Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) In Vitro

KAJIAN ANTIDIABETOGENIK EKSTRAK DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum) IN VITRO

MUHAMMAD ALFARABI
G851080051

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Antidiabetogenik Ekstrak
Daun Sirih Merah (Piper crocatum) In Vitro adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, 18 Februari 2010

Muhammad Alfarabi
NIM G851080051

ABSTRACT
MUHAMMAD ALFARABI. Study on Antidiabetogenic of The Leaf Extract of
Piper crocatum (Sirih merah) In Vitro. Under direction of MARIA BINTANG
and SURYANI.
Diabetes mellitus can be caused by the existence of free radical which
attacks membrane lipid of pancreatic cells. Previous research showed that the
extract of Piper crocatum leaf has an activity as antidiabetic and antioxidant.
However, there is no scientific reports about the mechanism of Piper crocatum as
antidiabetogenic. The main goal of this research is to elucidate the mechanism of
Piper crocatum as antidiabetogenic by acting as antioxidant and inhibitor of αglucosidase. This study used ethanol 70% as an eluent to extract Piper crocatum
leaf, followed by testing antioxidant activity of the extract and testing its ability to
inhibit α-glucosidase. Extract compounds detected by GC-MS. The results of this
study was extract of Piper crocatum leaf has an antidiabetogenic activity through
as antioxidants, which inhibited the oxidation of fatty acids and radical scavenger
as well as a competitive inhibitor of the α-glucosidase. Antioxidative activity
extract of Piper crocatum leaf could inhibit the oxidation of fatty acids 80.40%
(200 ppm) and radical scavenger (IC50 = 85.82 ppm). Inhibition activity of αglucosidase could inhibit 39.62% (1% b/v). Compounds in extract of Piper

crocatum leaf were groups of fatty acids, terpenoids, flavonoids, steroids,
alkaloids, pyrimidine, essential oils, polyphenols, and vitamin E.
Keyword: antidiabetogenic, antioxidant, inhibitor α-glucosidase, Piper crocatum

RINGKASAN
MUHAMMAD ALFARABI. Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah
(Piper crocatum) In Vitro. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan SURYANI.
Pola hidup masyarakat yang tidak sehat menyebabkan masuknya senyawasenyawa xenobiotik ke dalam tubuh sehingga menyebabkan terjadinya berbagai
penyakit. Senyawa-senyawa xenobiotik tersebut dapat berupa logam berat atau
senyawa radikal bebas. Salah satu penyakit tersebut adalah diabetes mellitus yang
terjadi akibat beberapa proses xenobiotik yang merusak sel beta pankreas
sehingga menyebabkan terganggunya proses metabolisme. Karakteristik diabetes
mellitus adalah terjadinya hiperglikemia, yaitu tingginya kadar glukosa di dalam
darah akibat kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau
keduanya. Indonesia menempati urutan ke empat di dunia dalam jumlah penderita
diabetes mellitus. Oleh karena itu, diabetes mellitus merupakan suatu penyakit
yang sangat serius bagi masyarakat Indonesia.
Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat menghasilkan senyawa radikal
bebas akibat terjadinya autooksidasi glukosa sehingga menyebabkan kerusakan
sel dan jaringan pada tubuh termasuk sel beta pankreas. Radikal bebas yang

terbentuk akan mengoksidasi serta merusak senyawa lipid, protein, dan
menurunkan aktivitas enzim. Banyaknya senyawa radikal bebas di dalam tubuh
dapat menimbulkan berbagai macam penyakit lainnya sehingga terjadi komplikasi
penyakit pada penderita diabetes Saat ini, selain menggunakan insulin dan obatobat sintetik, masyarakat di Indonesia melakukan pengobatan alternatif dengan
menggunakan tumbuhan-tumbuhan yang berkhasiat sebagai antihiperglikemia dan
antioksidan untuk menurunkan peningkatan kadar peroksidasi lipid pada penderita
diabetes mellitus. Salah satu tumbuhan yang memiliki kedua khasiat tersebut
adalah sirih merah. Secara ilmiah, daun sirih merah mengandung senyawa bioaktif
flavonoid, tanin, dan alkaloid serta memiliki aktivitas antihiperglikemia. Selain
itu, air rebusan daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan. Berdasarkan data
penelitian ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut mengenai mekanisme sirih
merah sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat antioksidasinya atau sebagai
inhibitor α-glukosidase, yaitu enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di
usus sehingga kadar glukosa di dalam darah dapat diturunkan.
Penelitian ini dilakukan dengan menguji aktivitas antioksidasi ekstrak etanol
70% daun sirih merah (metode TBA dan DPPH) dan daya inhibisi terhadap αglukosidase serta komponen ekstrak dianalisis dengan GC-MS. Hasil penelitian
ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah memiliki aktivitas
sebagai antidiabetogenik. Proses antidiabetogenik ini melalui aktivitas
antioksidasi, yaitu menghambat oksidasi asam lemak dan radical scavenger serta
sebagai inhibitor competitive α-glukosidase. Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol

70% daun sirih merah dapat berperan sebagai penghambat oksidasi asam lemak
dengan daya hambat terbesar 80.40% dan sebagai radical scavenger dengan nilai
IC50 85.82 ppm. Aktivitas inhibisi terhadap α-glukosidase mempunyai daya
hambat terbesar 39.62% dengan jenis inhibisi competitive. Oleh karena itu, daun
sirih merah berpotensi mengurangi kadar senyawa radikal bebas dan oksidasi lipid
serta kadar gula darah bagi penderita diabetes mellitus. Komponen senyawa yang
terkandung pada ekstrak etanol 70% daun sirih merah adalah golongan asam

lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol,
dan vitamin E. Senyawa yang diperkirakan memiliki aktivitas antidiabetogenik
adalah polifenol, alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan vitamin E.
Kata kunci: antidiabetogenik, antioksidan, inhibitor α-glukosidase, sirih merah

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2010
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KAJIAN ANTIDIABETOGENIK EKSTRAK DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum) IN VITRO

