Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium Dc.) Sumatera Utara Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok a. CTAB 5 %

Larutan dibuat dengan melarutkan : - NaCl : 2.0 g

- CTAB : 5.0 G - Aquades : 100 ml

b. Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - Tris : 12.114 g

- HCl p.a. : 4.2 ml - Aquades : 80 ml

- Larutan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia di dalam gelas beaker yang diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik di atas hot plate

- Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave

c. Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m)

Bahan yang digunakan adalah : - Tris : 6.057 g

- Aquades ditambahkan hingga volume larutan mendekati 50 ml

- Pengaturan Ph dilakukan dengan menambahkan NaOH 2.5 M hingga Ph 7.4 - Volume ditepatkan hingga 50 ml

- Larutan disterilisasi dengan autoclave

Bahan yang digunakan adalah : - NaEDTA : 18.612 g - NaOH : 2.0 g - Aquades : 80 ml

- Larutan dibuat dengan mencampur bahan kimia dalam gelas beaker dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik

- Pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan HCl hingga ph 8.0. - Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml

- Larutan disterilisasi dengan autoclave

e. NaCl 5 M pH 7.7 (l00 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - NaCl : 29.22 g

- Aquades ditambahkan hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik hingga larut

- Pengaturan PH dilakukan dengan menambahkan NaOH hingga pH 7.7 - Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml

- Larutan disterililasasi dengan autoclave

f. Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - CTAB 2 % : 40 ml CTAB 5 % - NaCl 1,26 M : 25.1 ml NaCl 5 M

- EDTA 20 mM : 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0

- Tris HCl pH 8.0 100 mM : 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 - Aquades steril : 20.8 ml

g. Buffer TAE 50 X (100 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - Tris : 24.2 ml

- Asam Asetat Glasial : 5.7 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 10 ml

- Aquades ditambahkan hingga olume larutan 100 ml

h. Buffer TAE 1X (500 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - Buffer TAE 50 X : 10 ml - Aquades : 490 ml

i. Buffer TE (50 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - Tris HCl 1 M PH 8.0 : 0.5 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 0.1 ml - Aquades : 49..4 ml

- Dimasukkan ke dalam gelas beaker dan diaduk hingga merata

j. Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml)

Bahan yang digunakan adalah : - Kloroform : 48 ml

- Isoamilalkohol : 2 ml - Dicampur merata

k. Etanol 70 % (100 ml)

- Etanol : 70 ml - Aquades : 30 ml

Lampiran 7. Hasil skoring 3 primer pada 30 sampel aksesi andaliman

Tabel 7. Hasil skoring dengan primer OPH-06 Skoring OPH-06

Aksesi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

D1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0

D2 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0

D3 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0

D4 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0

D5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

D6 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

D7 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0

D8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

D9 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

D10 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0

D11 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0

D12 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

K1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

K2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

K3 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

S1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1

S2 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1

S3 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

S4 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0

S5 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

S6 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

S7 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

S8 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0

S9 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0

D13 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D14 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D15 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

D16 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

D17 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

Tabel 8. Hasil skoring dengan primer OPN-03 Skoring OPH-06

Aksesi 1 2 3 4 5 6 7

D1 1 1 1 1 0 0 0

D2 1 1 0 1 1 1 0

D3 0 1 0 1 1 0 0

D4 1 1 0 1 1 1 0

D5 1 1 0 1 1 1 0

D6 - - - -

D7 1 1 1 1 0 0 0

D8 0 1 1 1 0 0 0

D9 1 1 0 1 0 0 0

D10 0 1 1 1 0 0 0

D11 0 1 0 1 0 0 0

D12 1 1 1 1 1 1 0

K1 1 1 0 1 0 1 0

K2 1 1 0 1 0 0 0

K3 0 1 1 1 0 0 0

S1 0 1 1 0 0 0 0

S2 0 1 0 1 0 0 1

S3 1 1 0 1 0 0 0

S4 1 1 0 1 1 0 0

S5 1 1 0 1 0 1 0

S6 0 1 0 1 0 0 0

S7 1 1 0 1 1 1 0

S8 0 1 0 0 0 0 0

S9 0 1 0 0 1 1 0

D13 0 1 0 0 0 0 0

D14 1 1 0 1 0 1 0

D15 1 1 0 1 0 1 0

D16 0 1 0 0 0 0 0

D17 1 1 0 1 1 0 0

Tabel 9. Hasil skoring dengan primer OPC-12 Skoring OPH-06

Aksesi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

D1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0

D2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

D3 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1

D4 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0

D5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

D6 - - - -

D7 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0

D8 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

D9 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0

D10 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1

D11 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0

D12 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0

K1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1

K2 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0

K3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

S1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0

S2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

S3 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0

S4 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0

S5 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1

S6 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0

S7 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0

S8 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0

S9 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

D13 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0

D14 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1

D15 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

D16 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0

D17 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0

Lampiran 8. Ukuran pola pita 3 primer (base pairs)

Tabel 10. Ukuran pola pita dengan primer OPH-06 Primer OPH-06

Aksesi 1 2 3 4 5 6

D1 1044 927 486 173

D2 1029 731 173

D3 1338 375 180

D4 2397 1156 892 759 201

D5 1007 187

D6 899

D7 1182 863 752 649 465 180

D8 1007 180

D9 856

D10 1375 1173 835

D11 1097 1014 759 381 201

D12 1338 1191 985 856

K1 1051 180

K2 1014 194 62

K3 1338 1173 842

S1 1038 797 518 397 132

S2 2387 1088 789 80

S3 1038 161

S4 2768 2072 1358 1163 936 820

S5 1327 1070 700

S6 2000 1344 1130 878 707

S7 1427 1232 828

S8 1964 1399 1209 634 205

S9 1427 1028 220

D13 2000 1327 1146 700

D14 2000 1327 1146 707

D15 2109 1455 1244 851

D16 2425 2072 1358 1197 835

D17 2443 2072 1372 1186 963 828

Tabel 11. Ukuran pola pita dengan primer OPN-03 Primer OPN-03

Aksesi 1 2 3 4 5

D1 1682 1374 945

D2 1646 1349 930 780 635

D3 1387 961 795

D4 1612 1374 938 795 592

D5 1727 1364 930 790 636

D6 - - - - -

D7 1579 1337 1055 922

D8 1337 1055 930

D9 1693 1364 930

D10 1313 1039 900

D11 1279 892

D12 1762 1442 953 790 649

K1 1658 1352 907 636

K2 1693 1316 907

K3 1236 885 664

S1 1236 885

S2 1215 847 88

S3 1642 1304 907

S4 1874 1547 1000 801

S5 1727 1389 945 649

S6 1697 1042

S7 1927 1596 1053 827 602

S8 1697

S9 1324 817 622

D13 1697

D14 1658 1316 907 622

D15 1658 1282 877 595

D16 1697

D17 1802 1531 1000 801

Tabel 12. Ukuran pola pita dengan primer OPC-12 Primer OPC-12

Aksesi 1 2 3 4 5 6

D1 1000 535

D2 573

D3 2167 1709 683 349 158

D4 1000 801 647 235

D5 676

D6 - - - -

D7 1044 821 676 245

D8 647 245

D9 1465 1121 800 562

D10 2038 1669 661 325 126

D11 1165 647

D12 1465 1157 816 562

K1 2019 1592 325 119

K2 1465 1121 808 723 543 257

K3 647 215

S1 2000 1594 393 196

S2 676 235

S3 2000 1836 1610 227

S4 1957 626 333 103

S5 1936 1517 626 341 79

S6 1894 1482 647

S7 1711 1127 990 677

S8 2069 1887 1599 708 409 212

S9 1915 1430

D13 1805 1162 657

D14 1482 1098 824 257

D15 1500 1145 849

D16 1945 1818 1530 424 219

D17 1926 1818 1515 697 416 219

Lampiran 9. Faktorial Koordinat

Tabel 13. Faktorial analisis (PCoA)

Tabel 14. Nilai Factorial coordinates

Axis Eigenvalue Inertia%

1 0.05046 19.74

2 0.03108 12.16

3 0.03027 11.84

4 0.02231 8.73

5 0.01793 7.01

Unit Axis 1 Axis 2 Axis 3 Axis 4 Axis 5

0.3362123519 -0.1305688590 4,39E+12 -8,68E+12 7,29E+12 2 0.1376503239 -0.2476267890 5,44E+12 0.11455087683 -8,15E+12 3 0.3094111475 3,68E+12 0.0499282621 4,84E+12 -0.2767422756 4 1,34E+12 -0.1624651948 7,65E+12 -0.1231940998 0.16071306514 5 0.2928508247 -0.1054665933 0.18412326308 3,52E+12 -6,83E+12 6 -0.390176303 -0.5144853177 -0.3109243722 0.26306133570 -8,42E+12 7 0.1729956058 1,39E+12 -1,83E+12 -0.1497824058 0.26011731622 8 0.3791159890 1,27E+12 -0.2162080816 -5,07E+12 -1,85E+12 9 -0.1745307504 -0.0412006091 4,39E+12 0.27672861312 0.1756200635 10 -8,51E+11 0.17499525077 0.0130353951 -0.1337375851 -0.2053155776 11 0.2274215139 -0.2602977069 -0.1112231568 -2,11E+12 -8,29E+11 12 -0.1881556113 -4,91E+12 0.20925998566 -2,60E+12 0.0530938622 13 0.2052205518 9,10E+12 0.26749800308 0.26062503593 -0.118867272 14 0.2124011668 5,99E+12 1,34E+12 7,24E+12 0.3043983650 15 -0.121951297 -5,95E+12 -0.2821977702 -0.1263379894 -0.008886190 16 0.2012546238 0.31405871883 -0.2833060605 0.22314092044 3,86E+12 17 0.2001142204 -0.1682954850 -0.24927636111 -1,37E+12 -4,42E+10 18 0.2506373298 0.15056332359 -8,02E+12 0.13171574945 -4,59E+12 19 -0.1715223531 -5,95E+12 0.10271401396 -0.1842159893 -0.2179552990 20 -0.2093617015 3,74E+12 0.18754125928 -0.0138428272 -4,75E+12 21 -0.2489936210 0.0121411141 -0.0822318730 -0.1751939599 -7,44E+12 22 -0.1694453088 -6,95E+12 0.13151633729 -6,62E+11 -1,60E+12 23 -4,52E+12 0.3354453626 -0.1380148540 -6,88E+12 0.11688422528 24 -7,31E+12 0.2385018962 0.10668303244 9,43E+12 -0.1851104724 25 2,52E+12 -4,53E+12 -3,09E+12 -0.4361263862 -4,60E+11 26 -2,60E+12 -1,67E+12 0.41735422710 -1,71E+12 0.1015126659 27 -0.2670617508 -3,48E+12 0.16419594473 7,70E+12 0.1989369700 28 -0.3831983699 0.2788171137 -0.2309758512 5,10E+12 2,57E+12 29 -0.2138660232 0.1131548140 -5,18E+12 -6,25E+12 1,42E+12 30 -0.2728099388 9,55E+12 1,98E+12 4,77E+12 -5,62E+12

