Deteksi dan identifikasi pineapple mealybug wiltassociated virus penyebab penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple mealybug wilt-associated virus PADA TANAMAN NANAS DI
INDONESIA adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
NIM A451040071
ABSTRAK
RENO TRYONO. Deteksi dan Identifikasi Pineapple mealybug wilt-associated
virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman Nanas di Indonesia. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA dan SOBIR.
Penyakit layu nanas merupakan penyakit penting yang banyak dilaporkan
di banyak negara produsen nanas. Penyakit ini melibatkan adanya partikel virus
Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2,
keberadaan vektor (Dysmicoccus brevipes), dan keadaan lingkungan yang
mendukung terjadinya penyakit. Meskipun demikian, di Indonesia, penyakit ini
relatif baru muncul beberapa tahun terakhir dan belum pernah ada laporan
penelitian mengenai virus yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi PMWaV
yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia.
Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi dan laporan pertama
mengenai keberadaan PMWaV yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Hasil deteksi secara serologi dengan metode Tissue blot immunoassays
(TBIA) menggunakan dua antibodi monoklonal spesifik terhadap PMWaV-1
maupun PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) berhasil mendeteksi keberadaan PMWaV1 dan PMWaV-2 pada jaringan daun tanaman nanas yang menunjukkan maupun
dari yang tidak menunjukkan gejala layu. Pendeteksian secara molekuler dengan
metode reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan
dua primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil
mengamplifikasi gen Heat Shock Protein 70 (HSP 70) pada kedua virus.
Penemuan ini mengindikasikan bahwa PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi
dengan penyakit layu nanas yang terjadi di Indonesia. Analisis protein
menggunakan sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) menunjukkan adanya sebuah struktural protein besar dengan perkiraan
ukuran sebesar 23 kDa. Keberadaan partikel virus berbentuk batang lentur juga
teramati pada preparasi mikroskop elektron yang berasal dari tanaman nanas yang
terinfeksi virus. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron ini sesuai
dengan ciri-ciri virus dari anggota Closterovirus. Analisis parsial genom HSP 70
virus layu nanas isolat Indonesia menunjukkan kisaran homologi sebesar 96
hingga 98% dengan PMWaV-1 dan PMWaV-2. Selain itu, analisis filogenetik
menunjukkan bahwa isolat PMWaV Indonesia dan Hawaii merupakan anggota
Closterovirus yang ditularkan oleh kutu putih, dan memiliki hubungan
kekerabatan yang dekat dengan Grapevine leafroll-associated virus-3 (GLRaV-3).
Kata kunci: penyakit layu nanas, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
ABSTRACT
RENO TRYONO. Detection and Identification of Pineapple mealybug wiltassociated virus Causing Wilt Disease on Pineapple in Indonesia. Under
supervised of GEDE SUASTIKA and SOBIR.
Field surveys on pineapple wilt disease were conducted on pineapple
production areas in Subang, West Java, Indonesia. The disease was characterized
by severe tip dieback, downward curling, reddening, and wilting of the leaves
which can lead to total collapse of the plant.
The objective of the research is to identify the viruses causing wilt disease
on pineapple in Indonesia. Tissue blot immunoassays (TBIAs) using two different
antibodies specific to either Pineapple mealybug wilt-associated virus-1
(PMWaV-1) or PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) successfully detected the viruses in
leaf tissues from both symptomatic and asymptomatic pineapple plants. A reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assays using oligonucleotide
primers specific to HSP 70 gene of PMWaV-1 and PMWaV-2 were also
successfully amplified the regions succesfully. These finding indicated that both
closteroviruses were associated with wilt disease on pineapple plants in Indonesia.
Protein analysis by using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) revealed that the viruses have a major structural
protein with molecular mass of approximately kDa. Flexuous filamentous
particles were also observed in electron microscopy preparations from infected
plants. These results were in agreement with characteritics of the closteroviruses.
Aligments of partial nucleotide sequences of the viral genomes exhibited 96 to
98% homology with that of PMWaV-1 and PMWaV-2 Hawaiian isolates as
previously reported by Sether et al. (2001), respectively. Phylogenetic analysis
revealed that Indonesian and Hawaiian virus isolates were belong to mealybugtransmitted closterovirus and closely related to Grapevine leafroll-associated
virus-3 (GLRaV-3).
Key word: pineapple wilt disease, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis
Dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
Bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Entomologi-Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Deteksi dan Identifikasi Pineapple Mealybug Wiltassociated Virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman
Nanas di Indonesia
: Reno Tryono
: A451040071
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
Ketua
Dr. Ir. Sobir, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Entomologi – Fitopatologi
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc.
Tanggal Ujian: 8 Agustus 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2005 hingga April 2006 ini
adalah deteksi virus tanaman, dengan judul “Deteksi dan Identifikasi pineapple
mealybug wilt-associated virus pada Tanaman Nanas di Indonesia”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. dan Dr.
Ir. Sobir, M.Si., selaku komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan
masukannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
Terima kasih juga kepada Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB yang telah
mengalokasikan anggaran dana untuk penelitian ini sebagai bentuk kerjasama
penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr. selaku
penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam
penyempurnaan tulisan dalam tesis ini. Terima kasih juga kepada Dekan Sekolah
Pascasarjana IPB, Ketua Program Studi Entomologi-Fitopatologi IPB atas
kesediaan menerima penulis untuk studi di Sekolah Pascasarjana IPB, dan kepada
Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Faperta IPB
atas izin penggunaan bahan dan peralatan laboratorium yang digunakan selama
penelitian.
Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah, Ibu, kakak, adik-adik,
serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis juga
mengucapkan banyak terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa EntomologiFitopatologi, rekan-rekan mahasiswa di Laboratorium Virologi Tumbuhan Faperta
IPB, dan saudari Tuti Legiastuti, S.Si yang telah banyak membantu dalam
penelitian ini. Rasa terima kasih yang tulus juga penulis ucapkan kepada Anna
Safarrida, S.Si atas dukungan moril yang selalu menjadi motivasi penulis.
Semoga penelitian ini bermanfaat dalam menambah khazanah ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1982 dari ayah
Kaselan dan ibu Titin Sukmawati sebagai putra ketiga dari lima bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMUN 1
Cikarang Bekasi pada tahun 1999. Pendidikan Sarjana diselesaikan oleh penulis
pada tahun 2004 dari Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian
Universitas Brawijaya, Malang. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi
di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Program Studi EntomologiFitopatologi. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam organisasi Forum
Mahasiswa Pascasarjana sebagai wakil ketua periode 2005-2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
PENDAHULUAN ...................................................................................
Latar Belakang ...............................................................................
Tujuan penelitian ............................................................................
Hipotesis .........................................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
1
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................
Gejala Penyakit Layu Nanas ..........................................................
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV ...........................................
Distribusi Geografi PMWaV .........................................................
Ciri-ciri PMWaV .............................................................................
Metode Deteksi PMWaV ...............................................................
4
4
5
6
7
9
BAHAN DAN METODE ........................................................................
Tempat dan Waktu Penelitian .........................................................
Metode Penelitian ..........................................................................
Bahan Penelitian .......................................................................
Tissue Blot Immunoassay (TBIA) .............................................
Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Purifikasi Virus .........................................................................
SDS-PAGE dan Western Blotting .............................................
Mikroskopi Elektron .................................................................
Perunutan Nukleotida ................................................................
10
10
10
10
10
11
12
13
15
15
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Deteksi PMWaV dengan TBIA ......................................................
Pemurnian PMWaV dan Visualisasi Visualisasi Morfologi
Partikel PMWaV dengan Mikroskop .............................................
Analisis Protein Selubung PMWaV dengan SDS-PAGE dan
Western Blotting .............................................................................
Deteksi Asam Nukleat PMWaV dengan RT-PCR .........................
Analisis Runutan dan Hubungan Kekerabatan PMWaV Indonesia
dengan Anggota Famili Closterovirus Lainnya .............................
16
16
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................
Kesimpulan ....................................................................................
Saran ...............................................................................................
31
31
31
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
32
LAMPIRAN .............................................................................................
34
18
21
24
25
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple mealybug wilt-associated virus PADA TANAMAN NANAS DI
INDONESIA adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
NIM A451040071
ABSTRAK
RENO TRYONO. Deteksi dan Identifikasi Pineapple mealybug wilt-associated
virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman Nanas di Indonesia. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA dan SOBIR.
Penyakit layu nanas merupakan penyakit penting yang banyak dilaporkan
di banyak negara produsen nanas. Penyakit ini melibatkan adanya partikel virus
Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2,
keberadaan vektor (Dysmicoccus brevipes), dan keadaan lingkungan yang
mendukung terjadinya penyakit. Meskipun demikian, di Indonesia, penyakit ini
relatif baru muncul beberapa tahun terakhir dan belum pernah ada laporan
penelitian mengenai virus yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi PMWaV
yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia.
Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi dan laporan pertama
mengenai keberadaan PMWaV yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Hasil deteksi secara serologi dengan metode Tissue blot immunoassays
(TBIA) menggunakan dua antibodi monoklonal spesifik terhadap PMWaV-1
maupun PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) berhasil mendeteksi keberadaan PMWaV1 dan PMWaV-2 pada jaringan daun tanaman nanas yang menunjukkan maupun
dari yang tidak menunjukkan gejala layu. Pendeteksian secara molekuler dengan
metode reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan
dua primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil
mengamplifikasi gen Heat Shock Protein 70 (HSP 70) pada kedua virus.
Penemuan ini mengindikasikan bahwa PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi
dengan penyakit layu nanas yang terjadi di Indonesia. Analisis protein
menggunakan sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) menunjukkan adanya sebuah struktural protein besar dengan perkiraan
ukuran sebesar 23 kDa. Keberadaan partikel virus berbentuk batang lentur juga
teramati pada preparasi mikroskop elektron yang berasal dari tanaman nanas yang
terinfeksi virus. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron ini sesuai
dengan ciri-ciri virus dari anggota Closterovirus. Analisis parsial genom HSP 70
virus layu nanas isolat Indonesia menunjukkan kisaran homologi sebesar 96
hingga 98% dengan PMWaV-1 dan PMWaV-2. Selain itu, analisis filogenetik
menunjukkan bahwa isolat PMWaV Indonesia dan Hawaii merupakan anggota
Closterovirus yang ditularkan oleh kutu putih, dan memiliki hubungan
kekerabatan yang dekat dengan Grapevine leafroll-associated virus-3 (GLRaV-3).
Kata kunci: penyakit layu nanas, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
ABSTRACT
RENO TRYONO. Detection and Identification of Pineapple mealybug wiltassociated virus Causing Wilt Disease on Pineapple in Indonesia. Under
supervised of GEDE SUASTIKA and SOBIR.
Field surveys on pineapple wilt disease were conducted on pineapple
production areas in Subang, West Java, Indonesia. The disease was characterized
by severe tip dieback, downward curling, reddening, and wilting of the leaves
which can lead to total collapse of the plant.
