Analisis oligosakarida hasil hidrolisis pati kentang hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim amilase dari Brevibacterium sp.

ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI
KENTANG HITAM (Culeus tuberosus) OLEH ENZIM
AMILASE DARI Brevibacterium sp.

TITI ROHMAYANTI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

ABSTRAK
TITI ROHMAYANTI. Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati Kentang
Hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp. Dibimbing
oleh ANNA P. ROSWIEM dan YOPI

Oligosakarida merupakan kelompok penting dari makromolekul
karbohidrat yang disusun 2 sampai 20 unit sakarida. Oligosakarida memiliki
banyak manfaat di bidang pangan dan kesehatan. Salah satu bahan utama untuk
produksi oligosakarida secara enzimatis adalah pati. Kentang hitam mengandung

karbohidrat tinggi terutama pati sekitar 83%. Untuk mendapatkan oligosakarida
dari pati kentang hitam, digunakan enzim amilase yang diproduksi oleh
Brevibacterium sp. Produksi ekstrak kasar enzim amilase dari Brevibacterium sp.
menghasilkan aktivitas enzim sebesar 3.25 U/mL. Pati kentang hitam hasil
hidrolisis memiliki nilai gula reduksi sebesar 7482.500 ppm, setelah dilakukan
freeze dry gula reduksi sebesar 9647.500 ppm, dan setelah dipekatkan dengan
vacuum evaporator kandungan gula reduksinya sebesar 14908.300 ppm. Analisis
HPLC terhadap hasil hidrolisis pati kentang hitam menunjukkan adanya senyawa
oligosakarida maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa. Sampel yang diberi
perlakuan freeze dry dan evaporasi menghasilkan nilai gula reduksi dan
konsentrasi oligosakarida yang lebih tinggi serta kromatogram HPLC dengan
puncak yang lebih tajam sehingga sampel tersebut memiiki kualitas oligosakarida
yang lebih baik dibandingkan sampel segar tanpa perlakuan.

ABSTRACT
TITI ROHMAYANTI. Analysis of Oligosaccharide from Hydrolysis The Black
Potato Starch (Culeus tuberosus) by Amylase Enzyme from Brevibacterium sp.
Supervised by ANNA P. ROSWIEM and YOPI.

Oligosaccharide is an important group of carbohydrate macromolecul

composed of 2 to 20 saccharide units. Oligosaccharide has many benefits in the
field of food and health. Starch is one of the source origin material for
oligosaccharide production by enzimatic process. Black potatoes contain high
carbohydrates especially starch of about 83%. To obtain oligosaccharide from
black potato starch can be hidrolyzed using amylase enzymes which are produced
by Brevibacterium sp. Crude extracts amylase enzyme production from
Brevibacterium sp. producing enzyme activity of 3.25 U/mL. Black potato starch
hydrolysis results a value of reducing sugar of 7482.500 ppm, after freeze drying
a value of reducing sugar was 9647.500 ppm, and after concentrated by vacuum
evaporator the value of reducing sugar was 14908.300 ppm. The results of HPLC
analysis of black potato starch hydrolysis showed that there are oligosaccharide
compound such as maltose, maltotriose, and maltopentose. The samples were
given preferential treatment freeze dry and evaporation produce reducing sugar
value and concentration of the oligosaccharide better than the fresh samples
without treatment. The identification result of oligosaccharide obtained by HPLC
shows that freeze drying and evaporating samples has a higher concentration and
better peak and sharp.

ANALISIS OLIGOSAKARIDA HASIL HIDROLISIS PATI
KENTANG HITAM (Culeus tuberosus) OLEH ENZIM

AMILASE DARI Brevibacterium sp.

TITI ROHMAYANTI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul
Nama
NIM

: Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati Kentang Hitam (Culeus

tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.
: Titi Rohmayanti
: G84080034

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Anna P. Roswiem, MS.
Ketua

Dr. Yopi
Anggota

Diketahui

Dr. I Made Artika M.App.Sc.
Ketua Depertemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT. yang telah
melimpahkan berkah, rahmat, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian untuk memenuhi tugas akhir pada program mayor
Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor. Penelitian ini berjudul Analisis Oligosakarida Hasil Hidrolisis Pati
Kentang Hitam (Culeus tuberosus) oleh Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.
Kegiatan ini didanai oleh Projek DIPAN PN LIPI 2012 dan dilakukan di
Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi LIPI Cibinong, Bogor dari bulan Juni
hingga November 2012.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan dukungan selama proses penulisan penelitian ini. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan terutama kepada Dr. Anna P. Roswiem, MS. selaku
pembimbing utama dan Dr. Yopi selaku pembimbing kedua yang telah
memberikan saran, kritik, dan bimbingannya. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan kepada keluarga tercinta Ayah, Ibu, teh Yani, teh Nisa, dan Mia.
Terima kasih juga untuk segenap tim di LIPI Cibinong Mba Nanik, Mba Ade,
Mba Lia, Mas Alex, Mas Dicki, Pak Awan, Rohanah, dan Sari. Teman-teman
Biokimia angkatan 45 Ines, Osa, Nisa. Teman-teman Al Hurriyyah Tika, Leli,
Arni, Edy, Abas dan teman-teman Al Iffah Filda, Dania, Riska, dan semua yang

tidak bisa disebutkan satu persatu.
Penelitian ini tentu tidak terlepas dari kekurangan. Karena itu penulis
sangat mengharapkan adanya saran dan kritik yang bermanfaat bagi penulis di
masa yang akan datang. Semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat.

