Profil Flavonoid, Tanin, dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum)

PROFIL FLAVONOID, TANIN, DAN ALKALOID DARI
EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum)

SUHERMANTO

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Profil Flavonoid, Tanin,
dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini. Skripsi ini telah didanai oleh Yayasan Amanah IPB 2013 dan
BPOPTN NO 231/IT3.41.2/SPK/2013.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Suhermanto
NIM G84090058

ABSTRAK
SUHERMANTO. Profil Flavonoid, Tanin, dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih
Merah (Piper crocatum). Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SYAMSUL
FALAH.
Sirih merah merupakan tanaman obat Indonesia yang telah terbukti
memiliki aktivitas antihiperglikemik, antioksidan, dan antikanker. Oleh sebab itu,
tujuan dari penelitian ini adalah menentukan kadar total dan menganalisis
flavonoid, tanin, dan alkaloid dalam ekstrak air dan etanol 30 % daun sirih merah
(Piper crocatum). Profil flavonoid, tanin dan alkaloid ditentukan dengan teknik
spektofotometri, titrimetri, dan gravimetri, serta LC-MS. Identifikasi fitokimia
telah membuktikan bahwa ekstrak air dan etanol 30 % mengandung flavonoid,
tanin, dan alkaloid. Pengukuran flavonoid secara kuantitatif yang tertinggi
terdapat pada ekstrak etanol 30 % yaitu 6.09 ± 0.26 mg QE/g. Kuantitatif tanin
dan alkaloid tertinggi terdapat pada ekstrak air dengan nilai 3.97 ± 0.08 mg/g dan

543.75 ± 3.17 mg/g. Analisis LC-MS, senyawa flavonoid diduga banyak terdapat
dalam ekstrak air. Senyawa tanin dan alkaloid diduga banyak terdapat dalam
esktrak etanol 30 %.
Kata kunci: alkaloid, flavonoid, Piper crocatum, tanin.

ABSTRACT
SUHERMANTO. Flavonoid, Tannin, and Alkaloid Profiles of Piper crocatum
leave Extract. Supervised by MEGA SAFITHRI and SYAMSUL FALAH.
Piper crocatum is Indonesia’s medicinal plant that has been proven to
have anti-hyperglycemic, antioxidative, and anticancer activities. Hence, the aim
of this study was to determine and analyze flavonoid, tannin, and alkaloid profiles
of 30 % ethanol and water extracts of Piper crocatum leaves. Flavonoid, tannin,
and alkaloid profiles were measured using spectrophotometry, titrimetry,
gravimetry and LC-MS techniques. Phytochemical identification proved that both
of extracts contain flanovoids, tannins, and alkaloids. Measurement of flavonoids
quantitatively showed that the highest value was found in ethanol 30 % extract,
6.09 ± 0.26 mg QE/g. The highest quantitative tannin and alkaloid present in the
water extract with a value of 3.97 ± 0.08 mg/g and 543.75 ± 3.17 mg/g. LC-MS
analyze, the highest flavonoid compounds expected in water extract. The highest
tannin and alkaloid compounds were expected in ethanol 30 % extract.

Keywords: alkaloids, flavonoids, Piper crocatum, tannins.

PROFIL FLAVONOID, TANIN, DAN ALKALOID DARI
EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum)

SUHERMANTO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul Skripsi : Profil Flavonoid, Tanin, dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih

Merah (Piper crocatum)
Nama
: Suhermanto
NIM
: G84090058

Disetujui oleh

Dr Mega Safithri, S.Si, M.Si
Pembimbing I

Dr Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT
atas segala karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada Nabi
Muhammad SAW dan para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian ini berjudul “Profil Flavonoid,
Tanin, dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum)”. Kegiatan
penelitian ini dilakukan dari bulan April hingga September 2013, bertempat di
Laboratorium Biokimia IPB dan Laboratorium Kimia Fisik IPB, Laboratorium
Pusat Studi Biofarmaka (PSB) IPB serta Laboratorium Balai Pengkajian
Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Mega Safithri, S.Si, M.Si dan
Bapak Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Mbak Salinah dan Mas Endi beserta staf Pusat Studi
Biofarmaka, serta staf Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan
Penerapan Teknologi, yang telah membantu selama proses anlisis data. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada Bapak, Ibu (alm), Mimi, Supriwan,
Surachman, Suhermim, sahabat Diah Ayu Lestari, Irma Handasari, Dhian, Yayuk,
Nasrudin serta seluruh teman-teman Biokimia 46, atas segala doa dan kasih

sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Suhermanto

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur Percobaan

2

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil

Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN

6
6
10
16

Simpulan

16

Saran

16

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

20

RIWAYAT HIDUP

32

DAFTAR TABEL
1 Komponen fitokimia ekstrak daun sirih merah
2 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan flavonoid
ekstrak daun sirih merah hasil pengujian LC-MS
3 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan tanin
ekstrak daun sirih merah hasil pengujian LC-MS
4 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan alkaloid
ekstrak daun sirih merah hasil pengujian LC-MS

7
9
10

10

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5

Hasil rendemen ekstrak daun sirih merah
Hasil kadar total fenolik ekstrak daun sirih merah
Hasil kadar total flavonoid ekstrak daun sirih merah
Hasil kadar total tanin ekstrak daun sirih merah
Hasil kadar total alkaloid ekstrak daun sirih merah

6
7
8
8
9

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Bagan alir penelitian
Kadar air daun sirih merah
Contoh perhitungan rendemen ekstrak daun sirih merah
Hasil uji fitokimia
Kurva standar asam galat
Kandungan total fenolik ekstrak daun sirih merah
Kurva standar kuersetin
Kandungan total flavonoid ekstrak daun sirih merah
Kandungan total tanin ekstrak daun sirih merah
Kandungan total alkaloid ekstrak daun sirih merah
Kromatogram LC-MS golongan flavonoid ekstrak air daun sirih merah
Spektrum LC-MS golongan flavonoid ekstrak air daun sirih merah
Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan flavonoid ekstrak air
daun sirih merah
Kromatogram LC-MS golongan flavonoid ekstrak etanol 30 % daun
sirih merah
Spektrum LC-MS golongan flavonoid ekstrak etanol 30 % daun sirih
merah
Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan flavonoid ekstrak etanol
30 % daun sirih merah
Kromatogram LC-MS golongan tanin ekstrak air daun sirih merah
Spektrum LC-MS golongan tanin ekstrak air daun sirih merah
Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan tanin ekstrak air daun
sirih merah
Kromatogram LC-MS golongan tanin ekstrak etanol 30 % daun sirih
merah

20
21
21
21
22
23
23
24
25
25
26
26
26
27
27
27
28
28
28
29

21 Spektrum LC-MS golongan tanin ekstrak etanol 30 % daun sirih merah
22 Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan tanin ekstrak etanol
30 % daun sirih merah
23 Kromatogram LC-MS golongan alkaloid ekstrak air daun sirih merah
24 Spektrum LC-MS golongan alkaloid ekstrak air daun sirih merah
25 Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan alkaloid ekstrak air
daun sirih merah
26 Kromatogram LC-MS golongan alkaloid ekstrak etanol 30 % daun sirih
merah
27 Spektrum LC-MS golongan alakloid ekstrak etanol 30 % daun sirih
merah
28 Hasil analisis elemen puncak LC-MS golongan alkaloid ekstrak etanol
30 % daun sirih merah

