dan inklusi NaCl (1,4 M) dalam buffer lisis tanpa menggunakan nitrogen cair yang mahal, PVT dan LiCl, memberikan hasil DNA dari kemurnian yang cukup, cocok untuk amplifikasi PCR (Ibrahim dkk., 2010).

Beberapa penelitian mengenai keragaman genetik yang dilakukan dengan marka RAPD antara lain: belimbing (Yulita, 2011), jagung, (Leah dkk., 2010), jarak pagar (Yunus, 2007 dan Suryatini, 2011), kelapa sawit (Hayati dkk., 2004 dan Zulhermana, 2009), buah kiwi (Palombi dan Damiano, 2001).

Dari penelitian yang dilakukan oleh Yunus (2007) menunjukkan bahwa keragaman tanaman jarak pagar di Jawa Tengah dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok dan 2 individu tunggal tidak berkelompok. Dua kelompok itu yaitu kelompok I terdiri atas Kudus I dan Grobogan sedangkan kelompok II terdiri atas Banyumas I, Pati, Cilacap, Banyumas II, Pemalang, Purwodadi dan Batang. Dua kelompok tersebut berada pada jarak kemiripan DICE I. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman jarak pagar kelompok I memiliki kemiripan genetik yang tinggi.

Demikian juga tanaman jarak pagar kelompok II. Ciri-ciri tanaman memiliki kemiripan yang tinggi yaitu memilik jarak kemiripan DICE mendekati 0.

Sebanyak 723 aksesi kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Dari 26 populasi yang mewakili sepuluh negara di Afrika dan salah satu keluarga dura Deli disaring untuk variasi alel pada lokus tujuh enzim dari enam sistem enzim menggunakan elektroforesis gel pati. Diferensiasi genetik di antara populasi tinggi (F (ST) = 0,301), menunjukkan divergensi genetik tinggi. Perhitungan dari F (ST) oleh zona geografis mengungkapkan bahwa F tinggi (ST) adalah sebagian besar karena F (ST) di antara populasi di Afrika Barat, menunjukkan pilihan diversifikasi di wilayah ini. Analisis cluster UPGMA mengungkapkan tiga kelompok utama; populasi terpencil barat dari Sierra Leone Senegal dan berada di satu cluster tetapi dipisahkan menjadi dua sub-cluster yang berbeda, populasi terpencil timur dari Madagaskar berada di satu cluster, sedangkan populasi dari Angola, Kamerun, Demokrat Republik Kongo, Ghana, Tanzania, Nigeria dan Guinea berada di satu cluster. Keluarga dura Deli terkait erat dengan populasi 6 dari Guinea (Hayati dkk., 2004)

Berdasarkan hasil amplifikasi DNA dengan PCR – ISSR menggunakan tujuh primer, didapatkan hanya tiga primer (UBC 828, UBC 885, dan UBC 890) yang mampu mengamplifikasi DNA dalam reaksi PCR – ISSR. Hasil elektroforesis produk amplifikasi DNA menghasilkan 12 – 16 pola pita DNA dengan kisaran ukuran 280 – 1650 bp. Polimorfisme yang diperoleh sangat tinggi (masing – masing primer sebesar 100%). Nilai keinformatifan primer (PIC) berada pada kisaran 0,85 – 0,92, yang berarti primer tersebut mampu mendeteksi polimorfisme dalam suatu populasi sebesar 85 – 92%. Hasil analisis kelompok dengan UPGMA (MEGA 5.05) menunjukkan bahwa jarak pagar dibagi dalam dua

kelompok, dan hanya jarak pagar asal Pancasari yang membentuk kelompok sendiri (Suryatini, 2011).

Hasil analisis UPGMA menunjukkan bahwa marka RAPD mampu memisahkan individu pisifera Nigeria yang berasal dari TxP famili dan klon. Marka RAPD mengelompokan seluruh pisifera Nigeria pada tingkat kesamaan 0,83. Ketika analisis dilakukan menggunakan marka RAPD, seluruh klon pisifera membentuk satu kelompok pada tingkat kesamaan 1,00 hal ini mengindikasikan bahwa seluruh klon yang dianalisis benar-benar seragam (Zulhermana, 2009).

RAPD juga digunakan untuk sidik jari genotipe buah Kiwi dan untuk mendeteksi variasi genetik yang tidak diinginkan dalam mikropropogasi tanaman. Fragmen diberi skor sebagai ada (1) atau tidak (0), pembacaan yang dimasukkan dalam file komputer sebagai matriks biner (satu untuk setiap penanda). Dua analisis cluster dilakukan untuk mengekspresikan dalam bentuk dendrograms hubungan antara genotipe dan variabilitas genetik terdeteksi. Teknik berbasis DNA yang digunakan mampu memperkuat semua genotipe. Disimpulkan bahwa ketika teknik kultur jaringan yang digunakan, analisis variabilitas somaklonal bisa membutuhkan lebih dari satu teknik berbasis DNA; pada kenyataannya, variasi genetik hadir dalam sumber yang berbeda dapat mengganggu atau menggabungkan kemampuan polimorfik lebih atau kurang polimorfik, seperti

hasil penelitian yang ditunjukkan dengan penanda RAPD (Palombi dan Damiano, 2001).