Bogor, Februari 2013

Titi Rohmayanti

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 6 Oktober 1990 dari Bapak
Muhammad Yamin, SE. dan Ibu Siti Rohimah, S.Pd. Penulis merupakan anak
ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1
Kramatwatu, Serang dan diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis tercatat sebagai mahasiswa
Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada
tahun 2008.
Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam organisasi LDK Al
Hurriyyah di bagian departemen Hubungan Luar (2009-2011) dan sebagai Badan
Pengawas Nasional LDK di Jawa Barat. Penulis juga aktif di UKM Forum for

Scientific Studies (FORCES) pada tahun 2009 dan Dewan Perwakilan Mahasiswa
(DPM) FMIPA (2010). Pada tahun 2012 penulis aktif di departemen Sumber
Daya Manusia LDK Al Hurriyyah. Beberapa kepanitian yang pernah penulis ikuti
diantaranya pada tahun 2009 sebagai Penanggung Jawab Kelompok (PJK) Masa
Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru (MPKMB), tahun 2010 sebagai divisi acara
Seminar Pertanian Indonesia, tahun 2011 Bendahara kegiatan Puskomdays
nasional, dan divisi acara Gebyar Inspirasi Muslim Intelek serta di tahun 2012
sebagai Steereing Commetee (SC) acara Salam Islamic Student Center IPB.
Penulis juga aktif mengikut berbagai kompetisi. Pada tahun 2009, penulis
pernah mengikuti ajang Muslimah Teladan se-Nasional dan masuk ke dalam lima
besar. Tahun 2010 dan 2011 penulis pernah menjadi juara kedua lomba cipta dan
baca puisi tingkat nasional dan tulisan-tulisan fiksinya beberapa kali diterbitkan di
majalah Annida dan Kompasiana. Penulis pernah mengikuti dan lolos kompetisi
writing paper “Sustainable Future for Human Security” (SUSTAIN 2011) di
Kyoto, Jepang dan di tahun yang sama penulis juga mengikuti kompetisi writing
paper pada forum “Discussion on Sustainable Women Partnership of Women
Leaders from Asia and Africa” di Duksung Woman University, Korea. Penulis
juga pernah mendapat hibah dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan
Tinggi dalam Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang
Pengabdian Masyarakat pada tahun 2011. Penulis melakukan Praktik Lapangan di

Balai Besar Penelitian Pascapanen Jl. Tentara No 1, Cimanggu Bogor dengan
judul “Studi Analisis Mutu dalam Proses Pembuatan Manisan Kering Buah
Rambutan”.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .........................................................................................

ix

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................

ix

PENDAHULUAN .............................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA
Pati Kentang Hitam ...................................................................................

Enzim Amilase ..........................................................................................
Brevibacterium sp. ....................................................................................
Oligosakarida ............................................................................................
Analisis Oligosakarida ..............................................................................

1
2
3
3
4

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.... ......................................................................................
Metode ......................................................................................................

5
5

HASIL DAN PEMBAHASAN
Enzim Amilase dari Brevibacterium sp ....................................................

Hasil Reaksi Hidrolisis Pati Kentang Hitam dengan Enzim Amilase ......
Hasil Analisis TLC, Gula Reduksi, Gula Total .......................................
Hasil Analisis HPLC Sampel Pati Kentang Hitam Hasil Hidrolisis .........

6
7
8
9

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................... 12
Saran ......................................................................................................... 13
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 13
LAMPIRAN ....................................................................................................... 15

DAFTAR GAMBAR
Halaman

1

Pati Kentang Hitam ......................................................................................

2

2

Ekstrak Kasar Enzim Amilase .....................................................................

7

3

Warna dan Kekentalan Pati Kentang Hitam ................................................

7

4

Sampel Hasil Freeze Dry dan Evaporasi .....................................................

7

5

Kromatogram TLC Standar dan Sampel ......................................................

8

6

Kromatogram HPLC Standar dengan Perbandingan Fase Gerak 75:25
Kecepatan Aliran 1.4 mL/min dan Fase Gerak 60:40 Kecepatan Aliran
1 mL/min ......................................................................................................

10

7

Kromatogram HPLC Sampel Segar, Freeze Dry 2.5%, dan Evaporasi
2.5% ............................................................................................................. 11

DAFTAR TABEL
Halaman

1 Kandungan Nutrisi Kentang Hitam ...............................................................

2

2 Jenis Sakarida dan Senyawa Prebiotik Lainnya ............................................

3

3 Waktu Retensi Kromatogram TLC Standar dan Sampel……………....... ...

8

4 Nilai Gula Reduksi, Gula Total, dan Derajat Polimerasi ..............................

9

5 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Standar ........................................... 10
6 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Segar .................................. 10
7 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Freeze Dry ......................... 12
8 Waktu Retensi HPLC dan Konsentrasi Sampel Evaporasi ........................... 12

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman

1

Diagram Alir Penelitian ............................................................................... 16

2

Hidrolisis Substrat ........................................................................................

17

3

Kurva Standar Glukosa dan Nilai Aktivitas Enzim .....................................

18

4

Kurva Kalibrasi Standar Glukosa ................................................................

19

5

Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Segar ...................................

20

6

Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Hasil Freeze Dry .................

21

7

Hasil Analisis Kandungan Gula pada Sampel Hasil Evaporasi ...................

22

8

Kromatogram HPLC Standar dengan Perbandingan Fase Gerak 75:25
Kecepatan Aliran 1.4 mL/min......................................................................

23

Kromatogram HPLC Standar dengan Perbandingan Fase Gerak 60:40
Kecepatan Aliran 1 mL/min.........................................................................

24

10 Kromatogram HPLC Sampel Segar Hasil Hidrolisis...................................

25

11 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 2.5% .................................

26

12 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 5% ....................................

27

13 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Freeze Dry 10% ..................................

28

14 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 2.5% ...................................

29

15 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 5% ......................................