29
29
30
30
30
31
31
31

PENDAHULUAN
Negara Indonesia kaya akan berbagai macam tumbuhan dengan jumlahnya
yang mencapai 30.000 jenis (Rahmawati et al. 2012). Dari sekian banyak jumlah
tumbuhan yang ada, sekitar 7.500 diantaranya adalah tanaman obat. Jumlah
tersebut didukung dengan masyarakat Indonesia yang gemar mengonsumsi obat
dari tanaman herbal (Deptan 2012). Salah satu tanaman obat yang ada di
Indonesia adalah tanaman sirih merah (Piper crocatum). Daun sirih merah secara
empiris memiliki banyak fungsi, diantaranya untuk mengobati diabetes melitus,
asam urat, hipertensi, kanker payudara, peradangan (liver dan prostat), hepatitis,
kadar kolesterol, mencegah stroke, dan lain-lain (Werdhany et al. 2008).
Fungsi tanaman sirih merah ternyata tidak hanya sebatas data empiris. Data
ilmiah telah membuktikan bahwa daun sirih merah diantaranya memiliki fungsi
empiris tersebut. Safithri dan Fahma (2008) adalah peneliti yang telah
membuktikan bahwa air rebusan daun sirih merah memiliki fungsi
antihiperglikemik yaitu dapat menurunkan kadar glukosa darah tikus sebesar 38%.
Selain dengan air rebusan daun sirih merah, ekstrak etanol 70% dari daun sirih
merah memiliki aktivitas antidiabetogenik melalui aktivitas antioksidasi (Alfarabi
et al. 2010). Adapun fungsi lainnya yang telah dibuktikan melalui riset ilmiah
diantaranya antikanker payudara (Wicaksono et al. 2009), aktivator enzim glukosa
oksidase (Agustianti 2008), dan antiinflamasi (Fitriyani 2011).
Berbagai macam fungsi yang dimiliki oleh daun sirih merah disebabkan
oleh metabolit sekunder yang terkandung didalamnya. Hasil penelitian yang
dilakukan oleh Safithri dan Fahma (2005) serta Salim (2006) menunjukkan bahwa
rebusan air dari daun sirih merah mengandung alkaloid, flavonoid dan tannin.
Menurut Marlina (2008) ekstrak etanol 30 % dan rebusan air daun sirih merah
mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tanin. Kandungan flavonoid, tanin,
dan alkaloid merupakan kandungan terbesar dari metabolit sekunder daun sirih
merah. Data penelitian menyebutkan bahwa daun sirih merah selalu memiliki
kandungan flavonoid, tanin dan alkaloid (Salim 2006; Marlina 2008; Agustianti
2008; Fitriyani 2011). Kandungan tersebut juga membuat daun sirih merah
memiliki fungsi yang penting sebagai tanaman obat herbal dan menjadikannya
terkenal dalam khasanah obat herbal.
Senyawa flavonoid, akaloid, dan tanin yang terdapat dalam daun sirih
merah belum diketahui jenis golongannya dan hanya sebatas data fitokimia belum
berdasarkan jumlah totalnya. Ada kemungkinan bahwa jika diekstraksi dengan
dua pelarut yang berbeda yaitu air dan etanol 30 %, kemungkinan besar
kandungan yang dimiliki keduanya berbeda. Kandungan metabolit sekunder
terbanyak bisa jadi terdapat pada etanol 30 % atau bahkan sebaliknya. Oleh sebab
itu perlu dilakukan pengkajian dan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kadar
total senyawa flavonoid, alkaloid, dan tanin pada daun sirih merah (Piper
crocatum).
Dengan demikian tujuan penelitian ini adalah menentukan kadar total serta
menganalisis senyawa flavonoid, tanin, dan alkaloid yang terdapat dalam ekstrak
air dan etanol 30 % daun sirih merah (Piper crocatum). Adapun manfaat dari
penelitian ini yaitu dapat memberikan informasi ilmiah mengenai jumlah kadar
total senyawa flavonoid, tanin, dan alkaloid. Manfaat lainnya bahwa dapat

2
menambah informasi ilmiah baru dalam beberapa jenis senyawa metabolit
sekunder pada flavonoid, tanin dan alkaloid.

METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun sirih merah (Piper crocatum) asal
Bogor, air, akuades, etanol 30 %, standar asam galat, standar kuersetin, larutan
KMnO4 0.1 N, reagen Folin-Ciocalteau, AlCl3, Na2CO3, NaOH 1 M, indigokarmin,
natrium sulfat anhidrat, amil alkohol, magnesium, potasium asetat, H2SO4, HCl,
NH4OH pekat, NH4OH 1 %, asam asetat, aseton, asam askorbat, etil asetat, dietil
eter, n-heksan, kloroform, metanol, n-butanol, asetonitril, 0.1 % asam format,
FeCl3, pereaksi Dragendrof, Mayer, dan Wagner.
Alat
Peralatan yang digunakan adalah alat refluks, kapas, alat freeze dry, rotary
evaporator, sentrifuse, spektrofotometer UV-VIS, corong pisah, alat-alat gelas,
alat titrasi, waterbath, kertas saring, timbangan, oven, dan alat LC-MS (UPLCQToF-MS/MS System (Waters) dengan kolom yang digunakan yaitu Acquity
UPLC BEH C18 1.7 µm, 2.1x50 mm. Biotek, BPPT Serpong, Tangerang).
Prosedur Percobaan
Pengeringan Bahan Uji
Daun sirih merah yang akan diteliti dikumpulkan. Setelah itu dilakukan
pencucian dengan air yang mengalir dan ditiriskan. Selanjutnya tanaman dirajang
dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50 °C selama 5 hari. Daun sirih merah
yang sudah kering dilakukan penggilingan untuk mendapatkan serbuk dengan
ukuran 60 mesh.
Penentuan Kadar Air
Penentuan kadar air simplisia daun sirih merah menggunakan metode SNI
01-2891-1992 yang termodifikasi. Cawan porselin dikeringkan dalam oven 105
°C selama 3 jam, kemudian ditempatkan dalam desikator selama 1 jam. Setelah
itu ditimbang dengan neraca sartorius (a). Lalu ke dalam cawan ditambahkan
sebanyak 2.0-2.5 g sampel (b). Cawan yang berisi sampel ditempatkan dalam
oven 105 °C selama 3 jam. Setelah itu ditempatkan dalam desikator selama 1 jam.
Bobot cawan dan sampel ditimbang (c). Pengeringan dilakukan beberapa kali
sampai bobot sampel yang diperoleh konstan. Analisis dilakukan 3 kali ulangan
untuk masing-masing sampel.
c-a
% Bobot kering (BK) = x 100%
b
% Kadar air = 100 - % BK

