Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu Berdasarkan DNA Mikrosatelit
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN NAPOLEON
(Cheilinus undulatus) DI KEPULAUAN SERIBU
BERDASARKAN DNA MIKROSATELIT
DINAR PUTRALAKSANA
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Analisis
Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheillinus undulatus) Di Kepulauan Seribu
Berdasarkan DNA Mikrosatelit adalah benar karya saya dengan arahan
pembimbing dan belum diajukan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang terdapat dalam skripsi ini dalam bentuk karya tulis penulis lain
telah dicantumkan dalam bagian Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Dinar Putralaksana
NIM C54100050
ABSTRAK
DINAR PUTRALAKSANA. Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon
(Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu berdasarkan DNA Mikrosatelit.
Dibimbing oleh HAWIS H MADDUPPA dan ADRIANI SUNUDDIN.
Ikan Napoleon merupakan salah ikan Highly commercial yang juga
merupakan spesies kunci pemangsa yang memainkan peranan penting bagi proses
ekologi dan keberlanjutan ekosistem terumbu karang. Tujuan penelitian ini adalah
menganalisis tingkat keragaman genetik ikan napoleon berdasarkan DNA
Mikrosatelit di Kepulauan Seribu, serta mengetahui status konservasi dan
perdagangannya. Ekstraksi sampel menggunakan metode DNeasy blood and
tissue kit produksi Qiagen. Amplifikasi gen lokus mikrosatelit dengan proses PCR
(Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer lokus A3, A65, T63. Tahapan
annealing atau proses pemanasan untuk penempelan primer dilakukan pada suhu
57 °C untuk primer (A65), 58 °C (T63), dan 56 °C (A3), selama 30 detik dan 30x
siklus. Hasil keragaman genetik menunjukan nilai Heterozigositas observasi
(Hobs) rata-rata 0.608 dari tiga lokus yang digunakan. Nilai PIC (Polymorphic
information content) tertinggi terdapat pada primer lokus T63 dengan nilai PIC
sebesar 0.588 dan jumlah alel yang teramplifikasi sebanyak tujuh alel. Ikan
napoleon termasuk kedalam status konservasi IUCN kategori terancam. Status
perdagangan ikan napoleon berdasarkan CITES adalah Appendix II.
Kata kunci: keragaman genetik, DNA mikrosatelit, status konservasi, status
perdagangan
ABSTRACT
DINAR PUTRALAKSANA. Genetic Diversity Analysis of Napoleon Wrasse
(Cheilinus undulatus) in Kepulauan Seribu, based on Microsatellite DNA.
Supervised by HAWIS H MADDUPPA and ADRIANI SUNUDDIN.
Napoleon wrasse is one of many fish that belongs to highly commercial
category on Fishing Industry. In addition, napoleon wrasse is well known as one
of the key predator species which play an important role for the ecology and
sustainability of coral reef ecosystems. The purpose of this study was to analyze
genetic diversity level of napoleon wrasse at Kepulauan Seribu, and recognize the
conservation and trading status of napoleon wrasse. Sample extraction using
DNeasy blood and tissue kit by Qiagen. Amplification of microsatellite loci gene
by PCR using primer of A3, A65, and T63 loci. Stages of annealing was carried
out at 57 °C on A65 primer, 58 °C on T63 primer, and 56 °C on A3 primer, for 30
seconds and 30x cycle. Genetic diversity result showing that the average values of
Hobs from 3 loci that being used is 0.608. The highest PIC value was found on
T63 loci primer, with 0.588 PIC value and 7 numbers of alleles were amplified.
Based on IUCN, Napoleon wrasse was listed on endangered status and listed on
Appendix II of trading status by CITES.
Keywords: Genetic diversity, microsatellite DNA, conservation status, trade status
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN NAPOLEON
(Cheilinus undulatus) DI KEPULAUAN SERIBU
BERDASARKAN DNA MIKROSATELIT
DINAR PUTRALAKSANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Ilmu Kelautan
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheilinus undulatus)
di Kepulauan Seribu Berdasarkan DNA Mikrosatelit
Nama
: Dinar Putralaksana
NIM
: C54100050
Disetujui oleh
Dr. Hawis H Madduppa, S.Pi, M.Si
Pembimbing I
Adriani Sunuddin, S.Pi, M.Si
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Wayan Nurjaya, M.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Segala puji bagi Allah, Tuhan Yang Maha Esa, sang penguasa kehidupan
dan akhirat ini, karena berkat rahmat, ridho, dan petunjukNya lah, kegiatan
penelitian yang berjudul “Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheilinus
undulatus) di Kepulauan Seribu berdasarkan DNA Mikrosatelit” dapat
terselesaikan.
Skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya bantuan baik berupa materil dan
moril dari berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis
menyampaikan rasa terima kasih pada Bapak Dr. Hawis H. Madduppa S.Pi, M.Si
dan Ibu Adriani Sunuddin, S.Pi, M.Si selaku dosen pembimbing. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua beserta adik tercinta yang
selalu memberikan dukungan dan doa yang tulus kepada penulis, peneliti dan staff
Indonesian Biodiversity Research Center (IBRC) Bali atas fasilitas juga
bimbingannya, teman-teman seperjuangan Ilmu dan Teknologi Kelautan IPB
angkatan 47 serta semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan skripsi
ini.
Semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan kita selalu
mendapatkan berkat dari-Nya.
Bogor, November 2014
Dinar Putralaksana
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Lokasi Penelitian
2
Prosedur Penelitian
2
Analisis Data
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Karakteristik Mikrosatelit
6
Keragaman Genetik
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR TABEL
1 Informasi primer mikrosatelit lokus A65, T63, dan A3
2 Nilai karakteristik mikrosatelit dari tiga lokus mikrosatelit ikan
napoleon (Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu
3 Nilai heterozigositas yang diobservasi (Hobs) dan heterozigositas yang
diperkirakan (Hexp) dari tiga lokus mikrosatelit ikan napoleon
(Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu
4 Impor (dalam kg) ikan napoleon di China, Hongkong SAR
4
6
8
10
DAFTAR GAMBAR
1. Diagram alir prosedur analisis laboratorium
3
DAFTAR LAMPIRAN
1. Ukuran rata-rata panjang Napoleon
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan Napoleon, Cheilinus undulatus (Rüppell, 1835 dalam Wiadyna 2011),
adalah salah satu ikan terumbu besar yang hidup pada daerah tropis. Ikan
napoleon termasuk kedalam kategori ikan Highly Commercial dalam perikanan
tangkap (Wiadyna, 2011). Selain dikenal sebagai komoditas bernilai tinggi, Ikan
Napoleon diketahui merupakan salah satu species pemangsa kunci yang
memainkan peranan penting bagi proses ekologi dan keberlanjutan ekosistem
terumbu karang. Ikan Napoleon dilaporkan memangsa bintang laut berduri
(Crown of Thorns starfish) yang diketahui merupakan pemangsa organisme
pembangun terumbu karang (Sadovy et al., 2003). Kajian menunjukkan bahwa
hilangnya ikan Napoleon dari ekosistem terumbu karang akan mendorong
meledaknya populasi bintang laut berduri yang pada gilirannya memangsa
organisme pembangun terumbu secara besar-besaran (CRC Reef Research Centre,
2003). Dewasa ini, ikan napoleon dikultur untuk menjadi persediaan dari
permintaan ikan konsumsi pada skala internasional yang terus meningkat
(Soemodinoto et al., 2013). Selain itu, ada juga pengembangan pasar ekspor untuk
juwana dari ikan napoleon yang diperdagangkan untuk perdagangan akuarium
laut. Oleh karena itu ikan napoleon atau Cheilinus undulatus dianggap sebagai
ikan yang terancam di dunia (Donaldson dan Sadovy, 2001 dalam Dorenbosch,
2006). Berdasarkan hal tersebut perlu diadakan pelestarian dan penelitian lebih
lanjut mengenai biodiversitas dari ikan napoleon, khususnya di perairan sekitar
Indonesia, baik antar individu pada satu populasi maupun antar populasi yang
berjauhan.
Struktur genetik pada suatu populasi berperan penting dalam penyusunan
strategi konservasi. Struktur genetik populasi penting untuk diketahui agar dapat
ditentukan apakah suatu populasi dikelola sebagai unit manajemen berbeda atau
tidak, karena apabila hal ini tidak dilakukan dapat menimbulkan dampak yang
kurang baik pada populasi tersebut (Wandia et al., 2009 dalam Lumban Gaol et
al., 2013). Struktur genetik dapat diungkap dengan materi genetik berupa protein
dan DNA. Pada tingkat DNA struktur genetik dapat diungkap dengan
mikrosatelit.
Analisis marka mikrosatelit merupakan salah satu upaya yang bisa
dilakukan dalam penelusuran lebih lanjut informasi suatu spesies, baik dalam
rangka pelestarian maupun tambahan ilmu bagi dunia pengetahuan. Berbeda
halnya dengan marka mitokondria, mikrosatelit merupakan segmen langsung dari
genom inti sehingga variasi genetik yang ditemukan merupakan pencerminan
variasi genetik yang sebenarnya. Variasi genetik mikrosatelit yang tinggi
merupakan marka molekuler yang baik untuk kajian genetika populasi (Smith et
al., 2000 dalam Lumban Gaol et al., 2013). Mikrosatelit sebagai penanda
molekuler telah digunakan secara luas di berbagai studi genetika populasi
(Rogers, 2005 dalam Lumban Gaol et al., 2013) karena keunggulan yang
dimilikinya seperti kelimpahannya yang tinggi dalam genom eukariot, variasi
genetiknya tinggi akibat mutasi, dan amplifikasinya mudah secara in vitro melalui
Polymerase Chain Reaction (PCR).