Lampiran 10. Data .ARB

@DARwin 5.0 – ARB

30 30 57

1 34 0.135853159412245 2 32 0.04179416759316 3 37 0.18044076209408 4 41 0.103910907085965 5 32 0.069316943517951 6 39 0.487550446813494 7 41 0.181803378628321 8 36 0.147607581802304 9 39 0.179116219853173 10 37 0.183195601542284 11 34 0.127304735324597 12 33 0.041392997144877 13 35 0.137232188299194 14 43 0.160170985227662 15 58 0.208754401617218 16 38 0.240719889516776 17 36 0.14651006525652 18 45 0.234583121751093 19 53 0.184660209857784 20 52 0.10917441173434 21 47 0.119815903464756 22 40 0.076524907034596 23 38 0.175946777149891 24 46 0.294320423455378 25 47 0.308755525106673 26 35 0.162767811700806 27 33 0.078607002855123 28 31 0.155391879008313 29 31 0.029793306176872 30 54 0.15399429156064 31 54 0.101897964331616 32 44 0.121268548502836 33 40 0.049093822062394 34 42 0.059672492516435 35 49 0.104074017193083 36 42 0.046074411508333 37 49 0.087917324798259 38 46 0.048724689326577 39 55 0.081153839596115 40 52 0.030983132940927

41 48 0.062400409704204 42 43 0.028702979429972 43 44 0.010186148388343 44 45 0.014504466639912 45 48 0.02799877891438 46 51 0.060999676104283 47 53 0.042701673110506 48 50 0.033874308308847 49 50 0.01891178084266 50 51 0.024861844444029 51 57 0.051828643439484 52 55 0.055245978609983 53 57 0.033176890690831 54 56 0.028485431638959

55 56 1,07E+10

56 58 0.028135972582022 57 58 0.001328153921008 Tree_Parameters

Bootstraps

1000 26

31 54 63

32 44 68

33 40 54

34 42 37

35 49 37

36 42 28

37 49 34

38 46 24

39 55 28

40 52 34

41 48 29

42 43 6

43 44 3

44 45 3

45 48 1

46 51 10

47 53 28

48 50 1

49 50 6

50 51 0

51 57 0

52 55 10

54 56 10

56 58 1

57 58 0

End_Bootstraps Colors

30

1 16711935

2 3315455

3 3315455

4 13153535

5 9869055

6 13120200 7 13120200 8 16711935 9 13107350

10 65535

11 9868950

12 14474460 13 16711680 14 13137920 15 16762880 16 16777120

17 25600

18 38400

19 51200

20 65280

21 16776960 22 16766720 23 16766720 24 11184640

25 10380

26 25800

27 255

28 220

29 3289800

30 3302655

End_Colors Settings

0 0 1 1 0 0 0 0 1 0

End_Settings End_Parameters

Tree construction: UnWeighted Neighbor-Joining

30 selected units on 30 Bootstrap analysis: 1000

Average 'edge' distance between bootstrapped trees: 0.8057 5-percentile: 0.6667

95-percentile: 0.9259 ---

Dissimilarity calculated from data file:

new_30andaliman_kodearea_H6_N3_C12.var (type:'single') User selection Units: 30/30 and Variables: 32/32

Dissimilarity index: Presence / Absence - Dice Missing data options:

Integer code for missing data = 999

Pairwise variable deletion - Remove variables with missing data for the current unit pair (70 % of valid data required for each unit pair)

1000 bootstraps

--- Imported Single data...

DAFTAR PUSTAKA

Cheng, K.T., H.C. Chang, C.H. Su, and F.L. Hsu. 1997. Identification of dried rhizomes of Coptis species using random amplified polymorphic DNA.

Botanical Bulletin of Academia Sinica. 38: 241-244.

Dianxiang, Zhang dan Thomas G. H. 2008. Zanthoxylum Linnaeus, Sp. Fl. China

11: 53-66

Gultom, S. 2011. Flavonoid buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) sebagai antioksidan dan inhibitor α-Glukosidase. Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor, hlm. 33-45.

Harahap, M. K. 2013. Analisis genetik tanaman aren (Arenga pinnata Merr) di tapanuli selatan dengan menggunakan marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Tesis. Universitas Sumatera Utara. Medan, hlm. 21-60.

Hartley, T.G. (1966). A Revision of The Malesian Species of Zanthoxylum

(Rutaceae). J. of the Arnold Aboretum. 47: 171–221.

Hsuang, Keng. 1978. Orders and families of Malayan Seed Plants. Dalam Wijaya, C. H. 1999. Andaliman, rempah tradisonal Sumatera Utara dengan aktivitas antioksidan dan antimikroba. Bul.Teknol. dan Industri Pangan. 10(2): 58 -65.

Hutami, S., I. Mariska, dan Y. Supriati. 2005. Peningkatan Keragaman Genetik Tanaman melalui Keragaman Somaklonal. J. Agro. Biogen. 2(2):81-88. Kristanty, R. E., 2012. Isolasi dan elusidasi struktur senyawa antioksidan dan

penghambat xantin oksidase dari buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.). Tesis. Universitas Indonesia. Depok, hlm. 7-12 Miftakhurohmah dan Sintha, S. 2009. Potensi Andaliman Sebagai Sumber

Antioksidan dan Antimikroba alami. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri, 15(2).

Mulia, L. 2000. Kajian Aktivitas Antimikroba Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodicum) dan Antarasa (Litsea cubeba). Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor, hlm. 7–21.

Napitupulu, B., Sortha, S., dan Mery, S., 2004. Potensi andaliman sebagai Food Additive tradisional etnis batak Sumatera Utara. BPTP Sumatera Utara. Medan, hlm. 53-56.

Orozco–Castillo, K.J. Chalmers, R.Waugh & W. Powell, 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffe using RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 87. 934 –940.

Parhusip, A., Betty, S. L., Winiati, P. R., dan Sedamawati, Y., 2005. Pengaruh ekstrak andaliman (Zanthoxylum acanthopodicum DC) terhadap permeabilitas dan hidrofobisitas Bacilus cereus. Jurnal. Teknol. Dan Industri Pangan. 16(1): 24-26.

Perrier X. dan Jacquemoud-Colled J.P., (2006). DARwin Software. http://darwin.cirad.fr/darwin

Poehlman, J. M. 1983. Breeding Fields Crops 2nd edition. AVI Publishing Company, inc. Connecticut. hlm. 471.

Robi’ah, H. R. 2004. Analisis keanekaragaman genetik pisang introduksi (Musa spp.) berdasarkan penanda fenotipik dan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor, hlm. 18-31. Setiyo, I. E. 2001. Pemetaan dan keragaman genetik RAPD pada kelapa sawit

Pancur (RISPA). Tesis. PPS IPB. Bogor. (Tidak dipublikasikan).

Sitanggang, J.M. dan R. Habeahan. 1999. Tanaman rempah kawasan Danau Toba dan sekitarnya. Makalah Seminar Sehari Tanaman Berdaya Guna Tinggi di Kawasan Danau Toba dan Sekitarnya. Medan, hlm. 19.

Siregar, B. L., 2003. Andaliman (Zanthoxylum acanthopodicum DC.) di Sumatera Utara: Deskripsi dan perkecambahan. J. Hayati hlm. 38-40

Suksathan, R., Chusie T., Paritat, T., dan Prasit W. 2009. Notes on spice plants in the genus Zanthoxylum (Rutaceae) in Northern Thailand. Thai For Bull (Bot), Special Issue: 197-204

Sumarsono. 2000. Keanekaragaman genetik lima populasi kelapa Dalam dari Jawa berdasarkan penanda RAPD. Tesis. PPS IPB. Bogor, hlm. 12-18. Tensiska, Wijaya C., dan Nuri A., 2003. Aktivitas antioksidan ekstrak buah

andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) dalam beberapa sistem pangan dan kestabilan aktivitasnya terhadap kondisi suhu dan pH. J. Teknol. dan Industri Pangan 14(1)

Toruan-Matius, N., T. Hutabarat., T. Sundari. 1996. Pengaruh pengemasan dan penyimpanan terhadap DNA tanaman perkebunanuntuk analisis RAPD.

Men. Perkub. 64 (1): 3-12.

Widiastuti, B. 2000. Aktivitas antioksidan dan immunostimulan ekstrak buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.). Skripsi. Program Sarjana IPB. Bogor, hlm. 3-6.

Wijaya, C. H. 1999. Andaliman, Rempah Tradisonal Sumatera Utara Dengan Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba. Bul.Teknol.dan Industr Pangan. 10(2).