3
Pembuatan Ekstrak Etanol 30% Daun Sirih Merah
Ekstraksi daun sirih merah menggunakan metode Depkes (2000) yang
dimodifikasi. Serbuk kering daun sirih merah diekstraksi dengan metode refluks.
Serbuk kering daun sirih merah sebanyak 100 g diekstraksi dengan 1 L etanol
30% selama 2 jam pada suhu 70 °C menggunakan alat refluks. Ekstrak yang
diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali.
Hasil ekstrak dilakukan freeze dry sehingga diperoleh ekstrak kasar daun sirih
merah.
Pembuatan Ekstrak Air Daun Sirih Merah
Ekstraksi daun sirih merah menggunakan metode Depkes (2000) yang
dimodifikasi. Serbuk kering daun sirih merah diekstraksi dengan metode refluks.
Serbuk kering daun sirih merah sebanyak 100 g diekstraksi dengan 1 L air selama
2 jam pada suhu 100 °C menggunakan alat refluks. Ekstrak yang diperoleh
kemudian disaring dengan kertas saring. Ekstraksi diulang tiga kali. Hasil ekstrak
dilakukan freeze dry sehingga diperoleh ekstrak kasar daun sirih merah.
Analisis Fitokimia
Uji flavonoid (Harbone 1987). Sebanyak 0.1 g ekstrak daun sirih merah
dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 mL air panas dan
didihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk
pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g
serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol kemudian dikocok dengan
kuat. Positif flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah, kuning, atau
jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji tanin (Harbone 2007). Sebanyak 1.0 g ekstrak daun sirih merah
ditambahkan air kemudian didihkan selama beberapa menit. Setelah itu larutan
ditambahkan FeCl3. Terbentuknya warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan
adanya tanin.
Uji alkaloid (Harbone 2007). Sebanyak 0.5 g ekstrak daun sirih merah
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 mL kloroform dan
beberapa tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan
H2SO4. Fraksi H2SO4 diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Mayer,
dan Wagner. Terdapatnya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih
pada pereaksi Mayer, endapan merah pada pereaksi Dragendrof, dan endapan
cokelat pada pereaksi Wagner.
Penentuan Kadar Total Fenolik Ekstrak Daun Sirih Merah
Kadar total fenolik ditentukan dengan metode Javanmardi et al. (2003)
dengan Folin-Ciocalteau sebagai reagennya. Sebanyak 0.2 ml ekstrak daun sirih
merah (tiga kali ulangan) dengan konsentrasi 2500 mg/L, 2.5 ml reagen FolinCiocalteau 10%, dan 2 ml Na2CO3 7.5% dicampurkan dan diinkubasi selama 15
menit pada suhu 45 oC. Absorban larutan diukur menggunakan spektofotometer
pada panjang gelombang 765 nm. Total fenolik ekstrak daun sirih merah
diekspresikan sebagai miligram (mg) asam galat ekuivalen per gram bobot ekstrak
kering (mg GAE/g ekstrak daun sirih merah). Sebagai standar digunakan asam
galat pada berbagai konsentrasi (0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L).

4

Penentuan Kadar Total Flavonoid
Metode Chang et al. (2002) digunakan untuk penentuan kadar flavonoid.
Sebanyak 0.5 ml ekstrak daun sirih merah (tiga kali ulangan) dengan konsentrasi
50000 mg/L, ditambahkan 1.5 mL metanol, setelah itu dimasukkan 0.1 AlCl3 10%,
kemudian potasium asetat 1 M, dan terakhir tambahkan akuades 2.8 mL.
Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 30 menit, diukur pada panjang gelombang
415 nm. Total flavonoid ekstrak daun sirih merah diekspresikan sebagai miligram
(mg) kuersetin per gram bobot ekstrak kering (mg QE/g ekstrak daun sirih merah).
Sebagai standar digunakan kuersetin pada berbagai konsentrasi (0, 50, 100, 150,
200, 250, 300 mg/L).
Penentuan Kadar Total Tanin
Penentuan kadar total tanin menggunakan metode Depkes (1979). Ekstrak
sebanyak 0.2 g dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 250 mL yang sudah
ditambahkan dengan air mendidih 5 mL. Setelah itu dipanaskan selama 30 menit
di atas penangas air. Selanjutnya didiamkan selama beberapa menit dan dituang
ke dalam labu takar 25 mL dengan menggunakan segumpal kapas sebagai
penyaring. Residu yang tertinggal ditambahkan dengan air mendidih yang
kemudian disaring lagi dengan kapas sampai esktrak tanin habis. Setelah selesai,
cairan didinginkan dan ditambahkan dengan air sampai tanda tera. Pipet sebanyak
2.5 mL larutan ke dalam labu takar 100 mL, kemudian ditambahkan dengan 2.5
mL indigokarmin sulfonat LP dan air sampai tanda tera. Tahap akhir, titrasi
dengan KMnO4 0.1 N hingga larutan berwarna kuning emas. Larutan blanko
dibuat dengan prosedur yang sama tanpa sampel. Sebanyak 1 mL KMnO4 0.1 N
setara dengan 0.004157 g tanin.
0.004157

VKMnO4sampel - VKMnO4blanko X 1 mL
Kadar tanin (%) =
bobot sampel awal

X 100 %

Penentuan Kadar Total Alkaloid
Penentuan kadar total alkaloid menggunakan metode Harbone (1987) yang
dimodifikasi. Ekstrak kasar 6 g diasamkan dengan asam sulfat 2 M sampai pH 3.
Setelah mencapai pH 3, diekstraksi dengan kloroform sebanyak 3 kali sampai
lapisan kloroform menjadi tidak berwarna atau bening. Fase air-asam dibasakan
dengan amonium hidroksida sampai pH 9 lalu diekstraksi dengan kloroformmetanol (3:1) sebanyak 2 kali. Tahap ini telah didapatkan residu kasar alkaloid
total. Selanjutnya dipisahkan antara ekstrak kloroform-metanol dan ekstrak airbasa. Masing-masing diuji kualitatif terhadap alkaloid sebelum dikeringkan.
Ekstrak kloroform-metanol dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat
kemudian dipekatkan dan setelah itu ekstrak ditimbang bobotnya (Y). Ekstrak airbasa diuapkan lalu diekstraksi dengan metanol dan diuapkan kembali. Setelah itu
dipekatkan dan ditimbang (z). Jumlah alkaloid total yang terkandung di dalam
daun sirih merah adalah:
Kadar total alkaloid (%) =