2
Tujuan Penelitian
1. Menganalisis tingkat keragaman genetik antar individu yang terdapat di
perairan Pulau Pramuka, Kepulauan Seribu, DKI Jakarta berdasarkan
DNA Mikrosatelit
2. Mengetahui status konservasi dari ikan napoleon berdasarkan IUCN
(International Union for Conservation of Nature) serta status perdagangan
berdasarkan CITES (Convention on International Trade in Endangered
Species).
METODE
Lokasi Penelitian
Kegiatan penelitian ini dilakukan pada bulan April - Juli 2014.
Pengambilan sampel ikan napoleon dilakukan di Nusa Keramba, Kepulauan
Seribu pada keramba jaring apung ikan napoleon. Analisis laboratorium bertempat
di Indonesian Biodiversity Research Center (IBRC), Sesetan – Bali, dan
Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan, Departemen Ilmu dan
Teknologi Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor.
Prosedur Penelitian
Metode Perolehan Data Sampel
Sampel ikan napoleon (Cheilinus undulatus) yang diambil merupakan hasil
sitaan dari nelayan di sekitar perairan Kepulauan Seribu. Napoleon yang terdapat
di keramba jaring apung merupakan kumpulan dari populasi napoleon yang
berbeda karena berasal dari perairan yang berbeda. Sampel ikan napoleon diambil
sedikit pada bagian sirip kaudal. Jumlah sampel ikan napoleon yang diambil
adalah 56 sampel. Sampel dimasukkan dalam tube yang berisi etanol 96% dan
diberi label. Selain itu, dilakukan juga pengukuran data panjang ikan napoleon
menggunakan penggaris serta dokumentasi ikan yang dijadikan sampel. Kisaran
panjang ikan napoleon yang dijadikan sampel adalah 23 - 30.5 cm.
Analisis Laboratorium
Analisis laboratorium dilakukan dalam tiga tahap, yaitu Ekstraksi DNA,
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis. Sampel sirip ikan napoleon
(Cheilinus undulatus) yang digunakan untuk dianalisis berjumlah 39 sampel dari
56 sampel yang diambil pada keramba jaring apung di Nusa Keramba, Kepulauan
Seribu. Gambar 1 merupakan diagram alir prosedur analisis laboratorium:
3
Mulai
Ekstraksi DNA sampel
napoleon
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA Negatif
Elektroforesis
DNA Positif
Pengiriman Hasil DNA Positif Ke
Sequencing Facility UC, Barkeley
Analisa Data Mikrosatelit oleh
Software Genemarker V.1.85
(Demo Version) dan Cervus 3.0
Selesai
Gambar 1 Diagram alir prosedur analisis laboratorium
4
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA bertujuan untuk menghancurkan jaringan daging sampel dan
memisahkan DNA dari jaringannya. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dalam
beberapa metode. Metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA ikan napoleon ini
adalah dengan menggunakan Dneasy blood and tissue kit produksi Qiagen.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR bertujuan untuk mengamplifikasi gen lokus mikrosatelit. Komponen
yang digunakan pada tahap ini adalah template DNA, enzim Taq DNA
polymerase Gold, dNTPs, buffer PCR, MgCl2, primer sequence (5’-3”) forward
dan reverse dari Lokus A65;T63;A3 (Peng et al., 2013) sertaair deionase (ddH2O).
Komposisi dalam satu tube proses PCR antara lain ddH2O 15µl, 10x PCR
Buffer (Gold) 2.5 µl, dNTPs 1 µl, MgCl23 µl, primer forward 1 µl, primer reverse
1 µl, PE Amplitaq 0.1 µl, template DNA sebanyak 4 µl. PCR dilakukan dalam
satu siklus pada suhu 95°C selama 5 menit, lalu diikuti dengan 30 siklus
denaturasi pada 94°C untuk 30 detik, lalu 30 detik annealing pada temperatur
pada Tabel 1, lalu tahap ekstensi pada 72°C untuk 30 detik, dan ekstensi yang
terakhir pada 72°C untuk 5 menit.
Tabel 1 Informasi primer mikrosatelit lokus A65, T63, dan A3
Lokus
Dye
A65
VIC
(Red)
T63
A3
Primer Sekuens (5'-3")
F: AACCGACCACAGGAAGAGGAT
Repeat
Motif
Suhu Annealing
(°C)
(CA)13
57
(CT)6
58
(AC)7C2(AC)5
56
R: GGAGGAGGTAAGTGAAGTAACGC
PET
(Green)
F: GGTCAAGGAGGCGGGTTT
PET
(Green)
F: GTTCTCAGCAGCCATCCT
R: TGTCTGCACCAGGGTCAGC
R: CGATTAGACCCAAACCCT
Sumber :Peng et al. (2012)
Elektroforesis
Tahapan elektroforesis merupakan tahapan lanjutan untuk melihat DNA
yang positif atau negatif dari produk PCR yang dihasilkan. Tahap awal yang
dilakukan adalah pembuatan Gel Agarosa 10% dengan mencampurkan 0.75 gram
bubuk agarosa dengan 75 mL TBE 0.5x dalam tabung Erlenmeyer. Panaskan pada
microwave selama 1 menit hingga agarose terlihat larut. Kemudian tuangkan
dalam cetakan agarosa dan pasangkan sisir kemudian tunggu selama 15-25 menit
hingga gel terbentuk (Pratiwi, 2001).
