Hidrolisis Pati Umbi Tacca Menggunakan Ekstrak Kasar α-Amilase dari Brevibacterium sp. untuk Menghasilkan Oligosakarida

HIDROLISIS PATI UMBI TACCA MENGGUNAKAN
EKSTRAK KASAR α-AMILASE DARI Brevibacterium sp.
UNTUK MENGHASILKAN OLIGOSAKARIDA

FEBY HERYANI PUTRI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Hidrolisis Pati Umbi
Tacca Menggunakan Ekstrak Kasar α-Amilase dari Brevibacterium sp. untuk
Menghasilkan Oligosakarida adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Feby Heryani Putri
NIM G84090025

ABSTRAK
FEBY HERYANI PUTRI. Hidrolisis Pati Umbi Tacca Menggunakan Ekstrak
Kasar α-Amilase dari Brevibacterium sp. untuk Menghasilkan Oligosakarida.
Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan NANIK RAHMANI.
Oligosakarida memiliki fungsi penting dalam berbagai bidang seperti
kesehatan, industri, pangan dan pakan, termasuk sebagai bahan pangan fungsional
(prebiotik). Oligosakarida dapat diproduksi dari umbi Tacca (Tacca
leontopetaloides) yang mengandung 66.65% pati. Umbi Tacca yang digunakan
berasal Hutan Jati, dan enzim yang digunakan adalah α-amilase dari
Brevibacterium sp. yang memiliki aktivitas enzim sebesar 1.78 U mL-1. Tujuan
penelitian ini yaitu menentukan kondisi optimum reaksi hidrolisis pati umbi Tacca
serta menentukan jenis oligosakaridanya menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Hasil penelitian
menunjukkan reaksi hidrolisis pati umbi Tacca menggunakan α-amilase dari

Brevibacterium sp. untuk menghasilkan oligosakarida memiliki kondisi optimum
pada konsentrasi substrat 3%, perbandingan enzim dan substrat 1:5 serta waktu
hidrolisis selama 6-8 jam. Analisis profil oligosakarida dengan KLT dan KCKT
menunjukkan
bahwa
hidrolisat
mengandung
oligosakarida
jenis
maltooligosakarida berupa maltosa, maltotriosa dan maltotetraosa.
Kata kunci: umbi Tacca, Brevibacterium sp., maltooligosakarida, Kromatografi
Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

ABSTRACT
FEBY HERYANI PUTRI. Tacca Tuber Starch Hydrolysis Using Crude Extract αAmylase from Brevibacterium sp. to Produce Oligosaccharides. Supervised by
MEGA SAFITHRI and NANIK RAHMANI.
Oligosaccharides have an important function in various sectors such as
healthcare, industrial, food and feed, including as functional food ingredients
(prebiotics). Oligosaccharides were produced from Tacca tubers (Tacca
leontopetaloides) which containing 66.65 % of starch. Tacca tubers were used

from Hutan Jati, and enzymes were used α-amylase from Brevibacterium sp.
which has enzyme activity of 1.78 U mL-1 . The purposes of this research are to
determine the optimum conditions Tacca tuber starch hydrolysis reaction and
determine the type of oligosaccharides using Thin Layer Chromatography (TLC)
and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Optimal production was
achieved at 3 % substrate concentration, enzyme and substrate ratio of 1:5 and
hydrolysis time of 6-8 hours. Oligosaccharides profile analysis both using TLC
and HPLC showed that the enzimatically hydrolyzed samples contained maltose,
maltotriose and maltotetraose.
Keywords: Tacca tubers, Brevibacterium sp., maltooligossacharides, Thin Layer
Chromatography (TLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HIDROLISIS PATI UMBI TACCA MENGGUNAKAN
EKSTRAK KASAR α-AMILASE DARI Brevibacterium sp.
UNTUK MENGHASILKAN OLIGOSAKARIDA

FEBY HERYANI PUTRI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Judul Skripsi : Hidrolisis Pati Umbi Tacca Menggunakan Ekstrak Kasar α-Amilase
dari Brevibacterium sp. untuk Menghasilkan Oligosakarida
Nama
: Feby Heryani Putri
NIM
: G84090025

Disetujui oleh

Dr Mega Safithri, SSi MSi

Pembimbing I

Nanik Rahmani, MSi
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia-Nya sehingga penyusunan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 hingga bulan Januari
2014 ini berjudul Hidrolisis Pati Umbi Tacca Menggunakan Ekstrak Kasar αAmilase dari Brevibacterium sp. untuk Menghasilkan Oligosakarida. Penelitian
ini didanai oleh DIPA PN Pusat Penelitian Biologi LIPI Tahun 2011-2013.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Mega Safithri dan Ibu Nanik
Rahmani, MSi selaku pembimbing yang telah memberi arahan dan bimbingan. Di

samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Dr Yopi, Mbak Rohanah,
Mbak Lia dan Mas Dicky dari Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF)
Bidang Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, keluarga, serta seluruh teman
dan sahabat dari Biokimia 46 dan Pondok Asad atas doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan
khususnya bidang biokimia.

Bogor, Februari 2014
Feby Heryani Putri

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

METODE PENELITIAN

2

Bahan

2

Alat

2

Lokasi dan Waktu Penelitian

3

Prosedur Percobaan

3

HASIL

5

Amilase Ekstrak Kasar

5

Kondisi Optimum Hidrolisis Enzimatis Pati Umbi Tacca

6

Hidrolisis Pati Umbi Tacca Skala Besar

11

Analisis Oligosakarida Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

13

PEMBAHASAN

15

Amilase Ekstrak Kasar

15

Kondisi Optimum Hidrolisis Enzimatis Pati Umbi Tacca

16

Hidrolisis Pati Umbi Tacca Skala Besar

18

Analisis Oligosakarida dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

18

SIMPULAN DAN SARAN

20

Simpulan

20

Saran

20

DAFTAR PUSTAKA

20

LAMPIRAN

23

RIWAYAT HIDUP

31

DAFTAR TABEL
1
2
3
4

Derajat polimerisasi hasil hidrolisis pati Umbi Tacca pada berbagai
konsentrasi substrat
Derajat polimerisasi hasil hidrolisis pati umbi Tacca pada berbagai
perbandingan enzim dan substrat
Rf spot standar dan oligosakarida hasil analisis KLT
Waktu retensi standar KCKT dan oligosakarida (segar dan freeze dry)

8
10
12
14

DAFTAR GAMBAR
1
2
3

4

5

6

7
8
9
10
11

Hasil peremajaan isolat Brevibacterium sp. pada media padat
Media kultur bakteri sebelum ditanami bakteri (a) dan setelah
ditanami bakteri (kultur hari ke-4) (b)
Konsentrasi gula pereduksi (µg mL-1) hasil hidrolisis pati umbi
Tacca pada konsentrasi substrat
1.5%,
3%,
4.5%,
6%,
7.5%
Konsentrasi gula total (µg mL-1) hasil hidrolisis pati umbi Tacca
pada konsentrasi substrat
1.5%,
3%,
4.5%,
6%,
7.5%
Konsentrasi gula total (µg mL-1) hasil hidrolisis pati umbi Tacca pada
berbagai perbandingan enzim dan substrat
1:10,
1;5,
1:2,
1:1
Konsentrasi gula pereduksi (µg mL-1) hasil hidrolisis pati umbi Tacca
pada berbagai perbandingan enzim dan substrat
1:10,
1;5,
1:2,
1:1
Kromatogram KLT pada berbagai perbandingan enzim dan substrat
1:10 (a), 1:5 (b), 1:2 (c) dan 1:1 (d)
Oligosakarida Tacca segar (a) dan freeze dry (b) hasil hidrolisis skala
besar
Kromatogram KLT oligosakarida segar (a), freeze dry 1% (b), 2% (c),
dan 3% (d) hasil hidrolisis pati umbi Tacca skala besar
Kromatogram KCKT standar glukosa dan maltosa (a), maltotriosa (b)
serta maltopentosa (c)
Kromatogram KCKT hasil hidrolisis pati umbi Tacca skala besar
oligosakarida segar (a), dan freeze dry (b)