Marka RAPD

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan metode perbanyakan genom yang paling sering digunakan karena sangat mudah dan

membutuhkan jumlah DNA genom yang tidak terlalu banyak. RAPD banyak digunakan untuk menganalisis keanekaragaman karakter genetik dalam berbagai penelitian dengan pertimbangan antara lain tidak membutuhkan latar belakang pengetahuan tentang genom yang akan dianalisis, primer yang digunakan bersifat universal (dapat digunakan untuk prokariot maupun eukariot), mampu menghasilkan karakter yang relatif tidak terbatas jumlahnya, bahan-bahan yang digunakan relatif lebih murah, preparasi lebih mudah,dan memberikan hasil lebih cepat dibandingkan dengan analisis molekular lainnya. Metode RAPD mampu mendetekasi sekuen nukleotida dengan hanya menggunakan satu primer. Primer tersebut akan memberikan utas tunggal genom yang satu dan pada utas DNA pasangannya dengan arah berlawanan. Selama situs penempelan primer masih berada pada jarak yang dapat diamplifikasi pada umumnya tidak lebih dari 5000

pasangan basa (pb), maka akan diperoleh produk DNA amplifikasi (Weising dkk., 1995).

Prinsip teknik RAPD didasarkan pada kemampuan primer menempel pada cetakan DNA. Primer yang didesain berupa primer tunggal pendek agar dapat menempel secara acak pada DNA genom organisme. Dengan demikian akan terdapat banyak pola fragmen DNA. Perbedaan ini dapat dilihat dengan adanya pola pita pada gel agarosa setelah diwarnai dengan pewarnaan DNA seperti etidium bromide (gel red). Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini ditentukan juga oleh kemurnian dan keutuhan cetakan DNA. Cetakan DNA yang tidak murni akan mengganggu penempelan primer pada situsnya dan akan menghambat aktifitas enzim polymerase DNA. Enzim ini berfungsi untuk melakukan polimerisasi DNA.

Sedangkan cetakan DNA yang banyak mengalami fragmentasi dapat menghilangkan situs penempelan primer.

Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman dengan menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi amplifikasi PCR adalah kuantitas DNA yang diperlukan hanya sedikit. Disamping itu, dalam pelaksanaan teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yang dibutuhkan tidak perlu terlalu tinggi, atau dengan kata lain teknik amplifikasi PCR relatif toleran terhadap tingkat kemurnian DNA. Walaupun demikian, dalam suatu teknik isolasi DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan metabolit sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisakarida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Adanya polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisakarida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996).

Dalam program pemuliaan tanaman, diperlukan identifikasi baik karakter morfologi maupun molekuler untuk menguji keragaman genotip klon-klon yang akan dipilih untuk tetua persilangan. Pemakaian teknik RAPD memiliki resolusi yang sebanding dengan RFLP dalam hal analisis kekerabatan antar genotif dan mampu menghasilkan jumlah karakter yang tidak terbatas sehingga sangat membantu dalam analisis keragaman genetik tanaman yang tidak diketahui latar belakang genomnya. Analisis RAPD hanya memerlukan sejumlah kecil DNA sehingga sangat sesuai untuk species tanaman berkayu. RAPD memerlukan biaya lebih rendah dibandingkan biaya untuk uji kekerabatan berdasarkan analisis DNA

yang lain. Metode RAPD menggunakan primer dengan ukuran sepuluh basa sering digunakan untuk studi kekerabatan, identifikasi varietas, pemetaan genetik, analisis struktur DNA organisme dan finger printing suatu individu organisme. Teknik RAPD menggunakan primer acak maupun spesifik telah terbukti dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk berbagai karakter agronomis penting. Pemakaian marka molekuler RAPD banyak digunakan untuk menyusun kekerabatan beberapa individu dalam spesies maupun kekerabatan antar spesies. Penggunaan kekerabatan ini dapat dijadikan rujukan dalam pemuliaan persilangan untuk mendapatkan keragaman yang tinggi dari hasil suatu persilangan penanda RAPD yang efektif dalam mengevaluasi silsilah bahan, sementara SSR sangat penting untuk mengenali perbedaan antara karakteristik kuantitatif.

Pada tahun 2010 BALITKA sedang melakukan penelitian untuk mengidentifikasi fragmen DNA sebagai penanda sifat kopyor, klarifikasi kandidat penanda sifat produksi buah pada kelapa kultivar Dalam Mapanget, dan identifikasi penanda tanaman tahan terhadap P. palmivora. Pemanfaatan penanda DNA akan menghemat waktu dan tenaga kerja karena pengujian yang dilakukan pada tingkat DNA tidak dipengaruhi oleh lingkungan tumbuh. Keuntungan lainnya adalah jumlah benih, bibit, atau galur yang dibutuhkan untuk pengujian dapat dikurangi, karena banyak yang sudah tidak terpilih setelah seleksi dengan penanda DNA pada tahap awal generasi, sehingga desain pemuliaan lebih efektif. Efisiensi paling besar adalah seleksi terhadap sifat spesifik (target) akan lebih cepat karena seleksi berdasarkan genotif spesifik lebih mudah diidentifikasi dan diseleksi (Pandin, 2010).