The objective of the research is to identify the viruses causing wilt disease
on pineapple in Indonesia. Tissue blot immunoassays (TBIAs) using two different
antibodies specific to either Pineapple mealybug wilt-associated virus-1
(PMWaV-1) or PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) successfully detected the viruses in
leaf tissues from both symptomatic and asymptomatic pineapple plants. A reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assays using oligonucleotide
primers specific to HSP 70 gene of PMWaV-1 and PMWaV-2 were also
successfully amplified the regions succesfully. These finding indicated that both
closteroviruses were associated with wilt disease on pineapple plants in Indonesia.
Protein analysis by using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) revealed that the viruses have a major structural
protein with molecular mass of approximately kDa. Flexuous filamentous
particles were also observed in electron microscopy preparations from infected
plants. These results were in agreement with characteritics of the closteroviruses.
Aligments of partial nucleotide sequences of the viral genomes exhibited 96 to
98% homology with that of PMWaV-1 and PMWaV-2 Hawaiian isolates as
previously reported by Sether et al. (2001), respectively. Phylogenetic analysis
revealed that Indonesian and Hawaiian virus isolates were belong to mealybugtransmitted closterovirus and closely related to Grapevine leafroll-associated
virus-3 (GLRaV-3).
Key word: pineapple wilt disease, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis
Dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
Bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Entomologi-Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Deteksi dan Identifikasi Pineapple Mealybug Wiltassociated Virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman
Nanas di Indonesia
: Reno Tryono
: A451040071
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
Ketua
Dr. Ir. Sobir, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Entomologi – Fitopatologi
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc.
Tanggal Ujian: 8 Agustus 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2005 hingga April 2006 ini
adalah deteksi virus tanaman, dengan judul “Deteksi dan Identifikasi pineapple
mealybug wilt-associated virus pada Tanaman Nanas di Indonesia”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. dan Dr.
Ir. Sobir, M.Si., selaku komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan
masukannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
Terima kasih juga kepada Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB yang telah
mengalokasikan anggaran dana untuk penelitian ini sebagai bentuk kerjasama
penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr. selaku
penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam
penyempurnaan tulisan dalam tesis ini. Terima kasih juga kepada Dekan Sekolah
Pascasarjana IPB, Ketua Program Studi Entomologi-Fitopatologi IPB atas
kesediaan menerima penulis untuk studi di Sekolah Pascasarjana IPB, dan kepada
Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Faperta IPB
atas izin penggunaan bahan dan peralatan laboratorium yang digunakan selama
penelitian.
Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah, Ibu, kakak, adik-adik,
serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis juga
mengucapkan banyak terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa EntomologiFitopatologi, rekan-rekan mahasiswa di Laboratorium Virologi Tumbuhan Faperta
IPB, dan saudari Tuti Legiastuti, S.Si yang telah banyak membantu dalam
penelitian ini. Rasa terima kasih yang tulus juga penulis ucapkan kepada Anna
Safarrida, S.Si atas dukungan moril yang selalu menjadi motivasi penulis.
Semoga penelitian ini bermanfaat dalam menambah khazanah ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1982 dari ayah
Kaselan dan ibu Titin Sukmawati sebagai putra ketiga dari lima bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMUN 1
Cikarang Bekasi pada tahun 1999. Pendidikan Sarjana diselesaikan oleh penulis
pada tahun 2004 dari Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian
Universitas Brawijaya, Malang. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi
di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Program Studi EntomologiFitopatologi. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam organisasi Forum
Mahasiswa Pascasarjana sebagai wakil ketua periode 2005-2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
PENDAHULUAN ...................................................................................
Latar Belakang ...............................................................................
Tujuan penelitian ............................................................................
Hipotesis .........................................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
1
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................
Gejala Penyakit Layu Nanas ..........................................................
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV ...........................................
Distribusi Geografi PMWaV .........................................................
Ciri-ciri PMWaV .............................................................................
Metode Deteksi PMWaV ...............................................................
4
4
5
6
7
9
BAHAN DAN METODE ........................................................................
Tempat dan Waktu Penelitian .........................................................
Metode Penelitian ..........................................................................
Bahan Penelitian .......................................................................
Tissue Blot Immunoassay (TBIA) .............................................
Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Purifikasi Virus .........................................................................
SDS-PAGE dan Western Blotting .............................................
Mikroskopi Elektron .................................................................
Perunutan Nukleotida ................................................................
10
10
10
10
10
11
12
13
15
15
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Deteksi PMWaV dengan TBIA ......................................................
Pemurnian PMWaV dan Visualisasi Visualisasi Morfologi
Partikel PMWaV dengan Mikroskop .............................................
Analisis Protein Selubung PMWaV dengan SDS-PAGE dan
Western Blotting .............................................................................
Deteksi Asam Nukleat PMWaV dengan RT-PCR .........................
Analisis Runutan dan Hubungan Kekerabatan PMWaV Indonesia
dengan Anggota Famili Closterovirus Lainnya .............................
16
16
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................
Kesimpulan ....................................................................................
Saran ...............................................................................................
31
31
31
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
32
LAMPIRAN .............................................................................................
34
18
21
24
25
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Distribusi geografik PMWaV di dunia .................................................
7
2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen
PMWaV-1 dan PMWaV-2 ...................................................................
11
3 Deteksi PMWaVpada Jaringan daun nanas dan beberapa gulma serta
tanaman pisang yang tumbuh di sekitar pertanaman nanas di
Kabupaten Subang ...............................................................................
16
4 Visualisasi partikel PMWaV dengan mikroskop elektron hasil dari
fraksi-fraksi pemurnian virus ...............................................................
21
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil
dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa
Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit ...........
5
2 Partikel PMWaV pada mikroskop elektron .........................................
8
3 Tissue blot dari potongan daun nanas. Kiri: daun nanas sehat (1,2), *)
reaksi tidak spesifik, daun nanas terinfeksi PMWaV-1 (3). Kanan:
daun nanas sehat (1,2,5), daun nanas terinfeksi PMWaV-2 (3,4) .......
18
4 Hasil separasi protein virus dengan SDS-PAGE. Lajur M, low mixture
molecular-weight marker; 1, fraksi 1 pemurnian PMWaV; 2, fraksi 2
pemurnian PMWaV; 3, fraksi 3 pemurnian PMWaV; K, kontrol
larutan penyangga ................................................................................
22
5 Analisis Western Blot terhadap protein selubung PMWaV.
Elektroforesis protein yang telah didenaturasi dilakukan pada 10%
SDS-PAGE. (A). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi
PMWaV-1. (B). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi
PMWaV-2. Lajur 1-5 pada gambar A dan B berturut-turut mewakili
fraksi 1 sampai 5 dari hasil pemurnian virus .......................................
23
6 Deteksi dan diferensiasi PMWaV-1 dan PMWaV-2 menggunakan RTPCR. Lajur 1, 100 bp DNA ladder; lajur 2, tanaman terinfeksi
PMWaV-1; lajur 3, tanaman terinfeksi PMWaV-2, lajur 4, 1 kb plus
DNA ladder; lajur 5 dan 6, tanaman sehat ...........................................
24
7 Alignment antara genom HSP 70 PMWaV Indonesia dengan genom
PMWaV yang terdapat pada Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov). (A)
PMWaV-1, (B) PMWaV-2. ( | ) basa antara kedua sekuen sama, ( )
basa antara kedua sekuen tidak sama, ( - ) delesi/tidak ada basa .......
27
8 Dendogram pohon filogenetik antara isolat PMWaV Indonesia dengan
beberapa anggota Closterovirus. Analisis dilakukan menggunakan
software Clustal W.................................................................................
29
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara penghasil nanas di Asia Tenggara.
Produksi nanas Indonesia pada tahun 2002 tercatat mencapai 300.000 ton yang
menempati posisi tertinggi ketiga setelah Thailand dan Filipina (CABI 2005).
Beberapa tahun terakhir, industri nanas di Indonesia dihadapkan pada suatu
permasalahan penting yaitu munculnya penyakit layu pada tanaman nanas yang
belum pernah dilaporankan sebelumnya. Berdasarkan laporan petani nanas,
penyakit layu nanas muncul di beberapa daerah sentra produksi nanas di Indonesia
seperti Jawa Barat, Jawa Timur, Lampung, dan Sumatera Utara.
Tanaman nanas yang terserang penyakit ini menunjukkan gejala berupa
warna daun tanaman yang terserang menjadi berwarna kuning sampai kemerahan,
daun menggulung ke bawah, pada ujung daun nekrotik, dan tanaman menjadi
layu. Pada keadaan yang sudah parah, tanaman nanas menjadi kerdil dan dapat
roboh akibat terhambatnya perkembangan perakaran tanaman. Penyakit ini juga
dapat menyebabkan kegagalan dalam menghasilkan buah, atau mampu
menghasilkan buah tetapi berukuran lebih kecil dari yang sehat.
Penyakit layu nanas merupakan salah satu penyakit penting pada industri
nanas di dunia. Gejala penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia mirip
dengan gejala penyakit layu tanaman nanas yang telah banyak dilaporkan di
negara-negara
produsen
nanas.
Tanaman
yang
terserang
penyakit
ini
menunjukkan gejala mati pucuk daun yang parah, penggulungan tepi daun ke
bawah, warna daun yang memerah, dan pelayuan daun yang dapat mengarah pada
robohnya seluruh tanaman. Hawaii, sebagai salah satu daerah penghasil nanas
terbesar di dunia, telah banyak mempublikasikan laporan mengenai penyakit layu
pada tanaman nanas, yang dikenal dengan nama mealybug wilt of pineapple
disease (MWP) yang disebabkan oleh pineapple mealybug wilt-associated virus
(PMWaV) (Sether & Hu 2002). Sebelumnya, penyakit layu juga telah menjadi
faktor pembatas penting terhadap produksi nanas di Hawaii pada awal tahun
1900an akibat penyakit ini (Carter 1933).
14
Di Malaysia, penyakit layu nanas menyebabkan tanaman yang terinfeksi
menghasilkan buah yang tidak sesuai kriteria pasar dan buah menjadi tidak cocok
untuk dikalengkan. Selain itu, kejadian penyakit layu nanas pada varietas
Masmerah di Malaysia mencapai antara 0,4% sampai 7,6% (Lim 1985). Di
Hawaii, Sether dan Hu (2002) melaporkan kehilangan hasil nanas sebesar 35%
pada tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas yang diketahui
terinfeksi PMWaV-2.
Beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap penyakit ini melaporkan
bahwa penyakit layu nanas merupakan suatu penyakit yang melibatkan adanya
partikel virus, serangga vektor, dan keadaan lingkungan yang mendukung
munculnya gejala pada tanaman. Partikel virus Pineapple mealybug wiltassociated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2 dilaporkan berhasil diekstrak dari
tanaman nanas yang menunjukkan maupun yang tidak menunjukan gejala
penyakit layu nanas (Sether et al. 2001). Dua spesies kutu putih yaitu
Dysmicoccus brevipes (pink mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dan D.
neobrevipes (grey mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dilaporkan berperan
sebagai vektor PMWaV-1 dan PMWaV-2 di lapang (Sether et al. 1998 ).
Penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia merupakan penyakit baru
yang belum pernah dilaporkan dan dikarakterisasi mengenai dugaan keberadaan
partikel virus penyebab penyakit ini di Indonesia. Deteksi dan identifikasi virus
penyebab penyakit layu nanas merupakan hal penting bagi penentuan strategi
pengendalian penyakit layu nanas. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian
yang dapat mengungkapkan identitas virus yang berasosiasi dengan penyakit layu
yang banyak ditemukan pada tanaman nanas di Indonesia dengan metode deteksi
secara serologi dan identifikasi virus melalui pendekatan biologi molekuler.
15
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi dan mengidentifikasi
partikel virus yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas cv.
Smooth Cayenne di Kabupaten Subang, Jawa Barat, Indonesia.
Hipotesis
PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi dengan gejala penyakit layu pada
tanaman nanas cv. Smooth Cayenne di Indonesia. Isolat PMWaV Indonesia
memiliki ciri-ciri biomolekuler dan runutan nukleotida yang berkerabat dekat
dengan PMWaV asal Hawaii.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam memberikan
informasi mengenai keberadaan PMWaV di Indonesia yang dapat digunakan
sebagai dasar keilmuan bagi Badan Karantina Indonesia untuk menyusun ulang
daftar Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT) Karantina, sehingga aturan
mengenai lalu lintas bahan tanaman dengan negara lain atau antar daerah di
Indonesia dapat disusun lebih tepat lagi.
16
TINJAUAN PUSTAKA
Nanas merupakan tanaman tropis yang dapat dibudidayakan di kisaran
wilayah 25° LU sampai 25° LS. Nanas memiliki banyak varietas yang berbeda
dalam ukuran tanaman dan buah, warna dan rasa daging buah, serta pola duri pada
tepi daunnya (CABI 2005).
Dalam prakteknya, budi daya nanas memiliki beberapa kendala yang salah
satunya adalah serangan hama dan penyakit. Dysmicoccus brevipes merupakan
hama tanaman nanas yang paling serius di dunia. Serangga ini sangat umum di
daerah tropis dan berperan dalam menyebabkan gejala layu nanas pada varietas
Smooth Cayenne dan Masmerah, namun varietas Singapore Spanish menunjukkan
sifat tahan terhadap hama ini (CABI 2005). Selain kerusakan akibat aktivitas
makan, serangga ini juga diketahui berperan sebagai vektor PMWaV yang dapat
menyebabkan penyakit layu pada tanaman nanas (Sether et al. 1998). Tanaman
terinfeksi menjadi merah kekuningan hingga merah terang pada ujung daun yang
segera menjalar ke daun lainnya, tanaman menjadi layu, dan buah yang dihasilkan
kecil. Meskipun demikian, timbulnya gejala penyakit merupakan fenomena
kompleks yang melibatkan adanya partikel virus, D. brevipes, dan faktor
lingkungan yang mendukung terjadinya penyakit (Sether et al. 1998). Penyakit ini
kemudian dikenal dengan nama penyakit layu nanas.
Gejala Penyakit Layu Nanas
Infeksi awal biasanya muncul pada tanaman-tanaman nanas yang berada di
pinggir lahan kemudian menyebar ke tanaman-tanaman di bagian dalam lahan.
Penyakit ini dicirikan dengan adanya gejala mati ujung daun dan kemerahan di
sepanjang daun, diikuti dengan terjadinya perkembangan perubahan warna daun
dari merah ke merah muda, kehilangan kebugaran daun, dan pada akhirnya daun
menjadi layu (Gambar 1).
17
Gambar 1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil
dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa
Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit.
Tanaman yang terinfeksi pada fase awal pertumbuhan tidak membentuk
buah, atau hanya menghasilkan buah yang kecil. Beberapa tanaman, bahkan yang
terlihat sangat layu, dapat pulih selama daun yang bergejala layu pada ujungnya
telah gugur dan daun yang tumbuh baru tumbuh secara normal. Penyakit ini juga
menghambat pertumbuhan akar dan menyebabkan tanaman menjadi layu
(Samson, 1986).
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV
Nanas merupakan satu-satunya tanaman yang diketahui sebagai inang
PMWaV. Meskipun demikian, rumput liar yang tumbuh disekitar tanaman nanas
seperti Andropogon insularis dan Paspalum urvillei diduga dapat menjadi inang
alternatif dari PMWaV (Gunasinghe 1989). Penyakit layu nanas dilaporkan dapat
ditularkan melalui perbanyakan vegetatif tanaman nanas dan melalui vektornya
yaitu D. brevipes. Rohrbach et al. (1988) melaporkan bahwa D. brevipes
merupakan hama kosmopolitan pada tanaman nanas dan merupakan vektor bagi
virus penyebab penyakit layu nanas. Selain itu, D. brevipes bersifat polifagus
dengan kisaran inang lebih dari 100 genus dari 53 famili tanaman, termasuk
beberapa gulma yang tumbuh di sekitar tanaman nanas seperti A. insularis dan P.
urvillei sehingga gulma ini diduga dapat menjadi inang dari PMWaV.
18
Meskipun demikian, hasil berbeda dilaporkan oleh Sether et al. (1998) yang
mendapatkan bahwa tidak ditemukan adanya infeksi PMWaV pada sampel
tanaman yang dikumpulkan dari lapang, yaitu gulma, tumbuhan semak, dan
pohon yang tumbuh disekitar lahan nanas. Sether et al. (1998) juga melaporkan
tidak ada infeksi PMWaV pada Agave, pisang, ketela pohon, Chenopodium,
tembakau, dan rumput-rumputan, dimana tanaman nanasnya sendiri menjadi
terinfeksi setelah diinokulasi dengan D. brevipes yang viruliferous, meskipun
beberapa dari tanaman non-nanas ini dapat dijadikan inang oleh D. brevipes.
Penyakit layu nanas dapat ditularkan oleh dua spesies kutu putih yang
menjadi vektor PMWaV, yaitu D. brevipes (pink mealybug), dan D. neobrevipes
(grey mealybug). Kedua serangga ini mampu menularkan PMWaV secara semi
persisten, meskipun kemampuan menularkannya akan berkurang setelah beberapa
hari setelah akuisisi. Sether et al. (1998) melaporkan adanya korelasi antara
kehadiran semut dengan tingkat penyebaran penyebaran penyakit layu nanas di
lapang. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Lim (1985) yang melaporkan bahwa
populasi D. brevipes biasanya berasosiasi dengan semut. Semut akan melindungi
dan memelihara D. brevipes dari predasi dan memanen embun madu yang
dihasilkan oleh D. brevipes.
Distribusi Geografi PMWaV
Berikut adalah laporan mengenai keberadaan PMWaV yang berhasil
dideteksi penyebarannya di dunia (Tabel 1). Carter (1933) dalam laporannya
menyebutkan keberadaan vektor penyakit layu nanas yaitu D. brevipes di
Indonesia (pulau Jawa) yang telah menyebar luas. Setelah itu, hingga saat ini
belum ada laporan detail yang menyebutkan tentang penyebaran penyakit layu
nanas di Indonesia. Meskipun demikian, berdasarkan pengamatan di lapang,
gejala penyakit layu nanas ditemukan di beberapa daerah sentra produksi nanas di
Indonesia seperti di Kabupaten Subang Jawa Barat, Lampung, Jawa Timur, dan
Sumatera Utara (Arta 2006, Komunikasi pribadi). Diduga penyakit layu nanas
telah menyebar luas di beberapa wilayah di Indonesia, mengingat bibit yang
dihasilkan umumnya berasal dari perbanyakan vegetatif dari tanaman induk yang
19
sebelumnya telah terinfeksi PMWaV. Di dunia, penyakit layu nanas telah banyak
dilaporkan di berbagai negara sentra produksi nanas (Tabel 1).
Tabel 1 Distribusi geografik PMWaV di dunia*
Benua
Eropa
Negara
Spanyol
Propinsi
Asia
Cina
India
Taiwan
Uttar Pradesh
Indonesia
Jawa
Malaysia
Semenanjung
Malaysia
Sabah
Sarawak
Keterangan
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Filipina
Tersebar luas
Tersebar luas
Tersebar luas
Afrika
Mauritius
Afrika Selatan
Tersebar luas
Tersebar luas
Western
Hemisphere
Brazil
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Guatemala
Jamaika
Peru
Oseania
Puerto Rico
USA
Florida
Australia
Hawaii
Queensland
* sumber: CABI (2005)
Ciri-ciri PMWaV
Kepadatan partikel PMWaV dalam caesium sulphate adalah 1,5 g/cm3.
Rasio A260/A280 virus yang telah dimurnikan adalah 1,8. Genom RNA utas
20
tunggalnya (single stranded RNA/ssRNA) bersifat linear dalam satu bagian
(monopartit). Ukuran RNA utas gandanya (double stranded RNA/dsRNA) adalah
8,35 x 106 Da (Gunasinghe & German 1989).
Pada tahun 1986, dsRNA berhasil diisolasi dari tanaman nanas terinfeksi di
Hawaii (Gunasinghe & German 1989) dan menyimpulkan bahwa virus dengan
RNA utas tunggal berasosiasi dengan penyakit layu nanas. Pada tahun 1987, suatu
virus berhasil diisolasi dari tanaman terinfeksi. Virus ini berbentuk batang lentur,
tidak beramplop, dan memiliki panjang 1200-1500 nm. Partikel virus, ketika
diwarnai dengan uranyl formate jenuh dalam methanol, menunjukkan suatu
struktur lubang pada sub unit selubung protein yang merupakan karakteristik
closterovirus (Gunasinghe & German 1989) (Gambar 2).
Gambar 2 Partikel PMWaV dibawah Mikroskop Elektron (CABI 2005).
Metode Deteksi PMWaV
Cara terbaik untuk mendeteksi PMWaV adalah dengan mengisolasi
dsRNA yang diikuti dengan seperasi RNA pada gel elektroforesis (Gunasinghe &
German 1989). Metode serologi seperti Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) atau Serological Specific Electron Microscopy (SSEM) dapat digunakan
jika tersedia antiserum (Gunasinghe dan German 1989), tetapi hasil deteksi
serologi yang lebih baik didapatkan dengan menggunakan metode Tissue Blot
Immunoassay (TBIA) (Hu et al. 1997). Virus ini dapat dimurnikan dengan
21
menggunakan presipitasi polyethyleneglycol (PEG) yang diikuti dengan cesium
sulphate gradient centrifugation menggunakan metode yang digunakan oleh
Gunasinghe dan German (1989). Ullman et al. (1989) berhasil menghasilkan
antiserum terhadap partikel mirip Closterovirus yang berasosiasi dengan penyakit
layu nanas. Hasil positif didapatkan dari tanaman yang terinfeksi virus
menggunnakan deteksi secara serologi dengan uji difusi ganda Ouchterloney,
ELISA, dan Serological Specific Electron Microscopy (SSEM).