Wijaya, C. H., Irene, T., dan Anton, A., 2001. Komponen volatil karakterisasi komponen kunci aroma buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium

DC.). J. Teknol. dan Industri Pangan. 12(2).

William, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalsky, J.A., Tingey, S.V., 1990. DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Dalam Harahap, M. K. 2013. Analisis Genetik Tanaman Aren (Arenga pinnata Merr) Di Tapanuli Selatan Dengan Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Tesis Pasca Sarjana USU. Medan.

Zhang, D. & Hartley, T.G. (2008). Zanthoxylum. In: Z. Wu, & P.H. Raven (eds), Flora of China Vol. 11: 53–66. Beijing, Science Press; St Louis, Missouri Botanical Garden Press.

Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisis genetik tanaman. J. Agroteknologi

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan yang dimulai pada bulan Maret 2014 hingga Agustus 2014.

Bahan dan Alat

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun andaliman yang masih muda dari Kabupaten Dairi pada 3 kecamatan yaitu Kecamatan Parbuluan (desa Siarung-arung, Sitohang, dan Sigalingging), Kecamatan Sidikalang (desa Hutarakyat), Kecamatan Sumbul (desa Tigabaru) dan dari Kabupaten Simalungun yaitu Kecamatan Pematang Raya (desa Sigonting dan desa Bintang) sebanyak 30 aksesi. Bahan lain yang digunakan yaitu Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) (Promega H6269),

Polyvinilpolypirolidone (PVPP) (Promega 77627), buffer ekstraksi CTAB (2 g NaCl, 5 g CTAB, 100 ml aquades) , buffer TAE (Tris-acetate-EDTA) (pembuatan buffer dapat dilihat pada Lampiran 1.), buffer TE (Tris-EDTA), 24 ml Kloroform : 1 ml Isoamil-alkohol (KIAA), NaCl, NaOH, Na-EDTA, HCl p.a, alkohol 100 % dan 70 %, Isopropanol dingin, aquadest, β-mercaptoethanol 2 %, agarose LE.

Analytical Grade (Promega, V3121), primer oligonukleotida (Sigma Aldrich),

Go Tag Green Master Mix (Promega, M7122), 100 bp DNA ladder (Promega,

G2101), kertas tissue.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gunting, timbangan digital, hot plate, mortar, centrifuge (Eppendorf 5415), vortex, freezer, tabung

200-1000μl, pinset, sarung tangan karet, tip pipet (warna kristal, kuning dan biru), autoklaf, kamera, penangas air (water Bath, Biosan), oven, pH meter, pengaduk magnetik, alat-alat gelas (baker glass, erlenmeyer, dll), UV-transilluminator (UV Tec Cambridge 20 UV), elektroforesis (Power PAC 3000, Biorad), PCR (Therma Cycler), Gel-Doc (UV Cambridge), power supply, alat tulis.

Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction) yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak, dan data diolah dengan software

PELAKSANAAN PENELITIAN Pengambilan Sampel Daun

Daun andaliman yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah kabupaten Dairi dan sekitarnya. Daun dipilih yang masih muda/lembut berwarna hijau kemerahan, kemudian dicuci bersih, dilap pakai tissue dan kemudian dibawa ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran.

Isolasi dan Pemurnian DNA

Daun andaliman yang berasal dari pohon yang berbeda ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g (Gambar 18., pada Lampiran 3.). Daun dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus dan ditambahkan nitrogen cair sampai tergenang (Gambar 19., pada Lampiran 3.). Daun digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP sebagai antioksidan + 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB (Toruan, et al., 1996), kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10μl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65o C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada

kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4oC selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan `100μl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo, et al., 1994).

Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4 o C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 μl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA 100 μl dapat dilihat di Lampiran 3, Gambar 20. Stok DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± 20o C bila tidak digunakan (Orozco-Castillo, et al., 1994).

Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 5μl stok DNA ditambah 2μl loading dye dan dihomogenkan. Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v). Agarose ditimbang 0,28 g kemudian dilarutkan kedalam 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume

dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan dan bersamaan dengan itu, ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dihomogenkan dengan magnetik stirer, lalu didinginkan dengan cara, tabung dialirkan pada air yang mengalir.

Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis dan diberi larutan TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x (Lampiran 1.) ± 670 ml (hingga terendam). Stok DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2μl dan stok DNA 5μl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Pelaksanaan ini dapat dilihat pada lampiran 4 (Gambar 21, 22, 23). Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.

Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.

Amflifikasi dan genotyping

Amplifikasi mengikuti prosedur baku analisis RAPD, sesuai prosedur William et al., (1990). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 5 primer polimorfik, yaitu OPD-16, OPH-06,OPH-19, OPC-12, dan OPN-03.

Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 μl stok DNA dan ditambah 45μl ddH2O sehingga diperoleh 50 μl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 μl stok primer.

Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan Master dimisalkan 5 sampel yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas : dd H₂O 9.5 μl x 5 = 47.5 μl, Go Tag 12,5 μl x 5 = 62.5 μl, aliquot primer 1 μ x 5 = 5 μl. Dari tube diambil 23 μl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masing masing DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan suhu annealing 36 OC. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystems di desain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali (3 jam 51 menit) berdasarkan yang digunakan peneliti Setiyo (2001). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA 30 aksesi andaliman

Tahapan Proses Suhu 0C Waktu

I (1 siklus) Pre Denaturasi 94 2 menit

II (45 siklus) Denaturasi 94 1 menit

Penempelan 36 1 menit

Elongasi 72 2 menit

III (1 siklus) Post Elongasi 72 10 menit

Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu ± 20o C bila sedang tidak digunakan.

Elektroforesis

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 % (b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60o C) larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras.

Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml (hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel.

Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 65 volt selama 90 menit. Setelah running elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.

Analisis Data

Penentuan Skoring Marka RAPD

Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel dari masing- masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode -1 (ada) dan -0 (tidak ada) (Ferreira dan Grattapaglia, 1994).

Penentuan Ukuran Pasangan Basa

Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA yang digunakan yaitu 1 kb DNA ladder. Dengan menggunakan software UVITEC

Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA hasil amplifikasi dapat terukur seperti pada Gambar 28 dan 29 (Lampiran 6). Ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan dari ladder yang kita gunakan. Program ini akan mengukur pita

yang muncul berdasarkan ukuran ladder dimana data ukurannya harus diinput terlebih dahulu melihat panduan ukuran ladder yang digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk ini dengan pendar cahaya DNA yang terbentuk saat proses elektroforesis dengan sinar UV.

Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1) Principal Coordinates Analyisis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbor-Joining Tree (NJtree) berdasarkan Saitou dan Nei (1978) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Perhitungan

dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2006).

untuk dianalisis selanjutnya menggunakan mesin PCR. Pola yang didapat jelas tetapi tipis tetapi masih memiliki kotoran atau protein-protein lain yang terlihat adanya smear pada bagian bawah pita DNA. Sedangkan pada aksesi yang belum menunjukkan pita DNA pada uji kualitas tersebut selanjutnya diisolasi kembali dan hasil uji kualitasnya dapat dilihat pada Gambar 23. (Lampiran 4.).

Hasil PCR dengan Marka RAPD

Lima primer dari sekuen acak digunakan pada 30 aksesi andaliman dalam suatu reaksi RAPD. Tiga dari lima primer mengamplifikasi DNA pada semua sampel aksesi. Hasil amplifikasi dari dua primer (OPH-19 dan OPD-16) tidak konsisten dalam mengamplifikasi DNA. Pimer OPH-19 menghasilkan produk amplifikasi hanya pada 3 sampel DNA, sedangkan OPD-16 menghasilkan produk amplifikasi hanya pada 8 sampel DNA. Kedua primer ini tidak diikutkan dalam analisis selanjutnya untuk mencegah kesalahan penentuan polimorfisme yang disebaban oleh kegagalan reaksi PCR.

Pada penelitian ini, dari tiga primer (OPH-06, OPC-12 dan OPN-03) menghasilkan produk amplifikasi dan pola pita yang berbeda. Masing-masing primer menghasilkan 7 sampai 14 fragmen DNA. Dari tiga primer tersebut menghasilkan beberapa pola pita dengan ukuran 62,5 – 2443,8 bp (base pair). Ukuran pola pita pada ketiga primer tersebut dapat dilihat pada Tabel 12, 13 dan 14 (Lampiran 8.). Jumlah fragmen DNA dari masing-masing andaliman dan tingkat keinformatifan dari masing-masing primer disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3. Jumlah fragmen DNA dari masing-masing andaliman dan tingkat keinformatifan masing-masing primer RAPD

N o . Jenis Primer RAPD Sequens Primer (5’- 3’) Suhu Anne aling (0C)

Total Pola Pita % Pita Polimorfi k Ukuran Fragmen (bp) Terenda h Tertingg i 1 . OPH-06 ACGCATCGC

A 36 14 100 %

62 2443

2 .

OPC-12 TGTCATCCCC 36 11 100%

126 2069

3 .

OPN-03

GGTACTCCC

C 36 6 85,7%

88 1927

Total 31

Rataan 10,3 95,23% 92 2146

Amplifikasi primer OPH-06 pada 30 aksesi andaliman yang diuji menghasilkan 14 pola pita yang berukuran 62 – 2443 bp. Empat belas pola pita (100%) adalah polimorfik (Gambar 7 dan 8).

Gambar 7. Profil hasil PCR dengan primer OPH-06 pada sampel aksesi andaliman D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11, D12, K1, K2, K3 Ladder 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 500

Analisis Hubungan Genetik Andaliman

Berdasarkan elektroforesis hasil amplifikasi dengan menggunakan 3 primer, diperoleh data biner berupa skoring untuk menentukan kesamaan hubungan genetik antar individu dalam 30 aksesi andaliman. Hasil pengelompokan menggunakan program DARwin 5.05 diperoleh 3 kelompok besar pada 30 aksesi andaliman Sumatera Utara yang tertera pada Gambar 11.