30

16 Kromatogram HPLC Sampel Hasil Evaporasi 10% ....................................

31

9

1

PENDAHULUAN
Oligosakarida
merupakan
kelompok
penting dari makromolekul karbohidrat yang
memiliki gula rantai pendek dari polisakarida
dengan 2 sampai 20 unit sakarida. Dewasa ini
perkembangan produk oligosakarida menjadi
salah satu usaha yang memiliki nilai jual
sangat tinggi di dunia industri. Produk
oligosakarida memiliki banyak manfaat di
bidang pangan dan kesehatan tubuh seperti
meningkatkan
kualitas
makanan
dan
modifikasi rasa makanan (Marlis 2008),
meningkatkan populasi bakteri baik di saluran
cerna atau sebagai senyawa prebiotik (Rycroft
et al. 2001), mereduksi reaksi alergi
(Nakakuki 2002), meningkatkan penyerapan
mineral dan memodulasi metabolisme lipid
(Sakuma 2002).
Banyaknya manfaat oligosakarida tersebut
menyebabkan tumbuhnya inovasi baru untuk
menghasilkan
oligosakarida.
Penemuan
enzim-enzim baru mikroba yang mampu
mensintesis oligosakarida dengan struktur
yang
spesifik
meningkatkan
produksi
bermacam-macam
oligosakarida
seperti
galaktooligosakarida,
laktosukrosa,
xilooligosakarida,
maltooligosakarida,
dan
isomaltooligosakarida (Dinoto 2010). Salah
satu bahan dasar untuk memproduksi
oligosakarida secara enzimatis adalah pati
yang terdiri dari unit α-D-glukopiranosil yang
terhubung dengan ikatan α-1.4-glikosidik
dan/atau ikatan α-1.6-glikosidik.
Kentang hitam mengandung karbohidrat
tinggi terutama pati yaitu sekitar 83% dengan
kadar amilosa 32% dan amilopektin sebesar
51% (Rahmani et al. 2011). Tingginya
kandungan pati tersebut menyebabkan kentang
hitam dapat dijadikan sebagai salah satu
sumber pangan dalam upaya pengembangan
program
diversifikasi
pangan.
Kadar
amilopektin yang lebih tinggi dari amilosa
menyebabkan kentang hitam memiliki
karakter yang unik yaitu lebih kenyal dan
renyah dibanding kentang yang lain. Hal ini
dikarenakan struktur amilopektin yang banyak
memiliki cabang disisinya. Penelitian terkait
manfaat yang terkandung dalam kentang
hitam masih terbatas sehingga penelitian
tentang analisis oligosakarida kentang hitam
ini merupakan suatu langkah menggali potensi
sumber daya umbi lokal tersebut.
Beberapa jenis enzim amilase dilaporkan
dapat dihasilkan dari mikroorganisme dan
diproduksi secara komersial pada industri.
Beberapa mikroba yang dapat memproduksi
enzim
amilase
untuk
menghasilkan

oligosakarida
seperti
maltoheksosa,
maltopentosa, maltotetrosa, dan maltotriosa
diantaranya
Aerobacter,
Bacillus,
Pseudomonas, dan Streptomyces (Takasaki
1982; Taniguchi 1983; Robyt 1971; Wako et
al. 1979).
Saat ini mikroba yang banyak digunakan
berasal dari tanah, mikroba yang berasal dari
laut belum banyak dimanfaatkan padahal
karakteristik mikroba laut sangat unik yaitu
tahan terhadap NaCl yang sangat tinggi. Salah
satu mikroba laut yang dapat menghasilkan
enzim amilase yaitu Brevibacterium sp.
(Rahmani et al. 2011). Berdasarkan penelitian
Rohanah (2012), kondisi optimum hidrolisis
pati kentang hitam dengan enzim amilase dari
Brevibacterium sp. memiliki waktu hidrolisis
selama 4 jam, konsentrasi substrat sebesar
2.5%, dilakukan pada suhu 30oC, serta
perbandingan enzim dan substrat 1:5 dengan
aktivitas enzim amilase yang diperoleh
sebesar 2.488 U/mL.
Analisis sakarida hasil hidrolisis secara
enzimatik dapat
diidentifikasi
dengan
beberapa cara salah satunya adalah metode
High Performance Liquid Cromatography
(HPLC). Metode tersebut digunakan karena
memiliki kecepatan dan sensitivitas yang lebih
baik dari kromatografi lainnya. HPLC dapat
digunakan untuk mengidentifikasi bahanbahan yang mengandung karbohidrat dan
senyawa organik (Zou & Chen 2008).
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
menganalisis oligosakarida hasil hidrolisis pati
kentang hitam oleh enzim amilase dari
Brevibacterium sp. Adapun hipotesis dari
penelitian ini adalah oligosakarida dapat
dihasilkan dari pati kentang hitam hasil
hidrolisis dengan enzim amilase dari
Brevibacterium sp. Penelitian ini diharapkan
dapat memberikan pengetahuan dan nilai guna
mengenai manfaat pati kentang hitam dan
produk turunannya berupa oligosakarida yang
bernilai ekonomis dan berfungsi sebagai
komponen pangan sehat.

TINJAUAN PUSTAKA
Pati Kentang Hitam
Kentang hitam atau kentang kleci
merupakan tanaman pangan berwarna cokelat
tua hingga hitam gelap seukuran ibu jari atau
jempol kaki orang dewasa. Umbinya memiliki
banyak manfaat dan akan berwarna
kekuningan setelah direbus. Taksonomi
tanaman kentang hitam dapat diklasifikasikan
ke
dalam
kerajaan
Plantae,
divisi

2

Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo
Lamiales, famili Lamiaceae, genus Culeus,
dan spesies Culeus tuberosus. Kentang hitam
mempunyai kandungan karbohidrat yang
tinggi, khususnya pati yaitu sebesar 33.7 gram
(Nugraheni 2011). Kompisisi nilai gizi
kentang hitam dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Kandungan nutrisi kentang hitam
Kandungan
Kadar (per 100 g)
Air
64 %
Energi
142 kal
Karbohidrat
33.7 g
Protein
0.9 g
Lemak
0.4 g
Kalsium
34 mg
Fosfor
75 mg
Besi
0.2 mg
Tiamin
0.02 mg
Vit. C
38 mg
Sumber: Nugraheni (2011)
Kentang hitam yang digunakan pada
penelitian ini merupakan kentang hitam
varietas 2.12 hasil kultur jaringan di
Laboratorium Biak Sel dan Kultur Jaringan,
Puslit Biologi, LIPI. Sampel kentang hitam
yang digunakan dalam kultur jaringan berasal
dari daerah Nganjuk, Jawa Timur. Kentang
hitam tersebut diekstrak hingga didapatkan
pati umbi kentang hitam dalam bentuk bubuk
(Gambar 1).