6
6

7

7

9

9
10
11
12
13
14

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Kurva standar glukosa untuk penentuan aktivitas amilase
Perhitungan aktivitas enzim amilase ekstrak kasar
Kurva standar untuk perhitungan gula pereduksi dan gula total
Perhitungan konsentrasi gula pereduksi dan gula total hasil hidrolisis
pati umbi Tacca pada berbagai konsentrasi substrat
Perhitungan konsentrasi gula pereduksi dan gula total hasil hidrolisis
pati umbi Tacca pada berbagai perbandingan enzim dan substrat
Konsentrasi gula pereduksi, gula total dan derajat polimerisasi hasil
hidrolisis pati umbi Tacca skala besar

23
24
25
26
28
30

PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara agraris yang kaya akan hasil alam termasuk
tanaman pangan. Tanaman pangan ini dimanfaatkan untuk kebutuhan konsumsi
makhluk hidup. Pengembangan pertanian saat ini tidak hanya berorientasi pada
peningkatan produksi, tetapi juga pada produktivitas dan nilai tambah bahan
pangan tersebut. Umbi Tacca (Tacca leontopetaloides) adalah salah satu tanaman
pangan sumber karbohidrat alternatif yang banyak ditemui tumbuh liar di seluruh
wilayah pesisir Indonesia, misalnya di daerah pesisir Garut Selatan dengan nama
lokal jalawure, dan di daerah Kabupaten Kepulauan Talaud khususnya Kecamatan
Nanusa, Sulawesi Utara dengan nama lokal anuwun. Umbi Tacca ini tidak dapat
langsung dikonsumsi karena pada umbi tersebut terdapat senyawa rasa pahit
Taccaline. Selain itu, pengembangan umbi Tacca ini juga masih sangat terbatas.
Masyarakat disekitarnya hanya mengonsumsi umbi Tacca sebagai bahan pangan
alternatif pengganti beras, dan tepung Tacca digunakan untuk membuat berbagai
jenis kue, baik kue kering maupun kue basah (Aatjin 2012).
Umbi Tacca mengandung 66.65% pati yang terdiri dari 22.7% amilosa dan
43.88% amilopektin (Aatjin 2012). Pati yang dikandung oleh umbi Tacca ini
berpotensi untuk menghasilkan oligosakarida melalui proses hidrolisis enzimatis.
Dengan mengubah terlebih dahulu pati menjadi oligosakarida, nilai jual umbi
Tacca akan semakin tinggi.
Oligosakarida memiliki fungsi penting dalam berbagai bidang seperti
kesehatan, industri, pangan dan pakan. Di bidang kesehatan oligosakarida
memiliki pengaruh yang menguntungkan terhadap proliferasi sel dari dinding
mukosa usus, menunjukkan sifat anti radang dan aktivitas antitumor, serta
meningkatkan aktivitas motorik usus (Haryati et al. 2010). Selain itu
oligosakarida juga berfungsi dalam penurunan kolesterol serta pencegah karies
(Nakakuki 2002). Di bidang industri oligosakarida dimanfaatkan pada pembuatan
berbagai produk sehari-hari seperti kue, roti, yoghurt, permen, sirup dan minuman
ringan lainnya (Nakakuki 2002). Di bidang pangan oligosakarida berperan sebagai
bahan pangan fungsional (prebiotik) dan pengawet makanan (Barreteau et al.
2006). Selain untuk manusia, oligosakarida juga dapat digunakan sebagai
prebiotik untuk ternak (Haryati et al. 2010) dan zat pemacu pertumbuhan
alternatif yang aman sebagai pengganti antibiotik pada unggas (Nurmeiliasari
2008).
Produksi oligosakarida dapat dilakukan dengan cara menghidrolisis pati.
Pati dapat dihidrolisis dengan asam (non enzimatis) atau dengan enzim
(enzimatis). Hidrolisis dengan asam memiliki beberapa kelemahan, yaitu metode
ini harus dilakukan pada medium yang sangat asam (pH 1-2), suhu yang tinggi
(150-230°C), dan tekanan yang tinggi. Sebagai akibat dari proses termal,
hidrolisis secara asam menghasilkan proses samping yang mengontaminasi
hidrolisat produksi akhir, sedangkan hidrolisis enzimatis dilakukan pada kondisi
temperatur yang lebih rendah (dibawah 100°C), tekanan normal, pH sedang (6-8),
dan memiliki kecepatan reaksi yang tinggi (Kolusheva dan Marinova 2006).
Kebanyakan hidrolisis enzimatis menggunakan amilase dari berbagai sumber
yang berbeda, salah satunya yaitu dari mikroorganisme seperti Brevibacterium sp.

2
yang merupakan bakteri laut gram positif, bersifat aerobik serta dapat
menghasilkan amilase pada kondisi suhu ruang dan pH 8 (Rahmani et al. 2011a).
Proses hidrolisis enzimatis dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu enzim,
konsentrasi substrat, suhu, pH, waktu hidrolisis, perbandingan enzim dan substrat
serta pengadukan (Purba 2009). Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan
optimasi hidrolisis enzimatis pati umbi Tacca menggunakan amilase dari
Brevibacterium sp. untuk menghasilkan oligosakarida dengan menggunakan
beberapa parameter, yaitu konsentrasi substrat, perbandingan konsentrasi enzim
dan konsentrasi substrat, serta waktu hidrolisis. Hasil hidrolisis tersebut
selanjutnya dianalisis gula total, gula pereduksi, Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Tujuan penelitian ini yaitu menentukan kondisi optimum reaksi hidrolisis
pati umbi Tacca untuk menghasilkan oligosakarida serta menganalisis profil
oligosakarida hasil hidrolisis pada kondisi optimum tersebut. Adapun hipotesis
dari penelitian ini adalah oligosakarida dapat dihasilkan melalui proses hidrolisis
pati umbi Tacca menggunakan enzim α-amilase dari Brevibacterium sp. pada
kondisi optimum konsentrasi substrat ≤7.5%, perbandingan enzim dan substrat
≤1:10 dan waktu hidrolisis ≤8 jam, serta oligosakarida yang dihasilkan merupakan
jenis maltooligosakarida. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
pengetahuan dan nilai guna mengenai manfaat pati umbi Tacca dan produk
turunannya berupa oligosakarida yang bernilai jual tinggi dan berfungsi sebagai
komponen pangan sehat seperti prebiotik.

METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan utama yang digunakan sebagai substrat yaitu pati hasil ekstraksi
umbi Tacca asal Hutan Jati berumur 9 bulan yang dikulturkan di Laboratorium
Biak Sel dan Jaringan Tanaman, Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Pusat
Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) CibinongBogor. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media peremajaan,
pertumbuhan, dan produksi amilase ekstrak kasar yaitu artificial sea water (ASW),
yeast extract, pepton, pati komersial, akuades, agar. Isolat Brevibacterium sp.
merupakan koleksi bakteri laut di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat
penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong Bogor. Bahan-bahan lain yang digunakan
untuk analisis kimia yaitu aquades, buffer fosfat pH 6.6 (0.02 M), pereaksi DNS
(dinitrosalicylic acid), fenol 5% (b/v), H2SO4 pekat, n-butanol, asam asetat, αdifenilamin, aseton, asam fosfat, anilin dan asetonitril.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan media peremajaan dan
pertumbuhan bakteri yaitu Erlenmeyer, cawan petri steril, magnetic stirrer, jarum
ose steril, bunsen, laminar dan plastik wrap. Alat-alat yang digunakan untuk
produksi enzim α-amilase yaitu Erlenmeyer, sumbat kapas, hot plate dan
inkubator goyang (Stuart orbital incubator S1500, Staffordshire United Kingdom).

3
Selain itu alat-alat yang digunakan untuk analisis kimia yaitu tabung reaksi, rak
tabung, microtube eppendorf, pipet mikro, sentrifus, stopwatch, waterbath, kuvet,
spektrofotometer UV-VIS (Hitachi, U-3900H, Tokyo Japan), autoklaf,
Kromatografi Lpis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
menggunakan Agilent Technology 1290 Infinity, United States.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi (LBF)
Bidang Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong mulai dari
Februari 2013 sampai Januari 2014.
Prosedur Percobaan
Produksi Enzim Amilase Ekstrak Kasar dari Brevibacterium sp.
Pembuatan Media Peremajaan dan Kultur Penumbuhan Bakteri
(Rahmani et al. 2011a). Pembuatan media diawali dengan menyiapkan bahan
penyusun media peremajaan dan kultur bakteri terlebih dahulu yang terdiri dari
2% pati komersial, 1.5% agar, 1 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 pepton dan 38 g L-1
artificial sea water (ASW), yaitu campuran garam mineral terlarut, terdiri dari
garam-garam anorganik dan ion anorganik seperti natrium klorida, kalium klorida,
natrium bromide dan magnesium klorida, yang mensimulasikan air laut serta
memungkinkan persiapan media yang tepat untuk organisme laut. Media tersebut
disterilisasi pada 121 °C selama 15 menit. Peremajaan bakteri dilakukan pada
cawan petri steril, sedangkan kultur pertumbuhan bakteri dilakukan pada media
cair. Bahan yang digunakan pada media peremajaan dan kultur pertumbuhan
bakteri hampir sama, hanya saja agar tidak ditambahkan pada media kultur
pertumbuhan.
Peremajaan dan Proses Kultur Bakteri (Rahmani et al. 2011a).
Peremajaan bakteri Brevibacterium sp. dilakukan dengan menggoreskan isolat
bakteri menggunakan jarum ose steril pada media padat yang telah disiapkan.
Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja disinari sinar UV terlebih
dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan
sehingga dapat menurunkan risiko kontaminasi sebelum penanaman. Media yang
telah ditanami isolat diinkubasi pada suhu 30 °C selama 3 hari.
Setelah itu dilakukan prekultur dan kultur isolat bakteri pada media cair.
Prekultur dilakukan dengan memindahkan sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri
ke dalam 20 mL media cair. Tujuan prekultur yaitu sebagai tahap adaptasi bakteri
terhadap media pertumbuhan sebelum dilakukan kultur pada volume yang lebih
besar yaitu 180 mL media cair. Prekultur diinkubasi pada inkubator goyang 150
rpm, 30°C selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan proses kultur pada kondisi yang
sama seperti pada prekultur selama 4 hari.
Preparasi Enzim Amilase Ekstrak Kasar (Rahmani et al. 2011a).
Amilase ekstrak kasar didapatkan dari ekstraksi kultur sel dengan cara sentrifugasi
pada kecepatan 6764 xg selama 15 menit pada suhu 4 °C untuk menjaga aktivitas
enzim. Supernatan yang diperoleh merupakan amilase ekstrak kasar yang siap
digunakan untuk proses hidrolisis.

4
Analisis Aktivitas Amilase Ekstrak Kasar (Modifikasi Bernfeld 1995).
Reaksi dilakukan dengan menginkubasi sebanyak 0.5 mL enzim ditambah 0.5 mL
larutan pati 0.5% (b/v) dalam buffer fosfat pH 6.6 (0.02 M) pada suhu 30 °C
selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan diinkubasi pada 100 °C selama 20
menit, dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Warna yang terbentuk diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Satu unit aktivitas
enzim didefinisikan sebagai produksi 1 µmol maltooligosakarida per menit pada
kondisi diatas.
Penentuan Kondisi Hidrolisis Enzimatis Pati Umbi Tacca (Rohanah 2012)
Tahap penentuan kondisi optimum produksi oligosakarida dilakukan dengan
menggunakan enzim amilase ekstrak kasar. Terdapat tiga variabel yang harus
ditentukan. Penentuan kondisi tersebut dilakukan secara bertahap, yaitu sebagai
berikut.
1. Penentuan konsentrasi substrat (b/v) 1.5%, 3%, 4.5%, 6%, dan 7.5%.
2. Penentuan perbandingan enzim dan substrat (v/v) 1:1, 1:2, 1:5 dan 1:10.
3. Penentuan waktu reaksi pada jam ke-1, 2, 4, 6 dan 8.
Dalam penelitian ini konsentrasi substrat ditentukan terlebih dahulu. Setelah
dipilih konsentrasi substrat optimum, dilanjutkan dengan penentuan perbandingan
enzim dan substrat, serta waktu reaksi.
Adapun proses reaksi hidrolisis enzimatis dilakukan dengan cara membuat
larutan substrat terlebih dahulu menggunakan pelarut akuades, lalu dipanaskan
pada suhu 80 °C selama 10 menit dan didiamkan hingga suhunya mencapai 30 °C.
Selanjutnya dilakukan penambahan amilase ekstrak kasar dan disimpan pada
inkubator goyang 150 rpm pada suhu tertentu. Pengambilan sampel dilakukan
pada jam ke-1, 2, 4, 6, dan 8. Sampel dipanaskan pada suhu 100 °C selama 15
menit, dan didiamkan hingga suhunya 27 °C, lalu disentrifugasi pada kecepatan
6764 xg selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis gula
pereduksi, gula total, KLT dan KCKT.
Analisis Kimia
Analisis Gula Pereduksi (Modifikasi Miller 1959). Jumlah gula pereduksi
yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS yang telah dimodifikasi.
Sebanyak 0.5 mL larutan standar glukosa dengan konsentrasi 0, 100, 150, 200,
250 dan 300 µg mL-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 0.75 mL
pereaksi DNS (dinitrosalicylic acid), begitupun sampel hasil hidrolisis. Larutan
standar sampel direaksikan pada suhu 100°C selama 20 menit kemudian
didiamkan hingga suhunya mendekati suhu ruang. Setelah itu dilakukan
pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
Analisis Gula Total (Modifikasi Dubois et al. 1956). Analisis gula total
ditentukan dengan menggunakan metode fenol-asam sulfat yang telah
dimodifikasi. Larutan glukosa standar masing-masing sebanyak 0.5 mL dengan
konsentrasi 0, 40, 60, 80 dan 100 µg mL-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
begitu juga sampel hasil hidrolisis. Sebanyak 0.5 mL larutan fenol 5% (b/v) dan
2.5 mL asam sulfat pekat ditambahkan ke dalam larutan standar dan sampel
kemudian diinkubasi pada suhu 40 °C selama 20 menit. Setelah itu absorbansi
diukur pada panjang gelombang 490 nm.