Y+Z
X

X 100 %

5
Keterangan:
X
= bobot simplisia yang diekstraksi.
Y
= bobot klorom : metanol.
Z
= bobot air : basa.
Fraksinasi Flavonoid
Ekstrak pekat etanol 30 % dan juga air dilarutkan dalam air, diaduk terus
sampai encer dan homogen, kemudian dimasukkan dalam corong pisah yang
berbeda (ekstrak air dan etanol 30 %). Setelah itu difraksinasi berturut-turut secara
ekstraksi cair-cair dengan pelarut n-heksan, kloroform, dietileter, etilasetat, dan nbutanol. Langkah awal difraksinasi dengan pelarut n-heksan sebanyak 40 mL,
diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dipisahkan, kemudian
fraksi air difraksinasi dengan kloroform sebanyak 40 mL, diperoleh fraksi
kloroform dan fraksi air. Fraksi kloroform dipisahkan, kemudian fraksi air
difraksinasi dengan dietil eter, diperoleh fraksi dietil eter dan air. Fraksi air
selanjutnya difraksinasi dengan etil asetat, diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air.
Fraksi etil asetat dipisahkan, dan fraksi air ditambahkan dengan n-butanol. Fraksi
terakhir dipekatkan. Fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali dengan menggunakan
40 mL pelarut untuk sekali fraksinasi (Modifikasi Budzianowski et al. 1985 dalam
Heryani 2002).
Fraksinasi Tanin
Fraksinasi tanin menggunakan metode Makkar (1985). Ekstrak pekat
etanol 30 % dan air dilarutkan dalam air panas pada dua tempat yang berbeda,
diaduk sampai homogen kemudian disaring dan dimasukkan dalam corong pisah
yang berbeda. Selanjutnya, diekstraksi dengan n-heksana, fraksi n-heksana
dipisahkan. Fraksi air diekstraksi dengan aseton:air (70:30) dengan asam askorbat
0.1 %. Fraksi air:aseton dipisahkan dan fraksi air dicuci dengan kloroform, cucian
dibuang. Fraksi air diekstrasi lagi dengan etil asetat, diperoleh fraksi etil asetat
dan fraksi air. Fraksi etil asetat dipisahkan dan hasil akhir yaitu fraksi air
dipekatkan dan didapatkan ekstrak tanin. Fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali
dengan menggunakan 40 mL pelarut untuk sekali fraksinasi.
Fraksinasi Alkaloid
Fraksinasi alkaloid menggunakan metode Martono (1983). Ekstrak etanol
30 % dan air direndam dengan asam asetat 10 % dalam etanol (minimal 4 jam).
Hasil rendaman disaring dan filtrat dipekatkan sampai ¼ volume awal. Setelah itu
ditambahkan NH4OH pekat tetes demi tetes sampai terbentuk endapan. Endapan
dipisahkan dengan sentrifuse. Hasilnya dicuci dengan NH4OH 1 %. Endapan
dilarutkan dalam kloroform + HCL 10 % (kocok kuat). Hasilnya akan terbentuk
dua fase, yaitu fase air dan kloroform. Fase kloroform ditambahkan dengan
NH4OH 10 % sampai alkalis yang kemudian ditambahkan dengan kloroform.
Fase air di buang dan fase kloroform dipekatkan.
Analisis Flavonoid, Tanin, dan Alkaloid
Analisis flavonoid, tanin dan alkaloid menggunakan Liquid
Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS). Prinsipnya yaitu setelah sampel

6
dipisahkan melalui HPLC atau UPLC, sampel akan masuk kedalam detektor
massa. Selanjutnya sampel tersebut diubah menjadi fase gas, kemudian ion
tersebut akan terionisasi dalam kondisi vakum. Ion-ion tersebut diakselerasi oleh
medan elektrik atau magnetik, yang terukur sebagai rasio massa terhadap muatan
(m/z), dan akan terdeteksi berdasarkan kelimpahan masing-masing ion (Rouessac
dan Rouessac 2007). Hasil fraksinasi diinjeksikan ke dalam alat LC-MS.
Spesifikasi LC-MS yang digunakan adalah sebagai berikut. Alat UPLC-QToFMS/MS System (Waters). Kolom Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm, 2.1x50 mm.
Fase gerak yang digunakan berupa H2O + 0.1% formic acid, dan Acetonitrile +
0.1% formic acid. Suhu yang digunakan 40 °C. Laju alir yang digunakan sebesar
0.3 mL/min dengan volume yang diinjeksikan sebesar 5 µL.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar Air Ekstrak Daun Sirih Merah
Kadar air daun sirih merah diperoleh melalui cara pengeringan. Pengeringan
dilakukan menggunakan oven pada suhu 50 °C selama 5 hari. Hasil pengeringan
dipastikan daun sudah berada dalam keadaan benar-benar kering. Kadar air yang
didapatkan sebesar 6.52 ± 0.01 %.
Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah

Rendemen (%)

Ekstraksi daun sirih merah dilakukan dengan metode refluks yang
menggunakan perbedaan suhu. Ekstrak etanol 30 % dilakukan pada suhu 70 °C
dan 100 °C untuk air. Hasilnya bahwa ekstrak etanol 30 % memiliki rendemen
lebih besar daripada ekstrak air yaitu 14.83 % (Gambar 1).
16
14
12
10
8
6
4
2
0

14.83
11.94

air

etanol 30 %
Ekstrak

Gambar 1 Hasil rendemen ekstrak daun sirih merah
Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Sirih Merah
Uji fitokimia meliputi flavonoid, tanin, dan alkaloid. Hasilnya terbukti
bahwa daun sirih merah memiliki metabolit sekunder flavonoid, tanin dan alkaloid
(Tabel 1). Hasil positif berdasarkan reaksi warna yang terbentuk dari pereaksi
yang digunakan (Lampiran 4).

7
Tabel 1 Komponen fitokimia ekstrak daun sirih merah
Ekstrak

Uji
Flavonoid
Tanin
Dagendrof
Mayer

Alkalod

Wagner

air

Etanol 30 %

+

+

+
+

+
+

+

+

+

+

Keterangan:
(+)
= mengandung senyawa
(-)
= tidak mengandung senyawa
Total Fenolik Ekstrak Daun Sirih Merah
Hasil pengukuran kandungan fenolik pada ekstrak daun sirih merah
menunjukkan perbedaan diantara ekstrak air dan etanol 30 %. Ekstrak etanol 30 %
memiliki kandungan fenolik lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak air.
Kandungan fenolik pada ekstrak etanol 30 % yaitu 34.6 ± 4.90 mg GAE/g
(Gambar 2).

Total fenolik (mg GAE/g)

40
35

34.6 ± 4.90

32.93 ± 1.22

30
25
20
15
10

5
0
air

etanol 30 %
Ekstrak

Gambar 2 Hasil kadar total fenolik ekstrak daun sirih merah
Total Flavonoid Ekstrak Daun Sirih Merah
Kandungan total flavonoid ekstrak daun sirih merah tertinggi terdapat pada
ekstrak etanol 30 % dibandingkan dengan ekstrak air. Hasil tersebut memiliki
kesamaan dengan kandungan fenolik yang memiliki kandungan terbesar pada
ekstrak etanol. Ekstrak etanol 30 % memiliki kandungan flavonoid sebesar 6.09 ±
0.26 mg QE/g (Gambar 3).

8

Total flavonoid (mg QE/g)

7

6.09 ± 0.26

6
5

4.71 ± 0.14

4
3
2
1
0
air

etanol 30 %
Ekstrak

Gambar 3 Hasil kadar total flavonoid ekstrak daun sirih merah
Total Tanin Ekstrak Daun Sirih Merah
Tanin dan flavonoid termasuk dalam senyawa fenolik yang sama-sama suka
dengan pelarut polar. Hasil percobaan yang didapat kandungan total tanin berbeda
dengan kandungan fenolik ataupun flavonoid. Kandungan total tanin pada ekstrak
daun sirih merah yang tertinggi tidak terdapat pada ekstrak etanol 30 %. Tanin
tertinggi dihasilkan dari ekstrak air. Adapun hasilnya yaitu 3.97 ± 0.08 mg/g
(Gambar 4).
4,5

3.97 ± 0.08

Total tanin (mg/g)

4

3.36 ± 1.12

3,5
3

2,5
2
1,5
1
0,5
0
air

etanol 30 %
Ekstrak

Gambar 4 Hasil kadar total tanin ekstrak daun sirih merah
Total Alkaloid Esktrak Daun Sirih Merah
Hasil pengukuran kandungan total alkaloid ekstrak daun sirih merah
memiliki kasus yang sama seperti tanin. Hasil tertinggi terdapat pada ekstrak air
dan ekstrak etanol 30 % jauh lebih rendah. Kandungan total alkaloid pada ekstrak
air yaitu sebesar 543.75 ± 3.17 mg/g (Gambar 5).