Gambar 11. Pohon filogenetik 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi, Tanah Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching

І

0 0.2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 K1 K2 K3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D13 D14 D15 D16 D17 D18 37 68 34 29 28 28 54 37 3 0 24 1 10 10 28 34 10 63 10 3 6 6 1 0 0 1

ІІ

ІІІ

Gambar 12. Profil radial neighbor-joining 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi, Tanah Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan

Matrix Dissimilarity Simple Matching

0 0.2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 K1 K2 K3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D13 D14 D15 D16 D17 D18 37 68 34 29 28 28 54 37 3 0 24 1 10 10 28 34 10 63 10 3 6 6 1 0 0 1

S4 S6 D13 K3 D18 D16 D17 D6 D9

S5 S7 D12 D15 S2 D8 D11 D1 K2 D5 D2 S3 D7 D4

D10 D3 D14 K1 S8 S1 S9

ІІ

ІІІ

І

Hasil skoring pada setiap fragmen pita DNA yang terbentuk setelah amplifikasi dapat diketahui kekerabatan setiap aksesi andaliman dari 3 kabupaten tersebut. Nilai bootsrap pada 1000 replikasi untuk mengetahui tingkat kekerabatan pengelompokan ditunjukkan pada Gambar 12.

Gambar 13. Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertikal) dengan 3 primer marka RAPD

Factorial analysis: Axes 1 / 2

-.4 -.35 -.3 -.25 -.2 -.15 -.1 -.05 .05 .1 .15 .2 .25 .3 .35 .4 .35 .3 .25 .2 .15 .1 .05 -.05 -.1 -.15 -.2 -.25 -.3 -.35 -.4 -.45 -.5 -.55 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 K1 K2 K3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D13 D14 D15 D16 D17 D18

ІІІ

ІІ

І

Gambar 13. menunjukkan perbedaan faktorial analisis (PCoA) diantara 3 kelompok tercermin dari perbedaan pada hasil aksis 1 dan 2 (Tabel 14.) yang mampu menjelaskan total 31,90% dari keseluruhan keragaman molekuler (Lampiran 9). Dari gambar 13. dapat dilihat bahwa 30 aksesi andaliman tersebut memiliki keragaman molekuler yang tinggi, dimana ke-30 aksesi tersebut menyebat pada keempat kuadran aksis 1 dan 2.

Pita Spesifik

Pada hasil skoring hasil amplifikasi DNA andaliman dengan 3 primer tersebut terdapat pita spesifik, yaitu suatu pita DNA yang hanya dimiliki oleh 1 aksesi andaliman dan tidak dimiliki aksesi yang lain. Pita spesifik tersebut terdapat pada primer OPN-03 pada sampel aksesi andaliman S2 yaitu aksesi yang berasal dari Kabupaten Simalungun, Kecamatan Purba, Desa Purba Hinalang. Pita spesifik tersebut tertera pada Tabel 4. Pada aksesi S2 yang memiliki pita spesifik tersebut merupakan aksesi dengan warna daun bagian bawah adalah hijau yang berada pada ketinggian 1432 m dpl.

Tabel 4. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPN-03

OPN-03

P

it

a

D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 _{D10 D11 D12} K1 K2 K3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 _{D13 D14 D15 D16 D17 D18}

7 0 0 0 0 0 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Keterangan: K= Kabupaten Tanah Karo D= Kabupaten Dairi

S= Kabupaten Simalungun

Selain pita spesifik yang hanya terdapat pada 1 aksesi tersebut, terdapat juga beberapa pita DNA yang hanya dimiliki oleh aksesi andaliman yang yang berasal dari suatu daerah dan tidak dimiliki oleh aksesi andaliman dari daerah

lainnya. Pita spesifik tersebut merupakan hasil amplifikasi dengan primer OPH-06. Tabel 5. menunjukkan adanya pita yang hanya dimiliki oleh aksesi andaliman yang berasal dari kabupaten Dairi, dan tidak dimiliki oleh aksesi yang berasal dari Kabupaten Tanah Karo dan Simalungun. Aksesi andaliman dari Kabupaten Dairi yang memiliki pita spesifik tersebut adalah D15 (Kecamatan Sumbul, Desa Tiga Baru, 1202 mdpl., daun berwarna hijau kemerahan), D16 (Kecamatan Sumbul, Desa Tiga Baru, 1206 mdpl., daun berwarna hijau kemerahan) D17 (Kecamatan Sumbul, Desa Tiga Baru, 1217 mdpl., daun berwarna merah) dan aksesi D18 (Kecamatan Sumbul, Desa Tiga Baru, 1276 mdpl., daun berwarna hijau). Pada Tabel 5. dapat dilihat bahwa aksesi dengan kode K (Kabupaten Tanah Karo) dan aksesi kode S (Kabupaten Simalungun) tidak terdapat pita DNA pada pita ketiga dengan primer OPH-06.

Tabel 5. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPH-06 OPH-06

P

it

a

K1 K2 K3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 _{D13 D14 D15 D16 D17 D18}

1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Keterangan: K= Kabupaten Tanah Karo D= Kabupaten Dairi

S= Kabupaten Simalungun

Pada skoring hasil amplifikasi dengan primer OPH-06 juga terdapat pita spesifik yang hanya dimiliki oleh satu aksesi andaliman pada satu Kabupaten tersebut, yaitu pada pita ke-7. Pada Kabupaten Simalungun terdapat 9 aksesi dan hanya terdapat 1 aksesi yang memiliki pita DNA pada pita ke-7 yaitu aksesi andaliman S4 yaitu aksesi yang berasal dari Kecamatan Purba, Desa Purba Hinalang yang berada pada ketinggian 1408 mdpl. dengan warna daun yaitu

merah. Delapan aksesi lain yang berasal dari Kabupaten Simalungun tidak memiliki pita DNA seperti pada aksesi S4 tersebut. Pita spesifik tersebut dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPH-06 pada kabupaten Simalungun

OPH-06

Pita S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0

2 0 1 0 1 0 1 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 1 0 0 1 1 1 1 1 1

5 0 0 0 1 1 1 1 1 0

6 1 1 1 0 0 0 0 0 1

7 0 0 0 1 0 0 0 0 0

Keterangan: S= Kabupaten Simalungun

Pembahasan

Aksesi andaliman sebanyak 30 dari 3 kabupaten diperoleh kekerabatan dan keragaman genetiknya setelah asam deoksiribunukleat (DNA) dari daun andaliman berhasil diisolasi. Beberapa sampel yang diisolasi berhasil diisolasi dengan metode penggerusan menggunakan buffer CTAB dan menggunakan nitrogen cair saat menggerus daun andalliman dengan tujuan untuk membekukan daun agar lebih mudah digerus dan memecah dinding selnya. Beberapa DNA yang belum berhasil diisolasi digerus kembali dengan beberapa optimasi pemberian nitrogen cair berulang-ulang. Hal ini karena pada setiap daun andaliman memiliki tingkat ketebalan yang berbeda dan beberapa daun memiliki duri pada daun sehingga DNA nya lebih sulit diisolasi. Stok DNA yang didapat diuji kualitasnya dengan elektroforesis menggunakan agarose 0.8%.

Stok DNA yang telah memenuhi syarat yaitu munculnya sebuah pita yang dekat dengan sumur saat elektroforesis uji kualitas diamplifikasi dengan 3 primer yaitu OPH-06, OPC-12 dan OPN-03. Amplifikasi ini menggunakan suhu

annealing yaitu 360 C. Suhu tersebut adalah suhu standar untuk menempelnya primer pada DNA. Hasil pengujian suhu annealing yang dilakukan pada 1 sampel yang sama dan primer yang sama pada beberapa tingkat suhu annealing juga menunjukkan bahwa pada suhu 360 C DNA menempel dengan stabil dan jelas, sedangkan pada suhu 350 C tidak terjadi penempelan, dan pada suhu diatas 360 C sampai 390 C DNA berhasil menempel, namun kurang jelas.

Amplifikasi DNA andaliman dengan menggunakan 3 primer yang polimorfik menghasilkan beberapa pita DNA, dimana pada primer OPH-06 terbentuk 14 pola pita yang yang polimorfik secara keseluruhan. Pada primer

OPC-12 terbentuk 11 pola pita yang polimorfik 100%. Sedangkan pada primer OPN-03 terbentuk pola pita sebanyak , dimana salah satu dari pola pita tersebut adalah monomorfik, sehingga persentase polimorfik primer OPN-03 terhadap 30 sampel andaliman adalah 85,7%.

Pada tanaman aren menurut penelitian Harahap (2013) primer OPH-06 polimorfik sebesar 38,89% untuk aksesi aren, sedangkan pada andaliman polimorfik 100%, pada primer OPC-12 menghasilkan pita polimorfik 27,39% pada aren, sedangkan pada andaliman polimorfik 100%. Pada primer OPN 03 yang polimorfik 85,7% pada andaliman, pada aren primer ini polimorfik 42,13%.

Perbandingan lain untuk primer OPN-03 dan OPH-06 yang digunakan yaitu pada tanaman kedelai penelitian Saragih (2014) menunjukkan bahwa primer OPN-03 membentuk 6 pola pita pada kedelai, sedangkan pada andaliman, primer OPN-03 ini membentuk 7 pola pita. Sedangkan pada primer OPH-06 membentuk 6 pola pita pada tanaman kedelai, sedangkan pada tanaman andaliman membentuk 11 pola pita. Hal ini menunjukkan bahwa setiap primer mampu membentuk pola pita yang berbeda-beda pada setiap tanaman tergantung bahan genetik tanaman tersebut.