5
Derajat Polimerisasi (Apriyantono et al. 1989). Derajat polimerisasi (DP)
dihitung berdasarkan perbandingan antara gula total dan gula pereduksi dengan
rumus sebagai berikut:

Analisis Kromatografi Lapis Tipis (Rahmani et al. 2013). Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) digunakan secara kuantitatif untuk melihat jenis oligosakarida
yang terbentuk. Analisis ini dilakukan pada plat silika gel 60 F254 (Merck art 2020 cm) sebagai fase diam. Plat tersebut dibuat dengan ukuran 10 cm x 10 cm,
garis start 1 cm dari batas bawah dan garis finish 0.5 cm dari batas atas. Sampel
diteteskan menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 cm antara sampel. Plat
dimasukkan ke dalam bejana pengembang berisi eluen yang telah dijenuhkan
selama 1 jam. Eluen tersebut terdiri dari n-butanol:asam asetat:akuades dengan
perbandingan 2:1:1 (mL). Elusi dilakukan hingga garis finish. Plat diangkat
hingga eluen menguap semua pada suhu kamar lalu disemprotkan dengan
pewarna gula (0.5 gram α-difenilamin, 25 mL aseton, 2.5 mL asam fosfat, 0.5 mL
anilin pada Erlenmeyer 300 mL). Plat dikeringkan didalam oven 100 °C selama
15 menit hingga terbentuk spot. Setelah dingin diukur nilai Rf dari masing-masing
komponen. Nilai Rf adalah perbandingan tinggi spot pada plat silika gel dengan
tinggi larutan pengembang. Rumusnya yaitu:

Analisis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Kandra et al. 2002; Lee et
al. 2003; Eliasson dan Gudmundsson 2006). Oligosakarida hasil hidrolisis
enzimatis dianalisis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Detektor yang digunakan yaitu refractive index detector (RID) dan kolom Zorbax
SIL (silika) dengan dilapisi 3-aminopropilsilen. Fase gerak yang digunakan adalah
asetonitril dan akuades dengan perbandingan 75:25 (v/v). Kecepatan alir yang
digunakan adalah 1 mL/menit pada suhu 30 °C.

HASIL
Amilase Ekstrak Kasar
Penelitian diawali dengan peremajaan Brevibacterium sp. pada media padat
selama 3 hari pada suhu 30 °C. Hasil isolat yang telah diremajakan memiliki
kenampakan yaitu koloni berwarna putih kekuningan dan permukaan yang licin
(Gambar 1). Bakteri ini kemudian digunakan untuk produksi amilase ekstrak kasar
sebanyak 1 L. Media cair dibuat terlebih dahulu untuk prekultur dan kultur.
Perbandingan volume media dan volume Erlenmeyer yaitu 1:5 untuk kebutuhan
aerasi saat pertumbuhan bakteri berlangsung. Prekultur dilakukan dengan tujuan
agar bakteri bisa beradapatasi pada media cair sebelum ditumbuhkan pada
lingkungan yang baru, sebagai stimulasi atau rangsangan isolat untuk
mengeluarkan enzim. Media kultur bakteri berubah dari kuning jernih menjadi
kuning keruh setelah ditanami bakteri (Gambar 2). Aktivitas enzim yang terukur
yaitu sebesar 1.78 U mL-1.

6

Gambar 1 Hasil peremajaan isolat Brevibacterium sp. pada media padat

(a)
Gambar 2

(b)

Media kultur bakteri sebelum ditanami bakteri (a) dan setelah
ditanami bakteri (kultur hari ke-4) (b)

Kondisi Optimum Hidrolisis Enzimatis Pati Umbi Tacca
Konsentrasi Substrat Optimum
Hasil pengukuran konsentrasi gula pereduksi pada berbagai konsentrasi
substrat memperlihatkan bahwa semakin lama waktu inkubasi konsentrasi gula
pereduksi relatif semakin bertambah, karena semakin banyak pula substrat yang
terhidrolisis oleh enzim membentuk gula pereduksi (Gambar 3). Akan tetapi
pertambahan konsentrasi substrat tidak berbanding lurus dengan pertambahan
konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Konsentrasi substrat 4.5%
menghasilkan gula pereduksi lebih besar dibandingkan konsentrasi substrat 7.5%.
Gula pereduksi tertinggi yang dihasilkan yaitu pada jam ke-8 dengan konsentrasi
substrat 4.5% sebesar 2470.81 µg mL-1, sedangkan konsentrasi gula pereduksi
terkecil yaitu pada jam ke-1 dengan konsentrasi substrat 3% sebesar 1760.46 µg
mL-1.
Gula total menggambarkan total konsentrasi gula baik gula monosakarida,
disakarida, dan oligosakarida. Gula total pada pati dianalisis dengan metode fenol
sulfat. Asam sulfat yang bereaksi dengan fenol dan larutan pati menghasilkan
perubahan warna larutan menjadi cokelat muda yang diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 490 nm. Gula total menggambarkan banyaknya gula yang
terdapat pada pati dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Semakin pekat warna
larutan maka gula total yang dihasilkan semakin banyak. Berdasarkan Gambar 4
dapat dilihat bahwa dengan konsentrasi substrat 7.5% gula total yang dihasilkan

7
3000
[Gula pereduksi] (µg mL-1)

2500
2000
1500
1000
500
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

Waktu hidrolisis (jam)

Gambar 3 Konsentrasi gula pereduksi (µg mL-1) hasil hidrolisis
pati umbi Tacca pada konsentrasi substrat
1.5%,
3%,
4.5%,
6%,
7.5%

[Gula total] (µg mL-1)

70000
60000
50000
40000
30000
20000

10000
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

Waktu hidrolisis (jam)

Gambar 4 Konsentrasi gula total (µg mL-1) hasil hidrolisis pati
umbi Tacca pada konsentrasi substrat
1.5%,
3%,
4.5%,
6%,
7.5%
tergolong besar jika dibandingkan dengan konsentrasi substrat lainnya, terutama
pada jam ke-2 yaitu sebesar 60304.69 µg mL-1. Pada kondisi ini derajat
polimerisasi (DP) yang dihasilkan masih tinggi yaitu 11 hingga 77 (Tabel 1).
Meskipun pada analisis gula pereduksi konsentrasi substrat 4.5%
menghasilkan hidrolisat yang cukup baik, namun setelah dicoba menggunakan
KLT sampel terlihat belum terpisah dan gula belum terdegradasi. Kemungkinan
diperlukan enzim yang unit aktivitasnya lebih tinggi, sehingga degradasinya lebih
optimal. Amilase yang dihasilkan dari Brevibacterium sp. ini memiliki aktivitas
yang cukup kecil sehingga kurang cocok untuk memotong-motong substrat
dengan konsentrasi 4.5%. Oleh karena itu konsentrasi yang lebih rendah yaitu 3%
dipilih sebagai konsentrasi substrat optimum dalam penentuan perbandingan
enzim dan substrat.

