dengan jarak 3 cm dari koloni R. solani. Perlakuan juga dibandingkan dengan pertumbuhan dan penghambatan R. pickettii kontrol. Perlakuan yang sama
dilakukan untuk jenis transkonjugan R. pickettii yang lainnya. Zona penghambatan pertumbuhan miselium R. solani dibentuk oleh jenis transkonjugan
R. pickettii yang memiliki sifat antagonis tinggi. Isolat transkojugan yang memiliki potensi penghambatan kemudian digunakan kembali untuk uji
antagonisme dual culture terhadap R. solani pada PDA yang telah ditambahkan kanamisin berkonsenterasi 50 µgml. Seleksi dipilih berdasarkan kemampuan
dalam menghambat pertumbuhan R. solani yang ditunjukkan dengan adanya proses kerusakan pada jaringan miselia cendawan yang tumbuh di dekat isolat
transkonjugan, perubahan warna pada miselia cendawan, dan yang terakhir adalah tebal dan tipis perkembangan miselia cendawan.
Pengujian Antagonisme antara Transkonjugan R. pickettii dengan R. solani
Transkonjugan R. pickettii terpilih digores terlebih dahulu pada PDA dengan pH 7 yang telah ditambahkan kanamisin berkonsenterasi 50 µgml dengan
jarak 3 cm dari tepi petri. Setelah biakan transkonjugan R. pickettii berumur 3 hari, 1 bulatan yang ditumbuhi R. solani dengan diameter 0.5 cm berumur 3 hari
diletakkan berseberangan terhadap transkonjugan pada PDA dengan jarak 3 cm dari tepi petri. Posisi keduanya sejajar satu sama lain. Hal yang sama ini juga
dilakukan pada transkonjugan R. pickettii lain. R. pickettii tipe liar digunakan sebagai perlakuan pembanding kontrol. Jenis transkonjugan yang memiliki
persentase penghambatan pertumbuhan miselia R. solani yang besar dapat digunakan untuk uji selanjutnya.
Konfirmasi Penyisipan Plasmid pUT Mini-Tn5Km1 pada Genom Transkonjugan R. pickettii dengan Teknik
Polymerase Chain Reaction PCR Isolasi DNA Genom Transkonjugan
R. pickettii Tn5Km1. Transkonjugan
R. pickettii yang terpilih dibiakkan pada LB 3 ml yang telah ditambahkan kanamisin dengan konsenterasi 50 µgml selama 48 jam. Biakan dimasukkan ke
dalam ependorf 1.5 ml dan disentrifugasi pada suhu 20 ᴼC selama 15 menit dengan
kecepatan 10 000 rpm. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensikan dengan 250 µl buffer TE yang telah dicampurkan lisozim 5 mgml, ependorf dikocok
11
berulang kali untuk mempercepat lisis sel. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada 37
ᴼC selama 30 menit menggunakan water shaker bath. Proses lisis bakteri dilanjutkan dengan penambahan 50 µl Sodium Dodecyl Sulfate SDS 10,
kemudian ependorf dikocok kembali berulang-ulang. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada suhu 37
ᴼC selama 1 jam dengan water shaker bath. Sebanyak 65 µl NaCl 5 M dan 80 µl CTAB-NaCl ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian
diinkubasi lagi pada suhu 65 ᴼC selama 20 menit, tabung kembali dikocok
berulang-ulang secara perlahan-lahan. Purifikasi DNA dan pemisahan debris sel dilakukan dengan ditambah
kloroform isoamil 24:1 sebanyak equal volume sebelumnya 450 µl, kemudian dikocok kuat selama 30 menit. DNA dipisahkan dari debris sel dengan cara
disentrifugasi pada suhu 20 ᴼC selama 15 menit dengan kecepatan 11 000 rpm.
Untuk mengendapkan DNA, supernatan sebanyak 450 µl yang didapatkan kemudian ditambahkan 450 µl isopropanol dingin dan dibantu dengan
disentrifugasi selama 20 menit dengan suhu 4 ᴼC dengan kecepatan 12 000 rpm.
Kemudian, pelet dicuci dengan 70 ETOH, supernatan dibuang. Pelet dikeringkan dengan membuka penutup dan ditutup dengan kertas tisu selama satu
malam. DNA pelet dilarutkan dengan buffer TE 100 µl dan dapat disimpan pada mesin freezer dengan suhu -20
ᴼC.
Ampilifikasi Sisipan Tn5Km1 pada Genom R. pickettii dengan PCR.
Sebanyak 1 µl larutan DNA dimasukkan ke dalam ependorf steril. Selanjutnya, komponen berikut ditambahkan, yaitu: primer forward Km0: 5’-ACA CTG ATG
AAT GTT CCG TTG- 3’ 40 pmol sebanyak 1 µl, primer reverse Km1: 5’-ACC
TGC AGG CAT GCA AGC TTC- 3’ 40 pmol sebanyak 1 µl, 2x Dream Taq
Green PCR master mix 12.5 µl, dan dd H
2
O ditambahkan hingga total volume dengan larutan DNA menjadi 25 µl. Suspensi tersebut dicampur hingga merata
dan dimasukkan ke dalam mesin PCR. Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu pradenaturasi 95
ᴼC selama 5 menit. Proses amplifikasi kemudian dilanjutkan sebanyak 30 siklus dengan tahap denaturasi 95
ᴼC selama 2 menit, primer annealing pada suhu 60
ᴼC selama 1 menit, dan primer ekstensi dilakukan pada suhu 72
ᴼC selama 1 menit. Setelah 30 siklus, proses PCR diakhiri dengan 12
tambahan ekstensi akhir pada suhu 72 ᴼC selama 10 menit. Selanjutnya, hasil PCR
dapat digunakan untuk proses selanjutnya. Proses selanjutnya adalah elektroforesis hasil PCR pada agarose yang ditambahkan EtBr, kemudian proses
running diatur pada tegangan 75 Volt selama 45 menit. Setelah selesai, hasil dapat dilihat dengan mesin UV transiluminator.
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
R. pickettii sebagai Agen Hayati R. solani