Masukan sampel hasil PCR dengan menggunakan micropipet dengan
terlebih dahulu campurkan dengan loading dye sebagai pewarna. Tahap
pencampuran dilakukan menggunakan micropipet. Setelah itu masukkan kedalam
5
cetakan gel tersebut. Jalankan mesin elektroforesis pada 200 V dan arus 400 mA.
Setelah selesai, rendam hasil cetakan gel pada wadah berisi EtBr, tunggu hingga
15 menit, lalu bilas pada air TBE dan lihat hasilnya dengan menggunakan lampu
UV pada panjang gelombang 254 nm kemudian hasil gambar difoto dengan
menggunakan kamera.
Fragment Analysis
Fragment analysis adalah istilah umum yang digunakan untuk
mendeskripsikan analisis eksperimen penanda genetik, yang bergantung pada
pendeteksian perubahan panjang sekuens DNA yang spesifik untuk menentukan
presensi atau absensi dari penanda genetik (Olga, 2013). Fragment analysis
adalah teknik genetik umum yang hasil sekuens dari suatu gen tidak dianalisis
secara langsung dari urutan basanya, melainkan keberadaan dari suatu alel atau
versi mutasi dari alel yang ada, dan ditujukan oleh keberadaan atau mutasi alel
pada sekuens DNA yang terhubung yang nantinya dijadikan penanda dari alelnya.
Hal ini menyebabkan penggunaan data fragment analysis tepat digunakan dalam
analisis mikrosatelit untuk melihat keragaman genetik dari spesies yang diteliti.
Cara mendapatkan data fragment analysis adalah dengan mengamplifikasi sampel
yang sudah diekstraksi dengan metode PCR. Proses fragment analysis dikirim ke
Berkeley Sequencing Facility yang terdapat di Amerika (Sanger et al., 1997).
Analisis Data
Karakteristik Mikrosatelit
Parameter dari karakteristik mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
ini yaitu jumlah alel per lokus, jumlah sampel yang dianalisis, nilai PIC
(Polymorphic information content) serta Hardy-Weinberg principle (HWP).
Jumlah alel tiap lokus dan frekuensi alel dikalkulasikan atau dihitung
menggunakan perangkat lunak Genemarker V 1.8 dan CERVUS 3.0 (Marshall et
al., 1998).
Keragaman Genetik
Dua parameter dari keragaman genetik yang digunakan dalam penelitian
ini yaitu nilai Heterozigositas observasi (Hobs) dan Heterozigositas yang
diperkirakan (Hexp). Heterozigositas observasi (Hobs) merupakan nilai
heterozigositas yang diperoleh dari sampel pengamatan, sedangkan
heterozigositas yang diperkirakan (Hexp) merupakan nilai heterozigositas yang
diharapkan berdasarkan Hardy-weinberg Principle. Menezes (2005) berpendapat
bahwa suatu penanda lokus dianggap sangat baik ketika nilai Hobs rata rata yang
didapat lebih tinggi dari 0.7, dan kurang baik apabila nilainya dibawah 0.5.
Jumlah heterozigositas yang diamati dan heterozigositas didapatkan (Nei, 1973)
dikalkulasikan atau dihitung menggunakan perangkat lunak CERVUS 3.0
(Marshall et al., 1998).
6
Status Konservasi dan Perdagangan
Status konservasi napoleon dilihat dari situs IUCN (International Union of
Conservation Nation) yaitu www.iucnredlist.org dan status perdagangan napoleon
dilihat dari situs CITES (Convention on the International Trade in Endangered
Species) cites.org/eng/app/appendices.php.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Mikrosatelit
Mikrosatelit atau biasa disebut simple sequence repeat merupakan kelas
dari polimorfik genetik yang biasa digunakan dalam pemetaan genetik
(phylogeography) dan analisis kekerabatan serta untuk merekam jejak pola
keturunan. Setelah dilakukan analisis mikrosatelit terhadap sampel napoleon
didapatkan hasil pada Tabel 2.
