3.3Prosedur Percobaan 3.3.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit jantan dewasa Mus musculus L. sebagai hewan percobaan. Kisaran umur mencit yang digunakan sekitar dua bulan
dengan berat badan 20-22 gram, sebelum diberi perlakuan, 24 ekor mencit jantan dewasa yang digunakan sebagai percobaan diaklimatisasi selama 7 hari. Kandang
yang digunakan selama pemeliharaan berupa bak plastik yang berukuran panjang 39 cm, lebar 31 cm dan tinggi 15 cm yang ditutup dengan penutup kawat, dialasi
dengan sekam dan diberi pakan setiap hari selama 35 hari.
3.3.2Pembuatan Jus Buah delimaPunica granatum L.
Jus buah delima dibuat dari buah delima merah produk lokal. Setelah dipetik, buah delima dicuci bersih. Buah dikupas dari kulitnya. Ditimbang buah
sebanyak 250 gram. Diblender buah delima dan disaring. Jus buah delima dibuat dalam konsentrasi yang berbeda yaitu 4, 5 dan 6 dengan penambahan
akuades sebanyak 100 ml, jus buah delima disimpan dilemari es pada suhu 4 C
Aviram et al, 2000.
3.3.3 Pembuatan Ekstrak Daun Tembakau Nicotiana tabaccum L.
Daun tembakau dipotong kecil-kecil, dikeringanginkan selama 48 jam, diblender sampai berbentuk serbuk, ditimbang daun tembakau sebanyak 800 g, dimasukan
kedalam botol dan dimeserasi serbuk daun tembakau dengan reagen methanol selama 48 jam sampai terendam. Hasil meserasi disaring dengan kertas saring dan
diperoleh filtrat. Residu yang ada direndam kembali dengan pelarut methanol 96 . Hal ini dilakukan secara berulang hingga diperoleh filtrat jernih. Kemudian
filtrat yang diperoleh dipisahkan dengan rotavapor, filtrat dimasukkan kedalam beaker glass.
Ekstrak diasamkan dengan penambahan HCl 2N sampai PH=2 yang dicek dengan kertas lakmus, diekstraksi dengan CHCl
3
untuk menghilangkan senyawa organic non alkaloid, filtrate dimasukkan kedalam corong pemisah,dimasukkan
kedalam beaker glass, ditambahkan filtrat dengan NaOH sampai PH=10 yang dicek dengan kertas lakmus, ditambahkan CHCl
3
, dipisahkan dengan corong pemisah, diuapkan sampai menghasilkan ekstrak kental sebanyak 4,653 gram
Harbone,J.B, 1998. Dilarutkan ekstrak sebanyak 46,53 mg dengan akuades sebanyak 100 ml dengan dosis 0.121 mgbb Nugraheni et al., 2003.
3.3.4 Pemberian Perlakuan
Pada perlakuan kontrol negatif K0 mencit hanya diberi akuades saja. Pada perlakuan kontrol positif K1 mencit hanya diberi ekstrak daun tembakau
sebanyak 0,1 ml, dan pada kontrol positif K2 mencit diberi jus buah delima sebanyak 0,1 ml. Pada perlakuan 1 P1 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus
buah delima dengan konsentrasi 4 sebanyak 0,1 ml dan pada perlakuan 2 P2 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus buah delima dengan konsentrai 5
sebanyak 0,1 ml dan perlakuan 3 P3 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus buah delima dengan konsentrasi 6 sebanyak 0,1 ml. Dosis pemberian ekstrak
tembakau sebanyak 0.121 mg0,1 mlhari. Dosis jus buah delima dengan berat 250g untuk mencit yaitu 0,1 mlhari wahyuni etal., 2013. Pemberian jus buah
delima yaitu 0,1 ml pada mencit. Hal ini dikarenakan kapasitas lambung mencit 1 ml Suganto, 2011. Pemberian ekstrak daun tembakau dan jus buah delima
menggunakan jarum gavage yang diberikan setiap hari selama 35 hari dan dilakukan pembedahan dan pengamatan spermatozoa pada hari ke 36.
3.4Variabel yang diamati 3.4.1 Jumlah spermatozoa
Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang
berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa. Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µL , dimasukkan ke
dalam kotak hemositometerImproved Neubauer dan ditutup dengan cover glass. Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali dan
dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa.
Gambar 3.3.5.1Kamar Hitung Improved Neubauer Zaneveld et al., 1986
Pengamatan jumlah sperma dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983, Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam rumus:
Jumlah spermatozoa = N2 x 10
5
spermatozoaml suspensi Dimana, N = Jumlah spermatozoa yang dihitung dalam kotak
10
5
= Bidang permukaan kamar hitung 3.4.2 Morfologi Spermatozoa
Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi
NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa.Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µ L, dimasukkan ke dalam
kotak hemositometerImproved Neubauerdan ditutup dengan cover glass.Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400
kali dan dilakukan perhitungan persentase jumlah spermatozoa yang normal dan abnormal.
Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan kauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya.
Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma yang abnormal mempunyai bentuk kepala tidak
beraturan, dapat berbentuk seperti kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan amorphus, atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak
lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala WHO, 1988.
Spermatozoa normal Spermatozoa Normal = x 100
100 spermatozoa normalabnormal 3.4.3 Viabilitas Spermatozoa
Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang
berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa. Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µL, dimasukkan ke
dalam kotak hemositometerImproved Neubauer,diberi giemsa 3 dan ditutup dengan cover glass. Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 400 kali dan dilakukan perhitungan viabilitas spermatozoa. Spermatozoa yang hidup tidak berwarna dan yang mati berwarna
kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400x dan dihitung terhadap 100-200 spermatozoa. Sebagai hasilnya dinyatakan
dalam bentuk persen hidup yang didapat dari hasil bagi jumlah spermatozoa hidup dengan jumlah total spermatozoa hidup dan mati yang dikalikan dengan 100
WHO, 1988.
spermatozoa hidup Spermatozoa Hidup = x 100
100 spermatozoa hidupmati 3.4.4 Motilitas Spermatozoa
Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang
berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa.Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µ L, dimasukkan ke
dalam kotak hemositometerImproved Neubauer dan ditutup dengan cover glass.Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400
kali dan dilakukan perhitungan motilitas spermatozoayang bergerak cepat, tidak bergerak, dan bergerak lamban WHO, 1988.
3.4 Analisis Data