Gambar 1 Pati kentang hitam
Secara alamiah pati merupakan campuran
dari amilosa dan amilopektin. Monomer
glukosa dengan hanya terdapat ikatan α-1.4
glikosidik dinamakan amilosa. Di sisi lain,
adanya ikatan α-1.6 glikosidik menghasilkan
polimer glukosa bercabang yang dinamakan
amilopektin.
Komposisi
amilosa
dan
amilopektin
berbeda-beda
pada
tiap
tumbuhan. Untuk pati yang berasal dari
kentang hitam memiliki kadar amilosa 32.31%
dan kadar amilopektin 52.56% (Rahmani et al.
2011). Pati kentang hitam memiliki senyawa
turunan tripterpenic acid seperti urselic acid,

oleanolic acid, dan maslinic acid, senyawa
yang
berfungsi
sebagai
antioksidan,
hepatoprotektif, antitumor, anti inflamasi, dan
peningkat daya tahan tubuh (Yoon & Liu
2008; Feng et al., 2008; Fai & Tao 2009).
Pati
termasuk
karbohidrat
jenis
polisakarida yang banyak terdapat di dalam
tumbuhan. Pati atau amilum bersifat tidak
larut dalam air pada suhu kamar, berwujud
bubuk putih, tidak berasa, dan tidak berbau. Di
dalam tumbuhan, pati disimpan dalam sel
sebagai granula kecil yang dapat dilihat di
bawah mikroskop. Bentuk granula pati
berbeda-beda tergantung dari tumbuhan
sumber patinya. Pati kentang hitam memiliki
granula dengan ukuran 10 m dan baik pada
aplikasi industri (Rahmani et al. 2011).
Komponen utama polisakarida pada pati
kentang hitam dapat dihidrolisis dengan
menggunakan enzim-enzim yang memiliki
cara kerja spesifik untuk menghasilkan
oligosakarida. Enzim spesifik untuk memecah
pati menjadi gula-gula sederhana yaitu enzim
amilase (Winarno 2008).
Enzim Amilase
Enzim adalah protein yang berfungsi
sebagai
katalisator,
senyawa
yang
mempercepat proses reaksi tanpa habis
bereaksi dalam suatu reaksi kimia. Enzim
bekerja secara spesifik, artinya setiap enzim
hanya dapat bekerja pada satu macam
senyawa atau reaksi kimia. Hal ini karena
adanya urutan asam amino spesifik yang
membentuk enzim serta mengikat dan
mengaktifkan molekul substrat. Sebagai
contoh, enzim α-Amilase hanya dapat
digunakan pada proses perombakan pati
menjadi gula sederhana (Marks et al. 2000).
Enzim α-Amilase tipe endoenzim yang
memotong ikatan amilosa dan amilopektin
dengan cepat pada larutan pati kental yang
telah mengalami gelatinisasi. Produk akhir
yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah
dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan
maltosa. α-Amilase akan menghidrolisis
ikatan α-1.4 glikosidik pada polisakarida
dengan hasil degradasi secara acak di bagian
tengah atau bagian dalam molekul (Conkerton
et al. 1983).
Enzim amilase didapatkan dari berbagai
macam sumber seperti tanaman, hewan, dan
mikroorganisme (Akyuni 2004). Amilase
diproduksi oleh berbagai mikroorganisme
seperti bakteri, khamir, kapang, ganggang
laut, dan beberapa invertebrata seperti ulat.
Penggunaan
mikroba
dianggap
lebih
prospektif karena mudah tumbuh, cepat

3

menghasilkan produk, kondisi lingkungan
dapat dikendalikan, menguntungkan secara
ekonomis dan memilki siklus hidup pendek
sehingga produktivitasnya dapat ditingkatkan.
Salah satu bakteri yang dapat menghasilkan
enzim amilase tipe endo yaitu Brevibacterium
sp. (Rahmani et al. 2011)
Brevibacterium sp.
Mikroba laut yang dapat menghasilkan
enzim amilase diantaranya adalah bakteri
Brevibacterium sp. Isolat tersebut diprediksi
dapat memproduksi amilase tipe endo, yaitu
enzim yang bekerja menghidrolisis substrat
secara random atau acak sehingga dapat
menghasilkan produk oligosakarida dalam
jumlah yang lebih banyak. Enzim amilase
yang dihasilkan oleh Brevibacterium sp.
memiliki suhu optimum 25-30oC dan pH
optimum 6.6 (Rahmani et al. 2011).
Genus Brevibacterium adalah campuran
heterogen organisme coryneform yang
memiliki aplikasi khusus untuk produksi
industri, asam amino untuk produksi bahan
kimia halus, dan produksi keju. Genus ini
berisi sembilan spesies dari habitat beragam
seperti tanah, unggas, ikan, kulit manusia, dan
makanan (Gruner & Alexander 1993). Bakteri
yang digunakan pada penelitian ini diisolasi
dari laut dan merupakan koleksi dari BTCC
(Biotechnology Culture Collection). Isolat ini
memiliki koloni yang berwarna putih apabila
masih muda dan akan berwarna kuning di
pinggir koloni jika sudah tua (Rahmani et al.
2011).
Brevibacterium sp. memiliki bentuk sel
batang. Diameter koloni 0.6-1.2 x 1.5-6 µm.
Bakteri ini termasuk ke dalam bakteri gram
positif, aerob, tidak mampu bergerak dan
termasuk ke dalam katalase positif. Bakteri
Brevibacterium sp. yang berasal dari laut
tahan terhadap NaCl yang sangat tinggi.
Selain itu, bakteri ini juga dapat menghasilkan
enzim amilase secara ekstraseluler. Dengan
adanya substrat berupa pati yang menjadi
nutrisi metabolismenya, bakteri ini akan
mengeluarkan zat berupa enzim amilase untuk
memotong polisakarida pada pati menjadi gula
yang lebih sederhana seperti oligosakarida
(Rahmani et al. 2011).
Oligosakarida
Oligosakarida merupakan gula rantai
pendek dari polisakarida dengan 2 hingga 20
unit
sakarida.
Karakteristik
senyawa
oligosakarida
terdiri
atas
susunan
monosakarida antara lain glukosa, galaktosa,
xylosa, dan fruktosa. Oligosakarida memiliki

berat molekul lebih rendah dibawah
polisakarida (Manning 2004). Sebagian besar
oligosakarida berfungsi sebagai bahan pangan
prebiotik. Jenis dan senyawa prebiotiknya
dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Jenis sakarida dan senyawa prebiotik
lainnya
Kelompok
Senyawa Prebiotik
Polylol
Xylitol
Sorbitol
Mannitol
Disakarida
Laktulosa
Laktitol
Oligosakarida
Rafinosa
Fruktooligosakarida
Oligofruktosa
Galaktooligosakarida
Palatinosa
Isomaltooligosakarida
Laktosukrosa
Galaktosil-sukrosa
Polisakarida