Ukuran basa pola pita yang muncul pada setiap primer berbeda-beda. Pada primer OPH-06 ukuran basa pita bersiksar antara 62 – 2443 bp (base pair). Primer OPC-12 memiliki ukuran basa 126 - 2069 bp. Sedangkan pada primer OPN-03 ukuran basa pitanya 88 – 1927 bp. Ukuran pita pada ketiga primer yaitu pada 62 – 2443 bp. Menurut Grattapaglia et al (1992) jumlah pasang basa yang dapat diamplifikasi pada DNA genom tanaman berkisar antara 200-2.000 bp bahkan terkadang mencapai 5.000 bp. Namun pada ketiga primer yang digunakan pada

aksesi andaliman ini terlihat bahwa ukuran bsa pita DNA yang didapat yaitu 62 bp yaitu dibawah 200 bp. Menurut Sumarsono (2000) perbedaan ukuran basa ini disebabkan oleh sebaran lokasi nukleotida di dalam genom yang menjadi tempat pelekatan primer.

Data biner hasil skoring amplifikasi 3 primer yang diolah dengan software

DARwin dihasilkan radial filogenetik yang menunjukkan kekerabatan aksesi andaliman dimana 30 aksesi andaliman yang dikelompokkan menjadi 3

clustering. Kelompok pertama terdiri dari aksesi D15, D12, S7, S5, D9, D6, D17, D16, D18, K3, D13, S6, S4 sedangkan kelompok kedua terdiri dari aksesi S2, D8, D11, D1, K2, D5, D2, S3, D7, D4, D10, D3, D14, K1 dan kelompok ketiga terdiri dari 3 aksesi yaitu S8, S1 dan S9. Hasil clustering ini menunjukkan bahwa keragaman genetik dari andaliman pada 3 kabupaten tersebut adalah tinggi.

Keragaman 30 sampel aksesi andaliman secara molekuler yaitu sebesar 31,90 % yaitu keragaman yang didapat pada axis 1 dan 2, yang dapat dilihat pada Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertikal) dengan 3 primer marka RAPD (Gambar 13.). Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa 30 aksesi andaliman tersebut menyebar pada beberapa daerah pada keempat zona tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa aksesi andaliman tersebut memiliki keragaman genetik yang tinggi, setiap aksesi tidak mengelompok pada satu sisi.

Pengelompokan tersebut menunjukkan bahwa pengelompokan tersebut tidak berdasarkan warna daun andaliman yang beberapa berwarna hijau, hijau kemerahan dan merah. Setiap jenis andaliman yang berbeda berwana daun sama menyebar pada ketiga kelompok tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan

secara morfologi tidak menentukan bahwa perbedaan tersebut dipengaruhi oleh faktor genetik.

Hasil pengelompokan aksesi andaliman berdasarkan marka RAPD tersebut yang menghasilkan 3 kelompok menunjukkan bahwa setiap aksesi dalam suatu kelompok tidak dipengaruhi oleh letak geografis dan ketinggian tempat setiap aksesi. Setiap aksesi dalam kelompok tersebut berada pada ketinggian 978 – 1518 mdpl. Setiap kelompok tidak dipengaruhi oleh ketinggian tempat dilihat dari beragamnya ketinggian tempat setiap aksesi pada suatu kelompok tersebut dan setiap aksesi pada umumnya tumbuh pada ketinggian tempat di atas 1000 mdpl.

Hasil clustering 30 aksesi andaliman, dapat dilihat bahwa pada kelompok ketiga, yang terdiri dari S8, S1 dan S9 merupakan aksesi yang berasal dari 1 kabupaten yaitu kabupaten Simalungun. Pada kelompok ketiga ini tidak terdapat aksesi yang berasal dari kabupaten lain, meskipun aksesi dari kabupaten Simalungun yang lainnya menyebar pada kelompok yang lainnya. Pada cluster

ketiga, terbentuk 2 subcluster. Subcluster pertama yaitu S8 dan S1, dan subcluster

kedua yaitu aksesi S9. Aksesi S8 yang mengelompok dengan aksesi S1 berasal dari desa yang berbeda, namun kecamatan yang sama. Aksesi S9 berasal dari desa yang sama dengan S8 dan memiliki jarak lokasi yang lebih dekat dibandingkan dengan S1. Namun aksesi S8 dan S9 yang memiliki jarak tempat yang sangat dekat tidak mengelompok pada subcluster yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa aksesi S8 dan S9 yang lokasi tumbuhnya sangat dekat memiliki perbedaan genetik yang mungkin disebabkan oleh beberapa faktor seperti asal tetua yang berbeda atau faktor lingkungan yang tidak dapat diketahui dan membutuhkan penelitian lanjut untuk mengetahuinya.

Menurut Sitanggang dan Habeahan (1999) ada tiga jenis andaliman yang terdapat di kawasan danau Toba yaitu: Sihorbo (buah besar, kurang aromatis dan produksi rendah, Simanuk (buah kecil, aroma dan rasa lebih tajam dari Sihorbo, produksi lebih tinggi) dan jenis Sitanga (aroma sangat tajam sehingga mirip bau kepinding alias tanga. Produksi tinggi namun kurang disenangi masyarakat). Ketiga jenis andaliman ini merupakan pengelompokan masyarakat secara morfologi dan pengamatan visual yang tidak terukur. Dari hasil filogenetik andaliman dengan marka RAPD ini juga dapat dilihat bahwa andaliman dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok besar, namun tidak dapat dihubungkan dengan pengelompokan secara morfologi tersebut karena tidak dilakukan pengamatan morfologi secara spesifik untuk setiap sampel aksesi andaliman tersebut.

Menurut Zulfahmi (2013) informasi keragaman genetik tanaman pada tingkat individu, spesies maupun populasi perlu diketahui sebagai dasar pertimbangan dalam menyusun strategi konservasi, pemuliaan, pengelolaan dan pemanfaatan sumber daya genetik tanaman secara berkelanjutan. Dari filogenetik pada 30 aksesi andaliman ini dapat dilihat bahwa andaliman memiliki tingkat keragaman genetik yang tinggi, dimana menurut Hutami, et al.. (2006) Keragaman genetik ini dapat dimanfaatkan untuk merakit varietas unggul baru.

Pita DNA hasil amplifikasi dengan 3 primer pada 30 aksesi andaliman menunjukkan adanya pita-pita DNA yang spesifik, dimana hanya dimiliki oleh 1 aksesi saja, dan tidak dimiliki oleh aksesi lainnya. Pada primer OPN-03 pada aksesi S2 terdapat pita DNA nomor 7, sedangkan pada 29 aksesi lainnya tidak ada. Hal ini menunjukkan bahwa pada aksesi S2 terdapat suatu alel yang berbeda

dengan yang lainnya. Pita spesifik seperti ini perlu diteliti lebih lanjut untuk mengetahui bahan genetik tersebut dan sifat atau fenotipe dari alel tersebut. Selain itu, terdapat juga pita-pita DNA lain pada primer lain yang hanya dimiliki oleh beberapa aksesi pada 1 kabupaten, sedangkan aksesi pada 2 kabupaten lainnya tidak terdapat aksesi yang memiliki pita tersebut. Sedangkan pada primer OPH-06 terdapat beberapa pola pita yang hanya terbentuk pada salah satu aksesi andaliman pada kabupaten Simalungun. Satu dari 9 aksesi tersebut memiliki pita DNA yang tidak dimiliki 8 aksesi lainnya pada kabupaten tersebut.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan

Dari 3 primer yang digunakan dalam mengamplifikasi DNA aksesi andaliman persentase polimorfik primer tersebut adalah 95,23%. Ukuran basa fragmen ketiga primer tersebut adalah 62 – 2443 bp. Untuk 30 aksesi andaliman dari tiga kabupaten tersebut menunjukkan keragaman molekuler yang tinggi, dengan nilai faktorial analisis (PCoA) yaitu 31,90%. Dilihat dari penyebaran aksesi andaliman di 3 kabupaten tersebut, 30 aksesi andaliman tersebut menyebar rata. Dari bootstrap 1000 yang digunakan dalam penentuan filogenetik andaliman tersebut dapat diketahui bahwa 30 aksesi andaliman tersebut membentuk 3 kelompok (cluster) secara genetik dan ke-30 aksesi tersebut memiliki keragaman genetik yang tinggi. Dari ketiga primer yang digunakan dapat terlihat bahwa adanya pita spesifik pada aksesi andaliman S2 yang berasal dari Kabupaten Simalungun, Kecamatan Purba, desa Purba Hinalang pada ketinggian tempat 1423 mdpl.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk keragaman genetik andaliman dengan menggunakan primer yang lebih banyak untuk tingkat keakuratan kekerabatan lebih tinggi.

TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman

Andaliman termasuk tanaman perdu. Hsuang Keng (1978 dalam Wijaya, 1999) menyatakan bahwa sistematika tanaman andaliman adalah sebagai berikut: kingdom: Plantae; divisio: Spermatophyta; subdivisio: Angiospermae; kelas: Dicotyledonae; sub kelas: Rosidae; ordo: Rutales; family: Rutaceae; genus: Zanthoxylum; spesies: Zanthoxylum acanthopodium DC.

Menurut Dianxiang dan Thomas (2008), andaliman merupakan tanaman rempah yang tumbuh di hutan terbuka yang dapat ditemui di Bangladesh, Bhutan, India, Indonesia, Laos, Malaysia, Myanmar, Nepal, Thailand dan Vietnam. Di Indonesia, menurut Wijaya (1999) tanaman andaliman ini hanya terdapat di Sumatera Utara, yaitu di Tapanuli, sekitar danau Toba.