8
Tabel 1 Derajat polimerisasi hasil hidrolisis pati Umbi Tacca pada berbagai
konsentrasi substrat
[Substrat]
1.5%

3.0%

4.5%

6.0%

7.5%

Waktu hidrolisis
(jam)
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8

[Gula total]
(µg mL-1)
12013.02
13580.73
14346.35
14145.83
30424.48
10445.31
15877.60
23570.31
24117.19
23898.44
26869.79
26085.94
31536.46
33723.96
33177.08
22986.98
44333.33
49473.96
36330.73
40122.40
16406.25
60304.69
51585.94
58007.81
55546.88

[Gula pereduksi]
(µg mL-1)
785.75
859.31
1059.31
1334.02
1569.66
760.46
799.54
1096.09
1359.31
1645.52
921.38
930.57
1422.53
1892.64
2470.80
797.24
1051.26
1200.69
1636.32
2066.21
857.01
776.55
890.34
1100.69
1580.00

DP
15
16
14
11
19
14
20
22
18
15
29
28
22
18
13
29
42
41
22
19
19
78
58
53
35

Perbandingan Enzim dan Substrat Optimum
Hasil percobaan menunjukkan bahwa pada semua perbandingan enzim dan
substrat konsentrasi gula pereduksi mengalami pertambahan seiring dengan
bertambahnya waktu hidrolisis, namun tidak begitu signifikan. Pada jam ke-6
konsentrasi gula pereduksi dengan perbandingan enzim dan substrat 1:5
mengalami penurunan dan kembali bertambah pada jam ke-8 (Gambar 5).
Gambar 6 memperlihatkan bahwa konsentrasi gula total pada perbandingan
enzim dan substrat 1:2 dan 1:1 cukup konstan, tidak mengalami penambahan atau
pengurangan yang signifikan. Untuk perbandingan enzim dan substrat 1:10 nilai
konsentrasi gula total pada jam ke-1 yaitu 10445.32 µg mL-1 lalu naik pada jam
ke-2 dan konstan hingga jam ke-8. Sebaliknya, untuk perbandingan enzim dan
substrat 1:5, nilai konsentrasi gula total konstan pada mulanya hingga jam ke-6
dan bertambah secara signifikan pada jam ke-8 yaitu dari 24846.35 menjadi
45463.54 µg mL-1. Derajat polimerisasi hasil hidrolisis pati umbi Tacca pada
berbagai perbandingan enzim dan substrat menunjukkan jumlah rantai

[Gula pereduksi] (µg mL-1)

9
50000
45000
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

Waktu hidrolisis (jam)

Gambar 6

Konsentrasi gula total (µg mL-1) hasil hidrolisis pati
umbi Tacca pada berbagai perbandingan enzim dan
substrat
1:10,
1;5,
1:2,
1:1

[Gula total] (µg mL-1)

6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

Waktu hidrolisis (jam)

Gambar 5

Konsentrasi gula pereduksi (µg mL-1) hasil hidrolisis
pati umbi Tacca pada berbagai perbandingan enzim
dan substrat
1:10,
1;5,
1:2,
1:1

monosakarida yang terbentuk lebih pendek dibanding derajat polimerisasi hasil
hidrolisis optimasi konsentrasi substrat yaitu 4-10 (Tabel 2).
Analisis kromatografi dilakukan untuk mengetahui jenis gula hasil hidrolisis
enzimatis pati Tacca dari berbagai waktu sampling. Kromatogram KLT
memperlihatkan pemisahan yang cukup baik pada beberapa perbandingan enzim
dan substrat (Gambar 7). Glukosa digunakan sebagai standar monosakarida,
sedangkan standar oligosakarida yang digunakan adalah maltosa, maltotriosa dan
maltopentosa. Sampel hasil hidrolisis secara keseluruhan menunjukkan bahwa
telah terjadi pemecahan pati oleh enzim. Hal ini terlihat dengan terbentuknya spot.
Setelah dibandingkan dengan standar dan dihitung faktor retensinya (retention
factor, Rf) hasil KLT menunjukkan bahwa oligosakarida yang terbentuk terdiri
dari maltosa dan maltotriosa, serta sebuah spot yang diperkirakan merupakan
maltotetraosa, karena memiliki nilai Rf diantara maltotriosa dan maltopentosa.

10
Tabel 2

Derajat polimerisasi hasil hidrolisis pati umbi Tacca pada berbagai
perbandingan enzim dan substrat

Enzim:substrat
1:5

1:2

1:1

1:10

Waktu hidrolisis
(jam)
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8
1
2
4
6
8

[Gula total]
(µg mL-1)
25611.98
25903.65
24664.06
24846.35
45463.54
22731.77
21838.54
24098.96
22750.00
23424.48
21437.50
21255.21
19760.42
21419.27
21802.08
10445.31
15877.60
23570.31
24117.19
23898.44

[Gula pereduksi]
(µg mL-1)
1679.66
2069.31
2351.21
1574.48
2231.72
2594.31
2888.28
3199.48
3359.31
3931.72
4224.83
4290.34
4702.41
5152.41
5400.69
760.46
799.54
1096.09
1359.31
1645.52

DP
15
13
10
16
20
9
8
8
7
6
5
5
4
4
4
14
20
22
18
15

Gambar 7 Kromatogram KLT pada berbagai perbandingan enzim
dan substrat 1:10 (a), 1:5 (b), 1:2 (c) dan 1:1 (d)

11
Perbandingan enzim dan substrat 1:2 dan 1:1 menghasilkan pemisahan
kurang baik. Sedangkan pada perbandingan konsentrasi enzim dan substrat 1:5
dan 1:10 menujukkan plot terlihat terpisah. Jika dibandingkan diantara keduanya
perbandingan 1:5 mencirikan intensitas kromatogram yang lebih kuat daripada
1:10 pada jam ke-6 hingga jam ke-8. Oleh karena itu 1:5 dipilih sebagai
perbandingan enzim dan substrat optimum dan waktu hidrolisis optimumnya
terjadi pada jam ke-6 hingga jam ke-8.
Hidrolisis Pati Umbi Tacca Skala Besar
Volume total hidrolisis pati umbi Tacca skala besar yang dilakukan yaitu
3.6 L, dengan volume substrat 3 L dan enzim 0.6 mL. Volume total hasil
hidrolisis adalah sekitar 3 L. Sebanyak 1 L dari hasil sentrifugasi tersebut
disimpan dalam lemari pendingin sebagai oligosakarida segar hasil optimasi
hidrolisis skala besar, sedangkan sebanyak 2 L sampel segar tersebut
dikeringbekukan (freeze dry) pada tekanan 10 µHg dengan suhu -50 °C. Bobot
setelah dikeringbekukan berupa padatan berbentuk bubuk berwarna putih
kecokelat-cokelatan adalah sebesar 34.4903 gram (Gambar 8).