Inulin
Pati resisten
Sumber: Suskovic et al. (2001)
Menurut Aiyer (2005) terdapat beberapa
oligosakarida turunan pati yang memiliki
banyak manfaat di bidang pangan, misalnya
maltosa banyak digunakan sebagai pemanis,
suplemen gula pada intravena. Sirup
maltotetrosa dijadikan sebagai pengganti
sukrosa yaitu dapat mengurangi manisnya
makanan tanpa mempengaruhi rasa dan
aroma, serta dapat menjaga kelembaban dalam
pangan. Selain itu, oligosakarida juga dapat
digunakan sebagai pangan fungsional yang
memiliki potensi besar untuk meningkatkan
kualitas bahan makanan, modifikasi rasa
makanan, dan karakter fisikokimia yang
menguntungkan bagi kesehatan konsumen.
Oligosakarida ditemukan secara alami
dalam buah-buahan, sayuran, susu, dan madu.
Oligosakarida banyak digunakan dalam
minuman, susu bubuk balita, permen, roti,
yoghurt, dan produk turunan susu (Marlis
2008). Ada juga oligosakarida campuran
(maltooligomer mix) yang diperoleh dari
pemecahan pati jagung dengan α-amilase, βamilase, dan pululanase. Komposisinya yaitu
terdiri atas 37.5% glukosa, 2.2% maltosa, dan
46.6% maltotriosa.
Oligosakarida dapat dimanfaatkan sebagai
bahan
pangan
prebiotik.
Prebiotik
didefinisikan sebagai komponen pangan yang
tidak tercerna dan memberikan keuntungan
pada inang melalui modulasi mikroflora (FAO

4

2007). Prebiotik menyebabkan mikroflora
yang bermanfaat bagi kesehatan dapat tumbuh
lebih baik dibandingkan mikroflora patogen.
Mikroflora tersebut terdapat di dalam usus
besar dan bermanfaat untuk pencernaan
misalnya Bifidobacterium spp., Eubacterium
spp., dan Lactobacilus spp. Mikroflora
tersebut akan bersaing dengan mikroflora
patogen yang terbawa masuk ke saluran
pencernaan melalui makanan (Roberfroid
2007).
Analisis Oligosakarida
Metode yang dikembangkan dalam analisis
karbohidrat adalah Kromatografi. Proses
kromatografi digunakan dalam metode
pemisahan komponen gula dari komponen non
gula menjadi fraksi-fraksi terpisah yang
diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi
dan eksklusi komponen gula dan non gula
tersebut terhadap adsorben dan eluen yang
digunakan. Jenis kromatografi yang biasa
digunakan dalam analisis gula-gula sederhana
adalah Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer
Cromatography, TLC) dan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (High Performance Liquid
Cromatography, HPLC) (Zou & Chen 2008).
TLC merupakan bentuk kromatografi
planar yang fase diamnya berupa lapisan yang
seragam (uniform) pada permukaan bidang
datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium atau pelat plastik Jel silika atau
alumina merupakan fase diam. Fase diam
untuk TLC seringkali juga mengandung
substansi yang dapat berpendar dalam sinar
ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa
digunakan adalah alumina-aluminium oksida
Fase gerak yang biasa digunakan berupa
senyawa cair seperti akuades, n-butanol, dan
asam asetat (Weston & Brokleblank 1999).
Selain TLC, kromatografi lainnya yaitu
HPLC yang mendasarkan analisis terhadap
keragaman struktur dan isomeric multiplicity.
Mekanisme pemisahan dilakukan dengan
interaksi hidrofilik, pertukaran ligan, size
exclusion, Deteksi HPLC dilakukan dengan
Deteksi Indeks Refraktif (Refractive Index
Detection, RID) atau Pulse-Amperometric
Detection (PAD) (Soga 2002). HPLC
merupakan
teknik
analisis
pemisahan
sekaligus penentuan kualitatif maupun
kuantitatif yang banyak digunakan pada
senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih
tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan
analisis secara kromatografi gas (Zou & Chen
2008).
Prinsip pemisahan HPLC sama dengan
prinsip kromatografi pada umumnya yaitu

berdasarkan pada perbedaan sifat dalam
distribusi kesetimbangan dari 2 komponen
yang berbeda fasenya (fase diam dan fase
gerak). HPLC terdiri dari fase diam dengan
permukaan aktifnya yang berupa padatan,
resin penukar ion, atau polimer berpori yang
ditempatkan pada kolom serta dialiri fase
gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu
pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada
temperatur rendah dengan adanya kompetisi 2
fase (gerak dan diam). Migrasi dari komponen
molekul akan sebanding dengan koefisien
distribusinya, maka komponen dengan
distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak
lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat
terpisah dari komponen yang distribusinya
rendah (Du & Chen 2009).
Setiap komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah
puncak pada kromatogram menyatakan jumlah
komponen,
sedangkan
luas
puncak
menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Komputer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja sistem HPLC dan
mengumpulkan serta mengolah data hasil
pengukuran HPLC (Zou & Chen 2008).
Terdapat beberapa perlakuan yang
dilakukan pada sampel sebelum dianalisis
dengan HPLC yaitu sampel dikeringbekukan
terlebih dahulu agar air atau senyawa-senyawa
pengotor yang terkandung dalam sampel tidak
mengganggu saat proses analisis. Proses yang
dapat dilakukan diantaranya freeze dry dan
vacuum evaporator. Proses ini juga bertujuan
sebagai bentuk sediaan bahan pangan yang
mengandung senyawa oligosakarida dalam
jumlah yang banyak.
Prinsip kerja freeze dry adalah pada
kondisi tekanan penguapan yang rendah, air
dapat diuapkan dari fase es tanpa membuat es
mancair. Prinsip penyubliman menjadi dasar
freeze dry ini, air akan tersublimasi pada suhu
0 derajat atau lebih rendah dan diletakkan
pada wadah dan tekanan 4,7 mmHg atau
kurang dari itu. Selain itu, prinsip utama
metode freeze-dry adalah menghilangkan
kandungan air suatu bahan sebanyak ± 98 (Du
& Chen 2009).
Metode pengeringan vaccum evaporator
dapat menghasilkan produk kering dengan
kualitas tinggi. Pada metode ini suhu atau
panas pada makanan dan laju penguapan air
dari bahan pangan dapat diatur. Panas
merambat pada bahan pangan melalui proses
radiasi dan konduksi. Setiap alat yang bekerja
dengan
prinsip
vaccum
evaporator
mempunyai 4 bagian alat yang penting yaitu

5

wadah vakum dengan konstruksi berat untuk
menahan tekanan air dari luar yang mungkin
melebihi tekanan di dalam, penyuplai panas,
sebuah alat untuk menghasilkan dan menjaga
kondisi vakum dan sebuah komponen untuk
mengumpulkan uap air yang diuapkan dari
bahan pangan (Du & Chen 1997).