Metode pendeteksian secara molekuler dengan reverse transcriptase
polymerase chain reaction (RT-PCR) juga dapat digunakan untuk mendeteksi
PMWaV dari tanaman nanas yang terinfeksi. Amplikon genom HSP 70 dari
PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil dideteksi dari tanaman nanas yang terinfeksi
oleh PMWaV menggunakan primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan
PMWaV-2 (Sether et al. 2001).
22
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan
Agustus 2005 sampai April 2006.
Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah sampel daun nanas cv. Smooth
Cayenne yang berasal dari pertanaman nanas di Kabupaten Subang Jawa Barat.
Sampel daun nanas di ambil dari lahan perkebunan nanas secara acak terhadap
tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas, serta sampel tanaman nanas
sehat. Beberapa tumbuhan selain nanas yang tumbuh di sekitar areal penanaman
nanas juga diambil untuk dianalisis.
Tissue Blot Immunoassay (TBIA)
Deteksi PMWaV secara serologi pada tanaman nanas dilakukan dengan
menggunakan metode TBIA seperti yang dilaporkan oleh Hu et al. (1997). Daun
dari tanaman nanas yang menunjukkan gejala maupun yang tidak bergejala layu,
digunakan sebagai sampel yang akan dideteksi. Sampel daun dipotong melintang
pada bagian dasar daun yang masih putih untuk membuat tepi potongan yang rata.
Potongan ini kemudian ditempelkan pada 0,45 µm Nitro ME nitrocelulose
membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA) selama 3-5 detik. Pola jaringan
pembuluh daun akan menempel dan tertinggal pada membran. Membran
kemudian disimpan kering diantara lipatan kertas saring pada suhu ruang sampai
siap dianalisis.
Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan
diblocking dengan 2% (wt/vol) susu skim yang dilarutkan dalam larutan
penyangga tris buffer saline (TBS) (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5)
selama 30 menit pada suhu ruang. Membran kemudian diinkubasikan dalam
23
wadah plastik yang baru atau kantung plastik segel dengan antibodi monoklonal
PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam TBS pada suhu
ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C selama 1 malam. Membran kemudian
dicuci dengan TBST (TBS + 0,5% Tween 20) selama 10 menit sebanyak 3 kali
pada suhu ruang. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasikan dengan
konjugat alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada
pengenceran 1:1000 dalam TBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran
kemudian dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat 5-bromo-4chloro-3-Indolyl
Phosphate/Nitro
Blue
Tetrazolium
(BCIP/NBT)
(Sigma
Chemical Co., USA) menggunakan satu tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam
10 ml larutan penyangga Alkaline Phosphate (AP). Pewarnaan dilakukan pada
suhu ruang hingga terjadi perubahan warna pada membran. Reaksi pewarnaan
dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Total RNA diekstrak dari 100 mg jaringan daun tanaman nanas
menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA).
Sampel RNA yang telah dimurnikan diresuspensikan dengan 40 µl air bebas
RNase, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai akan digunakan. Amplifikasi
sebagian genom PMWaV-1 dan PMWaV-2 dilakukan menggunakan sepasang
primer 223 dan 224 untuk PMWaV-2 dan 225 dan 226 untuk PMWaV-1 (Tabel
2).
Tabel 2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen PMWaV1 dan PMWaV-2 (Sether et al. 2001)
PMWaV Primer
225y
226z
224y
223z
Sekuen
Ukuran
produk
589
...
609
...
5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’
5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’
5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’
5’-TCATTGCACTCACTTATCGTTG-3’
x
Lokasi primer (posisi nukleotida dari awal) gen homolog HSP70 PMWaV
y
Forward primer
z
Reverse primer
1
1
2
2
Nukleotidax
118
707
226
835
24
Reaksi RT dilakukan pada volume 20 µl terdiri dari 3 µl RNA hasil
ekstraksi, 0,75 pmol primer, 500 mM dNTPs, 5 mM MgCl2, 4 µl bufer RT (250
mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), 20 unit
RNAsin Ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI, USA), dan 65 unit
MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Reaksi RT
dilakukan pada kondisi 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, diikuti
dengan inaktivasi pada 72 °C selama 15 menit.
Reaksi PCR dilakukan pada volume 50 µl terdiri dari 0,75 pmol forward
primer (224 untuk PMWaV-2 dan 226 untuk PMWaV-1) dan reverse primer (223
untuk PMWaV-2 dan 225 untuk PMWaV-1) (Tabel 2), 3 µl bufer reaksi (500 mM
KCl, 100 mM Tris-HCl [pH 9,0 pada 25°C], 1,0% [vol/vol] triton X-100), dan 0,5
µl taq DNA polimerase (Promega, Madison, USA). Kondisi PCR awalnya adalah
denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan 45
siklus pada 94 °C selama 1 menit, 50 °C selama 1 menit, dan 72 °C selama 1
menit, dan diikuti dengan perpanjangan pada 72 °C selama 10 menit pada mesin
PCR (Perkin Elmer 9700 thermocycler).
Separasi DNA produk RT-PCR dilakukan pada gel agarose 1% dalam
larutan penyangga TBE (54 gr Tris base, 27,5 gr Asam Borat, 20 ml EDTA 0,5 M,
pH 8,0 dalam 1000 ml air) pada kondisi 70 V selama 2 jam. Amplicon
divisualisasi dengan 2 µg/ml ethidium bromida dalam larutan penyangga TBE
untuk elektroforesis. Setelah pewarnaan, gel kemudian difoto di atas cahaya ultra
violet (310 nm) menggunakan kamera polaroid Direct Screen DS34 dan film
polaroid FP-3000B SS.
Purifikasi Virus
Seratus gram jaringan tanaman sakit dibekukan dengan nitrogen cair,
ditumbuk hingga halus dengan mortar, dan dicairkan dengan bufer ekstraksi EB
(500 mM Tris-Cl, pH 8,4, 4% Triton-X 100, 0,2% 2-mercaptoethanol) sebanyak 2
ml/g jaringan. Hasil gerusan dihomogenisasi menggunakan pengaduk selama satu
jam pada suhu 4°C dan disaring menggunakan kain kasa, dan hasil saringan
disentrifugasi pada 7.500 rpm selama 30 menit pada rotor P70AT (Hitachi).
25
Supernatan yang didapatkan kemudian disentrifugasi pada 44.500 rpm selama 60
menit pada rotor P70AT, dan peletnya dilarutkan dalam bufer TM (100 mM TrisCl, pH 8,5, dan 10 mM MgCl2) menggunakan 1/8 volume bufer ekstraksi.
Suspensi ini diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 7.500 rpm selama 15 menit
pada rotor P70AT, dan supernatan yang didapatkan dilapiskan diatas 5 ml 0,48
molal Cs2SO4 dalam bufer TM dan disentrifugasi pada 46.000 rpm selama 16 jam
dalam rotor P80AT pada suhu 8°C. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dalam 200 µl
bufer TM (Gunasinghe & German 1989).
Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
dan Western Blotting
Berat molekul protein selubung PMWaV dianalisis dengan menggunakan
metode SDS-PAGE. Analisis dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil pemurnian
virus, tanaman terinfeksi virus gemini, dan tanaman terinfeksi TMV sebagai
pembanding. Fraksi hasil pemurnian virus dihomogenisasi dengan 200 µl larutan
penyangga (62 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% 2-mercaphtoethanol, 10%
glycerol, dan 0.004% bromophenolblue), kemudian dipanaskan sampai mendidih
(100 °C) selama 10 menit, dan disentrifugasi 13.000 rpm (rotor Tomy MRX-151)
selama 10 menit. Supernatan dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu 20 °C.
Analisis SDS-PAGE membutuhkan dua jenis gel yang berbeda yaitu
separating gel (gel pemisah) dan stacking gel. Gel pemisah dibuat dengan cara
mencampur acrylamide 10% (1,8 ml) dengan bis-acrylamide 0,25% (1,5 ml),
Tris-HCl 0,375 M pH 8,8 (2,5 ml), SDS 0,1% (0,005 ml), TEMED 0,025% (0,006
ml), APS (amonium persulphate) 0,025% (0,17 ml), dan 4 ml air. Setelah bahanbahan tercampur rata kemudian dimasukkan ke dalam pelat gelas ukuran 10 x 7,2
cm yang telah dipasang pada gel stand. Permukaan atas gel diratakan dengan
menambah air di atas lapisan gel sekaligus untuk mempercepat pembekuan gel.
Air dapat dibuang setelah terlihat batas tegas antara air dan gel yang membeku.
Stacking gel dibuat dengan cara mencampur acrylamide 3% (0,06 ml) dengan bisacrylamide 0,08% (0,04 ml), Tris-HCl 0,125 M (2,5 ml), pH 6,8, SDS 0,1% (0,1
26
ml),
TEMED 0,025% (0,006 ml),
APS 0,025% (0,1 ml), dan 6,3 ml air.
Campuran tersebut selanjutnya dituang di atas gel pemisah, kemudian dipasang
sisir (comb), dan setelah gel membeku comb dapat dicabut dan gel siap
digunakan.
Sampel selubung protein virus yang berasal dari pemurnian virus,
didenaturasikan dengan cara memanaskan protein selubung virus pada suhu 100
°C selama 10 menit di dalam water bath. Setelah itu, sebanyak 15 µl masingmasing sampel protein dimasukkan ke dalam lubang gel poliakrilamid 10% yang
dibuat sebagaimana disebutkan di atas, dalam penyangga 10 ml Tris-HCl pH 8,3
yang mengandung 3.2 ml glisin 0,2 M dan 2 ml SDS 10%. Elektroforesis
dilakukan pada suhu ruang (24 °C) pada 80 volt selama 120-180 menit. Selubung
protein
PMWaV
dibandingkan
dengan
berat
molekul
penanda
seperti
phosphorilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic
anhydrase (30 kDa), trypsin inhibitor (20,1 kDa), α-lactabumin (14,4 kDa), yang
terdapat dalam satu ladder (Amersham Bioscience, UK).
Setelah
dielektroforesis,
protein
divisualisasi
dengan
pewarnaan
Coomassie Blue (Bio-Rad Laboratories, USA). Gel direndam dalam asam asetat
glasial 12,5% selama 5 menit kemudian direndam dalam larutan Coomassie blue
0,25% dan diinkubasi selama 12 jam di atas shaker. Gel dicuci menggunakan
larutan penghilang warna yang terdiri atas metanol 50% dan larutan asam asetat
10% sebanyak 3 x 10 menit.
Analisis protein dengan Western Blotting dilakukan untuk mengkonfirmasi
keberadaan protein selubung PMWaV dengan menggunakan metode He et al.
(1997). Protein murni virus dielektroforesis
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple mealybug wilt-associated virus PADA TANAMAN NANAS DI
INDONESIA adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
NIM A451040071
ABSTRAK
RENO TRYONO. Deteksi dan Identifikasi Pineapple mealybug wilt-associated
virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman Nanas di Indonesia. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA dan SOBIR.