MUHAMMAD ALFARABI

Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

Judul Tesis

Nama
NIM

: Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) In Vitro
: Muhammad Alfarabi
: G851080051

Disetujui
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S
Ketua

Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi

Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S

Tanggal Ujian: 18 Februari 2010

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tak lupa penulis
panjatkan shalawat serta salam bagi teladan penulis Nabi Muhammad SAW.
Karya ilmiah berjudul Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) In Vitro disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan

Juli 2009 hingga November 2009 di Laboratorium Biokimia Departemen
Biokimia dan Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria
Bintang, MS dan Dr. Suryani, SP, M.Sc yang telah memberikan bimbingan dan
saran selama berlangsungnya penelitian dan dalam penyusunan karya ilmiah.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, Mega Safithri S.Si,
M.Si, dan Tyas yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada
penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih
penulis tujukan kepada Waras, Dimas, Rangga, Nophe, Olga, staf laboratorium
Pusat Studi Biofarmaka dan laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia,
FMIPA IPB atas kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2010
Muhammad Alfarabi

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juni 1986 dari ayah MZ Iqbal
Moenaf dan ibu Dewi R. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana mayor

Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan
menamatkannya pada tahun 2008. Kesempatan untuk melanjutkan program
pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2008.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................................x
DAFTAR TABEL ....................................................................................................x
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... xi
PENDAHULUAN ...................................................................................................1
TINJAUAN PUSTAKA
Sirih Merah ..........................................................................................................4
Diabetes mellitus .................................................................................................5
Radikal Bebas ......................................................................................................7
Antioksidan .........................................................................................................8
Inhibitor enzim α-glukosidase .............................................................................9
Analisis Aktivitas Antioksidasi dan Inhibisi Enzim α-glukosidase ..................11
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ..................................................................................................13
Metode penelitian ..............................................................................................14

HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................18
Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah (metode TBA) .......................19
Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah (metode DPPH) .....................24
Inhibisi dan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase ...........................................27
Analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah ..................29
SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................................31
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................32
LAMPIRAN ...........................................................................................................36

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Tanaman sirih merah (Piper crocatum) ................................................................4
2 Beberapa senyawa antioksidan eksogen ...............................................................8
3 Grafik Lineweaver-Burk .....................................................................................10
4 Kurva kadar MDA terhadap waktu .....................................................................19
5 Kadar MDA ekstrak etanol 70% daun sirih merah .............................................20
6 Mekanisme reaksi pembentukkan MDA .............................................................22
7 Pembentukkan senyawa kompleks MDA-TBA ..................................................23

8 Kadar p-nitrofenol ekstrak etanol 70% daun sirih merah dan grafik jenis inhibisi
ekstrak etanol 70% daun sirih merah ..................................................................28

DAFTAR TABEL

Halaman
1 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah dan vitamin E
metode DPPH ......................................................................................................25
2 Komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah .................................30

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Tahapan umum penelitian ...................................................................................37
2 Ekstraksi daun sirih merah ..................................................................................37
3 Analisis ekstrak etanol 70% daun sirih merah dengan GC-MS ..........................38
4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat ..........................................38
5 Analisis aktivitas antioksidasi metode TBA .......................................................39
6 Analisis aktivitas antioksidasi metode DPPH .....................................................39
7 Analisis inhibisi enzim α-glukosidase.................................................................40
8 Analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase ...................................................40
9 Rendemen hasil ekstraksi daun sirih merah dengan etanol 70% ........................41
10 Absorban inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu (λ = 532 nm) ...............41
11 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode TBA .......42
12 Absorban kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) ...........................42
13 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode DPPH ....43
14 Aktivitas antioksidasi α-tokoferol (vitamin E) metode DPPH..........................44
15 Inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terhadap enzim α-glukosidase ..45
16 Hasil kurva standar p-nitrofenol........................................................................45
17 Hasil analisis kinetika inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terhadap
enzim α-glukosidase ..........................................................................................46
18 Hasil analisis GC-MS........................................................................................47
19 Analisa statistika data aktivitas antioksidasi dan inhibisi enzim ......................49
20 Dokumentasi hasil penelitian ............................................................................51

PENDAHULUAN
Pola hidup masyarakat yang tidak sehat menyebabkan masuknya senyawasenyawa xenobiotik ke dalam tubuh sehingga menyebabkan terjadinya berbagai
penyakit. Senyawa-senyawa xenobiotik tersebut dapat berupa logam berat atau
senyawa radikal bebas. Salah satu penyakit tersebut adalah diabetes mellitus yang
terjadi akibat beberapa proses xenobiotik yang merusak sel beta pankreas
sehingga menyebabkan terganggunya proses metabolisme. Karakteristik diabetes
mellitus adalah terjadinya hiperglikemia, yaitu tingginya kadar glukosa di dalam
darah akibat kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau
keduanya (The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus 2003). Diabetes mellitus merupakan salah satu penyakit yang banyak
diderita di dunia. Terdapat 171 juta kasus diabetes mellitus di dunia dan
diperkirakan pada tahun 2030 akan menjadi 366 juta kasus (Wild 2004). Indonesia
menempati urutan ke empat di dunia dalam jumlah penderita diabetes mellitus.
Oleh karena itu, diabetes mellitus merupakan suatu penyakit yang sangat serius
bagi masyarakat Indonesia.
Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat menghasilkan senyawa radikal
bebas akibat terjadinya autooksidasi glukosa sehingga menyebabkan kerusakan
sel dan jaringan pada tubuh termasuk sel beta pankreas (Dobretsov et al. 2007).
Radikal bebas yang terbentuk akan mengoksidasi serta merusak senyawa lipid,
protein, dan menurunkan aktivitas enzim (Murray 2003). Banyaknya senyawa
radikal bebas di dalam tubuh dapat menimbulkan berbagai macam penyakit
lainnya sehingga terjadi komplikasi penyakit pada penderita diabetes (Maritim et
al. 2003). Kasus yang banyak terjadi adalah penderita diabetes mellitus disertai
dengan peningkatan kadar peroksidasi lipid. Salah satu hasil penelitian
menunjukkan bahwa dari 38 penderita diabetes mellitus terjadi peningkatan kadar
peroksidasi lipid dari orang normal (Memisogullari et al. 2003). Oleh karena itu
diperlukan pengobatan yang dapat mengurangi keadaan hiperglikemia dan
mencegah terjadinya komplikasi penyakit akibat meningkatnya peroksidasi lipid.
Pengobatan tersebut dapat dilakukan dengan pemberian insulin atau obat-obat
yang bersifat hipoglikemia dengan cara mengurangi distribusi glukosa ke dalam