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk
penelitian ini antara lain pati kentang hitam
varietas 2.12, isolat Brevibacterium sp. koleksi
Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi Puslit
Bioteknologi LIPI. Komposisi media cair prekultur dan kultur terdiri atas ekstrak khamir,
bacto pepton, ASW (Artificial Sea Water),
pati komersil (Merck) 2%, dan akuades. Untuk
media padat, komposisi media cair ditambah
agar 1.5%. Reagen dinitrosalisilat (DNS) yang
terdiri atas DNS murni, NaOH padat, dan
kalium natrium tartrat (KNa-tartrat) Merck.
Alkohol 70%, es batu, asam sulfat pekat,
Na2S, fenol 5%, dan bufer fosfat 2M pH 6.6.
Eluen atau fase gerak yang digunakan untuk
TLC yaitu n-butanol, asam asetat, dan akuades
dengan perbandingan 12:6:6. Adsorben atau
fase diam yang digunakan yaitu plat silica gel
60 F254 (Merck Art 20-20 cm). Standar yang
digunakan dalam TLC yaitu glukosa, maltosa,
maltotriosa, dan maltopentosa. Fase gerak
yang digunakan yaitu acetonitril dan akuades
steril dengan perbandingan 75:25 dan 60:40.
Standar yang digunakan untuk HPLC yaitu
glukosa,
maltosa,
maltotriosa,
dan
maltopentosa.
Adapun alat-alat yang digunakan antara
lain High Performance Liquid Cromatography
(HPLC), Laminar Air Flow, autoklaf,
inkubator goyang, evaporator, freeze dryer,
hair dryer, spektrofotometer UV-Vis,
sentrifus, hot plate, vortex, neraca analitik,
labu Erlenmeyer, falcon, gelas beker, kuvet,
tabung reaksi, gelas ukur, cawan petri, rak
tabung, sudip, tisu, bunsen, pipet mikro, pipet
tetes, pinset, tabung Eppendorf, tips,
aluminium foil, lemari pendingin, botol
semprot, kertas saring, tusuk gigi, membran
dialisis, baskom, penjepit membran, corong,
tabung sentrifugasi, botol Schott, labu ukur,
sarung tangan, dan masker.
Metode Penelitian
Metode penelitian terdiri atas empat tahap
yaitu tahap awal produksi ekstrak kasar enzim
amilase dari Brevibacterium sp., tahap kedua

proses reaksi hidrolisis pati kentang hitam
dengan enzim amilase. Selanjutnya tahap
ketiga dilakukan analisis TLC, gula reduksi,
dan gula total. Tahap keempat analisis profil
oligosakarida dengan HPLC (lampiran 1).
Produksi Ekstrak Kasar Enzim Amilase
dari Brevibacterium sp.
Sebelum penelitian, isolat Brevibacterium
sp. diremajakan kembali dengan cara
ditumbuhkan dalam media agar. Isolat
diinkubasi selama 96 jam pada suhu 30oC
dengan inkubator goyang 150 rpm (Rahmani
et al. 2011). Selanjutnya isolat yang sudah
diremajakan diinokulasi ke dalam media
prekultur dan kultur. Hasil kultur disentrifus
dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit
pada suhu 4oC. Setelah itu supernatan diambil
dan dipisahkan dengan peletnya. Ekstrak kasar
enzim amilase tersebut diuji aktivitasnya
dengan cara 0.25 mL larutan pati komersil
(Merck) ditambahkan dengan 0.5 mL ekstrak
kasar enzim amilase lalu divorteks dan
kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama
30 menit. Selanjutnya ditambahkan 0.75 mL
reagen DNS dan di vortex kembali. Setelah itu
dipanaskan di suhu 100oC selama 15 menit
dan kemudian didinginkan ke dalam es serta
diukur
absorbansinya
pada
panjang
gelombang =540 nm (Bernfeld 1λλ5).
Proses Reaksi Hidrolisis Pati Kentang
Hitam dengan Enzim Amilase
Hidrolisis substrat pati kentang hitam
dengan enzim amilase pada skala 1 Liter
dilakukan pada kondisi optimum berdasarkan
Rohanah (2012). Konsentrasi pati yang
digunakan sebesar 2.5%, waktu hidrolisis
selama 4 jam, perbandingan enzim dan
substrat 1:5, dan dilakukan pada suhu 30oC.
Pati kentang hitam sebanyak 25 gram
dilarutkan ke dalam akuades 1 L dan
dipanaskan pada suhu 80oC. Selanjutnya
ditambahkan enzim amilase yang memiliki
aktivitas sebesar 3.25 U/mL sebanyak 20 mL.
Substrat dan enzim tersebut kemudian
dihidrolisis selama 4 jam pada inkubator
goyang dengan kecepatan 150 rpm dan suhu
30oC. Sampel hasil reaksi hidrolisis tersebut
diberikan perlakuan dengan cara freeze dry
dan vacuum evaporator. Sampel sebanyak 1
Liter diberi perlakuan freeze dry pada tekanan
4.7 mmHg dan suhu -50oC. Perlakuan Freeze
dry dilakukan di Laboratorium PAU IPB.
Perlakuan vacuum evaporator sampel
sebanyak 1 Liter dilakukan pada suhu chiller
10oC, suhu water bath 65oC, dan tekanan 80
kPa. (Potter & Hotchkiss 1997).