Andaliman merupakan tumbuhan yang termasuk ke dalam famili Rutaceae, tumbuh perdu, dengan tinggi 3 - 8 m, batang dan cabang merah kasar beralur, berbulu halus dan berduri. Daun berukuran kecil, mirip daun bunga mawar. Buah andaliman tumbuh di antara duri-duri dan bertangkai, buah muda berwarna hijau, dan matang berwarna merah, bila dipetik warnanya cepat berubah menjadi hitam. Bentuk buah bulat dan kecil, lebih kecil dari merica, bila digigit mengeluarkan aroma wangi dan rasa tajam yang khas, dan dapat merangsang produksi air liur (Miftakhurohmah dan Sintha, 2009).

Gambar 1. Tanaman andaliman

Pucuk daun andaliman berwarna coklat kemerahan, berduri halus beraroma tajam. Batang dan ranting berduri tajam yang tidak sama besar ukurannya. Bunga yang menjadi buah muncul di ranting, cabang atau batang utama. Buah sebesar biji merica berwarna hijau waktu muda dan berubah menjadi merah bila sudah matang (Simatupang, et al., 2001).

Gambar 2. Daun andaliman yang berduri pada tanaman muda

Biji andaliman berwarna hitam, akan mencuat dari buah tua setelah 10 hari panen pada temperatur kamar. Andaliman yang dikonsumsi adalah buah beserta bijinya. Kebanyakan dijual dalam bentuk segar berwarna hijau yang tercampur buah berwarna merah sekitar 5 – 10 % (Simatupang, et al., 2004). Uniknya bila buah tidak dipanen, ranting atau cabang tempat buah melekat tersebut menjadi kering dan mati, dan bila semua buah tidak dipanen dari satu pohon, pohon stress

lalu mati. Belum diteliti zat apa yang dikeluarkan buah andaliman yang meracuni pohonnya sendiri (Napitupulu, et al., 2004).

Ciri lain famili Rutaceae yang terdapat pada andaliman ialah daun majemuk, bunga majemuk berbatas dalam anak payung, mempunyai perhiasan bunga satu lingkaran, yaitu kelopak yang disusun oleh lima daun kelopak bebas. Lain halnya dengan anggota famili Piperaceae, berdaun tunggal, bunga majemuk tidak terbatas, tersusun dalam bulir (lada), dan tidak memiliki perhiasan bunga (Siregar, 2003).

Tanaman ini tergolong perdu dengan tinggi 3-8 m, batang dan cabang merah kasar, berbulu halus dan berduri. Tumbuhan ini berasal dari daerah Himalaya subtropis. Di Indonesia, tumbuhan ini terdapat di Sumatera Utara dan ditemukan liar di pegunungan pada ketinggian 1400 m dpl, dengan temperatur 15-180 C (Gultom, 2011).

Manfaat dan Kandungan Andaliman

Saat ini andaliman diperhitungkan menjadi senyawa aromatik dan minyak esensial. Masyarakat Himalaya, Tibet dan sekitarnya menggunakan tanaman ini sebagai bahan aromatik, tonik, perangsang napsu makan dan obat sakit perut. Manfaat lain buah andaliman berdasarkan penelitian adalah sebagai insektisida untuk menghambat pertumbuhan serangga Sitophilus zeamais. Efeknya berupa daya tolak makan serangga atau mengurangi selera makan serangga. Sedangkan di Jepang, daun andaliman digunakan untuk pemberi aroma (Tensiska, 2001).

Komponen sitronella dan geraniol dikenal bersifat anti jamur dan antibakteri. Berdasarkan penelitian, buah andaliman mampu menghambat pertumbuhan 9 mikroba yang bersifat patogen dan perusak bahan pangan. Serbuk

buah andaliman mampu menghambat pertumbuhan Eschericia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas fluorescens. (Miftakhurohmah dan Sintha, 2009).

Buah andaliman berpotensi menjadi bahan pengawet alami berkaitan dengan aktivitas antimikroba dan antioksidannya, sehingga dapat menggantikan penggunaan pengawet makanan sintetik yang telah terbukti membahayakan bagi kesehatan konsumen (Miftakhurohmah dan Sintha, 2009).

Andaliman juga mempunyai potensi sebagai insektisida alami dalam mengendalikan hama gudang bahan pangan (Andayanie, 2001 dalam Napitupulu

et al., 2004). Penambahan 10 % ekstrak andaliman pada tepung beras tidak disukai hama gudang Sithopilus zeamais, yang ditunjukkan tidak ada serangga yang meletakkan telur pada tepung beras tersebut. Insektida alami sangat diperlukan bahan pangan karena tidak mengandung racun bagi manusia yang akan mengkonsumsinya.

Analisis minyak atsiri buah andaliman dengan teknik GC-MS menghasilkan 11 komponen, dengan 5 komponen utama adalah alfapinen, limonen, geraniol, sitronelal, dan geranil asetat. Sedangkan dengan teknik kromatografi gas, senyawa yang berhasil diidentifikasi sebanyak 7 komponen, yaitu geranil asetat, sitronelal, geraniol, geranial, mirsen, linalool, dan limonen (Miftakhurohmah dan Sintha, 2009).

Keragaman Genetik

Dalam proses pemuliaan tanaman ada beberapa hal penting yang umum diakukan yaitu: 1) mengenali karakter morfologi dan fisiologi serta respon secara pathologi dari satu spesies tanaman yang penting untuk adaptasi terhadap

lingkungan, hasul dan kualitas tanaman tersebut, 2) merancang teknik yang akan mengevaluasi potensi genetik untuk karakter-karakter tersebut dalam proses penapisan spesies yang diinginkan, 3) untuk mencari sumber-sumber gen untuk karakter yang diinginkan yang bisa digunakan dalam program pemuliaan tanaman dan mengkombinasikan potensi genetik untuk karekter-karekter ini ke dalam

varietas atau kultivar baru (Poehlman, 1983 dalam Robi’ah, 2004).

Penilaian keragaman genetik tanaman secara morfologi dilakukan melalui uji progeni, uji provenan dan pengujian lainnya dengan mengamati penampilan fenotipik tanaman. Pengujian ini dilakukan pada lingkungan yang berbeda dengan fokus utama adalah ciri kualitatif dan kuantitatif yang bernilai ekonomi serta ciri yang secara biologi penting seperti kemampuan hidup (survive), sifat toleran terhadap stres lingkungan, sifat produksi dan resistensi terhadap hama dan penyakit. Sebagian diantara ciri–ciri tersebut bersifat poligenik dan ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan. Studi secara tradisional dengan metode genetika kuantitatif, penilaian keragaman dan distribusi keragaman dikelompokkan ke dalam beberapa kelas pengaruh, seperti pengaruh fenotifik, genotipe, lingkungan dan interaksi antara lingkungan dan genotipe. Penentuan keragaman genetik tanaman secara konvensional ini membutuhkan waktu yang lama, relatif mahal, dipengaruhi oleh lingkungan dan keragaman yang diperoleh terbatas dan tidak konsisten (Zulfahmi, 2013).

Keragaman tingkat genetik merupakan tingkat keragaman yang paling rendah dalam organisasi biologi. Keragaman genetik sangat penting bagi tanaman untuk beradaptasi terhadap perubahan lingkungan yang terjadi disekitarnya. Informasi keragaman genetik tanaman pada tingkat, individu, spesies maupun

populasi perlu diketahui, sebagai dasar pertimbangan dalam menyusun strategi konservasi, pemuliaan, pengelolaan dan pemanfaatan sumberdaya genetik tanaman secara berkelanjutan. Penilaian keragaman genetik tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan penanda morfologi, biokimia dan molekuler DNA (Zulfahmi, 2013).

Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik. Beberapa teknik penanda DNA tersebut adalah Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Harahap, 2013).

Marka RAPD

Sejak ditemukan teknologi PCR oleh Mullis dan Faloona (1987), penanda molekuler DNA berkembang pesat dan diaplikasikan pada berbagai bidang, baik yang menggunakan primer acak yang tidak memerlukan informasi sekuen DNA maupun yang memerlukan informasi sekuen DNA, hal ini karena kecepatan, efisiensi dan kesuksesan dalam mendeteksi berbagai tipe variasi DNA yang tinggi. Teknologi PCR terus disederhanakan dan dikembangkan, sehingga biaya relatif rendah, kecepatan tinggi, membutuhkan contoh uji sangat sedikit, metode ekstraksi dan amplifikasi yang sederhana sehingga membuat penanda berdasarkan PCR dapat diaplikasikan pada semua spesies (Zulfahmi, 2013).

RAPD adalah metode analisis genetik yang menggunakan prinsip kerja mesin PCR dan pertama kali dikembangkan oleh William, Kubedi, Rafalski dan Tingey pada tahun 1990 dengan menggunakan primer tunggal atau sekuen nulkeotida pendek (10-20-mer) yang susunan basanya dibuat secara acak. Tahun 1991, Welsh dan McClelland mengembangkan metode yang sama dan dinamakan AP-PCR (Arbitrary-Primer PCR). Pada tahun yang sama, Caetano-Anolles, Bussam dan Gresshoff juga mengembangkan metode yang sama dengan menggunakan primer yang nukleotidanya jauh lebih pendek, metode ini diberi nama DAF (DNA Amplified Fingerprinting). AP-PCR, DAF maupun RAPD merupakan metode yang prinsipnya sama saja. Metode RAPD ini mampu mendeteksi sekuen nukleotida dengan hanya menggunakan satu primer atau nukleotida yang disusun secara acak (Sumarsono, 2000).