(a)

(b)
Gambar 8 Oligosakarida Tacca segar (a) dan freeze dry (b) hasil hidrolisis skala
besar

12
Hasil analisis konsentrasi gula pereduksi untuk oligosakarida segar adalah
6580.46 µg mL-1 dan freeze dry 3317.82 µg mL-1. Besarnya konsentrasi gula total
oligosakarida segar sebesar 17793.81 µg mL-1 dan freeze dry sebesar 4240.21 µg
mL-1, sehingga derajat polimerisasinya masing-masing yaitu 2.7 untuk
oligosakarida segar dan 1.3 untuk oligosakarida freeze dry.
Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan standar oligosakarida yang
terdiri dari maltosa, maltotetraosa dan maltopentosa yang memiliki nilai Rf
berturut-turut 0.486, 0.405, 0.270, 0.203. Hasil kromatografi menunjukkan bahwa
sampel segar dan freeze dry menghasilkan nilai Rf yang tidak jauh berbeda serta
mengandung oligosakarida yang sama dengan hasil hidrolisis pada saat optimasi,
yaitu maltosa, maltotetraosa dan diperkirakan maltotriosa karena memiliki nilai Rf
diantara maltosa dan maltotetraosa (Gambar 9 dan Tabel 3). Dari hasil KLT dapat
dilihat bahwa yang menghasilkan pemisahan paling baik adalah sampel freeze dry
dengan konsentrasi 1%, sehingga yang digunakan untuk analisis profil
oligosakarida menggunakan KCKT adalah sampel segar dan freeze dry 1%.

Gambar 9

Kromatogram KLT oligosakarida segar (a), freeze dry 1% (b), 2%
(c), dan 3% (d) hasil hidrolisis pati umbi Tacca skala besar

Tabel 3 Rf spot standar dan oligosakarida hasil analisis KLT
Retention factor (Rf)
Glukosa Maltosa
X
Maltotetraosa
Standar
0.486
0.405
0.270
Segar
0.392
0.324
0.243
Freeze dry 1%
0.419
0.351
0.270
Freeze dry 2%
0.405
0.324
0.257
Freeze dry 3%
0.392
0.324
0.270
Keterangan: X= Spot yang tidak diketahui standar
Spot

Maltopentosa
0.203
-

13
Analisis Oligosakarida Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Analisis KCKT dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan informasi
mengenai jenis oligosakarida yang terdapat dalam sampel. Standar yang
digunakan adalah glukosa+maltosa 5%, maltotriosa 10.000 µg mL-1 dan
maltotetraosa 100.000 µg mL-1. Standar tersebut diinjek terlebih dahulu dan
menghasilkan waktu retensi (retention time, Rt) yang berbeda-beda (Gambar 10).
Glukosa

Maltosa

(a)

Maltotriosa

(b)
Maltotetraosa

(c)
Gambar 10 Kromatogram KCKT standar glukosa dan maltosa
(a), maltotriosa (b) serta maltopentosa (c)

14
Analisis oligosakarida hasil hidrolisis pati umbi Tacca baik segar maupun
freeze dry menghasilkan empat puncak (Gambar 11). Masing-masing puncak
memiliki waktu retensi yang tidak jauh berbeda dengan waktu retensi standar.
Waktu retensi yang mendekati antara komponen sampel dengan standar
menunjukkan komponen yang dikandung sampel sama dengan standar. Setelah
dibandingkan dengan standar, puncak pertama dicirikan sebagai monosakarida,
yaitu glukosa dan puncak lainnya dicirikan sebagai oligosakarida yaitu maltosa,
maltotriosa dan maltotetraosa (Tabel 4).

(a)

(b)
Gambar 11 Kromatogram KCKT hasil hidrolisis pati umbi
Tacca skala besar oligosakarida segar (a), dan
freeze dry (b)
Tabel 4 Waktu retensi standar KCKT dan oligosakarida (segar dan freeze dry)
Jenis sakarida
Glukosa
Maltosa
Maltotriosa
Maltotetraosa

Standar
7.838
11.336
17.050
28.823

Waktu retensi
Sampel segar
Sanpel freeze dry 1%
7.883
11.295
16.975
26.077

7.838
11.247
16.850
28.823

15

PEMBAHASAN
Amilase Ekstrak Kasar
Setiap bakteri yang akan digunakan harus diremajakan terlebih dahulu
dengan tujuan mendapatkan bakteri yang aktif. Hal ini dikarenakan sebelumnya
bakteri tersebut disimpan pada keadaan inaktif dalam media di lemari pendingin
bersuhu -80 °C. Brevibacterium sp. merupakan bakteri laut, oleh karena itu isolat
Brevibacterium sp. diremajakan pada media padat yang mengandung artificial sea
water (ASW). Dengan media ASW ini, isolat Brevibacterium sp. dapat tumbuh
pada media yang sesuai.
Berdasarkan Gambar 1 terlihat bahwa hasil isolat yang telah diremajakan
memiliki kenampakan koloni berwarna putih kekuningan dan permukaan yang
licin. Hal ini sesuai dengan yang telah dilaporkan oleh Putranto (2012), yaitu
isolat berwarna putih apabila masih muda dan akan berwarna kuning di pinggir
koloni jika sudah tua. Diameter koloni berukuran 0.6-1.2 x 1.5-6 μm. Bakteri ini
memiliki bentuk sel batang, termasuk ke dalam bakteri gram positif, aerob, tidak
mampu bergerak dan termasuk ke dalam katalase positif.
Enzim α-amilase dapat diproduksi dari berbagai sumber seperti tumbuhan,
hewan dan mikroorganisme. Sumber α-amilase yang banyak digunakan berasal
dari mikroorganisme, karena mudah ditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol
dengan baik, serta cepat menghasilkan enzim dengan jumlah yang lebih banyak
(Waluyo 2007). Brevibacterium sp. merupakan salah satu mikroorganisme yang
mampu menghasilkan α-amilase secara ekstraseluler. Pati dalam media
terhidrolisis oleh enzim amilase yang disekresikan oleh Brevibacterium sp.
menjadi senyawa yang lebih sederhana seperti glukosa dan maltosa. Enzim
ekstraseluler dapat memecah polimer yang tidak larut seperti pati, kemudian
produk dari pemecahan tersebut akan ditranspor ke dalam sel dan digunakan
sebagai nutrisi untuk tumbuh (Madigan et al. 2000).
Hasil produksi α-amilase dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk memisahkan
media yang mengandung α-amilase dengan sel bakteri sehingga dihasilkan filtrat
yang berisi ekstrak kasar enzim dan terpisah dari sel bakteri serta sisa-sisa media
yang tidak larut. Sentrifugasi pada suhu dingin bertujuan umtuk meminimalkan
kerusakan enzim. Sel bakteri yang berukuran lebih besar dibandingkan dengan
enzim ekstraselulernya akan mengalami gaya sentrifugal yang lebih besar pada
kecepatan radial dan jarak putar yang sama. Akibatnya sel akan mengendap dan
enzim akan tetap berada pada bagian filtrat (Rachmadani 2007).
Karakteristik enzim yang dihasilkan dari bakteri laut dibandingkan dengan
enzim dari bakteri darat yaitu memiliki aktivitas optimum yang lebih tahan pada
salinitas tinggi (Mohapatra et al. 2003). Produksi optimum α-amilase dari
Brevibacterium sp. terjadi pada pH 8, sedangkan enzim α-amilase ekstrak kasar
yang dihasilkan memiliki aktivitas optimum pada pH 6.6 dan suhu 30 oC. Hasil
penelitian Chofid (2010) menunjukkan bahwa α-amilase dari Bacillus subtillis
memiliki aktivitas optimum pada pH 6-7 dan suhu 95-110 oC. Sedangkan Sari et
al. (β01γ) melaporkan bahwa α-amilase yang diisolasi dari Saccharomyces
cerevisiae memiliki aktivitas optimum pada pH 4.9 dan suhu 23 oC. Perbedaan ini
disebabkan oleh perbedaan lingkungan hidup masing-masing bakteri tersebut,