Tabel 2 Nilai karakteristik mikrosatelit Jumlah alel (Na), jumlah sampel (N),
polymorphic information content (PIC). Tanda asterisk (*) menunjukan
deviasi signifikan dari Hardy-Weinberg principle (HWP) dengan
menggunakan koreksi Bonferroni (P
(Cheilinus undulatus) DI KEPULAUAN SERIBU
BERDASARKAN DNA MIKROSATELIT
DINAR PUTRALAKSANA
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Analisis
Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheillinus undulatus) Di Kepulauan Seribu
Berdasarkan DNA Mikrosatelit adalah benar karya saya dengan arahan
pembimbing dan belum diajukan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang terdapat dalam skripsi ini dalam bentuk karya tulis penulis lain
telah dicantumkan dalam bagian Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Dinar Putralaksana
NIM C54100050
ABSTRAK
DINAR PUTRALAKSANA. Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon
(Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu berdasarkan DNA Mikrosatelit.
Dibimbing oleh HAWIS H MADDUPPA dan ADRIANI SUNUDDIN.
Ikan Napoleon merupakan salah ikan Highly commercial yang juga
merupakan spesies kunci pemangsa yang memainkan peranan penting bagi proses
ekologi dan keberlanjutan ekosistem terumbu karang. Tujuan penelitian ini adalah
menganalisis tingkat keragaman genetik ikan napoleon berdasarkan DNA
Mikrosatelit di Kepulauan Seribu, serta mengetahui status konservasi dan
perdagangannya. Ekstraksi sampel menggunakan metode DNeasy blood and
tissue kit produksi Qiagen. Amplifikasi gen lokus mikrosatelit dengan proses PCR
(Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer lokus A3, A65, T63. Tahapan
annealing atau proses pemanasan untuk penempelan primer dilakukan pada suhu
57 °C untuk primer (A65), 58 °C (T63), dan 56 °C (A3), selama 30 detik dan 30x
siklus. Hasil keragaman genetik menunjukan nilai Heterozigositas observasi
(Hobs) rata-rata 0.608 dari tiga lokus yang digunakan. Nilai PIC (Polymorphic
information content) tertinggi terdapat pada primer lokus T63 dengan nilai PIC
sebesar 0.588 dan jumlah alel yang teramplifikasi sebanyak tujuh alel. Ikan
napoleon termasuk kedalam status konservasi IUCN kategori terancam. Status
perdagangan ikan napoleon berdasarkan CITES adalah Appendix II.
Kata kunci: keragaman genetik, DNA mikrosatelit, status konservasi, status
perdagangan
ABSTRACT
DINAR PUTRALAKSANA. Genetic Diversity Analysis of Napoleon Wrasse
(Cheilinus undulatus) in Kepulauan Seribu, based on Microsatellite DNA.
Supervised by HAWIS H MADDUPPA and ADRIANI SUNUDDIN.
Napoleon wrasse is one of many fish that belongs to highly commercial
category on Fishing Industry. In addition, napoleon wrasse is well known as one
of the key predator species which play an important role for the ecology and
sustainability of coral reef ecosystems. The purpose of this study was to analyze
genetic diversity level of napoleon wrasse at Kepulauan Seribu, and recognize the
conservation and trading status of napoleon wrasse. Sample extraction using
DNeasy blood and tissue kit by Qiagen. Amplification of microsatellite loci gene
by PCR using primer of A3, A65, and T63 loci. Stages of annealing was carried
out at 57 °C on A65 primer, 58 °C on T63 primer, and 56 °C on A3 primer, for 30
seconds and 30x cycle. Genetic diversity result showing that the average values of
Hobs from 3 loci that being used is 0.608. The highest PIC value was found on
T63 loci primer, with 0.588 PIC value and 7 numbers of alleles were amplified.
Based on IUCN, Napoleon wrasse was listed on endangered status and listed on
Appendix II of trading status by CITES.
Keywords: Genetic diversity, microsatellite DNA, conservation status, trade status
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN NAPOLEON
(Cheilinus undulatus) DI KEPULAUAN SERIBU
BERDASARKAN DNA MIKROSATELIT
DINAR PUTRALAKSANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Ilmu Kelautan
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheilinus undulatus)
di Kepulauan Seribu Berdasarkan DNA Mikrosatelit
Nama
: Dinar Putralaksana
NIM
: C54100050
Disetujui oleh
Dr. Hawis H Madduppa, S.Pi, M.Si
Pembimbing I
Adriani Sunuddin, S.Pi, M.Si
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Wayan Nurjaya, M.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Segala puji bagi Allah, Tuhan Yang Maha Esa, sang penguasa kehidupan
dan akhirat ini, karena berkat rahmat, ridho, dan petunjukNya lah, kegiatan
penelitian yang berjudul “Analisis Keragaman Genetik Ikan Napoleon (Cheilinus
undulatus) di Kepulauan Seribu berdasarkan DNA Mikrosatelit” dapat
terselesaikan.
Skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya bantuan baik berupa materil dan
moril dari berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis
menyampaikan rasa terima kasih pada Bapak Dr. Hawis H. Madduppa S.Pi, M.Si
dan Ibu Adriani Sunuddin, S.Pi, M.Si selaku dosen pembimbing. Ucapan terima
kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua beserta adik tercinta yang
selalu memberikan dukungan dan doa yang tulus kepada penulis, peneliti dan staff
Indonesian Biodiversity Research Center (IBRC) Bali atas fasilitas juga
bimbingannya, teman-teman seperjuangan Ilmu dan Teknologi Kelautan IPB
angkatan 47 serta semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan skripsi
ini.
Semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan kita selalu
mendapatkan berkat dari-Nya.
Bogor, November 2014
Dinar Putralaksana
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Lokasi Penelitian
2
Prosedur Penelitian
2
Analisis Data
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Karakteristik Mikrosatelit
6
Keragaman Genetik
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR TABEL
1 Informasi primer mikrosatelit lokus A65, T63, dan A3
2 Nilai karakteristik mikrosatelit dari tiga lokus mikrosatelit ikan
napoleon (Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu
3 Nilai heterozigositas yang diobservasi (Hobs) dan heterozigositas yang
diperkirakan (Hexp) dari tiga lokus mikrosatelit ikan napoleon
(Cheilinus undulatus) di Kepulauan Seribu
4 Impor (dalam kg) ikan napoleon di China, Hongkong SAR
4
6
8
10
DAFTAR GAMBAR
1. Diagram alir prosedur analisis laboratorium
3
DAFTAR LAMPIRAN
1. Ukuran rata-rata panjang Napoleon
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan Napoleon, Cheilinus undulatus (Rüppell, 1835 dalam Wiadyna 2011),
adalah salah satu ikan terumbu besar yang hidup pada daerah tropis. Ikan
napoleon termasuk kedalam kategori ikan Highly Commercial dalam perikanan
tangkap (Wiadyna, 2011). Selain dikenal sebagai komoditas bernilai tinggi, Ikan
Napoleon diketahui merupakan salah satu species pemangsa kunci yang
memainkan peranan penting bagi proses ekologi dan keberlanjutan ekosistem
terumbu karang. Ikan Napoleon dilaporkan memangsa bintang laut berduri
(Crown of Thorns starfish) yang diketahui merupakan pemangsa organisme
pembangun terumbu karang (Sadovy et al., 2003). Kajian menunjukkan bahwa
hilangnya ikan Napoleon dari ekosistem terumbu karang akan mendorong
meledaknya populasi bintang laut berduri yang pada gilirannya memangsa
organisme pembangun terumbu secara besar-besaran (CRC Reef Research Centre,
2003). Dewasa ini, ikan napoleon dikultur untuk menjadi persediaan dari
permintaan ikan konsumsi pada skala internasional yang terus meningkat
(Soemodinoto et al., 2013). Selain itu, ada juga pengembangan pasar ekspor untuk
juwana dari ikan napoleon yang diperdagangkan untuk perdagangan akuarium
laut. Oleh karena itu ikan napoleon atau Cheilinus undulatus dianggap sebagai
ikan yang terancam di dunia (Donaldson dan Sadovy, 2001 dalam Dorenbosch,
2006). Berdasarkan hal tersebut perlu diadakan pelestarian dan penelitian lebih
lanjut mengenai biodiversitas dari ikan napoleon, khususnya di perairan sekitar
Indonesia, baik antar individu pada satu populasi maupun antar populasi yang
berjauhan.
Struktur genetik pada suatu populasi berperan penting dalam penyusunan
strategi konservasi. Struktur genetik populasi penting untuk diketahui agar dapat
ditentukan apakah suatu populasi dikelola sebagai unit manajemen berbeda atau
tidak, karena apabila hal ini tidak dilakukan dapat menimbulkan dampak yang
kurang baik pada populasi tersebut (Wandia et al., 2009 dalam Lumban Gaol et
al., 2013). Struktur genetik dapat diungkap dengan materi genetik berupa protein
dan DNA. Pada tingkat DNA struktur genetik dapat diungkap dengan
mikrosatelit.
Analisis marka mikrosatelit merupakan salah satu upaya yang bisa
dilakukan dalam penelusuran lebih lanjut informasi suatu spesies, baik dalam
rangka pelestarian maupun tambahan ilmu bagi dunia pengetahuan. Berbeda
halnya dengan marka mitokondria, mikrosatelit merupakan segmen langsung dari
genom inti sehingga variasi genetik yang ditemukan merupakan pencerminan
variasi genetik yang sebenarnya. Variasi genetik mikrosatelit yang tinggi
merupakan marka molekuler yang baik untuk kajian genetika populasi (Smith et
al., 2000 dalam Lumban Gaol et al., 2013). Mikrosatelit sebagai penanda
molekuler telah digunakan secara luas di berbagai studi genetika populasi
(Rogers, 2005 dalam Lumban Gaol et al., 2013) karena keunggulan yang
dimilikinya seperti kelimpahannya yang tinggi dalam genom eukariot, variasi
genetiknya tinggi akibat mutasi, dan amplifikasinya mudah secara in vitro melalui
Polymerase Chain Reaction (PCR).