6

Analisis Kimia Kandungan Karbohidrat
Identifikasi
komponen
kabohidrat
dengan TLC (Thin Layer Cromatography).
Plat silica gel 60 F254 (Merck Art 20-20 cm)
nm ukuran 10x20 cm diukur jarak 1 cm dari
bawah plat sebagai garis start dan 1 cm dari
atas sampel sebagai garis finish. Sampel
ditotolkan sebanyak 4µL pada plat TLC
menggunakan pipet mikro 10 µL. Eluen yang
digunakan adalah campuran n-butanol, asam
asetat, dan akuades dengan perbandingan
12:6:6. Standar yang digunakan yaitu glukosa,
maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa. Eluen
dikocok dan dijenuhkan selama 60 menit.
selanjutnya,
plat
TLC
dikeringkan
menggunakan hair dryer kemudian dilakukan
proses elusi. Setelah elusi selesai. Plat TLC
disemprot dengan larutan pewarna gula yaitu
0.5 gram α-difenilamin,25 ml aseton, 2.5 ml
asam fosfat, dan 0.5 ml anilin. Setelah kering,
plat TLC dipanaskan pada suhu 100oC selama
15 menit hingga terbentuk spot. Spot yang
terbentuk dihitung nilai Rf (Retention
factor)nya dengan rumus:
Rf =
Analisis Gula Total (modifikasi Dubois
et al. 1956). Analisis gula total diukur dengan
metode fenol-sulfat. Sebanyak 0.5 mL sampel
yang sudah diencerkan sebanyak 400 kali
ditambahkan 0.5 ml fenol 5% (b/v) dan 2.5 ml
asam sulfat pekat. Selanjutnya divorteks dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.
Kemudian dipanaskan dalam water bath pada
suhu 40oC selama 20 menit dan diukur
absorbansinya pada = 4λ0 nm. Hasil
absorbansi kemudian dimasukkan ke dalam
persamaan kurva standar glukosa.
Analisis Gula Pereduksi (modifikasi
Miller 1959). Sebanyak 10 µL sampel
ditambahkan 490 µL akuades kemudian
divorteks, selanjutnya ditambahkan 750 µL
larutan DNS dan divorteks kembali. Setelah
itu, dipanaskan pada suhu 100oC selama 15
menit sampai berubah warna. Kemudian
didinginkan di dalam es dan selanjutnya
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang =540 nm. Hasil absorbansi
kemudian dimasukkan ke dalam persamaan
kurva standar glukosa.
Derajat Polimerasi (Apriyantono et al.
1989).
Derajat
polimerasi
dihitung

berdasarkan perbandingan antara gula total
dan gula pereduksi.

Analisis Oligosakarida dengan HPLC
Penentuan kondisi optimum pada HPLC
dilakukan
pada
tiga
variabel
yaitu
perbandingan fase gerak, kecepatan alir, dan
konsentrasi sampel. Optimasi pertama
dilakukan pada perbandingan fase gerak
asetonitril:akuades sebesar 75:25 dengan
kecepatan alir sebesar 1.4 mL/min dan
perbandingan fase gerak asetonitril:akuades
sebesar 60:40 dengan kecepatan alir sebesar 1
mL/min. Fase gerak yang digunakan di filter
dan di degass terlebih dahulu. Sampel terdiri
atas sampel segar, sampel freeze dry dengan
optimasi konsentrasi 2.5%, 5%, dan 10% serta
sampel evaporasi dengan optimasi konsentrasi
2.5%, 5%, dan 10%. Detektor yang digunakan
yaitu Refractive Index Detector (RID) dan
kolom Zorbax SIL (silika) dengan dilapisi 3aminopropilen. Volume injek sebesar 10µL.
Standar yang digunakan yaitu glukosa,
maltosa, maltotriosa, dan maltopentaosa.
Standar dan sampel diinjek ke dalam kolom
sebanyak 10 µL hingga diperoleh data
komatogram pada komputer.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.
Produksi enzim amilase diawali dengan
meremajakan isolat Brevibacterium sp. Tujuan
dari peremajaan ini agar diperoleh isolat yang
segar sehingga bakteri Brevibacterium sp.
dapat optimal menghasilkan enzim amilase.
Isolat yang sudah diremajakan dimasukkan ke
dalam media prekultur dan kultur. Tujuan
prekultur dan kultur yaitu agar isolat dapat
beradaptasi dan sebagai stimulasi atau
rangsangan untuk menghasilkan enzim
amilase secara optimal. Media kultur bakteri
berubah dari kuning bening menjadi kuning
keruh. Hal tersebut merupakan salah satu ciri
adanya pertumbuhan dan sistem metabolisme
bakteri.
Keberadaan substrat berupa pati sebagai
satu-satunya sumber karbon dalam media akan
menginduksi sintesis enzim amilase. Enzim
amilase ekstrak kasar diproduksi sebanyak 1
liter dan setelah proses sentrifugasi diperoleh
volume enzim sebanyak 810 mL. Aktivitas
enzim amilase ekstrak kasar didapatkan

7

sebesar 3.25 U/mL yang berarti enzim amilase
tersebut dapat menghasilkan 3.25 mikromol
produk per menit. Rahmani et al. (2011)
menemukan bahwa Brevibacterium sp. yang
diisolasi dari Teluk Kamal mampu
menghasilkan enzim amilase dengan aktivitas
2.85 U/mL. Semakin tinggi aktivitas enzim
amilase maka semakin optimal enzim tersebut
memecah pati menjadi gula sederhana seperti
oligosakarida.
Enzim amilase ekstrak kasar tersebut
berasal dari bakteri laut, sehingga diperlukan
dialisis untuk menghilangkan garam-garam
berlebih yang kemungkinan berasal dari media
Artificial Sea Water (ASW). Dialisis
merupakan bagian dari proses pemurnian
enzim
menggunakan
membran
semipermiabel. Ekstrak kasar enzim amilase hasil
dialisis berwarna kuning jernih (Gambar 2).

Gambar 2 Ekstrak kasar enzim amilase dari
Brevibacterium sp.

Hasil Reaksi Hidrolisis Pati Kentang Hitam
dengan Enzim Amilase
Reaksi hidrolisis pati kentang hitam pada
kondisi optimum berdasarkan Rohanah
(2012). Pati kentang hitam berwarna putih
kecoklatan
kemudian
dilarutkan
dan
dipanaskan pada suhu 80°C selama 5 menit.
Sebelum dipanaskan, larutan pati tersebut
berwarna putih sedikit kecoklatan akibat
warna pati kentang hitam itu sendiri. Setelah
mengalami pemanasan pati menjadi lebih
coklat dan terlihat bahwa pati tersebut terlarut.
Setelah reaksi berlangsung selama 4 jam,
substrat berubah warna menjadi cokelat
bening karena warna cokelat terpengaruh dari
warna enzim dan substrat terlihat lebih encer,
seperti yang terlihat pada Gambar 3.
Hasil hidrolisis masih mengandung enzim
yang aktif. Kerja enzim dihentikan dengan
memanaskan hidrolisat pada suhu tinggi
supaya protein enzim terdenaturasi. Sampel
hasil hidrolisis mengandung oligosakarida

yang memiliki rantai pendek dan terlarut,
maka dilakukan sentrifugasi.