Penanda RAPD bersifat dominan, fragmen DNA yang dihasilkan tidak dapat membedakan individu yang memiliki genotipe homozigot (AA) dengan heterozigot (Aa), sedangkan yang tidak ada pita secara jelas menunjukkan genotipe resesif (aa). Fragmen DNA hasil amplifikasi RAPD diskoring dengan

ketentuan ―1‖ untuk ada pita dan ―0‖ untuk tidak ada pita, data tersebut

kemudian digunakan untuk menghasilkan matrik biner untuk analisis statistik selanjutnya. Keuntungan utama penanda RAPD adalah secara teknik lebih sederhana dan cepat dalam pengujiannya, tidak memerlukan informasi sekuen DNA sehingga penanda ini dapat digunakan secara luas, jumlah sampel DNA yang dibutuhkan sedikit, primer tersedia secara komersial, dan tidak menggunakan senyawa radioaktif (Cheng, et al., 1997)

Produk amplifikasi DNA dari pasangan primer yang sama menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda. Perbedaan ukuran fragmen DNA atau polimorfisme fragmen DNA hasil amplifikasi ini disebabkan oleh sebaran lokasi basa nukleotida di dalam genom yang menjadi tempat pelekatan primer. Dengan demikian RAPD menjadi cara yang efektif untuk memeriksa polimorfisme sekuen DNA setiap individu dan sensitif, karena mampu mendeteksi

perubahan satu basa nukleotida pada tempat penempelan primer (Sumarsono, 2000).

PENDAHULUAN Latar Belakang

Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.), famili Rutaceae, adalah tanaman yang khas dijumpai di Sumatera Utara, Indonesia. Buahnya umum digunakan sebagai bumbu masakan tradisional suku Batak (Siregar, 2003).

Zanthoxylum L. (Rutaceae) terdiri dari 200 spesies dengan distribusi pantropical yang berumah dua (jarang berumah satu atau polygamomonecious) dan tumbuh sebagai tanaman semak, scramblers, pohon atau kayu pemanjat. Tanaman ini juga tersebar pada zona daerah Asia dan Amerika Utara (Hartley, 1966; Zhang and Hartley, 2008). Ada 8 atau 9 spesies dari Zantholyum di Thailand (Esser, pers, comm. 2008; Hartley, pers: comm. 2001). Empat diantaranya yaitu, Z. Acanthopodium DC., Z. Armatum DC., Z. Myriacanthum

Wall. Ex Hook. F. Dan Z. Rhetsa (Roxb.) DC., yang biasanya digunakan sebagai bumbu dan rempah-rempah di negara bagian utara. Perbandingan dari empat spesies ini dilakukan dengan analisis morphometric multivariasi dan studi anatomi (Suksathan, et al, 2009).

Andaliman (Z. acanthopodium) merupakan salah satu jenis rempah. Di Indonesia, tumbuhan rempah yang satu ini hanya tedapat di kabupaten Toba Samosir dan Tapanuli Utara, Sumatera Utara. Bentuknya mirip lada (merica) bulat kecil berwarna hijau, tetapi jika sudah kering, agak kehitaman. Bila digigit tercium aroma minyak atsiri yang wangi dengan rasa khas getir (Posman, 2002).

Andaliman lebih terkenal di negara Cina, Jepang, Korea dan India. Di Cina, masyarakat muslim Sin Jiang menggerus buah andaliman, lada, ketumbar, dan garam, lalu disangrai, dan dijadikan sebagai cocolan daging. Masyarakat

Jepang dan Korea menjadikan buah andaliman sebagai hiasan atau penambah rasa pedas pada sup dan mie. Di India, buah andaliman digunakan sebagai bumbu ikan. Selain dijual di pasar tradisional, seperti pasar Senen Jakarta dengan harga Rp 50.000/kg, buah andaliman juga diekspor ke Amerika Serikat, dengan harga

US$ 14,99/ons atau setara dengan Rp 140.990/ons (Miftakhurohmah dan Sintha, 2009).

Populasi andaliman masih sangat terbatas, kira-kira 1000 – 2000 pohon , dengan produksi 7 – 10 kg per pohon/tahun pada tanaman dewasa. Bibit yang diperoleh petani berasal dari hutan, karena benih andaliman tidak mau berkecambah walau pun kondisi tempat tumbuhnya sudah optimal. Dibudidayakan dengan sistem pekarangan. Rata-rata petani yang menanam andaliman 1 - 5 batang (Napitupulu, et al, 2004).

Untuk mempelajari keanekaragaman genetik pada tanaman dapat dilakukan dengan cara analisis langsung terhadap sifat morfologi-agronomi, melalui penggunaan penanda tertentu baik pada tingkat sitologi maupun molekuler, ataupun melalui analisis kimiawi jaringan tanaman. Penanda adalah karakter yang dapat diturunkan dan berasosiasi dengan genotipe tertentu.Penanda molekuler meliputi penanda isozim dan penanda DNA. Penanda isozim bermanfaat untuk melihat adanya polimorfisme enzim. Sedangkan penanda DNA dapat digunakan untuk menganalisis keanekaragaman genetik dengan lebih baik karena penanda DNA mampu menampakkan polimorfisme pola pita DNA dalam jumlah banyak, konsisten dan tidak dipengaruhi lingkungan (Sumarsono, 2000).

Andaliman merupakan tanaman rempah yang biasanya digunakan sebagai bumbu masakan bagi kalangan suku Batak di Sumatera Utara. Selain manfaatnya

sebagai bumbu dan rempah, menurut Wijaya (1999) andaliman memiliki kandungan minyak atrisi yang tinggi yang dapat dimanfaatkan sebagai antioksidasi dan antimikroba alami. Karena manfaatnya yang banyak, andaliman dari Sumatera Utara biasanya diekspor ke luar negeri dengan harga yang tinggi. Namun, belum terdapat pertanian andaliman yang cukup luas yang dijumpai di Indonesia. Hal ini selain disebabkan oleh tanamannya yang tumbuh liar, menurut Siregar (2003) andaliman juga memiliki daya perkecambahan yang sangat rendah. Untuk mengembangkan tanaman andaliman ini, diperlukan suatu informasi-informasi penting tentang tanaman tersebut, seperti keanekaragaman genetik tanaman andaliman yang dapat dimanfaatkan sebagai langkah awal dalam pemuliaan tanaman.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman genetik andaliman Sumatera Utara berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD).

Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh dengan mengidentifikasi keragaman genetik andaliman tersebut antara lain :

1. Tersedianya informasi mengenai keragaman genetik andaliman di Sumatera Utara.

2. Inventarisasi plasma nutfah andaliman. Informasi ini bermanfaat dalam usaha program pemuliaan melalui perakitan kultivar unggul yang dilakukan secara konvensional maupun modern dengan pendekatan bioteknologi.

ABSTRACT

AYU OSHIN YAP SINAGA: Genetic diversity analysis of andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC.) in North Sumatera population based on RAPD markers. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and LUTHFI AZIZ M. SIREGAR.

The aim of the research was to analyze the genetic diversity of the endemic andaliman in North Sumatera based on RAPD markers.

A total of 30 accessions andaliman originated from the various region in North Sumatera, i.e.: Dairi, Karo Highland, Simalungun. The RAPD analyse was used with 3 random primer: OPH-06, OPC-12 and OPN-03. Theses three primers showed 32 bands, on which 31 were polymorphic (95.23%). Further genetic diversity coefficient and the filogenetic dendogram were obtained using the Darwin 5.05 software. The results showed that 30 accessions of andaliman were clustered in three groups. Each group consisted of the accessions of three regions from different altitudes. There were 30 accessions of three regions studied showed a high genetic diversity.

ABSTRAK

AYU OSHIN YAP SINAGA: Analisis Keragaman Genetik Tanaman Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Di Sumatera Utara Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI sebagai ketua komisi pembimbing dan LUTHFI AZIZ M. SIREGAR sebagai anggota komisi pembimbing.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik andaliman Sumatera Utara berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD).

Sebanyak 30 aksesi andaliman, yang berasal dari berbagai daerah di Sumatera Utara, terdiri dari 3 Kabupaten yaitu Dairi, Tanah Karo dan Simalungun. Analisis RAPD dilakukan dengan menggunakan 3 primer acak: OPH-06, OPC-12 dan OPN-03. Ketiga primer tersebut menghasilkan 32 pola pita DNA, dimana 31 dari pita tersebut adalah polimorfik (95,23%). Selanjutnya koefisien keragaman genetik dan dendogram filogenetik diperoleh menggunakan software Darwin 5.05. Hasil ini menunjukkan bahwa 30 aksesi andaliman tersebut dikelompokkan menjadi tiga kelompok. Dalam setiap kelompok terdapat aksesi andaliman yang berasal dari tiga kabupaten tersebut dan dari ketinggian yang berbeda. Artinya setiap aksesi andaliman tidak mengelompok berdasarkan daerah dan ketinggian tempatnya. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa 30 aksesi dari tiga lokasi menunjukkan keragaman genetik yang tinggi.

Kata Kunci : Andaliman, keragaman genetik, random amplified polymorphic DNA

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) SUMATERA UTARA MENGGUNAKAN MARKA

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

SKRIPSI

Oleh:

AYU OSHIN YAP SINAGA

100301064

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2014

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) SUMATERA UTARA MENGGUNAKAN MARKA

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

SKRIPSI

OLEH:

AYU OSHIN YAP SINAGA 100301064/PEMULIAAN TANAMAN

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk dapat memperoleh gelar sarjana di Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2014

Judul Skripsi :Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium Dc.) Sumatera Utara Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Nama : Ayu Oshin Yap Sinaga

NIM : 100301064

Program Studi : Agroekoteknologi

Minat : Pemuliaan Tanaman

Disetujui oleh, Komisi Pembimbing :

Dr. Ir. Lollie Agustina P. Putri, MSi Luthfi Aziz M. Siregar, SP.,MSc.,PhD Ketua Komisi Pembimbing Anggota Komisi Pembimbing

Mengetahui,

Prof. Ir. T. Sabrina, M.Agr.Sc, Ph.D. Ketua Program Studi Agroekoteknologi

ABSTRACT

AYU OSHIN YAP SINAGA: Genetic diversity analysis of andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC.) in North Sumatera population based on RAPD markers. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and LUTHFI AZIZ M. SIREGAR.