2
Tujuan Penelitian
1. Menganalisis tingkat keragaman genetik antar individu yang terdapat di
perairan Pulau Pramuka, Kepulauan Seribu, DKI Jakarta berdasarkan
DNA Mikrosatelit
2. Mengetahui status konservasi dari ikan napoleon berdasarkan IUCN
(International Union for Conservation of Nature) serta status perdagangan
berdasarkan CITES (Convention on International Trade in Endangered
Species).
METODE
Lokasi Penelitian
Kegiatan penelitian ini dilakukan pada bulan April - Juli 2014.
Pengambilan sampel ikan napoleon dilakukan di Nusa Keramba, Kepulauan
Seribu pada keramba jaring apung ikan napoleon. Analisis laboratorium bertempat
di Indonesian Biodiversity Research Center (IBRC), Sesetan – Bali, dan
Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan, Departemen Ilmu dan
Teknologi Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor.
Prosedur Penelitian
Metode Perolehan Data Sampel
Sampel ikan napoleon (Cheilinus undulatus) yang diambil merupakan hasil
sitaan dari nelayan di sekitar perairan Kepulauan Seribu. Napoleon yang terdapat
di keramba jaring apung merupakan kumpulan dari populasi napoleon yang
berbeda karena berasal dari perairan yang berbeda. Sampel ikan napoleon diambil
sedikit pada bagian sirip kaudal. Jumlah sampel ikan napoleon yang diambil
adalah 56 sampel. Sampel dimasukkan dalam tube yang berisi etanol 96% dan
diberi label. Selain itu, dilakukan juga pengukuran data panjang ikan napoleon
menggunakan penggaris serta dokumentasi ikan yang dijadikan sampel. Kisaran
panjang ikan napoleon yang dijadikan sampel adalah 23 - 30.5 cm.
Analisis Laboratorium
Analisis laboratorium dilakukan dalam tiga tahap, yaitu Ekstraksi DNA,
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis. Sampel sirip ikan napoleon
(Cheilinus undulatus) yang digunakan untuk dianalisis berjumlah 39 sampel dari
56 sampel yang diambil pada keramba jaring apung di Nusa Keramba, Kepulauan
Seribu. Gambar 1 merupakan diagram alir prosedur analisis laboratorium:
3
Mulai
Ekstraksi DNA sampel
napoleon
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA Negatif
Elektroforesis
DNA Positif
Pengiriman Hasil DNA Positif Ke
Sequencing Facility UC, Barkeley
Analisa Data Mikrosatelit oleh
Software Genemarker V.1.85
(Demo Version) dan Cervus 3.0
Selesai
Gambar 1 Diagram alir prosedur analisis laboratorium
4
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA bertujuan untuk menghancurkan jaringan daging sampel dan
memisahkan DNA dari jaringannya. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dalam
beberapa metode. Metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA ikan napoleon ini
adalah dengan menggunakan Dneasy blood and tissue kit produksi Qiagen.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR bertujuan untuk mengamplifikasi gen lokus mikrosatelit. Komponen
yang digunakan pada tahap ini adalah template DNA, enzim Taq DNA
polymerase Gold, dNTPs, buffer PCR, MgCl2, primer sequence (5’-3”) forward
dan reverse dari Lokus A65;T63;A3 (Peng et al., 2013) sertaair deionase (ddH2O).
Komposisi dalam satu tube proses PCR antara lain ddH2O 15µl, 10x PCR
Buffer (Gold) 2.5 µl, dNTPs 1 µl, MgCl23 µl, primer forward 1 µl, primer reverse
1 µl, PE Amplitaq 0.1 µl, template DNA sebanyak 4 µl. PCR dilakukan dalam
satu siklus pada suhu 95°C selama 5 menit, lalu diikuti dengan 30 siklus
denaturasi pada 94°C untuk 30 detik, lalu 30 detik annealing pada temperatur
pada Tabel 1, lalu tahap ekstensi pada 72°C untuk 30 detik, dan ekstensi yang
terakhir pada 72°C untuk 5 menit.
Tabel 1 Informasi primer mikrosatelit lokus A65, T63, dan A3
Lokus
Dye
A65
VIC
(Red)
T63
A3
Primer Sekuens (5'-3")
F: AACCGACCACAGGAAGAGGAT
Repeat
Motif
Suhu Annealing
(°C)
(CA)13
57
(CT)6
58
(AC)7C2(AC)5
56
R: GGAGGAGGTAAGTGAAGTAACGC
PET
(Green)
F: GGTCAAGGAGGCGGGTTT
PET
(Green)
F: GTTCTCAGCAGCCATCCT
R: TGTCTGCACCAGGGTCAGC
R: CGATTAGACCCAAACCCT
Sumber :Peng et al. (2012)
Elektroforesis
Tahapan elektroforesis merupakan tahapan lanjutan untuk melihat DNA
yang positif atau negatif dari produk PCR yang dihasilkan. Tahap awal yang
dilakukan adalah pembuatan Gel Agarosa 10% dengan mencampurkan 0.75 gram
bubuk agarosa dengan 75 mL TBE 0.5x dalam tabung Erlenmeyer. Panaskan pada
microwave selama 1 menit hingga agarose terlihat larut. Kemudian tuangkan
dalam cetakan agarosa dan pasangkan sisir kemudian tunggu selama 15-25 menit
hingga gel terbentuk (Pratiwi, 2001).
