Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu kloroform. Lapisan pertama dipindahkan pada tabung eppendorf baru, lalu ditambahkan sodium asetat 3M sebanyak 110 x volume total pada tabung baru tersebut, lalu dihomogenkan. Ethanol absolute yang dingin sebanyak 2x volume total ditambahkan, kemudian dihomogenkan hingga terlihat putih awan, setelah itu diinkubasi pada suhu -20°C selama satu malam. Pada keesokan setelah proses inkubasi, akan dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan pada 15000 rpm selama 10 menit, sehingga terdapat pelet berwarna putih yang mengandung DNA, ethanol dibuang secara hati-hati, setelah itu dibilas menggunakan alkohol 70 sebanyak 1 x volume total, lalu alkohol dibuang kembali. Pelet dikeringkan di dalam oven selama kurang lebih 15 menit, setelah kering dilarutkan ke dalam Buffer T E 10 mM Tris1mM EDTA larutan tersebut adalah larutan stok DNA simpan pada suhu -20°C. DNA genome yang sudah diisolasi dicampurkan dalam 1 tabung, masing-masing diambil 1µl menjadi 1 tabung mikrotube. DNA bulk atau Mix DNA dan akan menghasilkan konsentrasi yang sesuai diinginkan Karsinah et al ., 2002. Proses ini merupakan tahapan yang dilakukan pada koleksi penelitian sebelumnya Kusumawaty, Tahun, belum dipublikasikan.

2. Pengukuran Konsentrasi DNA

Pengukuran konsentrasi DNA dengan metode spektrofotometri. DNA murni dapat menyerap cahaya UV karena adanya basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm, sehingga kemurnian dapat diukur dengan dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm Å260Å280. Rumus sebagai berikut Fatchiyah, 2002 : [DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

d. Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis

DNA genome ikan gurame yang diisolasi diamplifikasi dengan metode PCR. Komposisi PCR yang digunakan terdiri dari Dreamtaq Green PCR MasterMix 2x didalamnya terdapat dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, 0,4 mM masing-masing, MgCl 2 4mM , Dreamtaq Green DNA Polymerase dan Dreamtaq Green Buffer , Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu Primer degenerate yang terdapat pada Tabel 4.1, Taq DNA Polymerase , 1 µl DNA template ikan gurame DNA stok diencerkan 20x dan 200x kemudian diambil 1µl, dan air deion ditambahkan hingga volume 12,5µl. Bahan tersebut dimasukan ke dalam tabung khusus untuk alat Thermal cycler dengan program Gene Amplyfied PCR System 9700 Scientific, 2011 . Pembuatan komposisi PCR dilakukan dengan keadaan dingin dengan konposisi terdapat pada Tabel 3.2 Polymerase , dan DNA template , dilakukan dengan cara divorteks sebelum ditambahkan seluruh bahan, dan menjentik-jentik tabung dengan cepat dan hati-hati, disentrifugasi lalu dimasukan ke dalam mesin PCR, yang sudah diprogram sesuai dengan primer yang sudah dirancang. Setelah itu DNA amplifikasi di elektroforesis pada gel agarosa 1, dengan tegangan 100 volt selama 40 menit buffer TAE 1 x larutan buffer TAE 10x diencerkan dalam deion dengan perbandingan 1:19 vv Sampel DNA dicampurkan dengan larutan Loading dye, 5:2 vv, sebelum dimasukan ke dalam sumur gel. Disamping sampel DNA, dimasukan marker lambda Hind III Eco R1 yang merupakan larutan DNA yang sudah diketahui ukurannya .gel agarosa yang sudah dielektroforesis direndam dengan pewarnaan pada larutan ethidium bromida 10 µg.ml selama dua menit. Kemudian dibilas menggunakan aquades selama 6 menit, gel agarosa diamati pada UV transiluminator. Tabel 3.2. Komposisi reaksi PCR DreamTaq Green PCR Master Mix 2x Komponen Volume 50 µl reaksi Konsentrasi akhir Volume akhir 10 µl reaksi DreamTaq Green PCR Master Mix 2x 25 µl 1x 5 µl Primer Forward 0.1-1.0 µM 0.5 µM 0,5 µl Primer Reverse 0.1-1.0 µM 0.5 µM 0,5 µl Sample DNA 10 pg- 1 µg 10 ng 0,5 µl Nuclease-free water sampai 50 µl Sampai 10 µl Jumlah 50 µl 10 µl Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu Gambar 3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested Gambar 3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested e. Sequencessing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R Sequencessing urutan hasil amplifikasi dengan metode PCR 2 sampel, yaitu sampel ikan gurame dari primer degenerate non nested dan primer degenerate nested dilakukan dengan reaksi 2 arah pasangan primer menggunakan mesin sequencer BigDye Applied Biosystem yang tersedia pada Macrogen, Korea www.macrogen.com. Analisa urutan merupakan ringkasan dari seluruh metode yang sudah dilakukan untuk mengetahui basa nukleotida dan dibandingkan kesamaannya dengan urutan lainnya. 95 ºC 95 ºC 51,2 ºC ” ’ 72 ºC 72 ºC ” ” ’ 10 ºC ∞ 35 siklus 95 ºC 95 ºC 52,8 ºC ” ’ 72 ºC 72 ºC ” ” ’ 10 ºC ∞ 35 siklus Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

f. Perancangan Primer Spesifik dari