16
karena pH lingkungan hidup diketahui mempengaruhi sintesis dan sekresi amilase
sama seperti stabilitas (Sivaramakrishnan et al. 2006).
Adanya aktivitas enzim dapat digambarkan melalui hilangnya substrat atau
terbentuknya produk-produk reaksi. Enzim diinkubasi dengan substrat pada
kondisi yang sesuai, sehingga sampel akan terurai pada interval waktu tertentu
dan kemudian dianalisis. Aktivitas enzim dinyatakan dalam istilah unit (U). Satu
unit adalah sejumlah enzim yang mengkatalisis konversi dari 1 µmol substrat per
unit dalam kondisi normal (Bintang 2010). Aktivitas amilase ekstrak kasar yang
terukur yaitu sebesar 1.78 U mL-1 yang berarti amilase tersebut dapat
menghasilkan 1.78 µmol produk per menit. Nilai ini lebih rendah bila
dibandingkan dengan hasil penelitian Rahmani et al. (2011a) yang menemukan
bahwa Brevibacterium sp. yang diisolasi dari Teluk Kamal mampu menghasilkan
amilase dengan aktivitas 2.85 U mL-1. Perbedaan ini dapat disebabkan karena
adanya perbedaan sumber isolat bakteri yang digunakan. Isolat bakteri yang
digunakan pada penelitian ini merupakan hasil peremajaan dari bakteri yang
dibiakkan sebelumnya, sehingga isolat ini kemungkinan telah mengalami
perubahan yang mengakibatkan perbedaan pada aktivitas enzim yang dihasilkan.
Semakin tinggi aktivitas enzim amilase maka semakin optimal enzim tersebut
memecah pati menjadi gula sederhana seperti oligosakarida.
Kondisi Optimum Hidrolisis Enzimatis Pati Umbi Tacca
Konsentrasi Substrat Optimum
Penentuan kondisi optimum hidrolisis enzimatis pati umbi Tacca untuk
menghasilkan oligosakarida menggunakan beberapa parameter, yaitu konsentrasi
substrat, perbandingan enzim dan substrat, serta waktu. Menurut Purba (2009)
rekasi yang dikatalis oleh enzim dipengaruhi oleh konsentrasi substratnya.
Substrat yang akan bereaksi melekat terlebih dahulu pada molekul enzim di
daerah yang disebut sisi aktif membentuk kompleks enzim-substrat. Konsentrasi
substrat yang rendah mempunyai kesempatan yang kecil untuk diikat oleh enzim
dalam menghasilkan produk dan sebaliknya. Namun penambahan konsentrasi
substrat pada level tertentu melebihi konsentrasi optimumnya dapat menurunkan
laju reaksi. Hal ini terjadi karena substrat akhirnya menginhibisi kerja enzim.
Begitu banyak substrat menyebabkan terjadinya persaingan antar substrat untuk
menempati sisi aktif enzim sehingga laju reaksi menurun dan produk yang
dihasilkan kurang optimal (Husnil 2009).
Substrat yang digunakan adalah pati umbi Tacca yang berasal dari Hutan
Jati. Berdasarkan hasil penelitian terdahulu, pati umbi Tacca Hutan Jati memiliki
rendemen pati sebesar 28.44% dan daya cerna pati sebesar 97.23% (Rahmani et al.
2011b). Daya cerna pati adalah tingkat kemudahan suatu jenis pati untuk dapat
dihidrolisis oleh enzim pemecah pati menjadi unit-unit yang lebih sederhana
(Prangdimurti 2009). Dengan tingginya daya cerna tersebut, pati umbi Tacca
sangat berpotensi untuk memproduksi oligosakarida.
Peranan amilase ekstrak kasar pada hidrolisis pati umbi Tacca menjadi
oligosakarida dapat dilihat dari gula pereduksi yang dihasilkan. Gula
pereduksi merupakan golongan gula (karbohidrat) yang dapat mereduksi
senyawa-senyawa penerima elektron contohnya adalah glukosa dan fruktosa.
Ujung dari suatu gula pereduksi adalah ujung yang mengandung gugus aldehida

17
atau keton bebas. Semua monosakarida (glukosa, fruktosa, galaktosa) dan
disakarida (laktosa, maltosa), termasuk sebagai gula pereduksi. Semakin tinggi
aktivitas enzim maka semakin tinggi pula gula pereduksi yang dihasilkan. Jumlah
gula pereduksi yang dihasilkan selama reaksi diukur dengan menggunakan
pereaksi DNS pada panjang gelombang 540 nm sama seperti pada pengukuran
aktivitas enzim. Semakin tinggi nilai absorbansi yang dihasilkan, semakin banyak
pula gula pereduksi yang terkandung (Bintang 2010).
Konsentrasi optimum terpilih adalah 3%. Pada kondisi ini derajat
polimerisasi (DP) yang dihasilkan sebesar 15-21. DP nyatakan jumlah unit
monomer atau jumlah rata-rata rantai monosakarida dominan dalam suatu molekul.
Hal tersebut berarti bahwa hidrolisat pati diperkirakan masih mengandung rantai
monosakarida dominan pada rentang nilai tersebut. Oligosakarida sendiri
merupakan hasil hidrolisis pati dengan nilai DP 2-10 (Nakakuki 2002). Semakin
kecil nilai DP maka semakin banyak pula pati yang terhidrolisis menjadi gugus
yang lebih kecil. Pada reaksi hidrolisis kali ini pati belum berhasil terhidrolisis
menghasilkan oligosakarida dengan gugus yang kecil.
Perbandingan Enzim dan Substrat Optimum
Perbandingan enzim dan substrat dapat mempengaruhi reaksi hidrolisis. Jika
salah satu satu zat pereaksi dibuat berlebih maka keseimbangan dapat bergeser ke
sebelah kanan dengan baik. Menurut Yuanita et al. (2010) penambahan enzim
akan meningkatkan kecepatan reaksi bila substrat tersedia secara berlebih. Namun
peningkatan kecepatan reaksi akan semakin menurun untuk setiap penambahan
enzim. Waktu inkubasi juga merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi
reaksi hidrólisis. Pada reaksi hidrolisis, waktu inkubasi merupakan waktu kontak
antara enzim dan substrat sehingga menghasilkan produk. Bertambahnya waktu
kontak memungkinkan seluruh enzim berperan untuk merubah substrat menjadi
produk. Akan tetapi pada kondisi optimum, enzim akan terjenuhi oleh substrat
sehingga tidak terjadi penambahan produk dan memungkinkan reaksi balik
terjadinya kompleks substrat menjadi enzim bebas. Peningkatan produk akan
mencapai titik batas, setelah titik itu terlampaui maka tidak akan terjadi perubahan
nilai produk yang lebih tinggi lagi meskipun konsentrasi enzim ditambahkan dan
waktu diperpanjang. Hal ini terjadi karena sisi aktif enzim telah jenuh oleh
substrat sehingga tidak ada lagi substrat yang dapat melekat pada sisi aktif. Batas
tersebut disebut sebagai kecepatan maksimum, yaitu kecepatan ketika enzim telah
jenuh dengan substrat. Pada saat tercapai kecepatan maksimum semua enzim
terdapat dalam kompleks enzim substrat.
Secara keseluruhan analisis gula pereduksi pada berbagai perbandingan
enzim dan substrat menghasilkan konsentrasi gula pereduksi yang lebih tinggi
hingga dua kali lipat dibanding konsentrasi gula pereduksi pada berbagai
konsentrasi substrat. Begitupula DP yang dihasilkan menjadi lebih kecil yaitu 410. Berdasarkan pengertian oligosakarida menurut Nakakuki (2002) maka dapat
dikatakan bahwa hasil hidrólisis tersebut sudah merupakan oligosakarida.
Salah satu analisis yang digunakan untuk menentukan perbandingan enzim
dan substrat optimum adalah dengan menggunakan KLT. Menurut Patel dan
Arum (2011) KLT dapat mengungkapkan tingkat polimerisasi dari oligosakarida.
Dari produk yang dipisahkan oleh KLT dapat disimpulkan bahwa hidrolisis
adalah karena adanya enzim tipe endo yang menghidrolisis pati secara acak