Masukan sampel hasil PCR dengan menggunakan micropipet dengan
terlebih dahulu campurkan dengan loading dye sebagai pewarna. Tahap
pencampuran dilakukan menggunakan micropipet. Setelah itu masukkan kedalam
5
cetakan gel tersebut. Jalankan mesin elektroforesis pada 200 V dan arus 400 mA.
Setelah selesai, rendam hasil cetakan gel pada wadah berisi EtBr, tunggu hingga
15 menit, lalu bilas pada air TBE dan lihat hasilnya dengan menggunakan lampu
UV pada panjang gelombang 254 nm kemudian hasil gambar difoto dengan
menggunakan kamera.
Fragment Analysis
Fragment analysis adalah istilah umum yang digunakan untuk
mendeskripsikan analisis eksperimen penanda genetik, yang bergantung pada
pendeteksian perubahan panjang sekuens DNA yang spesifik untuk menentukan
presensi atau absensi dari penanda genetik (Olga, 2013). Fragment analysis
adalah teknik genetik umum yang hasil sekuens dari suatu gen tidak dianalisis
secara langsung dari urutan basanya, melainkan keberadaan dari suatu alel atau
versi mutasi dari alel yang ada, dan ditujukan oleh keberadaan atau mutasi alel
pada sekuens DNA yang terhubung yang nantinya dijadikan penanda dari alelnya.
Hal ini menyebabkan penggunaan data fragment analysis tepat digunakan dalam
analisis mikrosatelit untuk melihat keragaman genetik dari spesies yang diteliti.
Cara mendapatkan data fragment analysis adalah dengan mengamplifikasi sampel
yang sudah diekstraksi dengan metode PCR. Proses fragment analysis dikirim ke
Berkeley Sequencing Facility yang terdapat di Amerika (Sanger et al., 1997).
Analisis Data
Karakteristik Mikrosatelit
Parameter dari karakteristik mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
ini yaitu jumlah alel per lokus, jumlah sampel yang dianalisis, nilai PIC
(Polymorphic information content) serta Hardy-Weinberg principle (HWP).
Jumlah alel tiap lokus dan frekuensi alel dikalkulasikan atau dihitung
menggunakan perangkat lunak Genemarker V 1.8 dan CERVUS 3.0 (Marshall et
al., 1998).
Keragaman Genetik
Dua parameter dari keragaman genetik yang digunakan dalam penelitian
ini yaitu nilai Heterozigositas observasi (Hobs) dan Heterozigositas yang
diperkirakan (Hexp). Heterozigositas observasi (Hobs) merupakan nilai
heterozigositas yang diperoleh dari sampel pengamatan, sedangkan
heterozigositas yang diperkirakan (Hexp) merupakan nilai heterozigositas yang
diharapkan berdasarkan Hardy-weinberg Principle. Menezes (2005) berpendapat
bahwa suatu penanda lokus dianggap sangat baik ketika nilai Hobs rata rata yang
didapat lebih tinggi dari 0.7, dan kurang baik apabila nilainya dibawah 0.5.
Jumlah heterozigositas yang diamati dan heterozigositas didapatkan (Nei, 1973)
dikalkulasikan atau dihitung menggunakan perangkat lunak CERVUS 3.0
(Marshall et al., 1998).
6
Status Konservasi dan Perdagangan
Status konservasi napoleon dilihat dari situs IUCN (International Union of
Conservation Nation) yaitu www.iucnredlist.org dan status perdagangan napoleon
dilihat dari situs CITES (Convention on the International Trade in Endangered
Species) cites.org/eng/app/appendices.php.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Mikrosatelit
Mikrosatelit atau biasa disebut simple sequence repeat merupakan kelas
dari polimorfik genetik yang biasa digunakan dalam pemetaan genetik
(phylogeography) dan analisis kekerabatan serta untuk merekam jejak pola
keturunan. Setelah dilakukan analisis mikrosatelit terhadap sampel napoleon
didapatkan hasil pada Tabel 2.
Tabel 2 Nilai karakteristik mikrosatelit Jumlah alel (Na), jumlah sampel (N),
polymorphic information content (PIC). Tanda asterisk (*) menunjukan
deviasi signifikan dari Hardy-Weinberg principle (HWP) dengan
menggunakan koreksi Bonferroni (P