Pada umumnya ekstraksi DNA tanaman dilaksanakan dengan menggunakan bufer pengekstrak sodium dodecyl sulphate (SDS) dan cetyl trimetil ammonium bromide (CTAB). Perlakuan lisis sel dengan menggunakan detergen non ionik CTAB menghasilkan kuantitas DNA yang cukup tinggi terutama dari jaringan segar, dengan jumlah DNA yang dihasilkan bervariasi tergantung pada species dan kondisi awal material yang digunakan. Pada tanaman dengan kandungan polisakarida dan metabolit sekunder tinggi perlu dilakukan modifikasi pada saat ekstraksi DNA. Untuk menghilangkan polisakarida ekstraksi lisat disarankan dengan menggunakan kloroform dibandingkan dengan kloroform/isoamilalkohol karena lebih efisien untuk mengisolasi asam nukleat. Secara umum hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dengan pemakaian tiga metode isolasi DNA genom yang diujikan maka dihasilkan dua metode yang mampu menghasilkan DNA genom jarak pagar dengan kuantitas dan kualitas yang baik, yaitu metode Doyle and Doyle (1990), menggunakan bufer CTAB, menggunakan bufer pengektrak SDS. Metode isolasi DNA berdasarkan metode Doyle and Doyle yang menggunakan bufer CTAB dan metode Zheng dkk. yang menggunakan bufer pengektrak SDS sesuai untuk dipergunakan dalam isolasi DNA genom tanaman jarak pagar (Zainudin dan Maftuchah, 2010).

Ada tiga kontaminan utama yang terkait dengan DNA tanaman yang dapat menyebabkan kesulitan yang cukup besar ketika melakukan eksperimen PCR: senyawa polifenol, polisakarida dan RNA. Kehadiran zat fenolik seperti quercetin, isorhamnetin heterosides, (+) catechin, (-) epikatekin, 5-caffeoylshikimic asam (asam dactylifric) dan isomer posisi nya (asam 3-caffeoylshikimic dan asam 4-caffeoylshikimic) yang hadir dalam daun kurma dapat mengganggu keberhasilan isolasi DNA dengan amplifikasi PCR. Inklusi natrium klorida (NaCl) dengan

buffer lisis telah digunakan untuk menghilangkan polisakarida. Demikian juga, polivinilpirolidon (PVP) telah direkomendasikan untuk menghilangkan senyawa polifenol dan lithium klorida (LiCl) untuk RNA (Ibrahim dkk., 2010).

Hasil ekstraksi DNA kemiri sunan dengan menggunakan kombinasi penambahan antioksidan polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, namun tanpa penggunaan nitrogen cair, ataupun penyimpanan lebih lama (over night) dari ekstrak daun yang telah digerus sebelum dilakukan purifikasi seperti yang sering dilakukan untuk tanaman tahunan pada umumnya, memperlihatkan hasil yang sangat memuaskan, dimana DNA mempunyai kualitas dan kuantitas yang sangat baik serta pola pita amplikon DNA terlihat sangat jelas dan tebal, sehingga bisa dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang dipakai dalam kegiatan ini adalah sangat memberikan hasil yang nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA kemiri susan (Syafaruddin dan Santoso, 2011).

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu

Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan yang dimulai pada bulan April 2012 hingga bulan November 2012.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman aren yang masih muda di Tapanuli Selatan, cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Promega H6269), Polyvinilpolypirolidone (PVPP) (Promega 77627), buffer ekstraksi CTAB (2 g NaCl, 5 g CTAB, 100 ml aquades) , buffer TAE, buffer TE, 24 ml Kloroform : 1 ml Isoamil-alkohol (KIAA), NaCl, NaOH, Na-EDTA, HCl p.a, alkohol 100 % dan 70 %, Isopropanol dingin, aquadest, β -mercaptoethanol 2 %, agarose LE. Analytical Grade (Promega, V3121), primer oligonukleotida (Sigma Aldrich), Go Tag Green Master Mix (Promega, M7122), 100 bp DNA ladder (Promega, G2101), kertas tissue.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gunting, timbangan digital, hot plate, mortar, centrifuge (Eppendorf 5415), vortex, frezer, tabung eppendorf 2,0 ml dan 1.5 ml, mikropipet ukuran 1-50µl, 100-500µl dan 200-1000µl, pinset, sarung tangan karet, tip pipet (warna kristal, kuning dan biru), autoklaf, kamera, penangas air (water Bath, Biosan), oven, pH meter, pengaduk magnetik, alat-alat gelas (baker glass, erlenmeyer, dll), UV-transilluminator (UV Tec Cambridge 20 UV), elektroforesis (Power PAC 3000, Biorad), PCR (Therma Cycler), Gel-Doc (UV Cambridge), power supply, alat tulis.