9

Total alkaloid (mg/g)

600

543.75 ± 3.17

500
400
300

187.43 ± 11.83

200
100
0
air

Ekstrak

etanol 30 %

Gambar 5 Hasil kadar total alkaloid ekstrak daun sirih merah
Hasil Analisis LC-MS Ekstrak Daun Sirih Merah
Hasil analisis LC-MS berdasarkan pada bobot molekul dari golongan
senyawa yang ingin dianalisis. Golongan flavonoid pada ekstrak air diduga
memiliki senyawa terbanyak yaitu sembilan jenis bobot molekul yang berarti
diduga memiliki sembilan golongan flavonoid. Ekstrak etanol memiliki tujuh
senyawa yang diduga sebagai golongan flavonoid (Tabel 2). Hasil kromatogram
dari senyawa flavonoid pada masing-masing ekstrak mempunyai puncak tertinggi.
Puncak tertinggi flavonoid pada ekstrak air mempunyai waktu retensi 4.47
(Lampiran 11) dengan bobot molekul 450.2034 (m/z). Puncak tersebut diduga
memiliki rumus molekul C27H30O6. Ekstrak etanol 30 % memiliki puncak
tertinggi yang terletak pada waktu retensi 2.54 (Lampiran 14) dan bobot molekul
578.1639 (m/z) serta rumus molekul C27H30O14.
Tabel 2 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan flavonoid
ekstrak daun sirih merah hasil pengujian LC-MS
Ekstrak Air
Bobot Molekul (m/z)
Rumus Molekul
486.2250
C27H34O8
418.1765
C26H26O5
450.2034
C27H30O6
452.2197
C27H32O6
470.2294
C27H34O7
510.2247
C29H34O8
552.2734
C32H40O8
570.2461
C31H38O10
610.2780
C34H42O10

Ekstrak Etanol
Bobot Molekul (m/z) Rumus Molekul
338.2237
C23H30O2
578.1639
C27H30O14
594.1580
C27H30O15
662.2585
C33H42O14
678.5050
C40H70O8
418.1765
C26H26O5
450.2034
C27H30O6

Senyawa tanin diduga memiliki kandungan terbanyak pada ekstrak etanol
30 %. Total senyawa pada etanol 30 % yaitu tiga golongan, sedangkan ekstrak air
yaitu satu golongan (Tabel 3). Selain itu, senyawa golongan tanin pada ekstrak air
dan etanol 30 % memiliki puncak tertinggi dengan waktu retensi yang berbeda.

10
Ekstrak air memiliki puncak tertinggi pada waktu retensi 4.21 (Lampiran 17)
dengan bobot molekul 148.0152 (m/z), dan rumus molekul C8H4O3. Ekstrak etanol
30 % yaitu 2.54 (Lampiran 20) dengan bobot molekul 578.1639 (m/z), dan rumus
molekul C27H30O14.
Tabel 3 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan tanin ekstrak
daun sirih merah hasil pengujian LC-MS
Ekstrak Air
Bobot Molekul (m/z)
Rumus Molekul
148.0152
C8H4O3

Ekstrak Etanol
Bobot Molekul (m/z) Rumus Molekul
148.0158
C8H4O3
442.2209
C22H34O9
578.1639
C27H30O14

Hasil senyawa alkaloid sama dengan tanin bahwa pendugaan senyawa
alkaloid banyak terdapat pada ekstrak etanol 30 % dibandingkan dengan ekstrak
air yaitu sembilan (Tabel 4). Puncak tertinggi pada senyawa alkaloid memiliki
waktu retensi yang hampir sama yaitu 4.48 untuk ekstrak air dan 4.42 untuk
ekstrak etanol 30 %. Selain waktu retensi kesamaan juga terjadi pada bobot
molekulnya yaitu 400.1879 (m/z), dan 400. 1870 (m/z). Pendugaan bobot molekul
pada puncak tertinggi tidak dimasukkan kedalam hasil pada Tabel 4. Hal tersebut
disebabkan bukan senyawa golongan alkaloid.
Tabel 4 Hasil dugaan bobot molekul serta rumus molekul golongan alkaloid
ekstrak daun sirih merah hasil pengujian LC-MS
Ekstrak Air
Bobot Molekul
(m/z)
239.2230
341.2525
387.2268
421.2021
421.2030
459.2233
599.4562

Rumus Molekul
C15H29NO
C15H31N7O
C20H29N5O3
C29H27NO2
C29H27NO2
C25H33NO7
C37H61NO5

Ekstrak Etanol
Bobot Molekul
Rumus Molekul
(m/z)
239.2235
C15H29NO
341.2533
C15H31N7O2
387.2248
C20H29N5O3
402.1769
C17H22N8O4
417.2125
C23H31NO6
421.2026
C29H27NO2
459.2222
C21H29N7O5
807.3534
C49H49N3O8
835.3839
C39H57N5O15

Pembahasan
Kadar Air Simplisia Daun Sirih merah
Kadar air simplisisa dilakukan dengan beberapa tujuan yaitu untuk
mengetahui keberhasilan dari pengerjaan simplisia, sebagai faktor koreksi
rendemen, dan juga keamanan dari masa simpan simplisia. Kadar air simplisia
diperoleh melalui pengeringan. Pengeringan itu sendiri merupakan pengeluaran
air dari dalam bahan sehingga dihasilkan produk kering. Proses pengeringan
disamping berpengaruh terhadap kadar air, proses ini juga berpengaruh terhadap
komponen bioaktif yang terdapat pada simplisia tersebut. Pengeringan yang tepat

11
akan menghasilkan mutu simplisia yang tahan lama dalam proses penyimpanan
serta tidak merubah kandungan bahan aktif yang terdapat dalam simplisia (Manoi
2006).
Kadar air yang didapatkan sesuai dengan standar yang diberikan oleh
Farmakope Herbal Indonesia (Depkes 2008) dibawah 10 % yaitu 6.52 ± 0.01 %.
Selain Farmakope Herbal Indonesia, keputusan tersebut terdapat juga didalam
Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 661/Menkes/SK/VII/1994 tentang Persyaratan
Obat Tradisional. Keputusan tersebut menyatakan bahwa standar maksimum
simplisia adalah 10 %, dengan demikian keamanan dan kondisi bahan aktif pada
simplisia daun sirih merah dapat terjaga dalam waktu yang lama.
Rendemen Ekstrak Daun Sirih Merah
Ekstraksi daun sirih merah menggunakan metode refluks. Metode refluks
dilakukan karena ekstraksi daun sirih merah pernah dilakukan dengan cara direbus
dan hasilnya masih mengandung metabolit sekunder (Safithri dan Fahma 2008;
Salim 2006). Penjelasan tersebut dapat dikatakan bahwa prinsip metode refluks
hampir sama dengan perebusan yaitu dengan menggunakan panas (Mawaddah
2008), oleh sebab itu dilakukan metode refluks. Adapun perbedaanya hanya
terletak pada kondensor yang terdapat pada alat refluks.
Alasan lain menggunakan metode ini karena mempunyai beberapa
kelebihan yaitu komponen terekstrak dengan sempurna, hemat, dan waktu yang
dibutuhkan lebih cepat dan singkat karena adanya panas (Mawaddah 2008).
Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi yaitu air dan etanol 30 %. Kedua pelarut
digunakan berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Safithri dan Fahma (2008),
Marlina (2008) serta Alfarabi (2010) yang menyatakan kedua pelarut memiliki
senyawa aktif dalam daun sirih merah. selain itu juga didalam penggunaan
aplikasi obat herbal, pelarut polar seperti etanol sering digunakan untuk
pembuatan jamu dan obat-obatan fitofarmaka (Darusman et al. 2001).
Hasil ekstraksi daun sirih merah berupa gumpalan serbuk. Proses ekstraksi
tersebut menghasilkan rendemen yang berbeda. Hasil Rendemen menunjukkan
bahwa ekstrak etanol 30 % memiliki rendemen lebih besar dibandingkan dengan
ekstrak air (Gambar 1). Perbedaan hasil rendemen salah satu kemungkinannya
disebabkan oleh perbedaan pelarut. Kepolaran pelarut akan menentukan
komponen bioaktif dan metabolit sekunder yang terkandung dalam sirih merah.
Selain kepolaran, pemanasan atau suhu akan berpengaruh juga terhadap kelarutan
ekstrak jika dibandingkan tanpa pemanasan (Pambayun et al. 2007). Hasil
rendemen yang didapatkan menunjukkan kadar metabolit sekunder yang terbawa
oleh pelarut dan tidak dapat menentukan jenis senyawanya (Ukieyanna 2012).
Dengan demikian dapat diduga bahwa pelarut etanol 30 % dalam ekstrak daun
sirih merah dapat menarik senyawa lebih banyak dari ekstrak air.
Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Sirih Merah
Identifikasi fitokimia dilakukan untuk memastikan bahwa ekstrak air
ataupun etanol 30 % benar mengandung senyawa yang telah dibuktikan dalam
penelitian sebelumnya oleh Marlina (2008) dan Salim (2006). Identifikasi
fitokimia termasuk uji awal dalam penentuan kandungan metabolit sekunder pada
daun sirih merah. Identifikasi yang dilakukan meliputi uji flavonoid, tanin dan
alkaloid.