darah. Namun saat ini, selain menggunakan insulin dan obat-obat sintetik,
masyarakat di Indonesia melakukan pengobatan alternatif dengan menggunakan
tumbuhan-tumbuhan yang berkhasiat sebagai antihiperglikemia dan antioksidan
untuk menurunkan peningkatan kadar lipid peroksida pada penderita diabetes
mellitus. Salah satu tumbuhan yang memiliki kedua khasiat tersebut adalah sirih
merah.
Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang merambat dan
banyak tumbuh di daerah tropis khususnya Indonesia. Sirih jenis ini sebelumnya
terkenal sebagai tanaman hias, kemudian berubah menjadi tanaman obat sejak
diperkenalkan oleh produsen obat di Bulnyahrejo (Duryatmo 2005). Kegunaannya
di masyarakat selain antiseptik, daun sirih merah dapat digunakan untuk
mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal,
dan ambeien dengan cara memakan daunnya (Sudewo 2005). Secara ilmiah, daun
sirih merah mengandung senyawa bioaktif flavonoid, tanin, dan alkaloid serta
memiliki aktivitas antihiperglikemia (Safithri & Fahma 2005). Selain itu, air
rebusan daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi (Alfarabi 2008). Oleh
karena itu, sirih merah ini merupakan tumbuhan yang berkhasiat obat multifungsi
bagi penderita diabetes mellitus. Selain dapat sebagai antihiperglikemia, daun
sirih merah dapat mengurangi kadar peroksida lipid bagi penderita diabetes
mellitus yang mengalami peningkatan kadar peroksidasi lipid akibat autooksidasi
glukosa. Berdasarkan data penelitian ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut
mengenai mekanisme sirih merah sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat
antioksidasinya sehingga dapat mengurangi efek radikal bebas yang terbentuk
pada penderita diabetes mellitus atau sebagai inhibitor enzim α-glukosidase, yaitu
enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di usus sehingga kadar glukosa di
dalam darah dapat diturunkan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji daun sirih merah sebagai
antidiabetogenik secara in vitro. Mekanisme tersebut dapat melalui reaksi
antioksidasi, sebagai inhibitor enzim α-glukosidase, atau keduanya. Hipotesis
penelitian ini adalah ekstrak daun sirih merah dapat berperan sebagai
antidiabetogenik melalui reaksi antioksidasi dan inhibisi enzim α-glukosidase
secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai aktivitas antidiabetogenik daun sirih merah secara in vitro. Informasi ini
dapat dijadikan dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai
antihiperglikemia bagi penderita diabetes mellitus.

TINJAUAN PUSTAKA

Sirih Merah (Piper crocatum)
Tumbuhan sirih dikenal sebagai antiseptik sejak 600 SM. Sirih termasuk
famili Piperaceae yang merambat dan bersandar di batang pohon lain (Duryatmo
2005). Salah satu jenis sirih adalah sirih merah. Klasifikasi ilmiah dari sirih merah
ini

adalah

kingdom

Spermatophyta,

divisi

Plantae,

subkingdom

Magnoliophyta,

Tracheobionta,

kelas

super

Magnoliopsida,

divisi

subkelas

Magnoliidae, bangsa Piperales, suku Piperaceae, genus Piper, spesies Piper
crocatum. Sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya bersulur dan
beruas dengan jarak buku 5-10 cm dengan setiap buku tumbuh bakal akar.
Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi
rata, mengkilap atau tidak berbulu, dan mempunyai warna yang khas yaitu
permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun dan bagian bawah daun
berwarna merah hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau
tidak khas seperti sirih.
Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu
banyak kena sinar matahari. Jika terlalu sering kena sinar matahari maka warna
merah daunnya bisa menjadi pudar, buram, kurang menarik dan batangnya cepat
mengering. Sirih merah akan tumbuh baik jika mendapatkan 60-75% cahaya
matahari sehingga tempat tumbuh yang paling cocok untuk sirih merah adalah
lingkungan berhawa dingin (Gambar 1).

Gambar 1 Sirih merah

Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu jenis sirih yang banyak
dimanfaatkan sebagai tanaman hias pada tahun 1900-an namun sekarang
mengalami perubahan fungsi menjadi tanaman obat sejak dikenalkan oleh
Bambang Sudewo, seorang produsen tanaman obat di Bulnyahrejo (Duryatmo
2005). Daun sirih merah ini dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus,
maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien. Selain itu sirih
merah dapat digunakan secara bersama dengan tanaman obat lainnya untuk
mengobati penyakit (Sudewo 2005). Secara ilmiah, air rebusan daun sirih merah
dengan dosis pemberian 20 g/kg bobot badan dapat berfungsi sebagai
antihiperglikemia (Safithri & Fahma 2005), tidak memiliki efek toksik (Salim
2006), dapat memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006),
dan memiliki potensi sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006). Selain itu, air
rebusan daun sirih merah mempunyai aktivitas antioksidasi dalam menghambat
oksidasi asam lemak (Alfarabi 2008).