PENELITIAN I : OPTIMASI DAN MODIFIKASI

Metode Penelitian Pengambilan Sampel Daun

Sampel daun aren yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah Angkola Barat, Sipirok, Batangtoru, Porsea dan Ranto, Provinsi Sumatera Utara. Daun dipilih yang masih muda/lembut berwarna kuning keputihan kemudian dicuci bersih, dilap pakai tissue dan kemudian dibawa ke Laboratorium Kultur Jaringan Universitas Sumatera Utara, Medan.

1. Tanpa Menggunakan N2 Cair dan Pasir Kuarsa Isolasi dan Pemurnian DNA

Daun aren yang berasal dari pohon yang berbeda dari daerah Angkola Barat, Sipirok (Tapanuli Selatan) ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus dan ditambahkan buffer ekstraksi CTAB. Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP sebagai antioksidan + 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian

tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4o

Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4

C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan `100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo dkk., 1994).

o

C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA

yang diperoleh disimpan pada suhu ± 200 C bila tidak digunakan (Orozco-Castillo dkk., 1994).

2. Menggunakan Pasir Kuarsa

Isolasi dan Pemurnian DNA

Daun aren yang berasal dari 5 pohon yang berbeda dari Ranto dan Porsea ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara

melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus. Potongan daun yang ada dalam mortar ditambah pasir kuarsa 50 mg. Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortal ditambah 0,1 g PVPP dan 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan nomor pohon yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o

Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4

C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

o

Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4

C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo dkk., 1994).

o

C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000

rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang

diperoleh disimpan pada suhu ± 200 C bila tidak digunakan (Orozco-Castillo dkk., 1994).

3. Menggunakan N2 Cair

Isolasi dan Pemurnian DNA

Daun aren yang berasal dari 10 pohon yang berbeda dari Batangtoru (Tapanuli Selatan) ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus. Potongan daun yang ada dalam mortar ditambah N2 cair. Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10 µl β -mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan nomor pohon yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o

Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA kedalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4o

Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4

C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo dkk., 1994).

o

C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± 200 C bila tidak digunakan (Orozco-Castille dkk., 1994).

Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 2µl DNA stok ditambah 8 ml aquades steril ditambah 2µl loading buffer ke dalam tabung mikro 2 ml dan dihomogenkan.

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v). Agarose ditimbang 0,28 g kemudian dilarutkan kedalam 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan ditambah

larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada air yang mengalir.

Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o

Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.

C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis dan diberi larutan TAE 1x ± 670 ml (hingga terendam). Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2µl dan stok DNA 8µl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.

Amflifikasi/ genotyping

Amplifikasi mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur William dkk., (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer OPD-12 polimorpik dari Sigma-Aldrich yang telah terbukti menunjukkan polimorfisme pada kelapa sawit di Indonesia (Retno dkk, 2001) dengan pertimbangan aren dan kelapa sawit satu famili yaitu palmae (palem-paleman).

Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 µl stok DNA dan ditambah 45µl ddH2O sehingga diperoleh 50 µl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 µl stok primer.

Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Kemudian dibuat larutan master dengan contoh : dd H2O 9.5 µl x 5 = 47,5 µl, Go Tag 12,5 µl x 5 = 62,5 µl, aliquot primer 1 µ x 5 = 5 µl. Dari tube diambil 23 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan 2 µl masing masing DNA. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 36 O

Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu ± 20

C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystems di desain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1.

o

Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR C bila sedang tidak digunakan.

No Tahapan Suhu Waktu Jumlah siklus

1 2 3 4 5 6 Denaturasi awal Denaturasi Annealing Ekstension Ekstension akhir Kondisi akhir PCR

94o 94 C o 36 C o 72 C o 72 C o 4 C o 2 menit C 1 menit 1 menit 2 menit 10 menit Tak terbatas 1 45 45 45 1 1

‘ Telah dikembangkan untuk kelapa sawit (Setiyo, 2001)’.

Elektroforesis

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 % (b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35

ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening. Kemudian didinginkan dengan dialirkan tabung tersebut pada air mengalir, kemudian Ethidium Bromida ditambahkan 1 µl dan dipanaskan kembali. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan dengan cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o

Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml (hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel.

C) larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 70 menit. Setelah running elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil 1. Tanpa Menggunakan N2

Pola pita yang dihasilkan pada metode ini cukup baik, dari 6 pohon yang digunakan diperoleh 2 pohon untuk dianalisis pada tahap selanjutnya dengan pita DNA yang jelas dan tebal seperti terlihat pada Gambar 1 di bawah ini :

Cair dan Pasir Kuarsa

Gambar 1. Profil Genom DNA Tanpa Menggunakan N2 Keteranngan : (1) P3*, (2) P5, (3) P7*, (4) P8, (5) P9, (6) P10

Cair dan Pasir Kuarsa yang Diuji melalui Gel Agarose P = Parsalakan

* = DNA Jelas dan Tebal

Gambar 2. Profil DNA Genom Aren tanpa Menggunakan Nitrogen Cair dan Pasir Kuarsa Keterangan :(1) S1*, (2) S2*, (3) S6*, (4) S4*, (5) S8*, (6) S7, (7) S10*, (8) S3, (9) S3, (10) S9*, (11) S5*

1-11 : Nomor aksesi S : Sipirok

* : DNA Jelas dan Tebal

Dari hasil pengamatan kualitas DNA pada Gambar 2 menunjukkan adanya DNA pada aksesi aren S1, S2, S6, S4, S8, S10, S9, S5 yang memenuhi syarat

6 5 4 3* 2 1*

5* 4* 3 2* 1*

untuk dianalisis selanjutnya menggunakan mesin PCR. Pola pita yang didapat jelas dan tebal.