12
Identifikasi fitokimia ekstrak air dan etanol 30 % ternyata terbukti memiliki
kandungan flavonoid, tanin dan alkaloid (Tabel 1). Hasil yang didapatkan
berdasarkan pembentukan warna yang terjadi akibat pereaksi yang digunakan.
Senyawa flavonoid positif dengan ditunjukkannya warna kuning serta warna hijau
untuk tanin. Senyawa alkaloid diuji dengan menggunakan tiga pereaksi alkaloid
yaitu pereaksi Dragendrof (positif endapan merah), Mayer (positif endapan putih)
dan Wagner (positif endapan cokelat) (Harbone 2007).
Selain itu berdasarkan penelitian sebelumnya telah dikatakan bahwa pelarut
air dan etanol 30 % dapat menarik senyawa dengan hasil fitokimia yang sama
(Agustianti 2008). Hasil tersebut telah terbukti seperti yang telah dilakukan oleh
Salim (2006) dan Agustianti (2008) bahwa ekstrak air dan etanol sama-sama
menghasilkan senyawa metabolit sekunder flavonoid, tanin, dan alkaloid. Dengan
demikian bahwa pelarut air dan etanol 30 % dapat mengekstraksi tiga senyawa
metabolit sekunder tersebut.
Total Fenolik Ekstrak Daun Sirih Merah
Pengujian fenolik dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui keseluruhan
dari golongan fenolik. Seperti yang telah diketahui bahwa flavonoid dan tanin
termasuk dalam golongan fenolik. Senyawa fenolik juga menrut Deore et al.
(2009) merupakan senyawa yang telah mempunyai banyak fungsi seperti
antioksidan, antitumor, dan antiviral serta antibiotik. Sehingga sangat perlu untuk
mengetahui kadar totalnya. Prinsip yang digunakan dalam penentuan kadar
fenolik yaitu berdasarkan metode Folin-Ciocalteau.
Prinsipnya bahwa terjadinya reaksi antara senyawa fenol dengan reagen
Folin-Ciocalteau. Reaksinya melibatkan transfer elektron dari senyawa fenolik
dengan campuran asam fosfotungstat atau asam molibdat dalam reagen dan
membentuk warna biru yang diukur absorbansinya (Kusumaningati 2009). Warna
biru inilah yang bisa menandakan banyak atau tidaknya kandunggan fenolik. Hal
itu terjadi pada saat pengukuran absorban. Warna biru yang lebih pekat akan
menghasilkan absorbansi yang tinggi, degan kata lain sebanding antara warna
dengan kandugan fenolik (Dai dan Mumper 2010). Selain itu asam galat
digunakan sebagai standar karena asam galat termasuk dalam senyawa fenolik
yang banyak terdapat pada tumbuhan. Asam galat juga termasuk senyawa yang
lebih murni dan lebih stabil (Kusumaningati 2009).
Kandungan fenolik ekstrak etanol 30 % lebih tinggi dibandingkan dengan
ekstrak air (Gambar 2). Hasil tersebut mempunyai kasus yang sama apabila
dibandingkan dengan hasil kadar fenolik pada daun surian dengan pelarut etanol
70 % dan air. Pelarut etanol pada esktrak daun surian mempunyai kadar fenolik
terbesar dibandingkan dengan air yaitu 500.30 mg/g GAE dan 465.30 mg/g GAE
(Haryadi 2012). Apabila dibandingkan antara daun surian dan sirih merah, kadar
fenolik daun surian memiliki kandungan yang lebih besar dari daun sirih merah.
Kandungan fenolik tertinggi disebabkan oleh tingkat kepolaran dari sifat
pelarut yang digunakan. Senyawa fenolik mudah larut dalam pelarut polar
(Harbone 1996 dalam Ukieyanna 2012). Namun demikian, senyawa fenolik tidak
hanya bersifat polar, ada beberapa aglikon (bebas) dari senyawa fenolik yang
bersifat semi polar. Seperti yang dikatakan Deore et al. (2009) bahwa pengujian
total fenolik tergantung dari struktur kimianya.