Penyakit layu nanas merupakan penyakit penting yang banyak dilaporkan
di banyak negara produsen nanas. Penyakit ini melibatkan adanya partikel virus
Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2,
keberadaan vektor (Dysmicoccus brevipes), dan keadaan lingkungan yang
mendukung terjadinya penyakit. Meskipun demikian, di Indonesia, penyakit ini
relatif baru muncul beberapa tahun terakhir dan belum pernah ada laporan
penelitian mengenai virus yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi PMWaV
yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia.
Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi dan laporan pertama
mengenai keberadaan PMWaV yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Hasil deteksi secara serologi dengan metode Tissue blot immunoassays
(TBIA) menggunakan dua antibodi monoklonal spesifik terhadap PMWaV-1
maupun PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) berhasil mendeteksi keberadaan PMWaV1 dan PMWaV-2 pada jaringan daun tanaman nanas yang menunjukkan maupun
dari yang tidak menunjukkan gejala layu. Pendeteksian secara molekuler dengan
metode reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan
dua primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil
mengamplifikasi gen Heat Shock Protein 70 (HSP 70) pada kedua virus.
Penemuan ini mengindikasikan bahwa PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi
dengan penyakit layu nanas yang terjadi di Indonesia. Analisis protein
menggunakan sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) menunjukkan adanya sebuah struktural protein besar dengan perkiraan
ukuran sebesar 23 kDa. Keberadaan partikel virus berbentuk batang lentur juga
teramati pada preparasi mikroskop elektron yang berasal dari tanaman nanas yang
terinfeksi virus. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron ini sesuai
dengan ciri-ciri virus dari anggota Closterovirus. Analisis parsial genom HSP 70
virus layu nanas isolat Indonesia menunjukkan kisaran homologi sebesar 96
hingga 98% dengan PMWaV-1 dan PMWaV-2. Selain itu, analisis filogenetik
menunjukkan bahwa isolat PMWaV Indonesia dan Hawaii merupakan anggota
Closterovirus yang ditularkan oleh kutu putih, dan memiliki hubungan
kekerabatan yang dekat dengan Grapevine leafroll-associated virus-3 (GLRaV-3).
Kata kunci: penyakit layu nanas, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
ABSTRACT
RENO TRYONO. Detection and Identification of Pineapple mealybug wiltassociated virus Causing Wilt Disease on Pineapple in Indonesia. Under
supervised of GEDE SUASTIKA and SOBIR.
Field surveys on pineapple wilt disease were conducted on pineapple
production areas in Subang, West Java, Indonesia. The disease was characterized
by severe tip dieback, downward curling, reddening, and wilting of the leaves
which can lead to total collapse of the plant.
The objective of the research is to identify the viruses causing wilt disease
on pineapple in Indonesia. Tissue blot immunoassays (TBIAs) using two different
antibodies specific to either Pineapple mealybug wilt-associated virus-1
(PMWaV-1) or PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) successfully detected the viruses in
leaf tissues from both symptomatic and asymptomatic pineapple plants. A reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assays using oligonucleotide
primers specific to HSP 70 gene of PMWaV-1 and PMWaV-2 were also
successfully amplified the regions succesfully. These finding indicated that both
closteroviruses were associated with wilt disease on pineapple plants in Indonesia.
Protein analysis by using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) revealed that the viruses have a major structural
protein with molecular mass of approximately kDa. Flexuous filamentous
particles were also observed in electron microscopy preparations from infected
plants. These results were in agreement with characteritics of the closteroviruses.
Aligments of partial nucleotide sequences of the viral genomes exhibited 96 to
98% homology with that of PMWaV-1 and PMWaV-2 Hawaiian isolates as
previously reported by Sether et al. (2001), respectively. Phylogenetic analysis
revealed that Indonesian and Hawaiian virus isolates were belong to mealybugtransmitted closterovirus and closely related to Grapevine leafroll-associated
virus-3 (GLRaV-3).
Key word: pineapple wilt disease, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis
Dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
Bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Entomologi-Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Deteksi dan Identifikasi Pineapple Mealybug Wiltassociated Virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman
Nanas di Indonesia
: Reno Tryono
: A451040071
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
Ketua
Dr. Ir. Sobir, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Entomologi – Fitopatologi
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc.
Tanggal Ujian: 8 Agustus 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2005 hingga April 2006 ini
adalah deteksi virus tanaman, dengan judul “Deteksi dan Identifikasi pineapple
mealybug wilt-associated virus pada Tanaman Nanas di Indonesia”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. dan Dr.
Ir. Sobir, M.Si., selaku komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan
masukannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
Terima kasih juga kepada Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB yang telah
mengalokasikan anggaran dana untuk penelitian ini sebagai bentuk kerjasama
penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr. selaku
penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam
penyempurnaan tulisan dalam tesis ini. Terima kasih juga kepada Dekan Sekolah
Pascasarjana IPB, Ketua Program Studi Entomologi-Fitopatologi IPB atas
kesediaan menerima penulis untuk studi di Sekolah Pascasarjana IPB, dan kepada
Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Faperta IPB
atas izin penggunaan bahan dan peralatan laboratorium yang digunakan selama
penelitian.
Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah, Ibu, kakak, adik-adik,
serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis juga
mengucapkan banyak terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa EntomologiFitopatologi, rekan-rekan mahasiswa di Laboratorium Virologi Tumbuhan Faperta
IPB, dan saudari Tuti Legiastuti, S.Si yang telah banyak membantu dalam
penelitian ini. Rasa terima kasih yang tulus juga penulis ucapkan kepada Anna
Safarrida, S.Si atas dukungan moril yang selalu menjadi motivasi penulis.
Semoga penelitian ini bermanfaat dalam menambah khazanah ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1982 dari ayah
Kaselan dan ibu Titin Sukmawati sebagai putra ketiga dari lima bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMUN 1
Cikarang Bekasi pada tahun 1999. Pendidikan Sarjana diselesaikan oleh penulis
pada tahun 2004 dari Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian
Universitas Brawijaya, Malang. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi
di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Program Studi EntomologiFitopatologi. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam organisasi Forum
Mahasiswa Pascasarjana sebagai wakil ketua periode 2005-2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
PENDAHULUAN ...................................................................................
Latar Belakang ...............................................................................
Tujuan penelitian ............................................................................
Hipotesis .........................................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
1
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................
Gejala Penyakit Layu Nanas ..........................................................
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV ...........................................
Distribusi Geografi PMWaV .........................................................
Ciri-ciri PMWaV .............................................................................
Metode Deteksi PMWaV ...............................................................
4
4
5
6
7
9
BAHAN DAN METODE ........................................................................
Tempat dan Waktu Penelitian .........................................................
Metode Penelitian ..........................................................................
Bahan Penelitian .......................................................................
Tissue Blot Immunoassay (TBIA) .............................................
Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Purifikasi Virus .........................................................................
SDS-PAGE dan Western Blotting .............................................
Mikroskopi Elektron .................................................................
Perunutan Nukleotida ................................................................
10
10
10
10
10
11
12
13
15
15
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Deteksi PMWaV dengan TBIA ......................................................
Pemurnian PMWaV dan Visualisasi Visualisasi Morfologi
Partikel PMWaV dengan Mikroskop .............................................
Analisis Protein Selubung PMWaV dengan SDS-PAGE dan
Western Blotting .............................................................................
Deteksi Asam Nukleat PMWaV dengan RT-PCR .........................
Analisis Runutan dan Hubungan Kekerabatan PMWaV Indonesia
dengan Anggota Famili Closterovirus Lainnya .............................
16
16
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................
Kesimpulan ....................................................................................
Saran ...............................................................................................
31
31
31
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
32
LAMPIRAN .............................................................................................
34
18
21
24
25
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple mealybug wilt-associated virus PADA TANAMAN NANAS DI
INDONESIA adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
NIM A451040071
ABSTRAK
RENO TRYONO. Deteksi dan Identifikasi Pineapple mealybug wilt-associated
virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman Nanas di Indonesia. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA dan SOBIR.
Penyakit layu nanas merupakan penyakit penting yang banyak dilaporkan
di banyak negara produsen nanas. Penyakit ini melibatkan adanya partikel virus
Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2,
keberadaan vektor (Dysmicoccus brevipes), dan keadaan lingkungan yang
mendukung terjadinya penyakit. Meskipun demikian, di Indonesia, penyakit ini
relatif baru muncul beberapa tahun terakhir dan belum pernah ada laporan
penelitian mengenai virus yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi PMWaV
yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia.
Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi dan laporan pertama
mengenai keberadaan PMWaV yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas di
Indonesia.
Hasil deteksi secara serologi dengan metode Tissue blot immunoassays
(TBIA) menggunakan dua antibodi monoklonal spesifik terhadap PMWaV-1
maupun PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) berhasil mendeteksi keberadaan PMWaV1 dan PMWaV-2 pada jaringan daun tanaman nanas yang menunjukkan maupun
dari yang tidak menunjukkan gejala layu. Pendeteksian secara molekuler dengan
metode reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan
dua primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil
mengamplifikasi gen Heat Shock Protein 70 (HSP 70) pada kedua virus.
Penemuan ini mengindikasikan bahwa PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi
dengan penyakit layu nanas yang terjadi di Indonesia. Analisis protein
menggunakan sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) menunjukkan adanya sebuah struktural protein besar dengan perkiraan
ukuran sebesar 23 kDa. Keberadaan partikel virus berbentuk batang lentur juga
teramati pada preparasi mikroskop elektron yang berasal dari tanaman nanas yang
terinfeksi virus. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron ini sesuai
dengan ciri-ciri virus dari anggota Closterovirus. Analisis parsial genom HSP 70
virus layu nanas isolat Indonesia menunjukkan kisaran homologi sebesar 96
hingga 98% dengan PMWaV-1 dan PMWaV-2. Selain itu, analisis filogenetik
menunjukkan bahwa isolat PMWaV Indonesia dan Hawaii merupakan anggota
Closterovirus yang ditularkan oleh kutu putih, dan memiliki hubungan
kekerabatan yang dekat dengan Grapevine leafroll-associated virus-3 (GLRaV-3).
Kata kunci: penyakit layu nanas, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
ABSTRACT
RENO TRYONO. Detection and Identification of Pineapple mealybug wiltassociated virus Causing Wilt Disease on Pineapple in Indonesia. Under
supervised of GEDE SUASTIKA and SOBIR.
Field surveys on pineapple wilt disease were conducted on pineapple
production areas in Subang, West Java, Indonesia. The disease was characterized
by severe tip dieback, downward curling, reddening, and wilting of the leaves
which can lead to total collapse of the plant.