Diabetes Mellitus
Beberapa proses metabolisme di dalam tubuh akibat adanya senyawasenyawa xenobiotik yang dapat berupa senyawa logam berat atau radikal bebas
dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Salah satu penyakit tersebut adalah
diabetes mellitus. Penyakit ini biasa disebut dengan penyakit kencing manis
karena memiliki karakteristik tingginya kadar glukosa darah dan adanya glukosa
di dalam air seni (Purwakusumah 2003). Keadaan hiperglikemia dapat terjadi
karena kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau keduanya.
Hiperglikemia kronis dalam jangka waktu lama akan menyebabkan komplikasi
penyakit lain seperti tidak berfungsinya organ mata, ginjal, dan jantung (The
Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus 2003).
Secara etiologi diabetes mellitus dibagi menjadi empat kelompok, yaitu
diabetes mellitus tipe 1, tipe 2, tipe spesifik akibat kelainan genetik, dan akibat
kehamilan. Namun yang banyak diderita adalah diabetes mellitus tipe 1 dan tipe 2.
Diabetes mellitus tipe 1 merupakan penyakit diabetes mellitus yang tergantung
dengan insulin. Tipe ini sangat tergantung dengan insulin dari luar tubuh untuk
menurunkan kadar glukosa darah karena sel-β pankreas penderita tidak memiliki

kemampuan untuk memproduksi insulin. Peristiwa ini terjadi akibat rusaknya selβ pankreas akibat proses autoimun tubuh atau serangan virus. Diabetes mellitus
tipe 2 merupakan penyakit diabetes mellitus yang tidak tergantung dengan insulin.
Penyakit jenis ini diasumsikan bahwa penderita mampu memproduksi insulin
tetapi kerja insulin tidak maksimal (The Expert Committee on the Diagnosis and
Classification of Diabetes Mellitus 2003). Kerja insulin ini dapat diganggu dengan
terjadinya stress oksidatif sehingga terbentuk radikal bebas di dalam tubuh.
Radikal bebas tersebut akan mengganggu kerja insulin sehingga insulin tidak
maksimal menurunkan kadar glukosa darah (Ceriello 2000).
Keadaan hiperglikemia akan memproduksi banyaknya radikal bebas
(Ceriello 2003). Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat juga menyebabkan
autooksidasi glukosa (Dobretsov et al. 2007). Banyaknya terbentuk senyawa
radikal bebas akan meningkatkan stress oksidatif dan banyak merusak senyawasenyawa

makromolekul

lainnya

seperti

lipid

dan

protein.

Kerusakan

makromolekul tersebut akan menyebabkan penurunan fungsi kerja organ sehingga
terjadi penyakit lainnya seperti kebutaan, gagal ginjal, dan aterosklerosis (Maritim
et al. 2003). Oleh karena itu, usaha untuk menjaga tidak terjadinya komplikasi
penyakit pada penderita diabetes mellitus sangat penting. Usaha tersebut selain
menggunakan obat yang bersifat hipoglikemik, dapat juga dengan mengkonsumsi
tumbuhan berkhasiat antidiabetes. Penggunaan herbal Cina yang terdiri dari Radix
Astragali (akar dari Astragalus membranaceus yang dikeringkan) dan Radix
Rehmanniae (rhizoma dari Rehmania glutinosa yang dikeringkan) mempunyai
efek antidiabetes (Lau 2009). Penggunaan senyawa kuarsetin (flavonoid) dari
daun Annona squamosa juga memiliki efek antidiabetes pada tikus yang
menderita diabetes mellitus (Panda & Kar 2007). Selain itu, senyawa pycnogenol
(flavonoid) dari ekstrak Pinus maritima mempunyai efek antidiabetes dan mampu
menurunkan stress oksidatif tikus yang menderita diabetes mellitus, sehingga
senyawa tersebut dapat menghambat terjadinya komplikasi penyakit pada
penderita diabetes mellitus (Jankyova et al. 2009).

Radikal Bebas
Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron sehingga molekul
tersebut tidak stabil dan sangat reaktif berusaha mengambil elektron dari molekul
atau sel lain (Betteridge 2000). Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh
seperti hasil oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di
mitokondria, atau oksidasi ion-ion logam transisi. Selain itu, radikal bebas dapat
berasal dari luar tubuh seperti asap rokok, asap kendaraan bermotor, hasil
penyinaran sinar ultra violet, bahan kimia dalam makanan, dan polutan lainnya
(Murray 2003).
Contoh akibat adanya radikal bebas dari luar tubuh adalah terkenanya
lapisan kulit oleh sinar UV. Peristiwa ini bila terjadi dalam jangka waktu lama
akan membentuk lapisan atau titik hitam pada kulit akibat rusaknya lapisan kulit
yang terdiri dari senyawa lipid dan protein (Nakayama et al. 2003). Beberapa
contoh lain kerusakan di dalam tubuh yang dapat timbul akibat radikal bebas dari
luar tubuh adalah kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran
sel. Kerusakan tersebut menyebabkan penyakit yang bersifat kronis, yaitu
dibutuhkan waktu untuk penyakit tersebut menjadi nyata (terjadi akumulasi dalam
tubuh). Radikal bebas yang biasa terdapat di dalam tubuh dan dapat merusak
berasal dari turunan oksigen reaktif. Contoh oksigen reaktif ini mencakup
superoksida (O2`), hidroksil (`OH), peroksil (ROO`), hidrogen peroksida (H2O2),
singlet oksigen (O`), oksida nitrit (NO`), peroksinitrit (ONOO`) dan asam
hipoklorit (HOCl) (Murray 2003).
Radikal bebas, baik dari dalam maupun luar tubuh terjadi melalui tahaptahap mekanisme reaksi dan menimbulkan reaksi berantai sehingga radikal bebas
yang terbentuk semakin banyak. Tahap pertama adalah pembentukan awal radikal
bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan
tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal
bebas stabil dan tak reaktif. Mekanisme reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut
(Hart et al. 2003):
Inisiasi
RH + OH

R* + H2O

Propagasi
R* + O2

ROO-

ROO- + RH

ROOH + R*

Terminasi
ROO- + ROO-

ROOR + O2

ROO- + R*

ROOR

R* + R*

RR

Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisir radikal bebas dan
mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal,
protein, dan lemak dengan cara melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki
radikal bebas sehingga senyawa radikal bebas tersebut stabil dan menghambat
terjadinya reaksi berantai dari pembentukkan radikal bebas. Berdasarkan cara
kerjanya, antioksidan terbagi menjadi dua bagian, yaitu antioksidan pelindung
merupakan antioksidan yang mereduksi rantai inisiasi radikal bebas, kemudian
yang kedua antioksidan pemutus rantai propagasi radikal bebas. Selain itu,
berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan dari dalam tubuh
(endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Antioksidan endogen contohnya seperti
superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH.Prx).
Enzim-enzim ini bekerja menetralkan senyawa-senyawa radikal bebas hasil
metabolisme tubuh atau radikal bebas dari luar tubuh.