13
Etanol dan air merupakan pelarut yang memiliki gugus hidroksil. Namun,
gugus hidroksil pada etanol dapat berikatan dengan ikatan hidrogen
intramolekuler pada gugus hidroksil senyawa fenolik. Hal tersebut menyebabkan
peningkatan kelarutan senyawa fenolik dalam etanol (Murnah 2011). Menurut
Tiwari et al. (2011) etanol merupakan pelarut yang efektif untuk senyawa fenolik
karena tingkat kepolarannya yang rendah dibandingkan dengan air. Hal itu
menyebabkan dinding sel pada tumbuhan yang kurang polar mudah terdegradasi
dan senyawa fenol mudah keluar dari sel tanaman. Selain itu Septiana et al.
(2002) menyatakan bahwa pelarut organik yang semipolar lebih mudah
mengekstrak senyawa fenolik. Oleh sebab itu kandungan fenolik tertinggi ada
pada ekstrak etanol 30 %.
Total Flavonoid Ekstrak Daun Sirih Merah
Kadar flavonoid ini ditentukan untuk mengetahui jumlah flavonoid pada
ekstrak yang diduga berpotensi atau bahkan merupakan senyawa yang paling
berperan pada daun sirih merah. Pengukuran kadar total flavonoid mengacu pada
metode Chang et al. (2002) yang disebut juga metode AlCl3. Standar yang
digunakan adalah kuersetin. Kuersetin digunakan karena akan memberikan
kestabilan reaksi terhadap pereaksi yang digunakan yaitu AlCl3. Selain itu Chang
et al. (2002) juga menyatakan bahwa flavonoid yang terukur adalah jenis flavon
dan flavonol dan dua golongan tersebut merupakan senyawa yang akan
membentuk kestabilan dengan AlCl3.
Total flavonoid yang dihasilkan dari percobaan menunjukkan bahwa
ekstrak etanol 30 % memiliki total flavonoid tertinggi dibandingkan dengan
ekstrak air (Gambar 3). Hasil tersebut sama halnya dengan total fenolik yang
dipengaruhi oleh kepolaran senyawa terhadap pelarut. Stankovic et al. (2011)
menyatakan bahwa kandungan flavonoid tertinggi terdapat pada pelarut dengan
kepolaran sedang. Ekstrak etanol 30 % bersifat tidak terlalu polar jika
dibandingkan dengan air. Flavonoid akan cenderung terlarut lebih banyak pada
ekstrak etanol 30 %.
Kadar total flavonoid pada ekstrak daun sirih merah mempunyai
kandungan yang sedikit apabila dibandingkan dengan tanaman herbal lain yang
menggunakan kuersetin sebagai standar. Tanaman herbal lain seperti daun surian
dengan pelarut etanol 70 % dan air memiliki kandungan flavonoid sebesar 62.96
mg/g QE dan 92.10 mg/g QE (Haryadi 2012). Selain daun surian, daun beluntas
juga mempunyai kadar flavonoid yang besar yaitu 2163.59 mg/100g QE
(Widyawati 2011).
Total Tanin Ekstrak Daun Sirih Merah
Tanin termasuk kedalam senyawa fenolik kompleks. Tanin juga terbagi
menjadi dua yaitu tanin terhidrolisis dan tanin terkondensasi. Tanin terhidrolisis
meliputi galotanin, elagitanin, dan kafetanin. Katekin, epikatekin, gallokatekin
dan epigallokatekin merupakan senyawa yang termasuk golongan tanin
terkondensasi (Hagerman 2002). Kadar tanin dalam ektstrak daun sirih merah
ditentukan dengan metode permanganometri. Prinsipnya bahwa titrasi yang
dilakukan berdasarkan reaksi oleh kalium permanganat (KMnO 4). Reaksi ini
difokuskan pada reaksi oksidasi dan reduksi yang terjadi antara KMnO 4 dengan
senyawa tertentu (Day 1999).

14
Ekstrak air memiliki kadar tanin yang tertinggi dibandingkan ekstrak etanol
30 %. Hasil tersebut tidak salah karena senyawa tanin suka terhadap pelarut polar
seperti air. Alasan lain bahwa senyawa tanin yang salah satunya adalah tanin
terhidrolisis termasuk senyawa yang hidrofilik. Senyawa hidrofilik adalah
senyawa yang suka air. Peristiwa tersebut juga terjadi pada penelitian yang
dilakukan oleh Marnoto et al. (2012) bahwa ekstrak etanol teknis yang lebih
banyak mengandung air mempunyai kadar yang lebih tinggi dibandingkan dengan
metanol. Kepolaran air yang membuat senyawa tanin lebih banyak terdapat pada
ekstrak air.
Total Alkaloid Ekstrak Daun Sirih Merah
Senyawa alkaloid banyak ditemukan pada tumbuhan diberbagai bagian
seperti biji, daun, ranting, dan kulit batang. Kandungan alkaloid salah satunya
terdapat dalam daun sirih merah. Sifat alkaloid adalah bersifat basa, sehingga
penentuan ekstraksi alkaloid lebih banyak menggunakan pelarut alkohol yang
bersifat asam lemah (Harbone 1986). Proses penentuan total alkaloid
menggunakan prinsip gavimetri yaitu penimbangan secara langsung yang
sebelumnya telah diekstraksi dengan pelarut alkaloid.
Ada dua jenis pengukuran yang dilakukan dalam pengukuran alkaloid dalam
satu prosedur. Pertama penimbangan total alkaloid berdasarkan fase kloroformmetanol dan kedua adalah fase air-basa. Kedua fase tersebut dipilih untuk
penentuan alkaloid. Pemilihan kedua fase tersebut disebabkan senyawa alkaloid
mempunyai sifat yang berbeda ketika diekstraksi. Alkaloid dapat larut dalam
pelarut bersifat basa dan juga pelarut organik (kloroform). Alkaloid yang bersifat
basa ada yang bersifat larut dan tidak larut dalam air (Besilla 1981 dalam
Rolandani 2001). Hasil tertinggi kadar total alkaloid terdapat dalam ekstrak air.
Dengan demikian alkaloid yang bersifat basa dan larut dalam air banyak
terkandung dalam ekstrak air daun sirih merah.
Hasil Analisis LC-MS Ekstrak Daun Sirih Merah
Analisis flavonoid, tanin, dan alkaloid menggunakan Liquid
Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS). LC-MS digunakan untuk analisis
metabolit sekunder karena mempunyai sensitivitas yang lebih tinggi. Alat ini juga
dapat digunakan untuk analisis kuantitatif maupun analisis struktural sehingga
senyawa akan lebih terdeteksi dengan baik. Analisis senyawa flavonoid dari
tanaman juga sering dilakukan dengan LC-MS (Fabre et al. 2001). Theodoridis et
al. (2008) juga menyatakan bahwa LC-MS sering digunakan dalam bidang
bioanalisis serta dapat menentukan profil metabolit sekunder karena mampu
memisahkan senyawa dengan resolusi yang tinggi.
Analisis LC-MS yang dilakukan harus melalui pemurnian terlebih dahulu.
Pemurnian dilakukan melalui fraksinasi corong pisah yaitu menggunakan
kepolaran bertingkat. Tujuan dilakukannya frakasinasi supaya pengotor serta
senyawa yang tidak diinginkan seperti protein, minyak serta yang lainnya tidak
terbawa, dan hanya didapatkan senyawa metabolit sekunder flavonoid, tanin, dan
alkaloid. Fraksinasi akan berpengaruh terhadap hasil LC-MS. Hasilnya dari semua
golongan yaitu flavonoid, tanin, dan alkaloid menunjukkan bahwa ekstrak air dan
etanol 30 % masih banyak terdapat pengotor, sehingga puncak yang muncul