The objective of the research is to identify the viruses causing wilt disease
on pineapple in Indonesia. Tissue blot immunoassays (TBIAs) using two different
antibodies specific to either Pineapple mealybug wilt-associated virus-1
(PMWaV-1) or PMWaV-2 (Agdia Inc., USA) successfully detected the viruses in
leaf tissues from both symptomatic and asymptomatic pineapple plants. A reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assays using oligonucleotide
primers specific to HSP 70 gene of PMWaV-1 and PMWaV-2 were also
successfully amplified the regions succesfully. These finding indicated that both
closteroviruses were associated with wilt disease on pineapple plants in Indonesia.
Protein analysis by using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) revealed that the viruses have a major structural
protein with molecular mass of approximately kDa. Flexuous filamentous
particles were also observed in electron microscopy preparations from infected
plants. These results were in agreement with characteritics of the closteroviruses.
Aligments of partial nucleotide sequences of the viral genomes exhibited 96 to
98% homology with that of PMWaV-1 and PMWaV-2 Hawaiian isolates as
previously reported by Sether et al. (2001), respectively. Phylogenetic analysis
revealed that Indonesian and Hawaiian virus isolates were belong to mealybugtransmitted closterovirus and closely related to Grapevine leafroll-associated
virus-3 (GLRaV-3).
Key word: pineapple wilt disease, Pineapple mealybug wilt-associated virus,
Closterovirus.
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis
Dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
Bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI
Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus PENYEBAB
PENYAKIT LAYU PADA TANAMAN NANAS DI INDONESIA
RENO TRYONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Entomologi-Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Tesis
Nama
NIM
: Deteksi dan Identifikasi Pineapple Mealybug Wiltassociated Virus Penyebab Penyakit Layu pada Tanaman
Nanas di Indonesia
: Reno Tryono
: A451040071
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
Ketua
Dr. Ir. Sobir, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Entomologi – Fitopatologi
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc.
Tanggal Ujian: 8 Agustus 2006
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2005 hingga April 2006 ini
adalah deteksi virus tanaman, dengan judul “Deteksi dan Identifikasi pineapple
mealybug wilt-associated virus pada Tanaman Nanas di Indonesia”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. dan Dr.
Ir. Sobir, M.Si., selaku komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan
masukannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
Terima kasih juga kepada Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB yang telah
mengalokasikan anggaran dana untuk penelitian ini sebagai bentuk kerjasama
penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M.Agr. selaku
penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam
penyempurnaan tulisan dalam tesis ini. Terima kasih juga kepada Dekan Sekolah
Pascasarjana IPB, Ketua Program Studi Entomologi-Fitopatologi IPB atas
kesediaan menerima penulis untuk studi di Sekolah Pascasarjana IPB, dan kepada
Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Faperta IPB
atas izin penggunaan bahan dan peralatan laboratorium yang digunakan selama
penelitian.
Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah, Ibu, kakak, adik-adik,
serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis juga
mengucapkan banyak terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa EntomologiFitopatologi, rekan-rekan mahasiswa di Laboratorium Virologi Tumbuhan Faperta
IPB, dan saudari Tuti Legiastuti, S.Si yang telah banyak membantu dalam
penelitian ini. Rasa terima kasih yang tulus juga penulis ucapkan kepada Anna
Safarrida, S.Si atas dukungan moril yang selalu menjadi motivasi penulis.
Semoga penelitian ini bermanfaat dalam menambah khazanah ilmu
pengetahuan.
Bogor, Agustus 2006
Reno Tryono
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1982 dari ayah
Kaselan dan ibu Titin Sukmawati sebagai putra ketiga dari lima bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMUN 1
Cikarang Bekasi pada tahun 1999. Pendidikan Sarjana diselesaikan oleh penulis
pada tahun 2004 dari Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian
Universitas Brawijaya, Malang. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi
di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Program Studi EntomologiFitopatologi. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam organisasi Forum
Mahasiswa Pascasarjana sebagai wakil ketua periode 2005-2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
PENDAHULUAN ...................................................................................
Latar Belakang ...............................................................................
Tujuan penelitian ............................................................................
Hipotesis .........................................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
1
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................
Gejala Penyakit Layu Nanas ..........................................................
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV ...........................................
Distribusi Geografi PMWaV .........................................................
Ciri-ciri PMWaV .............................................................................
Metode Deteksi PMWaV ...............................................................
4
4
5
6
7
9
BAHAN DAN METODE ........................................................................
Tempat dan Waktu Penelitian .........................................................
Metode Penelitian ..........................................................................
Bahan Penelitian .......................................................................
Tissue Blot Immunoassay (TBIA) .............................................
Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Purifikasi Virus .........................................................................
SDS-PAGE dan Western Blotting .............................................
Mikroskopi Elektron .................................................................
Perunutan Nukleotida ................................................................
10
10
10
10
10
11
12
13
15
15
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................
Deteksi PMWaV dengan TBIA ......................................................
Pemurnian PMWaV dan Visualisasi Visualisasi Morfologi
Partikel PMWaV dengan Mikroskop .............................................
Analisis Protein Selubung PMWaV dengan SDS-PAGE dan
Western Blotting .............................................................................
Deteksi Asam Nukleat PMWaV dengan RT-PCR .........................
Analisis Runutan dan Hubungan Kekerabatan PMWaV Indonesia
dengan Anggota Famili Closterovirus Lainnya .............................
16
16
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................
Kesimpulan ....................................................................................
Saran ...............................................................................................
31
31
31
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
32
LAMPIRAN .............................................................................................
34
18
21
24
25
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Distribusi geografik PMWaV di dunia .................................................
7
2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen
PMWaV-1 dan PMWaV-2 ...................................................................
11
3 Deteksi PMWaVpada Jaringan daun nanas dan beberapa gulma serta
tanaman pisang yang tumbuh di sekitar pertanaman nanas di
Kabupaten Subang ...............................................................................
16
4 Visualisasi partikel PMWaV dengan mikroskop elektron hasil dari
fraksi-fraksi pemurnian virus ...............................................................
21
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil
dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa
Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit ...........
5
2 Partikel PMWaV pada mikroskop elektron .........................................
8
3 Tissue blot dari potongan daun nanas. Kiri: daun nanas sehat (1,2), *)
reaksi tidak spesifik, daun nanas terinfeksi PMWaV-1 (3). Kanan:
daun nanas sehat (1,2,5), daun nanas terinfeksi PMWaV-2 (3,4) .......
18
4 Hasil separasi protein virus dengan SDS-PAGE. Lajur M, low mixture
molecular-weight marker; 1, fraksi 1 pemurnian PMWaV; 2, fraksi 2
pemurnian PMWaV; 3, fraksi 3 pemurnian PMWaV; K, kontrol
larutan penyangga ................................................................................
22
5 Analisis Western Blot terhadap protein selubung PMWaV.
Elektroforesis protein yang telah didenaturasi dilakukan pada 10%
SDS-PAGE. (A). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi
PMWaV-1. (B). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi
PMWaV-2. Lajur 1-5 pada gambar A dan B berturut-turut mewakili
fraksi 1 sampai 5 dari hasil pemurnian virus .......................................
23
6 Deteksi dan diferensiasi PMWaV-1 dan PMWaV-2 menggunakan RTPCR. Lajur 1, 100 bp DNA ladder; lajur 2, tanaman terinfeksi
PMWaV-1; lajur 3, tanaman terinfeksi PMWaV-2, lajur 4, 1 kb plus
DNA ladder; lajur 5 dan 6, tanaman sehat ...........................................
24
7 Alignment antara genom HSP 70 PMWaV Indonesia dengan genom
PMWaV yang terdapat pada Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov). (A)
PMWaV-1, (B) PMWaV-2. ( | ) basa antara kedua sekuen sama, ( )
basa antara kedua sekuen tidak sama, ( - ) delesi/tidak ada basa .......
27
8 Dendogram pohon filogenetik antara isolat PMWaV Indonesia dengan
beberapa anggota Closterovirus. Analisis dilakukan menggunakan
software Clustal W.................................................................................
29
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara penghasil nanas di Asia Tenggara.
Produksi nanas Indonesia pada tahun 2002 tercatat mencapai 300.000 ton yang
menempati posisi tertinggi ketiga setelah Thailand dan Filipina (CABI 2005).
Beberapa tahun terakhir, industri nanas di Indonesia dihadapkan pada suatu
permasalahan penting yaitu munculnya penyakit layu pada tanaman nanas yang
belum pernah dilaporankan sebelumnya. Berdasarkan laporan petani nanas,
penyakit layu nanas muncul di beberapa daerah sentra produksi nanas di Indonesia
seperti Jawa Barat, Jawa Timur, Lampung, dan Sumatera Utara.
Tanaman nanas yang terserang penyakit ini menunjukkan gejala berupa
warna daun tanaman yang terserang menjadi berwarna kuning sampai kemerahan,
daun menggulung ke bawah, pada ujung daun nekrotik, dan tanaman menjadi
layu. Pada keadaan yang sudah parah, tanaman nanas menjadi kerdil dan dapat
roboh akibat terhambatnya perkembangan perakaran tanaman. Penyakit ini juga
dapat menyebabkan kegagalan dalam menghasilkan buah, atau mampu
menghasilkan buah tetapi berukuran lebih kecil dari yang sehat.
Penyakit layu nanas merupakan salah satu penyakit penting pada industri
nanas di dunia. Gejala penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia mirip
dengan gejala penyakit layu tanaman nanas yang telah banyak dilaporkan di
negara-negara
produsen
nanas.
Tanaman
yang
terserang
penyakit
ini
menunjukkan gejala mati pucuk daun yang parah, penggulungan tepi daun ke
bawah, warna daun yang memerah, dan pelayuan daun yang dapat mengarah pada
robohnya seluruh tanaman. Hawaii, sebagai salah satu daerah penghasil nanas
terbesar di dunia, telah banyak mempublikasikan laporan mengenai penyakit layu
pada tanaman nanas, yang dikenal dengan nama mealybug wilt of pineapple
disease (MWP) yang disebabkan oleh pineapple mealybug wilt-associated virus
(PMWaV) (Sether & Hu 2002). Sebelumnya, penyakit layu juga telah menjadi
faktor pembatas penting terhadap produksi nanas di Hawaii pada awal tahun
1900an akibat penyakit ini (Carter 1933).
14
Di Malaysia, penyakit layu nanas menyebabkan tanaman yang terinfeksi
menghasilkan buah yang tidak sesuai kriteria pasar dan buah menjadi tidak cocok
untuk dikalengkan. Selain itu, kejadian penyakit layu nanas pada varietas
Masmerah di Malaysia mencapai antara 0,4% sampai 7,6% (Lim 1985). Di
Hawaii, Sether dan Hu (2002) melaporkan kehilangan hasil nanas sebesar 35%
pada tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas yang diketahui
terinfeksi PMWaV-2.
Beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap penyakit ini melaporkan
bahwa penyakit layu nanas merupakan suatu penyakit yang melibatkan adanya
partikel virus, serangga vektor, dan keadaan lingkungan yang mendukung
munculnya gejala pada tanaman. Partikel virus Pineapple mealybug wiltassociated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2 dilaporkan berhasil diekstrak dari
tanaman nanas yang menunjukkan maupun yang tidak menunjukan gejala
penyakit layu nanas (Sether et al. 2001). Dua spesies kutu putih yaitu
Dysmicoccus brevipes (pink mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dan D.
neobrevipes (grey mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dilaporkan berperan
sebagai vektor PMWaV-1 dan PMWaV-2 di lapang (Sether et al. 1998 ).
Penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia merupakan penyakit baru
yang belum pernah dilaporkan dan dikarakterisasi mengenai dugaan keberadaan
partikel virus penyebab penyakit ini di Indonesia. Deteksi dan identifikasi virus
penyebab penyakit layu nanas merupakan hal penting bagi penentuan strategi
pengendalian penyakit layu nanas. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian
yang dapat mengungkapkan identitas virus yang berasosiasi dengan penyakit layu
yang banyak ditemukan pada tanaman nanas di Indonesia dengan metode deteksi
secara serologi dan identifikasi virus melalui pendekatan biologi molekuler.
15
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi dan mengidentifikasi
partikel virus yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas cv.
Smooth Cayenne di Kabupaten Subang, Jawa Barat, Indonesia.
Hipotesis
PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi dengan gejala penyakit layu pada
tanaman nanas cv. Smooth Cayenne di Indonesia. Isolat PMWaV Indonesia
memiliki ciri-ciri biomolekuler dan runutan nukleotida yang berkerabat dekat
dengan PMWaV asal Hawaii.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam memberikan
informasi mengenai keberadaan PMWaV di Indonesia yang dapat digunakan
sebagai dasar keilmuan bagi Badan Karantina Indonesia untuk menyusun ulang
daftar Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT) Karantina, sehingga aturan
mengenai lalu lintas bahan tanaman dengan negara lain atau antar daerah di
Indonesia dapat disusun lebih tepat lagi.
16
TINJAUAN PUSTAKA
Nanas merupakan tanaman tropis yang dapat dibudidayakan di kisaran
wilayah 25° LU sampai 25° LS. Nanas memiliki banyak varietas yang berbeda
dalam ukuran tanaman dan buah, warna dan rasa daging buah, serta pola duri pada
tepi daunnya (CABI 2005).
Dalam prakteknya, budi daya nanas memiliki beberapa kendala yang salah
satunya adalah serangan hama dan penyakit. Dysmicoccus brevipes merupakan
hama tanaman nanas yang paling serius di dunia. Serangga ini sangat umum di
daerah tropis dan berperan dalam menyebabkan gejala layu nanas pada varietas
Smooth Cayenne dan Masmerah, namun varietas Singapore Spanish menunjukkan
sifat tahan terhadap hama ini (CABI 2005). Selain kerusakan akibat aktivitas
makan, serangga ini juga diketahui berperan sebagai vektor PMWaV yang dapat
menyebabkan penyakit layu pada tanaman nanas (Sether et al. 1998). Tanaman
terinfeksi menjadi merah kekuningan hingga merah terang pada ujung daun yang
segera menjalar ke daun lainnya, tanaman menjadi layu, dan buah yang dihasilkan
kecil. Meskipun demikian, timbulnya gejala penyakit merupakan fenomena
kompleks yang melibatkan adanya partikel virus, D. brevipes, dan faktor
lingkungan yang mendukung terjadinya penyakit (Sether et al. 1998). Penyakit ini
kemudian dikenal dengan nama penyakit layu nanas.
Gejala Penyakit Layu Nanas
Infeksi awal biasanya muncul pada tanaman-tanaman nanas yang berada di
pinggir lahan kemudian menyebar ke tanaman-tanaman di bagian dalam lahan.
Penyakit ini dicirikan dengan adanya gejala mati ujung daun dan kemerahan di
sepanjang daun, diikuti dengan terjadinya perkembangan perubahan warna daun
dari merah ke merah muda, kehilangan kebugaran daun, dan pada akhirnya daun
menjadi layu (Gambar 1).
17
Gambar 1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil
dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa
Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit.
Tanaman yang terinfeksi pada fase awal pertumbuhan tidak membentuk
buah, atau hanya menghasilkan buah yang kecil. Beberapa tanaman, bahkan yang
terlihat sangat layu, dapat pulih selama daun yang bergejala layu pada ujungnya
telah gugur dan daun yang tumbuh baru tumbuh secara normal. Penyakit ini juga
menghambat pertumbuhan akar dan menyebabkan tanaman menjadi layu
(Samson, 1986).
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV
Nanas merupakan satu-satunya tanaman yang diketahui sebagai inang
PMWaV. Meskipun demikian, rumput liar yang tumbuh disekitar tanaman nanas
seperti Andropogon insularis dan Paspalum urvillei diduga dapat menjadi inang
alternatif dari PMWaV (Gunasinghe 1989). Penyakit layu nanas dilaporkan dapat
ditularkan melalui perbanyakan vegetatif tanaman nanas dan melalui vektornya
yaitu D. brevipes. Rohrbach et al. (1988) melaporkan bahwa D. brevipes
merupakan hama kosmopolitan pada tanaman nanas dan merupakan vektor bagi
virus penyebab penyakit layu nanas. Selain itu, D. brevipes bersifat polifagus
dengan kisaran inang lebih dari 100 genus dari 53 famili tanaman, termasuk
beberapa gulma yang tumbuh di sekitar tanaman nanas seperti A. insularis dan P.
urvillei sehingga gulma ini diduga dapat menjadi inang dari PMWaV.
18
Meskipun demikian, hasil berbeda dilaporkan oleh Sether et al. (1998) yang
mendapatkan bahwa tidak ditemukan adanya infeksi PMWaV pada sampel
tanaman yang dikumpulkan dari lapang, yaitu gulma, tumbuhan semak, dan
pohon yang tumbuh disekitar lahan nanas. Sether et al. (1998) juga melaporkan
tidak ada infeksi PMWaV pada Agave, pisang, ketela pohon, Chenopodium,
tembakau, dan rumput-rumputan, dimana tanaman nanasnya sendiri menjadi
terinfeksi setelah diinokulasi dengan D. brevipes yang viruliferous, meskipun
beberapa dari tanaman non-nanas ini dapat dijadikan inang oleh D. brevipes.
Penyakit layu nanas dapat ditularkan oleh dua spesies kutu putih yang
menjadi vektor PMWaV, yaitu D. brevipes (pink mealybug), dan D. neobrevipes
(grey mealybug). Kedua serangga ini mampu menularkan PMWaV secara semi
persisten, meskipun kemampuan menularkannya akan berkurang setelah beberapa
hari setelah akuisisi. Sether et al. (1998) melaporkan adanya korelasi antara
kehadiran semut dengan tingkat penyebaran penyebaran penyakit layu nanas di
lapang. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Lim (1985) yang melaporkan bahwa
populasi D. brevipes biasanya berasosiasi dengan semut. Semut akan melindungi
dan memelihara D. brevipes dari predasi dan memanen embun madu yang
dihasilkan oleh D. brevipes.
Distribusi Geografi PMWaV
Berikut adalah laporan mengenai keberadaan PMWaV yang berhasil
dideteksi penyebarannya di dunia (Tabel 1). Carter (1933) dalam laporannya
menyebutkan keberadaan vektor penyakit layu nanas yaitu D. brevipes di
Indonesia (pulau Jawa) yang telah menyebar luas. Setelah itu, hingga saat ini
belum ada laporan detail yang menyebutkan tentang penyebaran penyakit layu
nanas di Indonesia. Meskipun demikian, berdasarkan pengamatan di lapang,
gejala penyakit layu nanas ditemukan di beberapa daerah sentra produksi nanas di
Indonesia seperti di Kabupaten Subang Jawa Barat, Lampung, Jawa Timur, dan
Sumatera Utara (Arta 2006, Komunikasi pribadi). Diduga penyakit layu nanas
telah menyebar luas di beberapa wilayah di Indonesia, mengingat bibit yang
dihasilkan umumnya berasal dari perbanyakan vegetatif dari tanaman induk yang
19
sebelumnya telah terinfeksi PMWaV. Di dunia, penyakit layu nanas telah banyak
dilaporkan di berbagai negara sentra produksi nanas (Tabel 1).
Tabel 1 Distribusi geografik PMWaV di dunia*
Benua
Eropa
Negara
Spanyol
Propinsi
Asia
Cina
India
Taiwan
Uttar Pradesh
Indonesia
Jawa
Malaysia
Semenanjung
Malaysia
Sabah
Sarawak
Keterangan
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Filipina
Tersebar luas
Tersebar luas
Tersebar luas
Afrika
Mauritius
Afrika Selatan
Tersebar luas
Tersebar luas
Western
Hemisphere
Brazil
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Tersebar luas
Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Guatemala
Jamaika
Peru
Oseania
Puerto Rico
USA
Florida
Australia
Hawaii
Queensland
* sumber: CABI (2005)
Ciri-ciri PMWaV
Kepadatan partikel PMWaV dalam caesium sulphate adalah 1,5 g/cm3.
Rasio A260/A280 virus yang telah dimurnikan adalah 1,8. Genom RNA utas
20
tunggalnya (single stranded RNA/ssRNA) bersifat linear dalam satu bagian
(monopartit). Ukuran RNA utas gandanya (double stranded RNA/dsRNA) adalah
8,35 x 106 Da (Gunasinghe & German 1989).
Pada tahun 1986, dsRNA berhasil diisolasi dari tanaman nanas terinfeksi di
Hawaii (Gunasinghe & German 1989) dan menyimpulkan bahwa virus dengan
RNA utas tunggal berasosiasi dengan penyakit layu nanas. Pada tahun 1987, suatu
virus berhasil diisolasi dari tanaman terinfeksi. Virus ini berbentuk batang lentur,
tidak beramplop, dan memiliki panjang 1200-1500 nm. Partikel virus, ketika
diwarnai dengan uranyl formate jenuh dalam methanol, menunjukkan suatu
struktur lubang pada sub unit selubung protein yang merupakan karakteristik
closterovirus (Gunasinghe & German 1989) (Gambar 2).
Gambar 2 Partikel PMWaV dibawah Mikroskop Elektron (CABI 2005).
Metode Deteksi PMWaV
Cara terbaik untuk mendeteksi PMWaV adalah dengan mengisolasi
dsRNA yang diikuti dengan seperasi RNA pada gel elektroforesis (Gunasinghe &
German 1989). Metode serologi seperti Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) atau Serological Specific Electron Microscopy (SSEM) dapat digunakan
jika tersedia antiserum (Gunasinghe dan German 1989), tetapi hasil deteksi
serologi yang lebih baik didapatkan dengan menggunakan metode Tissue Blot
Immunoassay (TBIA) (Hu et al. 1997). Virus ini dapat dimurnikan dengan
21
menggunakan presipitasi polyethyleneglycol (PEG) yang diikuti dengan cesium
sulphate gradient centrifugation menggunakan metode yang digunakan oleh
Gunasinghe dan German (1989). Ullman et al. (1989) berhasil menghasilkan
antiserum terhadap partikel mirip Closterovirus yang berasosiasi dengan penyakit
layu nanas. Hasil positif didapatkan dari tanaman yang terinfeksi virus
menggunnakan deteksi secara serologi dengan uji difusi ganda Ouchterloney,
ELISA, dan Serological Specific Electron Microscopy (SSEM).