Antioksidan eksogen

contohnya berupa vitamin dan senyawa bioaktif dari tumbuhan, seperti αtokoferol (vitamin E), beta karoten (vitamin A), dan asam askorbat (vitamin C)
(Murray 2003) (Gambar 2).

Flavonoid

Gambar 2 Beberapa senyawa antioksidan eksogen (Murray 2003, Hans & Heldt
2005)

Secara umum, senyawa bioaktif dari tumbuhan yang memiliki aktivitas
antioksidasi merupakan golongan flavonoid (Harborne & William 2000). Namun
selain flavonoid, golongan tanin dan alkaloid juga mempunyai aktivitas
antioksidasi. Senyawa-senyawa tersebut banyak terdapat di sayuran dan buah
(Hans & Heldt 2005). Oleh karena itu, mengkonsumsi buah dan sayuran yang
cukup akan membantu kerja tubuh untuk menurunkan kadar senyawa-senyawa
radikal bebas. Bagi penderita diabetes mellitus, hal tersebut akan menurunkan
tingkat peroksidasi lipid, karena terdapat banyak kasus diabetes mellitus yang
terjadi peningkatan lipid peroksida (Kalaivanam et al. 2006). Penelitian dengan
menggunakan kuarsetin (flavonoid) dari daun Annona squamosa memiliki efek
antioksidasi dengan menurunkan kadar lipid peroksida pada tikus yang menderita
diabetes mellitus (Panda & Kar 2007). Selain itu, senyawa polifenol dari Citrus
sinensis mampu menurunkan kadar lipid peroksida (Parmar & Kar 2007).
Inhibitor α-glukosidase
Senyawa yang dapat menghambat kerja katalisis enzim disebut dengan
inhibitor. Senyawa ini merupakan bagian dari modulator enzim yang memberikan
efek negatif terhadap kerja katalisis enzim. Terdapat dua jenis inhibitor, yaitu
yang bersifat reversible dan irreversible. Inhibisi reversible merupakan jenis
inhibisi enzim yang tidak merusak gugus fungsi dari enzim tersebut, hanya
menghambat proses katalisis. Jenis inihibisi reversibel dibagi menjadi tiga jenis,
yaitu competitive, noncompetitive, dan uncompetitive. Inhibisi competitive
merupakan proses inhibisi dengan senyawa inhibitor yang mempunyai tempat
ikatan yang sama dengan tempat ikatan substrat pada enzim. Jenis inhibisi ini
dapat dikurangi dengan menambah jumlah substrat dibandingkan jumlah inhibitor
karena jenis inhibisi ini bersifat kompetisi antara substrat dengan inhibitor. Jenis
yang kedua adalah noncompetitive, merupakan proses inhibisi dengan senyawa
inhibitor yang mempunyai tempat ikatan yang berbeda dengan tempat ikatan
substrat pada enzim. Jenis inhibisi ini dapat terjadi walaupun enzim telah
berikatan dengan substrat karena tidak bersifat kompetisi. Jenis yang terakhir
adalah uncompetitive, yaitu jenis inhibisi yang dapat terjadi bila suatu enzim telah
berikatan dengan substrat. Ketiga macam jenis inihibisi reversible ini dapat

diketahui bila reaksi enzim dengan dan tanpa inhibitor diplotkan ke grafik
Lineweaver-Burk (Gambar 3). Jenis inhibisi kedua adalah inhibisi irreversible.
Jenis inhibisi ini merupakan inhibisi yang dapat merusak struktur atau gugus
fungsi dari enzim sehingga enzim tersebut menjadi tidak aktif. Mekanisme
inhibisi ini merupakan mekanisme yang dimiliki oleh obat-obat tertentu seperti
obat kanker (Stryer 2000). Proses inhibisi ini dapat membantu penderita diabetes
mellitus untuk mengurangi kadar gula darah yang tinggi dengan cara menghambat
kerja enzim yang berperan membantu penyerapan karbohidrat, yaitu enzim αglukosidase.
α-glukosidase (EC 3.2.1.20) merupakan enzim dari golongan hidrolase.
Enzim ini berfungsi mengkatalisis reaksi akhir dari proses penyerapan karbohidrat
di usus. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis ikatan α-1,4 sehingga menghasilkan αD-glukosa (Stuart et al. 2004). Terhambatnya kerja enzim α-glukosidase
menyebabkan

berkurangnya

glukosa

yang diserap oleh

usus sehingga

berkurangnya sumber glukosa yang masuk ke dalam aliran darah. Peristiwa ini
mampu membantu menurunkan keadaan hiperglikemia sehingga penderita
diabetes dapat mengatur kadar glukosa darahnya. Saat ini banyak obat-obat yang
dibuat untuk menghambat (inhibitor) kerja α-glukosidase. Beberapa obat inhibitor
enzim α-glukosidase dapat ditemukan dengan mudah seperti, acarbose, miglitol,
dan voglibose. Namun, saat sekarang banyak penelitian yang telah melaporkan
bahwa banyak ekstrak tumbuhan yang berkhasiat sebagai inhibitor α-glukosidase.
Salah satu penelitian melaporkan bahwa asam triterpen yang diisolaasi dari daun

(a)

(b)

(c)

Gambar 3 Grafik Lineweaver-Burk: (a) inhibisi competitive, (b) noncompetitive,
(c) uncompetitive (Illanes A 2008)