2. Menggunakan Pasir Kuarsa

Gambar 3. Profil Genom DNA Menggunakan Pasir Kuarsa yang Diuji melalui Gel Agarose Keterangan : (1) G0*, (2) G1*, (3) G2, (4) G3*, (5) M2A*

G = Ranto M = Porsea * = DNA Smear

Pola pita yang dihasilkan pada metode menggunakan pasir kuarsa cukup baik, dari 5 pohon yang digunakan diperoleh 4 pohon untuk dianalisis pada tahap selanjutnya dengan pita DNA smear seperti terlihat pada Gambar 3.

3. Menggunakan N2 Cair

Gambar 4. Profil Genom DNA Menggunakan N2

Keterangan : (1) B1*, (2) B2, (3) B3, (4) B4, (5) B5, (6) B6*, (7) B7*, (8) B8* (9) B9*, (10) B10* Cair yang Diuji melalui Gel Agarose B = Batangtoru

* = DNA Smear

Pola pita yang dihasilkan pada metode menggunakan N2 cair cukup baik, dari 10 pohon yang digunakan diperoleh 6 pohon untuk dianalisis pada tahap selanjutnya dengan pita DNA yang smear seperti terlihat pada Gambar 4.

Dari 3 metode modifikasi untuk optimasi diperoleh pola pita PCR yang dapat dikenali/skoring, dapat dilihat pada Gambar 5 berikut ini :

1500 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100

Gambar 5. Propil Pita DNA dari Ketiga Metode Modifikasi Optimasi dengan Menggunakan Primer OPD-12 Keterangan : (1) S3, (2) S6, (3) G1/Pasir Kuarsa, (4) G3 Pasir Kuarsa, (5) M2A/Pasir Kuarsa, (6) NR1, (7) S2, (8)

P3, (9) P7, (10) G0/Pasir Kuarsa, (11) MIA, (12) B7/Nitrogen Cair, (13) B1/Nitrogen Cair, (14) B9/Nitrogen Cair, (15) B10/Nitrogen Cair, (16) M = 100 bp DNA Ladder

Pembahasan

Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan untuk mengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman yang digunakan. Tetapi pada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ektraksi dan purifikasi DNA secara optimal : 1) penghomogenan jaringan tanaman, 2) komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel dan 3) penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnya untuk tanaman tahunan. DNA tanaman dengan kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasi fragmen DNA tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi pada metode ekstraksi yang sudah baku pada tanaman perlu dilakukan.

Stok DNA yang memenuhi standar optimal dapat dicapai melalui pelaksanaan prosedur dan pengujian DNA yang baku dengan mencermati proses yang terjadi mulai dari pemecahan dinding sel dengan penggerusan jaringan hingga diyakini efisiensi dan efektifitasnya. Selanjutnya pemecahan membran sel dilakukan dengan mengoptimalkan pemberian buffer ekstraksi/CTAB. Buffer ekstraksi/CTAB dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya karakteristik perbedaan kelarutan antara keduanya (Rogers dan Bendich, 1988).

Sebagian besar metode isolasi DNA tanaman termasuk kit komersial memerlukan penggilingan bahan tanaman dengan nitrogen cair yang bertujuan untuk membantu memecahkan dinding sel. Berdasarkan hal ini, setiap jaringan yang direndam dalam nitrogen cair langsung menjadi padat rapuh sehingga mudah menghancurkannya menjadi bubuk, dengan keuntungan tambahan dapat menjaga jaringan pada suhu rendah.

Pasir kuarsa atau bubuk kaca dapat digunakan untuk menggiling daun aren seperti yang telah dilakukan Ibrahim dkk. (2010) pada tanaman kurma. Tujuan pemberian pasir kuarsa sama halnya dengan pemberian N2

Teknik yang digunakan dalam penelitian ini salah satunya kombinasi penambahan antioksidan PVPP dan mercaptoetanol pada buffer ekstraksinya. Dengan kombinasi ini dihasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang baik. PVPP Cair yaitu membantu memecahkan dinding sel. Isolasi DNA menggunakan pasir kuarsa juga telah banyak dilakukan pada spesies tanaman hutan. Hal ini disebabkan dalam laboratorium kecil di banyak negara berkembang, nitrogen cair tidak selalu tersedia. Disamping itu penyimpanan dan pemeliharaan nitrogen cair juga sulit (Ibrahim dkk., 2010).

dan β-mercapthoethanol akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA.