18
menghasilkan oligosakarida dengan DP lebih dari atau sama dengan 2.
Perbandingan enzim dan substrat 1:5 dipilih sebagai perbandingan enzim dan
substrat optimum pada jam ke-6 hingga jam ke-8 karena pada kondisi tersebut
hasil analisis KLT menunjukkan spot yang terlihat terpisah dan intensitas
kromatogram yang lebih kuat. Penggunaan dosis enzim yang terlalu tinggi
menyebabkan proses hidrolisis menjadi kurang optimal seperti pada hasil
hidrolisis dengan perbandingan enzim dan substrat 1:1 dan 1:2 (Gambar 7). Setiap
reaksi hidrólisis memiliki kondisi optimum yang berbeda-beda untuk
menghasilkan oligosakarida bergantung pada sumber substrat yang digunakan.
Seperti halnya pada reaksi hidrólisis pati kentang hitam yang memiliki kondisi
optimum pada konsentrasi substrat 2.5%, perbandingan enzim dan substrat 1:5,
serta waktu reaksi selama 4 jam (Rohanah 2012).
Hidrolisis Pati Umbi Tacca Skala Besar
Sebelumnya hidrolisis skala kecil dilakukan untuk proses optimasi yaitu
mengetahui konsentrasi, perbandingan enzim dan substrat, serta waktu optimum.
Adapun hidrolisis pati umbi Tacca skala besar dilakukan dengan tujuan untuk
memproduksi oligosakarida dalam pengaplikasiannya terhadap industri. Hidrolisis
dilakukanpada kondisi yang telah dioptimasi sebelumnya, yaitu konsentrasi
substrat 3%, perbandingan enzim dan substrat 1:5, dan waktu reaksi 6-8 jam dan
aktivitas enzim sebesar 1.78 U mL-1. Oligosakarida segar hasil hidrólisis skala
besar sebagian dikeringbekukan ( freeze dry) dengan tujuan menguapkan air yang
terkandung dalam sampel sehingga konsentrasi sampel menjadi lebih tinggi.
Selain itu hasil sampel yang berupa padatan merupakan langkah akhir yang ideal
untuk memudahkan proses analisis dan penyimpanan dalam jumlah yang banyak
(Zhu et al. 2006).
Analisis gula pereduksi dan DP oligosakarida hasil hidrolisis skala besar
menghasilkan nilai yang lebih baik dibandingkan dengan hidrolisis pada saat
optimasi. Hal ini dikarenakan proses hidrolisis yang dilakukan sudah dalam
keadaan optimum sehingga menghasilkan oligosakarida yang optimum pula yaitu
konsentrasi gula pereduksi oligosakarida segar sebanyak 6580.46 µg mL-1 dengan
DP 2.7 dan konsentrasi gula pereduksi freeze dry sebanyak 3317.82 µg mL-1
dengan DP 1.3. Hasil analisis KLT menunjukkan bahwa sampel segar dan freeze
dry mengandung oligosakarida yang sama dengan hasil hidrolisis pada saat
optimasi, yaitu maltosa, maltotetraosa dan diperkirakan maltotriosa karena
memiliki nilai Rf diantara maltosa dan maltotetraosa (Gambar 10 dan Tabel 3).
Dari hasil KLT dapat dilihat bahwa yang menghasilkan pemisahan paling baik
adalah sampel freeze dry dengan konsentrasi 1%, sehingga yang digunakan untuk
analisis profil oligosakarida menggunakan KCKT adalah oligosakarida segar dan
freeze dry 1%. Adapun oligosakarida freeze dry 2% dan 3% menghasilkan
pemisahan spot yang kurang baik karena konsentrasi yang terlalu besar.
Analisis Oligosakarida dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Analisis profil oligosakarida hasil hidrolisis pati umbi Tacca secara
kualitatif dilakukan menggunakan KCKT dengan tujuan untuk mendapatkan
informasi mengenai jenis oligosakarida yang terdapat dalam sampel. Menurut

19
Eliasson dan Gudmundsson (2006), pelarut polar yang digunakan dalam
menentukan profil oligosakarida yaitu asetonitril:akuades yang telah di-degassing
dengan perbandingan 75:25. Tujuan degassing yaitu untuk menghilangkan gas
sehingga dapat mengurangi gangguan saat analisis berlangsung. Teknik
pemisahan melibatkan kromatografi partisi cair-cair dengan mekanisme retensi
diikuti oleh fase normal dengan fase diam berupa senyawa polar dan fase gerak
berupa senyawa nonpolar. Polaritas fase gerak meningkat dengan mencampur
asetonitril dan air pada perbandingan 75:25. Indeks polaritas pelarut campuran
adalah 6.9 lebih nonpolar daripada air yang telah didestilasi (10.2) dan lebih polar
daripada asetonitril (5.8).
Jenis gula sederhana hasil analisis menggunakan KCKT hampir sama
dengan hasil analisis menggunakan KLT, hanya saja glukosa muncul pada KCKT
dan tidak muncul pada KLT. Hal ini dapat disebabkan karena konsentrasi glukosa
yang terdapat pada sampel terlalu rendah sehingga hanya muncul ketika analisis
menggunakan KCKT dengana tingkat kesensitifan yang tinggi, dan tidak muncul
pemisahan spot pada KLT. Adapun oligosakarida yang dihasilkan yaitu berupa
maltooligosakarida: maltosa, maltotriosa dan maltotetraosa. Dengan adanya
analisis menggunakan KLT dan KCKT yang memunculkan gula-gula baik
monosakarida maupun oligosakarida, menunjukkan bahwa pati umbi Tacca telah
terdegradasi menjadi gula-gula sederhana dengan menggunakan α-amilase dari
Brevibacterium sp.
Enzim α-amylase (EC 3.2.1.1) atau yang biasa disebut 1,4–α-D-glukan
glukanohidrolase merupakan endoenzim yang memutus ikatan α-1,4 amilosa dan
amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami
gelatinisasi. Enzim ini akan menghidrolisis ikatan α-1,4 glikosidik pada
polisakarida dengan hasil degradasi di bagian tengah atau di dalam molekul
sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek meliputi
glukosa, dekstrin dan produk oligosakarida berbagai ukuran dengan konfigurasi
alfa (Winarno 2010). α-Amilase mendegradasi G4 (maltotetraosa), G5
(maltopentosa), G6 (maltoheksosa) menjadi G1 (glukosa), G2 (maltosa), G3
(maltotriosa), dan G3 (maltotriosa) y