Lagerstroemia speciosa mampu sebagai inhibitor α-glukosidase (Wenli et al.
2009). Selain itu, beberapa ekstrak tumbuhan asal Meksiko yang mengandung
kaempferol seperti Cecropia obtusifolia, Equisetum myriochaetum, Acosmium
panamense, dan Malmea depressa dapat menghambat kerja α-glukosidase secara
in vitro dan in vivo (Cetto et al. 2008).
Analisis Aktivitas Antioksidasi dan Inhibisi α-glukosidase
Analisis aktivitas antioksidasi yang dilakukan dalam percobaan ini
menggunakan dua metode, yaitu metode DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl)
dan TBA (thiobarbituric acid). Kedua metode ini digunakan karena dapat
menunjukkan aktivitas dari ekstrak daun sirih merah sebagai penangkap senyawa
radikal bebas dan penghambat terjadinya peroksidasi lipid. Prinsip metode DPPH
adalah menguji kemampuan penangkapan senyawa radikal bebas (DPPH) oleh
senyawa ekstrak daun sirih merah (Aqil et al. 2006), kemudian prinsip metode
TBA adalah untuk menguji kemampuan ekstrak daun sirih merah menghambat
proses terjadinya peroksidasi lipid (Kikuzaki & Nakatani 1993). Adanya aktivitas
antioksidasi dengan cara menangkap senyawa radikal bebas pada ekstrak daun
sirih merah ini dapat mencegah radikal bebas dari dalam dan luar tubuh untuk
mengganggu proses metabolisme tubuh sehingga dapat mengurangi kemungkinan
terjadinya penyakit diabetes mellitus. Selain itu, kemampuan ekstrak daun sirih
merah menghambat terjadinya proses lipid peroksida dapat membantu penderita
diabetes mellitus kronis yang terjadi komplikasi dengan meningkatnya kadar lipid
peroksida di dalam tubuh. Selain itu, penggunaan konsentrasi yang sama untuk
kedua metode tersebut adalah untuk mempermudah melihat aktivitas ekstrak daun
sirih merah sebagai penangkap senyawa radikal bebas dan penghambat proses
peroksidasi lipid. Penggunaan α-tokoferol (vitamin E) dalam metode ini bertujuan
sebagai pembanding karena α-tokoferol telah diketahui merupakan senyawa
antioksidan (Linder 2006). Konsentrasi yang digunakan adalah 200 ppm
berdasarkan jumlah maksimum dalam makanan yang diperbolehkan dalam
peraturan Uni Eropa (Pokorny et al. 2001).
Selain aktivitas antioksidasi, ekstrak daun sirih merah dianalisis aktivitasnya
sebagai inhibitor α-glukosidase. Terhambatnya kerja enzim ini akan membantu

mengurangi penyerapan glukosa oleh usus sehingga tingginya kadar glukosa
darah pada penderita diabetes mellitus dapat diturunkan. Senyawa pembanding
menggunakan acarbose, yaitu senyawa aktif dari obat diabetes mellitus yang
berperan sebagai inhibitor α-glukosidase dengan konsentrasi 1% b/v (Suteja L
2003).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih merah
adalah daun sirih merah 25 gram dan etanol 100 mL. Bahan-bahan untuk analisis
aktivitas antioksidasi metode DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) adalah
larutan DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) (Sigma Aldrich), metanol, dan αtokoferol (vitamin E) (Sigma Aldrich). Bahan-bahan untuk penentuan waktu
inkubasi asam linoleat, analisis aktivitas antioksidasi, dan pembuatan kurva
standar metode TBA adalah buffer fosfat 0,1 M pH 7, asam linoleat 50 mM
(Sigma Aldrich), etanol absolut, α-tokoferol (vitamin E) (Sigma Aldrich), TCA
(trichloroacetic acid) 20%, TBA (tiobarbituric acid) 1% (Sigma Aldrich), asam
asetat 50%, dan TMP (1,1,3,3-tetrametoksipropana) (Sigma Aldrich). Bahanbahan untuk analisis inhibisi dan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase adalah
enzim α-glukosidase (Sigma Aldrich), 0,1 M buffer fosfat pH 7, DMSO, 0,02 M
p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (Sigma Aldrich), 0,2 M Na2CO3, dan acarbose.
Bahan-bahan untuk analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih
merah adalah larutan pendukung perangkat GC-MS (Gas Chromatography Mass
Spectro).
Alat-alat yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih merah adalah
labu Erlenmeyer, rotavapor, lemari pendingin, dan freeze dryer. Alat-alat untuk
analisis aktivitas antioksidasi metode DPPH adalah autopipet, tabung reaksi, gelas
ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip, corong, botol gelap, vortex,
kuvet, dan spektrofotometer (Hitachi U-2800). Alat-alat penentuan waktu
inkubasi asam linoleat, analisis aktivitas antioksidasi, dan pembuatan kurva
standar metode TBA adalah autopipet, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur,
batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip, pemanas, termometer, neraca analitik,
gelas piala, botol gelap, vortex, kuvet, spektrofotometer (Genesys 10 UV 1901100 nm), sentrifus (Hettich Universal Sentrifuse, 0-6000 rpm), dan tabung
sentrifus. Alat-alat untuk analisis inhibitor enzim α-glukosidase adalah autopipet,
tabung reaksi, pemanas, gelas ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip,
termometer, neraca analitik, gelas piala, vortex, kuvet, dan spektrofotometer. Alat-

alat untuk analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah
adalah kolom, detektor, dan perangkat pendukung GC-MS (Agilent 6890N).

Metode Penelitian

Ekstraksi Daun Sirih Merah Cara Maserasi (Harborne 1987)
Daun sirih merah sebanyak 25 g diekstrak dengan 100 mL etanol 70% dan
dimaserasi pada suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya disaring menggunakan
kertas saring, kemudian dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 50 °C sehingga
diperoleh ekstrak kasar. Ekstrak kasar tersebut dikeringkan dengan freeze dryer
dengan suhu – 50 °C dan tekanan 8 mBar. Rendemen dihitung dengan rumus
sebagai berikut:
Rendemen (%) = bobot ekstrak x 100%
bobot daun

Analisis Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah dengan Metode
TBA (thiobarbituric acid) (Kikuzaki & Nakatani 1993)
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat ditentukan dengan menggunakan 6
mL buffer fosfat 0,1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM
dalam etanol 99,8%, dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL
campuran ditempatkan di botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu
40 °C. Pengukuran intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL
campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA
20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi
diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan
disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit. Kemudian panjang
gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan
setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL
campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7.0, kemudian
ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan
blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah
dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit.