Proses penggerusan atau homogenasi daun aren tidak menggunakan nitrogen cair, tetapi ditambahkan 0.5 ml buffer ekstraksi CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Syafaruddin dan Santoso (2011), menyatakan bahwa buffer ekstraksi CTAB digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman kemiri susan yang menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang cukup baik.

Menghindari kemungkinan adanya kontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder dilakukan kombinasi penambahan antioksidan PVPP dan mercaptoethanol pada buffer ekstraksinya. Hasil penelitian menunjukkan kombinasi ini menghasilkan kualitas DNA yang cukup baik. Hal ini sesuai dengan penelitian Syafaruddin dan Santoso (2011) yang menyatakan bahwa PVPP dan mercaptoethanol akan mereduksi senyawa-senyawa fenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas dan kuantitas DNA.

DNA yang sudah dilepas kedalam larutan buffer harus dapat dilindungi dari aktifitas nuclease endogenous. Hal ini dapat diatasi dengan adanya EDTA dalam buffer ekstraksi yang dapat mengikat ion Mg, yaitu sebagai kofaktor yang diperlukan untuk aktifitas berbagai enzim nuclease (Rogers and Bendich, 1988).

Selain itu tingkat kemurnian DNA yang tinggi dapat diperoleh melalui pencucian berulang dengan penambahan kloroform atau KIAA agar protein mengalami denaturasi dan terpisah dari DNA. Kontaminan lain yang juga mengurangi kemurnian DNA menjelang berakhirnya isolasi adalah masih tercampurnya RNA bersama pelet DNA.

Untuk membuktikan bahwa DNA yang telah diperoleh mempunyai kualitas dan kuantitas yang baik maka DNA tersebut digunakan sebagai cetakan untuk analisis PCR-RAPD. Hasil amplifikasi PCR-RAPD menggunakan primer OPD-12 menunjukkan bahwa DNA yang diamplifikasi menghasilkan pita DNA yang sangat baik dimana pola pita terlihat jelas dan terang. Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang dipakai sangat memberikan hasil yang sangat nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ektraksi DNA aren. Beberapa penelitian tentang optimasi isolasi DNA dan protokol untuk PCR-RAPD telah dilakukan pada tanaman tahunan kemiri susan (Syafaruddin dan Santoso, 2011), kurma (Ibrahim dkk, 2010).

Hasil pengujian kualitas DNA pada ketiga metode di atas cukup baik, hasil ini dapat menentukan keberhasilan amplifikasi PCR. Menurut Waugh (1997), beberapa faktor yang mempengaruhi kehandalan reaksi RAPD diantaranya adalah kondisi dan konsentrasi DNA, ko-esktraksi pengkontaminan dan interferensi amplifikasi. Kriteria yang akan diampliikasi untuk stok DNA, paling tidak mengandung seutas DNA utuh dan ada regium dan bebas dari kontaminan.

Kesimpulan

Tiga metode modifikasi untuk optimasi memberikan hasil yang cukup baik dengan pola pita PCR yang dapat dikenali. Maka dipilih metode pertama untuk digunakan dalam penelitian II yaitu tanpa menggunakan N2 cair dan pasir kuarsa karena lebih sederhana, murah dan cepat dibandingkan dengan menggunakan nitrogen cair yang cukup mahal dan sulit dalam penyimpanan dan pemeliharaannya. Sedangkan jika menggunakan pasir kuarsa sulit diperoleh dan

kemungkinan masih ada elemen-elemen lain yang terkandung dalam pasir kuarsa tersebut meskipun telah disterilisasi.

PENELITIAN II : PEMAKAIAN MARKA RAPD UNTUK ANALISIS KERAGAMAN GENETIK

Metode Penelitian Pengambilan Sampel Daun

Daun aren yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah Tapanuli Selatan yaitu Napa/Angkola Selatan (0-400 mdpl), Angkola Barat (400-800 mdpl, Sipirok ((400-800-1200 mdpl), dan Batangtoru (400-(400-800) Provinsi Sumatera Utara (masing – masing lokasi diambil 10 aksesi). Daun dipilih yang masih muda/lembut berwarna kuning keputihan kemudian dicuci bersih, dilap pakai tissue dan kemudian dibawa ke Laboratorium Kultur Jaringan Universitas Sumatera Utara, Medan.

Isolasi dan Pemurnian DNA

Daun aren yang berasal dari pohon yang berbeda ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus dan ditambahkan buffer ekstraksi CTAB. Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP sebagai antioksidan + 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µl β -mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan

KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4o

Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4

C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan `100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo dkk., 1994).

o

C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang

diperoleh disimpan pada suhu ± 20o C bila tidak digunakan (Orozco-Castillo dkk., 1994).

Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 2µl DNA stok ditambah 8 ml aquades steril ditambah 2µl loading buffer ke dalam tabung mikro 2 ml dan dihomogenkan.

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v). Agarose ditimbang 0,28 g kemudian dilarutkan kedalam 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada air yang mengalir.

Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o

Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.

C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis dan diberi larutan TAE 1x ± 670 ml (hingga terendam). Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2µl dan stok DNA 8µl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.