15
bervariasi (Lampiran 11, Lampiran 14, Lampiran 17, Lampiran 20, lampiran 23,
Lampiran 26).
Analisis yang dilakukan masih dalam tahap awal yaitu ekstrak secara kasar
sehingga puncak yang bervariasi karena ekstrak yang diuji belum sepenuhnya
murni. Namun demikian, dari hasil yang didapatkan masih bisa dianalisis senyawa
dengan bobot molekul berapa saja yang termasuk kedalam golongan flavonoid,
tanin, dan juga alkaloid. Analisis data dilakukan melalui beberapa tahapan dengan
menggunakan program yang sesuai dan salah satunya yaitu software MassLynk
versi 4.1 (dilakukan di Laboratorium Biotek, BPPT Serpong). Hasil analisis
dugaan metabolit sekunder golongan flavonoid, tanin, dan alkaloid ditunjukkan
pada Tabel 2, 3 dan 4. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa ekstrak air dan
ekstrak etanol 30 % memiliki kandungan yang berbeda.
Perbedaan tersebut disebabkan oleh ketertarikan senyawa terhadap tingkat
kepolaran suatu pelarut. Penelitian ini menggunakan pemisahan dengan tingkat
kepolaran yang berbeda yaitu diantaranya n-heksan, kloroform, dietil eter, etil
asetat, n-butanol, dan aseton. Semua larutan yang digunakan mempunyai tingkat
kepolaran yang berbeda dari yang polar sampai dengan non polar. Pelarut nheksan mempunyai sifat non-polar, sedangkan dietil eter, eteil asetat dan aseton
pelarut yang semi polar. Dengan demikian senyawa yang mempunyai sifat
kepolaran yang sama dengan pelarut akan tertarik pada pelarut yang sesuai
(Markom et al. 2007).
Selain pelarut, senyawa flavonoid dan alkaloid juga memiliki perbedaan
kepolaran. Seperti pada senyawa flavonoid, flavonoid mempunyai dua sifat
kelarutan yaitu polar dan semi polar. Senyawa flavonoid yang bersifat polar
mudah larut dalam pelarut polar seperti air. Senyawa yang semi polar akan sangat
larut pada pelarut semi polar seperti dietil eter, dan etil asetat. Flavonoid yang
polar karena berikatan dengan gula yang disebut glikon flavonoid, sedangkan
flavonoid semi polar tidak berikatan dengan gula yang dikenal dengan aglikon
flavonoid (Lenny 2006).
Sampel yang digunakan untuk analisis LC-MS adalah fraksi akhir dari
proses fraksinasi baik ekstrak air maupun ekstrak etanol 30 %. Fraksinasi
flavonoid memiliki fraksi akhir campuran air:butanol. Senyawa tanin pada proses
fraksinasi memiliki fraksi akhir air. Sementara itu, senyawa alkaloid memiliki
fraksi akhir kloroform. Oleh sebab itu memberikan hasil yang berbeda pada hasil
analisis LC-MS.
Flavonoid fraksi air:butanol tertinggi pada ekstrak air dan diduga bahwa
senyawa flavonoid yang tertarik merupakan senyawa yang bersifat polar yaitu
termasuk dalam glikon flavonoid, sedangkan senyawa yang bersifat semi polar
sebagian akan tertarik pada pelarut dietil eter serta etil asetat sehingga
kandungannya sedikit pada ekstrak etanol 30 %. Hal tersebut juga terjadi pada
senyawa alkaloid fraksi kloroform. Senyawa alkaloid sebagian larut dalam pelarut
air dan banyak larut dalam pelarut organik. Hasil akhir dari pemisahan
menggunakan pelarut organik yaitu kloroform. Selain kloroform etanol juga
merupakan pelarut organik, sehingga gabungan kedua pelarut tersebut
menyebabkan kandungan alkaloid hasil analisis LC-MS terbanyak pada ekstrak
etanol 30 %.
Hasil analisis dengan LC-MS masih belum akurat untuk menentukan nama
senyawanya secara tepat hanya sebatas bobot dan rumus molekul. Analisis

16
tersebut tidak bisa dilakukan karena banyaknya senyawa yang terdeteksi dalam
satu kromatogram. Seperti puncak tertinggi pada alkaloid, puncak tertinggi yang
dihasilkan bukan termasuk golongan alkaloid karena tidak mengandung atom N
pada rumus molekulnya. Hasil analisis hanya memiliki atom C, H dan O. Satu
kromatogram LC-MS alkaloid tidak hanya mengandung senyawa alkaloid akan
tetapi senyawa lain juga ikut terdeteksi.
Namun demikian, ada beberapa puncak tertinggi pada golongan flavonoid
yang dapat ditentukan senyawanya melaului database. Puncak tertinggi pada
flavonoid dengan bobot molekul 450.2034 dan 578.1639 yang memiliki rumus
molekul C27H30O6 dan C27H30O14 dapat ditentukan melalui database pada buku
Andersen dan Markham tentang senyawa flavonoid. Andersen (2006) dalam
bukunya menyebutkan bahwa senyawa dengan bobot molekul 450.52 dengan
rumus molekul C27H30O6, terdapat dua senyawa golongan isoflavonoid yaitu
Flemiphilippinin B dan Glabrescione B. Bobot molekul 578.53 dengan rumus
molekul C27H30O14 memiliki 7 senyawa isoflavonoid diantaranya Coromandelin,
Biochanin A 7-O-(6’’-apiosylglucoside), Biochanin A 7-O-(6’’-xylosylglucoside),
Genistein 7-O-neohesperidoside, Genistein 7-O-rutinoside, Tectorigenin 7-O(6’’-xylosylglucoside), Daidzein 7,4’-O-diglucoside. Hasil database menunjukkan
bahwa dalam satu bobot molekul dan rumus molekul yang sama terdapat lebih
dari satu senyawa. Oleh sebab itu masih belum bisa ditentukan senyawanya secara
pasti. Selain itu menurut Sunaryanto (2011) LC-MS hanya bersifat memprediksi
suatu senyawa dengan bobot molekul, sedangakan untuk memastikan secara
akurat dibutuhkan analisis lanjut untuk elusidasi rumus molekul dengan alat
analisis lain seperti NMR dan juga FTIR.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak air dan etanol 30 % daun sirih merah memiliki kandungan flavonoid,
tanin dan alkloid. Kadar flavonoid tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 30%,
sedangkan ekstrak air lebih banyak mengandung tanin dan alkaloid. Analisis
golongan senyawa flavonoid diduga lebih banyak terdapat pada ekstrak air,
sedangkan golongan senyawa tanin dan alkaloid diduga banyak terdapat pada
ekstrak etanol 30 %.
Saran
Saran untuk penelitian selanjutnya bahwa perlu dilakukan pemurnian yang
lebih lanjut terhadap fraksinasi yang dilakukan untuk setiap senyawa. Tujuannya
adalah untuk menghasilkan senyawa yang lebih murni. Senyawa yang murni akan
lebih mudah menentukan senyawa pada saat dilakukan analisis. Selain senyawa
yang murni, diperlukan instrumen lain sebagai pendukung hasil analisis.

17

DAFTAR PUSTAKA
Agustianti L. 2008. Potensi daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai aktivator
enzim glukosa oksidase [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Alfarabi M, Bintang M, Suryani, Safithri M. 2010. The comparative ability of
antioxidant activity of Piper crocatum in inhibiting fatty acid oxidation and
free radical scavenging. Hayati J. Biosci 17(4):201-204.
Andersen ØM, Markham KR. 2006. Flavonoids : Chemistry, Biochemistry, and
Applications. New York (US): CRC Press.
Chang C, Yang M, Wen H, Chern J. 2002. Estimation of total flavonoid content in
propolis by two complementary colorimetric methods. J Food Drug
Analaysis 10: 178-182.
Dai J, Mumper RJ. 2010. Plant phenolic: extraction, analysis and their antioxidant
and anticancer properties. Molecules 15 : 7313-7352.
Darusman LK, Rohaeti E, Sulistiyani. 2001. Kajian senyawa golongan flavonoid
asal tanaman bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase
[laporan penelitian]. Bogor (ID): Pusat Studi Biofarmaka Lembaga
Penelitian, IPB.
Day RA, Underwood AL. 1999. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta (ID): Erlangga.
Deore SL, Khadabadi SS, Baviskar BA, Khangenbam RA, Koli US, Daga NP,
Gadbail PA, jain PA. 2009. Invitro antioxidant acti