Analisis antioksidasi ekstrak daun sirih merah sebagai larutan sampel dibuat
dalam konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil
sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 2 mL
asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL
α-tokoferol, 2 mL bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam
etanol 99,8%, sedangkan larutan kontrol negatif ditambahkan 1 mL air bebas ion,
2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol
99.8%.
Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di
penangas 40°C selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA. Pada hari
waktu inkubasi optimum, dilakukan pengukuran MDA (malondialdehida) melalui
metode TBA dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan
2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%.
Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah
dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit. Kemudian
panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko
digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99,8 % dan 2 mL buffer fosfat 0,1 M pH
7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50
%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10
menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15
menit. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP) dengan konsentrasi 1, 2.5, 5, 7.5, dan 10 µM. Tiap
larutan dipipet 1 mL dan ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan
TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air
100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5
g selama 15 menit. Serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan
blanko menggunakan 1 mL akuades yang diberi perlakuan seperti larutan
konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP). Persentase daya hambat ekstrak
dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% daya hambat = [MDA] kontrol negatif – [MDA] ekstrak x 100%
[MDA] kontrol negatif

Analisis Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah dengan Metode
DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) (Aqil et al. 2006)
Penentuan aktivitas antioksidasi dengan metode DPPH menggunakan 2 mL
ekstrak 70% daun sirih merah dengan berbagai konsentrasi (25, 50, 75, 100, 200
ppm). Ekstrak tersebut dicampurkan dengan 0,1 mM DPPH 2 mL (larutan DPPH
di dalam metanol). Larutan kontrol adalah 2 mL larutan DPPH dicampurkan
dengan 2 mL metanol. Selanjutnya diinkkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.
Reduksi dari sejumlah konsentrasi DPPH dihitung serapannya dengan panjang
gelombang 517 nm. Senyawa α-tokoferol dengan berbagai konsentrasi (1, 2.5, 5,
7.5, 10 ppm)digunakan sebagai pembanding. Persentase daya hambat dapat
dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% daya hambat = absorban kontrol – absorban ekstrak x 100%
absorban kontrol
Analisis Ekstrak Daun Sirih Merah Sebagai Inhibitor Enzim α-glukosidase
(Suteja L 2003)
Enzim α-glukosidase sebanyak 0,5 mg dilarutkan dengan 0,1 M buffer
fosfat pH 7 yang mengandung 100 mg BSA (Bovine Serum Albumin). Sebelum
digunakan enzim diencerkan 25 kali dengan 0.1 M buffer fosfat pH 7.
Selanjutnya untuk sistem reaksi enzim terdiri dari 500 µL 20 mM p-nitrofenil-αD-glukopiranosida (substrat), 980 µL buffer fosfat 0,1 M pH 7, 20 µL ekstrak
dengan konsentrasi 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, dan 1% b/v dalam DMSO
(dimethylsulfoxide). Campuran reaksi diinkubasi suhu 37 °C selama 5 menit.
Reaksi enzimatis dimulai dengan mencampurkan 500 µL enzim dengan pereaksi
lainnya dan diinkubasi 37 °C selama 15 menit. Produk yang terbentuk dari reaksi
enzimatis tersebut adalah p-nitrofenol (pNP). Reaksi dihentikan dengan
penambahan 2 mL 200 mM Na2CO3 dan diukur serapannya dengan panjang
gelombang 400 nm. Larutan pembanding menggunakan acarbose dengan
konsentrasi 1%. Analisis kinetik inhibisi menggunakan dua sistem reaksi, yaitu
substrat dengan konsentrasi berbeda (5, 10, 15, 20, 25 mM) dicampurkan dengan
enzim dan yang kedua menggunakan ekstrak daun sirih merah sebagai inhibitor
(konsentrasi ekstrak 1%). Pembuatan kurva standar dilakukan dengan
menggunakan larutan p-nitrofenol (pNP) dengan konsentrasi 1, 2,5, 5, 7,5, 10,

12,5, dan 15 µM. Larutan blanko menggunakan larutan buffer fosfat 0,1 M pH 7
(pelarut larutan standar p-nitrofenol) Serapannya diukur pada panjang gelombang
400 nm. Persentase daya hambat ekstrak dapat dihitung dengan menggunakan
rumus sebagai berikut:
% daya hambat = [pNP] kontrol negatif – [pNP] ekstrak x 100%
[pNP] kontrol negatif
Analisis Komponen Senyawa Ekstrak Etanol 70% Daun Sirih Merah
Menggunakan GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry)
Ekstrak etanol 70% daun sirih merah dideteksi komponen senyawanya
dengan GC-MS. Ekstrak etanol 70% sebanyak 842,1 mg dilarutkan dengan 1 mL
etanol 99% dan diinjeksikan sebanyak 1 µL. Kondisi GC-MS menggunakan
kolom kapiler HP-5 (Agilent 19091J-433: 0,25 mm x 30 m x 0,25 µm
mengandung 5% difenil 95% dimetilpolisilosan), laju alir yang digunakan adalah
1,0 mL/menit dengan suhu injeksi 300 °C mode split, dan tekanan 10,47 psi. Gas
pembawa yang digunakan adalah He (Helium). Parameter MS yang digunakan
adalah mendeteksi senyawa dengan massa 50-800. Kondisi MS adalah suhu MS
quad 150-200 °C dan suhu MS source 250-300 °C. Hasil kromatogram dianalisis
dengan database, untuk menentukan komponen senyawa yang terdapat di dalam
ekstrak.