Uji Kuantitas DNA

Penetapan kuantitas DNA dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan DNA menggunakan spektofotometer sinar UV. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Sebagai contoh digunakan aquades. Bila nilai panjang gelombang 260 (a) = 1 dapat dikatakan bahwa konsentrasi DNA adalah 50µl/ml, karena banyaknya sinar UV berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. Selanjutnya angka 50 ini digunakan sebagai faktor konversi dalam menghitung konsentrasi DNA dengan rumus :

Konsentrasi DNA = faktor konversi x faktor pengenceran x λ 260

Tingkat kemurnian DNA ditetapkan dengan membandingkan nilai

absorbansi pada λ 260 nm terhadap λ 280 nm. Bila rasio perbandingan

menunjukkan nilai 1,8 -2,0 maka tingkat konsentrasi DNA dinyatakan memenuhi syarat untuk dianalisis selanjutnya.

Amflifikasi/ genotyping

Amplifikasi mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur William et al., (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 10 primer polimorpik dari Sigma-Aldrich yang telah terbukti menunjukkan polimorfisme pada kelapa sawit di Indonesia (Retno dkk, 2001) dengan pertimbangan aren dan kelapa sawit satu famili yaitu palmae (palem-paleman).

Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 µl stok DNA dan ditambah 45µl ddH2O sehingga diperoleh 50 µl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 µl stok primer.

Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan Master dimisalkan 5 sampel yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas : dd H2O 9.5 µl x 5 = 47.5 µl, Go Tag 12,5 µl x 5 = 62.5 µl, aliquot primer 1 µ x 5 = 5 µl. Dari tube diambil 23 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masing masing DNA sebanyak 2 µl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 36 O

Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu ± 20

C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystems di desain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1.

o

C bila sedang tidak digunakan.

Elektroforesis

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 % (b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o C) larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras.

Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml (hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel.

Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 65 volt selama 90 menit. Setelah ranning elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.

Analisis Data Penentuan Skoring Marka RAPD

Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel dari masing- masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode1 (ada) dan o (tidak ada) (Ferreira dan Grattapaglia, 1994).

Penentuan Ukuran Pasangan Basa

Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan log jarak menggunakan program regresi linier. Fragmen DNA standar (100 bp DNA landder) digunakan sebagai absis (x) dan log jarak migrasi sebagai ordinat (y). Dari persamaan ini ditentukan ukuran pasangan basa dari fragmen produk PCR berdasarkan log jarak dari fragmen tersebut.

Matriks ketidaksamaan (dissimilarity) tiap kombinasi pasangan dihitung berdasarkan Dissimilarity Index Simple Matching pada bootstraps 1000, sesuai rumus :

dengan dij ketidaksamaan antara i dan j, L jumlah lokus, π merupakan tingkat ploidi dan m1 merupakan jumlah alel yang umum diantara i dan j untuk lokus l. Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1) Principal Coordinates Analyisis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbour-Joining Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet 2009).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Karakter morfologi dari 24 aksesi aren pada empat populasi alam di daerah Tapanuli Selatan merupakan data pendukung dalam penelitian ini dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

Gambar 6. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola Barat dengan Hasil Nira 10-25 liter/hari/pohon.

Gambar 7. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Sipirok dengan Hasil Nira 20-40 liter/hari/pohon.

Gambar 8. Tinggi Tanaman (cm) Sampel Tanaman Aren di daerah Angkola Selatan dengan Hasil Nira 15-25 liter/hari/pohon.

3,2 3,5 4,1 3,8

12,8

16,3 17

0 5 10 15 20

P1 P3 P4 P5 P7 P8 P10

6,4 6,7 ₆ 7,2

9,7 15,8

18,9

0 5 10 15 20

S1 S3 S4 S5 S6 S7 S10

6,4 8,2 7,3 8,2

17,8

0 5 10 15 20

Laboratory Manual. Chapter 6 Springer Verlag, Berlin Heidelberg. Pp. 305-333.

Weising, K., Nybom H., Wolff K., dan Meyer W., 1995. DNA Finger Printing in Plants and Fungi. Boca Raton-Florida: CRC Pr.

Wilkins, T.A. dan Smart, L.B.. 1996. Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to RNA. Isolation, Analysis and Synthesis. New York: Wiley – Liss.

William, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalsky, J.A., Tingey, S.V., 1990. DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Nucleic Acids Res. 18 : 6531-6536.

Yulita, K.S., 2011. Variasi dan kekerabatan genetik pada dua jenis baru belimbing (Averrhoa leucopetala Rugayah et Sunarti sp nov dan A. dolichorpa

Rugayah et Sunarti sp nov., Oxalidaceae) berdasarkan profil Random Amplified Polymorphic DNA. Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi- LIPI, Bogor. Jurnal Biologi Indonesia 7(2): 321-330.

Yunus, A., 2007. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas

L.) di Jawa Tengah Berdasarkan Penanda Isoenzim. BIODIVERSITAS 8 (3) : 249-252

Zainudin, A., dan Maftuchah, 2010. Pengembangan Metode Isolasi Genom pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas). Fakultas Pertanian Universitas Muhammadiyah Malang.