The aim of the research was to analyze the genetic diversity of the endemic andaliman in North Sumatera based on RAPD markers.

A total of 30 accessions andaliman originated from the various region in North Sumatera, i.e.: Dairi, Karo Highland, Simalungun. The RAPD analyse was used with 3 random primer: OPH-06, OPC-12 and OPN-03. Theses three primers showed 32 bands, on which 31 were polymorphic (95.23%). Further genetic diversity coefficient and the filogenetic dendogram were obtained using the Darwin 5.05 software. The results showed that 30 accessions of andaliman were clustered in three groups. Each group consisted of the accessions of three regions from different altitudes. There were 30 accessions of three regions studied showed a high genetic diversity.

ABSTRAK

AYU OSHIN YAP SINAGA: Analisis Keragaman Genetik Tanaman Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Di Sumatera Utara Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI sebagai ketua komisi pembimbing dan LUTHFI AZIZ M. SIREGAR sebagai anggota komisi pembimbing.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik andaliman Sumatera Utara berdasarkan marka Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD).

Sebanyak 30 aksesi andaliman, yang berasal dari berbagai daerah di Sumatera Utara, terdiri dari 3 Kabupaten yaitu Dairi, Tanah Karo dan Simalungun. Analisis RAPD dilakukan dengan menggunakan 3 primer acak: OPH-06, OPC-12 dan OPN-03. Ketiga primer tersebut menghasilkan 32 pola pita DNA, dimana 31 dari pita tersebut adalah polimorfik (95,23%). Selanjutnya koefisien keragaman genetik dan dendogram filogenetik diperoleh menggunakan software Darwin 5.05. Hasil ini menunjukkan bahwa 30 aksesi andaliman tersebut dikelompokkan menjadi tiga kelompok. Dalam setiap kelompok terdapat aksesi andaliman yang berasal dari tiga kabupaten tersebut dan dari ketinggian yang berbeda. Artinya setiap aksesi andaliman tidak mengelompok berdasarkan daerah dan ketinggian tempatnya. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa 30 aksesi dari tiga lokasi menunjukkan keragaman genetik yang tinggi.

Kata Kunci : Andaliman, keragaman genetik, random amplified polymorphic DNA

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Ayu Oshin Yap Sinaga, lahir pada tanggal 08 Agustus 1991 di Sidikalang, Sumatera Utara yang merupakan anak kedua dari lima bersaudara, putri dari Bapak Sabam Yap Sinaga dan Ibu Sorta Tampubolon.

Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Sidikalang dan pada tahun yang sama masuk Fakultas Pertanian USU melalui jalur tertulis Ujian Masuk Bersama Perguruan Tinggi Negeri (UMB-PTN). Penulis memilih Program Studi Agroekoteknologi.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai asisten Laboratorium Morfologi dan Taksonomi Tumbuhan (2012-2014), asisten Laboratorium Anatomi Tumbuhan (2012-2014), asisten Laboratorium Dasar Pemuliaan tanaman (2014) dan asisten Laboratorium Genetika Molekuler (2014). Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi eksternal di Unit Kegiatan Mahasiswa Kebaktian Mahasiswa Kristen Universitas Sumatera Utara (UKM-KMK USU). Penulis adalah anggota Himpunan Mahasiswa Agroekoteknologi (HIMAGROTEK).

Penulis melaksanakan praktek kerja lapang (PKL) di PTPN. IV Kebun Tonduhan dari tanggal 17 Juli sampai 20 Agustus 2013.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-Nya Penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sumatera Utara Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)”.

Pada Kesempatan ini Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua Penulis yang telah berjuang membesarkan, membimbing dan mendukung Penulis selama ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Komisi Pembimbing Dr. Ir. Lollie Agustina P. Putri, MSi., selaku ketua dan Luthfi Aziz. M. Siregar, SP., M.Sc., PhD., selaku anggota yang telah membimbing dan memberikan arahan kepada Penulis mulai dari penetapan judul, melakukan penelitian sampai penulisan skripsi ini.

Disamping itu, Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Tanoto Foundation yang turut membantu Penulis dalam hal materi, kepada Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran serta staf dan laboran yang telah membantu Penulis dalam penelitian, serta kepada para staf pengajar dan pegawai di Program Studi Agroekoteknologi dan teman-teman yang tidak dapat disebutkan namanya satu per satu yang telah banyak membantu Penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih. Semoga skripsi ini dapat menjadi bahan informasi yang bermanfaat bagi pihak yang membutuhkan.

Medan, Oktober 2014

DAFTAR ISI

Hal.

ABSTRACT ... i

ABSTRAK ... ii

RIWAYAT HIDUP ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... vii

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN ... ix

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 3

Manfaat Penelitian ... 3

TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman ... 4

Manfaat dan Kandungan Andaliman ... 6

Keragaman Genetik ... 7

Marka RAPD ... 9

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ... 11

Bahan dan Alat ... 11

Metode Penelitian ... 13

PELAKSANAAN PENELITIAN Pengambilan Sampel Daun ... 14

Isolasi Pemurnian DNA ... 14

Uji Kualitas DNA ... 15

Uji Kuantitas DNA ... 16

Amplifikasi dan Genotiping ... 17

Elektroforesis ... 18

Analisis Data... 19

Penentuan Skoring Marka RAPD ... 19

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ... 21

Data geografis dan morfologi andaliman ... 21

Uji Kualitas DNA ... 25

Hasil PCR dengan Marka RAPD ... 26

Analisis Hubungan Genetik Andaliman... 29

Pita Spesifik ... 32

Pembahasan ... 35

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan ... 41

Saran ... 41

DAFTAR PUSTAKA ... 42

LAMPIRAN ... 46

DAFTAR TABEL

No. Hal.

1. Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA 30 aksesi

andaliman ...18

2. Data sampel 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten ...22

3. Jumlah fragmen DNA dari masing-masing andaliman dan tingkat keinformatifan masing-masing primer RAPD ... 26

4. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPN-03 ...32

5. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPH-06 ...33

6. Pita spesifik hasil skoring amplifikasi dengan primer OPH-06 pada kabupaten Simalungun ... 34

7. Hasil skoring dengan primer OPH-06 ... 56

8. Hasil skoring dengan primer OPN-03 ... 57

9. Hasil skoring dengan primer OPC-12 ... 58

10. Ukuran pola pita dengan primer OPH-06 ... 59

11. Ukuran pola pita dengan primer OPN-03 ... 60

12. Ukuran pola pita dengan primer OPC-12 ... 61

13. Faktorial analisis (PCoA) ... 62

14. Nilai Factorial coordinates ... 62

15. Jarak genetik setiap aksesi ... 63

DAFTAR GAMBAR

No. Hal.

1. Tanaman andaliman ... 5

2. Daun andaliman yang berduri pada tanaman muda ... 5

3. Bagian bawah daun andaliman yang berwarna hijau... 21

4. Bagian bawah daun andaliman yang berwarna hijau kemerahan ... 21

5. Bagian bawah daun andaliman yang berwarna merah...21

6. Profil kualitas DNA genom andaliman dengan gel agarose 0,8% ...25

7. Profil hasil PCR dengan primer OPH-06 pada sampel aksesi andaliman D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11, D12, K1, K2, K3 ...27

8. Profil hasil PCR dengan primer OPH-06 sampel aksesi andaliman S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, D13, D14, D15, D16, D17, D18 ...27

9. Profil hasil PCR dengan primer OPC-12 sampel aksesi andaliman D1, D2, D3, D4, D5, D7, D8, D11, K1, K2, K3, S1, S2, S3, S4 ...28

10. Profil hasil PCR dengan primer OPN-03 sampel aksesi andaliman D1, D2, D3, D4, D5, D7, D8, D9, D10, D11, K1, K2, K3, S1, S2 ...28

11. Pohon filogenetik 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi, Tanah Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching ...29

12. Profil radial neighbor-joining 30 aksesi andaliman dari 3 kabupaten (Dairi, Tanah Karo dan Simalungun) yang dianalisis berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching ... 30

13. Faktorial analisis (Principal Coordinate Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertikal) dengan 3 primer marka RAPD ... 31

14. Tanaman andaliman berumur 4 tahun ... 46

15. Tanaman andaliman berumur 3 tahun ... 46

16. Tanaman andaliman berumur 2 tahun ... 47

17. Tanaman andaliman berumur 1 tahun ... 47

18. Daun muda andaliman (0,3 gram) yang akan digerus ... 48

19. Penggunaan nitrogen cair dalam penggerusan daun andaliman ... 48

20. Stok DNA andaliman sebanyak 100 μl ... 48

21. Pencampuran stok DNA + loading dye ... 49

22. Pemasukan stok DNA pada sumur agar ... 49

23. Agarose yang telah siap untuk dielektroforesis ... 49

24. Hasil elektroforesis uji kualitas pada agarose 0,8% ... 50

25. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPC-12 dan primer OPH-06 ... 51

26. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPC-12 ... 51

27. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPH-06 ... 52

28. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPN-03 ... 52

29. Ukuran pasangan basa (base pairs) pada primer OPN-03 ... 53

DAFTAR LAMPIRAN

No. Hal.

1. Deskripsi pembuatan larutan stok ... 46

2. Gambar sampel aksesi andaliman ... 48

3. Foto isolasi DNA ... 50

4. Foto uji kualitas ... 51

5. Foto hasil amplifikasi DNA andaliman ... 53

6. Profil penentuan ukuran pasangan basa DNA (base pairs) dengan software UVITEC Cambridge FireReader ...55

7. Hasil skoring 3 primer pada 30 sampel andaliman ... 56

8. Tabel ukuran pola pita 3 primer (base pairs) ... 59

9. Faktorial koordinat ... 62

10. Jarak genetik 1000 bootstrap ... 63