Metode pendeteksian secara molekuler dengan reverse transcriptase
polymerase chain reaction (RT-PCR) juga dapat digunakan untuk mendeteksi
PMWaV dari tanaman nanas yang terinfeksi. Amplikon genom HSP 70 dari
PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil dideteksi dari tanaman nanas yang terinfeksi
oleh PMWaV menggunakan primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan
PMWaV-2 (Sether et al. 2001).
22
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan
Agustus 2005 sampai April 2006.
Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah sampel daun nanas cv. Smooth
Cayenne yang berasal dari pertanaman nanas di Kabupaten Subang Jawa Barat.
Sampel daun nanas di ambil dari lahan perkebunan nanas secara acak terhadap
tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas, serta sampel tanaman nanas
sehat. Beberapa tumbuhan selain nanas yang tumbuh di sekitar areal penanaman
nanas juga diambil untuk dianalisis.
Tissue Blot Immunoassay (TBIA)
Deteksi PMWaV secara serologi pada tanaman nanas dilakukan dengan
menggunakan metode TBIA seperti yang dilaporkan oleh Hu et al. (1997). Daun
dari tanaman nanas yang menunjukkan gejala maupun yang tidak bergejala layu,
digunakan sebagai sampel yang akan dideteksi. Sampel daun dipotong melintang
pada bagian dasar daun yang masih putih untuk membuat tepi potongan yang rata.
Potongan ini kemudian ditempelkan pada 0,45 µm Nitro ME nitrocelulose
membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA) selama 3-5 detik. Pola jaringan
pembuluh daun akan menempel dan tertinggal pada membran. Membran
kemudian disimpan kering diantara lipatan kertas saring pada suhu ruang sampai
siap dianalisis.
Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan
diblocking dengan 2% (wt/vol) susu skim yang dilarutkan dalam larutan
penyangga tris buffer saline (TBS) (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5)
selama 30 menit pada suhu ruang. Membran kemudian diinkubasikan dalam
23
wadah plastik yang baru atau kantung plastik segel dengan antibodi monoklonal
PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam TBS pada suhu
ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C selama 1 malam. Membran kemudian
dicuci dengan TBST (TBS + 0,5% Tween 20) selama 10 menit sebanyak 3 kali
pada suhu ruang. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasikan dengan
konjugat alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada
pengenceran 1:1000 dalam TBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran
kemudian dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat 5-bromo-4chloro-3-Indolyl
Phosphate/Nitro
Blue
Tetrazolium
(BCIP/NBT)
(Sigma
Chemical Co., USA) menggunakan satu tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam
10 ml larutan penyangga Alkaline Phosphate (AP). Pewarnaan dilakukan pada
suhu ruang hingga terjadi perubahan warna pada membran. Reaksi pewarnaan
dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Total RNA diekstrak dari 100 mg jaringan daun tanaman nanas
menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA).
Sampel RNA yang telah dimurnikan diresuspensikan dengan 40 µl air bebas
RNase, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai akan digunakan. Amplifikasi
sebagian genom PMWaV-1 dan PMWaV-2 dilakukan menggunakan sepasang
primer 223 dan 224 untuk PMWaV-2 dan 225 dan 226 untuk PMWaV-1 (Tabel
2).
Tabel 2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen PMWaV1 dan PMWaV-2 (Sether et al. 2001)
PMWaV Primer
225y
226z
224y
223z
Sekuen
Ukuran
produk
589
...
609
...
5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’
5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’
5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’
5’-TCATTGCACTCACTTATCGTTG-3’
x
Lokasi primer (posisi nukleotida dari awal) gen homolog HSP70 PMWaV
y
Forward primer
z
Reverse primer
1
1
2
2
Nukleotidax
118
707
226
835
24
Reaksi RT dilakukan pada volume 20 µl terdiri dari 3 µl RNA hasil
ekstraksi, 0,75 pmol primer, 500 mM dNTPs, 5 mM MgCl2, 4 µl bufer RT (250
mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), 20 unit
RNAsin Ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI, USA), dan 65 unit
MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Reaksi RT
dilakukan pada kondisi 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, diikuti
dengan inaktivasi pada 72 °C selama 15 menit.
Reaksi PCR dilakukan pada volume 50 µl terdiri dari 0,75 pmol forward
primer (224 untuk PMWaV-2 dan 226 untuk PMWaV-1) dan reverse primer (223
untuk PMWaV-2 dan 225 untuk PMWaV-1) (Tabel 2), 3 µl bufer reaksi (500 mM
KCl, 100 mM Tris-HCl [pH 9,0 pada 25°C], 1,0% [vol/vol] triton X-100), dan 0,5
µl taq DNA polimerase (Promega, Madison, USA). Kondisi PCR awalnya adalah
denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan 45
siklus pada 94 °C selama 1 menit, 50 °C selama 1 menit, dan 72 °C selama 1
menit, dan diikuti dengan perpanjangan pada 72 °C selama 10 menit pada mesin
PCR (Perkin Elmer 9700 thermocycler).
Separasi DNA produk RT-PCR dilakukan pada gel agarose 1% dalam
larutan penyangga TBE (54 gr Tris base, 27,5 gr Asam Borat, 20 ml EDTA 0,5 M,
pH 8,0 dalam 1000 ml air) pada kondisi 70 V selama 2 jam. Amplicon
divisualisasi dengan 2 µg/ml ethidium bromida dalam larutan penyangga TBE
untuk elektroforesis. Setelah pewarnaan, gel kemudian difoto di atas cahaya ultra
violet (310 nm) menggunakan kamera polaroid Direct Screen DS34 dan film
polaroid FP-3000B SS.
Purifikasi Virus
Seratus gram jaringan tanaman sakit dibekukan dengan nitrogen cair,
ditumbuk hingga halus dengan mortar, dan dicairkan dengan bufer ekstraksi EB
(500 mM Tris-Cl, pH 8,4, 4% Triton-X 100, 0,2% 2-mercaptoethanol) sebanyak 2
ml/g jaringan. Hasil gerusan dihomogenisasi menggunakan pengaduk selama satu
jam pada suhu 4°C dan disaring menggunakan kain kasa, dan hasil saringan
disentrifugasi pada 7.500 rpm selama 30 menit pada rotor P70AT (Hitachi).
25
Supernatan yang didapatkan kemudian disentrifugasi pada 44.500 rpm selama 60
menit pada rotor P70AT, dan peletnya dilarutkan dalam bufer TM (100 mM TrisCl, pH 8,5, dan 10 mM MgCl2) menggunakan 1/8 volume bufer ekstraksi.
Suspensi ini diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 7.500 rpm selama 15 menit
pada rotor P70AT, dan supernatan yang didapatkan dilapiskan diatas 5 ml 0,48
molal Cs2SO4 dalam bufer TM dan disentrifugasi pada 46.000 rpm selama 16 jam
dalam rotor P80AT pada suhu 8°C. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dalam 200 µl
bufer TM (Gunasinghe & German 1989).
Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
dan Western Blotting
Berat molekul protein selubung PMWaV dianalisis dengan menggunakan
metode SDS-PAGE. Analisis dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil pemurnian
virus, tanaman terinfeksi virus gemini, dan tanaman terinfeksi TMV sebagai
pembanding. Fraksi hasil pemurnian virus dihomogenisasi dengan 200 µl larutan
penyangga (62 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% 2-mercaphtoethanol, 10%
glycerol, dan 0.004% bromophenolblue), kemudian dipanaskan sampai mendidih
(100 °C) selama 10 menit, dan disentrifugasi 13.000 rpm (rotor Tomy MRX-151)
selama 10 menit. Supernatan dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu 20 °C.
Analisis SDS-PAGE membutuhkan dua jenis gel yang berbeda yaitu
separating gel (gel pemisah) dan stacking gel. Gel pemisah dibuat dengan cara
mencampur acrylamide 10% (1,8 ml) dengan bis-acrylamide 0,25% (1,5 ml),
Tris-HCl 0,375 M pH 8,8 (2,5 ml), SDS 0,1% (0,005 ml), TEMED 0,025% (0,006
ml), APS (amonium persulphate) 0,025% (0,17 ml), dan 4 ml air. Setelah bahanbahan tercampur rata kemudian dimasukkan ke dalam pelat gelas ukuran 10 x 7,2
cm yang telah dipasang pada gel stand. Permukaan atas gel diratakan dengan
menambah air di atas lapisan gel sekaligus untuk mempercepat pembekuan gel.
Air dapat dibuang setelah terlihat batas tegas antara air dan gel yang membeku.
Stacking gel dibuat dengan cara mencampur acrylamide 3% (0,06 ml) dengan bisacrylamide 0,08% (0,04 ml), Tris-HCl 0,125 M (2,5 ml), pH 6,8, SDS 0,1% (0,1
26
ml),
TEMED 0,025% (0,006 ml),
APS 0,025% (0,1 ml), dan 6,3 ml air.
Campuran tersebut selanjutnya dituang di atas gel pemisah, kemudian dipasang
sisir (comb), dan setelah gel membeku comb dapat dicabut dan gel siap
digunakan.
Sampel selubung protein virus yang berasal dari pemurnian virus,
didenaturasikan dengan cara memanaskan protein selubung virus pada suhu 100
°C selama 10 menit di dalam water bath. Setelah itu, sebanyak 15 µl masingmasing sampel protein dimasukkan ke dalam lubang gel poliakrilamid 10% yang
dibuat sebagaimana disebutkan di atas, dalam penyangga 10 ml Tris-HCl pH 8,3
yang mengandung 3.2 ml glisin 0,2 M dan 2 ml SDS 10%. Elektroforesis
dilakukan pada suhu ruang (24 °C) pada 80 volt selama 120-180 menit. Selubung
protein
PMWaV
dibandingkan
dengan
berat
molekul
penanda
seperti
phosphorilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic
anhydrase (30 kDa), trypsin inhibitor (20,1 kDa), α-lactabumin (14,4 kDa), yang
terdapat dalam satu ladder (Amersham Bioscience, UK).
Setelah
dielektroforesis,
protein
divisualisasi
dengan
pewarnaan
Coomassie Blue (Bio-Rad Laboratories, USA). Gel direndam dalam asam asetat
glasial 12,5% selama 5 menit kemudian direndam dalam larutan Coomassie blue
0,25% dan diinkubasi selama 12 jam di atas shaker. Gel dicuci menggunakan
larutan penghilang warna yang terdiri atas metanol 50% dan larutan asam asetat
10% sebanyak 3 x 10 menit.
Analisis protein dengan Western Blotting dilakukan untuk mengkonfirmasi
keberadaan protein selubung PMWaV dengan menggunakan metode He et al.
(1997). Protein murni virus dielektroforesis