Zulkifli, L., Sudarsono, H. Aswidinnowar dan N. Toruan-Mathius, 2001. Analisis Pembeda Klon Karet Tahan dan Rentan Penyakit Daun Gugur

Corynespora serta Analisis Keragaman Genetik dengan AFLP dan RAPD.

Tesis Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Pp. 53-55. (Tidak dipublikasikan).

Zulhermana, 2009. Keragaman Genetik Intra dan Interpopulasi Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq) Pisifera Asal Nigeria Berdasarkan Analisis Marka

Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok

a. CTAB 5 %

Larutan dibuat dengan melarutkan :

- NaCl : 2.0 g

- CTAB : 5.0 G

- Aquades : 100 ml

b. Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml) Bahan yang digunakan adalah :

- Tris : 12.114 g

- HCl p.a. : 4.2 ml

- Aquades : 80 ml

- Larutan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia di dalam gelas beaker yang diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik di atas hot plate

- Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave

c. Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m) Bahan yang digunakan adalah :

- Tris : 6.057 g

- Aquades ditambahkan hingga volume larutan mendekati 50 ml

- Pengaturan Ph dilakukan dengan menambahkan NaOH 2.5 M hingga Ph 7.4

- Volume ditepatkan hingga 50 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave

d. EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml) Bahan yang digunakan adalah :

- NaEDTA : 18.612 g

- NaOH : 2.0 g

- Aquades : 80 ml

- Larutan dibuat dengan mencampur bahan kimia dalam gelas beaker dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik

- Pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan HCl hingga ph 8.0. - Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml

- Larutan disterilisasi dengan autoclave

e. NaCl 5 M pH 7.7 (l00 ml)

Bahan yang digunakan adalah :

- NaCl : 29.22 g

- Aquades ditambahkan hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik hingga larut

f. Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml) Bahan yang digunakan adalah :

- CTAB 2 % : 40 ml CTAB 5 %

- NaCl 1,26 M : 25.1 ml NaCl 5 M

- EDTA 20 mM : 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0

- Tris HCl pH 8.0 100 mM : 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0

- Aquades steril : 20.8 ml

g. Buffer TAE 50 X (100 ml)

Bahan yang digunakan adalah :

- Tris : 24.2 ml

- Asam Asetat Glasial : 5.7 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 10 ml

- Aquades ditambahkan hingga olume larutan 100 ml

h. Buffer TAE 1X (500 ml)

Bahan yang digunakan adalah :

- Buffer TAE 50 X : 10 ml

- Aquades : 490 ml

i. Buffer TE (50 ml)

Bahan yang digunakan adalah :

- Tris HCl 1 M PH 8.0 : 0.5 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 0.1 ml

- Aquades : 49..4 ml

- Dimasukkan ke dalam gelas beaker dan diaduk hingga merata

j. Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml) Bahan yang digunakan adalah :

- Kloroform : 48 ml

- Isoamilalkohol : 2 ml

- Dicampur merata

k. Etanol 70 % (100 ml)

- Etanol : 70 ml

Lampiran 2. Nilai Distance

1 2 4 5 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

2 0.19

4 0.36 0.41

5 0.73 0.68 0.78

7 0.43 0.50 0.39 0.71

8 0.51 0.44 0.50 0.42 0.53

10 0.51 0.51 0.56 0.39 0.55 0.33

11 0.62 0.55 0.67 0.74 0.62 0.63 0.63

12 0.47 0.47 0.48 0.74 0.39 0.55 0.55 0.62

13 0.27 0.28 0.41 0.71 0.45 0.63 0.49 0.56 0.53

14 0.24 0.28 0.36 0.77 0.40 0.59 0.54 0.58 0.34 0.18

15 0.34 0.33 0.28 0.77 0.42 0.58 0.55 0.56 0.38 0.24 0.11

16 0.51 0.62 0.63 0.70 0.61 0.68 0.53 0.67 0.67 0.64 0.57 0.64

17 0.66 0.77 0.74 0.83 0.63 0.71 0.63 0.77 0.62 0.74 0.70 0.77 0.57

18 0.57 0.57 0.66 0.70 0.53 0.65 0.62 0.69 0.64 0.61 0.63 0.69 0.74 0.79

19 0.49 0.54 0.57 0.75 0.59 0.61 0.57 0.59 0.59 0.59 0.55 0.62 0.44 0.46 0.58

20 0.44 0.49 0.63 0.75 0.58 0.62 0.51 0.63 0.55 0.58 0.49 0.58 0.30 0.57 0.57 0.30

21 0.54 0.59 0.63 0.75 0.64 0.70 0.59 0.58 0.66 0.63 0.59 0.63 0.39 0.64 0.60 0.36 0.27

22 0.48 0.51 0.60 0.79 0.62 0.69 0.59 0.58 0.58 0.55 0.51 0.55 0.37 0.57 0.61 0.37 0.23 0.35

23 0.60 0.61 0.73 0.81 0.70 0.65 0.79 0.76 0.69 0.80 0.70 0.76 0.75 0.73 0.71 0.74 0.74 0.68 0.77