tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan
ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih
sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4
o
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100 dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4
C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung
ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan `100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan
buffer TE Orozco-Castillo dkk., 1994.
o
C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000
rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA
yang diperoleh disimpan pada suhu ± 20 C bila tidak digunakan
Orozco-Castillo dkk., 1994.
2. Menggunakan Pasir Kuarsa Isolasi dan Pemurnian DNA
Daun aren yang berasal dari 5 pohon yang berbeda dari Ranto dan Porsea ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun dipotong halus dengan gunting secara
Universitas Sumatera Utara
melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus. Potongan daun yang ada dalam mortar ditambah pasir kuarsa 50 mg. Daun digerus sampai
halus searah jarum jam. Ke dalam mortal ditambah 0,1 g PVPP dan 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Daun
dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µl
β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan nomor pohon yang digunakan. Tabung tersebut
diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65
o
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan
ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih
sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4 C selama 30 menit, setiap 10 menit
tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga
homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
o
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100 dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4
C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung
ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan
buffer TE Orozco-Castillo dkk., 1994.
o
C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000
Universitas Sumatera Utara
rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang
diperoleh disimpan pada suhu ± 20 C bila tidak digunakan
Orozco-Castillo dkk., 1994.
3. Menggunakan N2 Cair Isolasi dan Pemurnian DNA