Analisis Data
Pengolahan data dari pengukuran aktivitas antioksidasi dan analisis inhibitor
enzim α-glukosidase dilakukan dengan Anova (Analysis of Variance) dengan
model rancangan percobaan RAL (Rancangan Acak Lengkap). Selanjutnya bila
terdapat perbedaan yang nyata dilakukan dengan uji lanjut Duncan. Model
rancangan tersebut adalah:
Yij =

+ + εij

keterangan:
 = Pengaruh rataan umum
λi = Pengaruh perlakuan (konsentrasi ekstrak) ke-i, i = 1,2,3,..,6
ij= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1,2,3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Daun Sirih Merah
Hasil ekstraksi etanol 70% didapatkan rerata rendemen dari 25 g daun sirih
merah segar adalah 4,42% (1,1195 g) (Data lengkap pada Lampiran 9). Hasil
rendemen ini lebih besar dari ekstrak etanol 30% daun sirih merah sebesar 2,47%
dengan bobot daun 30,8416 g dan bobot ekstrak 0,7633 g (Marlina PW 2008), hal
ini menunjukkan bahwa etanol dengan kadar yang lebih tinggi dapat mengekstrak
senyawa-senyawa bioaktif dari daun sirih merah lebih banyak dibandingkan
dengan etanol dengan kadar yang lebih rendah. Ekstraksi merupakan salah satu
cara untuk memisahkan satu atau lebih senyawa dari suatu bahan. Bahan tersebut
dapat berupa suatu jaringan atau organ tumbuhan. Metode ekstraksi yang
digunakan adalah maserasi. Metode ini dilakukan dengan cara merendam jaringan
atau organ tumbuhan dengan larutan yang tepat untuk mendapatkan senyawa yang
diinginkan (Harborne 1987). Maserasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah
daun sirih merah segar yang telah digerus direndam dengan larutan etanol 70%
selama 24 jam. Penggunaan daun yang segar bertujuan untuk mencegah terjadinya
perubahan kimia terhadap senyawa-senyawa yang terdapat di daun sehingga tidak
merusak senyawa yang diinginkan.
Pemilihan pelarut yang digunakan berdasarkan sifat dari senyawa yang
ingin diekstrak dari daun tersebut, apakah senyawa tersebut bersifat polar atau
nonpolar. Berdasarkan uji fitokimia pada penelitian sebelumnya, bahwa daun sirih
merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan tannin (Safithri & Fahma
2005), maka senyawa-senyawa tersebut bersifat polar terutama flavonoid. Oleh
karena itu, penggunaan etanol merupakan pelarut yang tepat untuk mengekstrak
senyawa-senyawa tersebut. Selain etanol, pelarut-pelarut lain yang dapat
digunakan untuk mengekstrak senyawa bersifat polar adalah metanol dan aseton,
namun tingkat toksisitasnya lebih tinggi dibandingkan dengan etanol (Harborne
1987). Walaupun etanol merupakan pelarut yang tepat, namun perlu dilakukan hal
yang dapat membantu proses ekstraksi menjadi lebih efesien, yaitu penggerusan
daun. Penggerusan ini bertujuan untuk memperbesar peluang terlarutnya
senyawa-senyawa yang ingin diekstrak dengan etanol karena dengan adanya

penggerusan maka dinding dan membran sel daun akan rusak sehingga
memudahkan etanol berinteraksi dengan senyawa-senyawa yang ingin diekstrak.
Penggunaan etanol 70% dalam maserasi ini bertujuan untuk dapat
mengekstrak senyawa aktif yang bersifat polar atau semipolar. Selain itu dapat
mencegah berkembangnya mikroba karena penggunaan daun segar rentan
terkontaminasi mikroba. Setelah dimaserasi, larutan tersebut dipekatkan dengan
rotavapor dengan suhu 50 °C. Penggunaan suhu 50 °C ini bertujuan untuk
mencegah rusaknya senyawa yang diekstrak oleh suhu tinggi. Setelah itu ekstrak
dikeringkan dengan freeze dryer untuk menghilangkan pelarut-pelarut yang masih
terdapat dari hasil pemekatan dengan rotavapor.

Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Metode TBA)
Hasil percobaan penentuan waktu inkubasi asam linoleat menunjukkan
kadar MDA dari hari ke-0 hingga hari ke-6 mengalami peningkatan dan setelah
hari ke-6 mengalami penurunan. Pembentukan MDA sebagai produk hasil
oksidasi asam linoleat terjadi maksimum di hari ke-6 (Gambar 4). Proses ini dapat
ditentukan karena ada lonjakan tinggi kadar MDA dari hari sebelumnya (hari ke5) dan hari berikutnya (hari ke-7) terjadi penurunan kadar MDA (Data lengkap
pada Lampiran 10). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa ekstrak etanol
70% daun sirih merah memiliki kemampuan menghambat terjadinya oksidasi
asam linoleat. Aktivitas ini dapat ditunjukkan dengan rendahnya kadar MDA
setiap konsentrasi dari ekstrak etanol 70% daun sirih merah dibandingkan dengan

Gambar 4 Kurva kadar MDA terhadap waktu

kontrol negatif (larutan asam linoleat tanpa ekstrak) (Gambar 5). Peningkatan
konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah berbanding terbalik dengan
kadar MDA yang terbentuk. Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah
terbesar (200 ppm) memiliki kadar MDA terkecil (1,0586 µM) dibandingkan
dengan konsentrasi lainnya. Konsentrasi esktrak etanol 70% daun sirih merah 200
ppm memiliki daya hambat terbesar, yaitu 80,40%. Kemampuan menghambat
pembentukkan MDA sekitar 50% dimiliki oleh esktrak etanol 70% daun sirih
merah 50 ppm, yaitu sebesar 56,30%. Daya hambat terkecil dimiliki ekstrak
etanol 70% daun sirih merah dengan konsentrasi 25 ppm, yaitu 44,31% dan nilai
ini merupakan setengah dari daya hambat konsentrasi terbesar (200 ppm) ekstrak
etanol 70% daun sirih merah. Oleh karena itu, konsentrasi 25 ppm ekstrak etanol
70%