(a)

(b)

Gambar 3 Perbedaan warna dan kekentalan
substrat pati kentang hitam
sebelum ditambahkan enzim
amilase
(a)
dan
setelah
ditambahkan enzim amilase (b).
Sampel segar hasil hidrolisis sebanyak 1
Liter dikeringbekukan (freeze dry) pada
tekanan 10 µHg dengan suhu -50°C. Bobot
sampel setelah dikeringbekukan menjadi 2.1
gram. Sampel hasil freeze dry berupa padatan
berbentuk bubuk berwarna cokelat. Setelah
itu, sampel segar hasil hidrolisis sebanyak 1
Liter juga dipekatkan menggunakan vaccum
evaporator. Pemekatan dilakukan hingga
didapatkan sampel sebanyak 40 mL dalam
bentuk cairan kental. Pada sampel hasil
evaporasi, sampel berwarna kuning kecoklatan
akibat dari warna asli pati kentang hitam.
Tujuan dilakukan pemekatan dan pengeringan
beku adalah untuk menguapkan air yang
terkandung
dalam
sampel
sehingga
konsentrasi sampel menjadi lebih tinggi dan
hasil sampel yang berupa padatan akan
memudahkan proses analisis dan penyimpanan
dalam jumlah yang banyak. Sampel freeze dry
dan evaporasi dapat dilihat pada Gambar 4.

(a)

(b)

Gambar 4 Sampel hasil freeze dry (a) dan
sampel hasil evaporasi (b)

8

Supernatan hasil sentrifugasi selanjutnya
dianalisis. Terdapat tiga sampel untuk
dianalisis yaitu sampel segar hasil hidrolisis,
sampel freeze dry, dan sampel evaporasi.
Analisis sampel terdiri atas analisis profil
dengan TLC, analisis gula reduksi, dan
analisis gula total serta identifikasi dengan
HPLC.
Hasil Analisis TLC, Gula Reduksi, dan
Gula Total
Analisis profil oligosakarida pada sampel
hasil hidrolisis secara kualitatif salah satunya
yaitu dengan menggunakan kormatografi lapis
tipis. Glukosa digunakan sebagai standar
monosakarida dan maltosa, maltotriosa dan
maltopentosa digunakan sebagai standar
oligosakarida. Kromatogram TLC dapat
dilihat pada Gambar 5.

berturut-turut sebesar 0.50, 0.41, 0.35, dan
0.22. Nilai tersebut dipengaruhi oleh
pergerakan karbohidrat selama elusi. Bobot
molekul yang lebih besar akan mengalami
pergerakan lebih lama sehingga nilai Rf
semakin rendah. Pada sampel segar, sampel
freeze
dry,
dan
sampel
evaporasi
menghasilkan nilai Rf yang tidak jauh berbeda
dengan standar. Seperti nilai maltosa dan
maltotriosa pada ketiga sampel sebesar 0.41
dan 0.35 sama seperti nilai standar. Masingmasing nilai Rf standar dan sampel dapat
dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Rf spot standar gulkosa (Glu), maltosa
(Mal), maltotriosa (Mal3), dan
maltopentosa (Mal5) pada sampel
segar (SS), freeze dry (FD), dan
evaporasi (EV)
Retention factor
Spot

Glukosa
Maltosa
Maltotriosa
Maltopentosa

1

2

3

4

1

Gambar 5 Kromatogram TLC standar (1) yang
teridiri atas glukosa, maltosa,
maltotriosa, dan maltopentosa
pada sampel evaporasi (2), sampel
freeze dry (3), dan sampel segar
(4)
Sampel hasil hidrolisis secara keseluruhan
menunjukkan bahwa telah terjadi pemecahan
pati oleh enzim. Spot kromatogram sampel
hasil freeze dry dan evaporasi memiliki
ketebalan yang lebih jelas dibandingkan spot
kromatogram pada sampel segar. Hal ini
dikarenakan kedua sampel tersebut telah
mengalami pengeringan. Sampel yang sudah
dikeringkan lebih tebal karena air yang
terkandung pada sampel tersebut telah
mengalami
penguapan
sehingga
konsentrasinya lebih tinggi dan menghasilkan
spot lebih jelas.
Waktu retensi pada standar glukosa,
maltosa, maltotriosa, dan maltopentosa

Glu

Mal

Mal3

x

Mal5

Std

0.50

0.41

0.35

-

0.22

SS
FD

0.50
0.48

0.41
0.41

0.35
0.35

0.28
0.28

0.21
0.22

EV

0.50

0.41

0.35

0.30

0.22

Pada semua sampel menghasilkan lima
spot sementara standar yang digunakan hanya
empat, hal ini diperkirakan di dalam sampel
tersebut mengandung maltotetrosa yang
memiliki nilai Rf diantara maltotriosa dan
maltopentosa. Keempat spot yang muncul
pada sampel oligosakarida segar, sampel hasil
freeze dry, dan sampel hasil evaporasi
memiliki nilai Rf yang sama atau mendekati
nilai standar sehingga di dalam sampel
tersebut menunjukkan adanya senyawa
glukosa,
maltosa,
maltotriosa,
dan
maltopentosa. Setelah adanya profil sakarida
pada analisis TLC, selanjutnya dilakukan
analisis gula reduksi dan gula total agar dapat
diperoleh derajat polimerasi.
Pada sampel segar, hasil freeze dry, dan
evaporasi. Kandungan gula reduksi pada
sampel segar hasil hidrolisis sebesar 7485.5
ppm. Gula reduksi menunjukkan terbentuknya
gula sederhana seperti oligosakarida pada pati
kentang hitam yang terhidrolisis. Jumlah gulagula pereduksi dan non pereduksi pada sampel
dinyatakan dalam gula total yang terdapat
pada sampel. Kandungan gula total pada
sampel segar sebesar 95600 ppm. Derajat
polimerasi (DP) diperoleh dari perbandingan
gula total dan gula pereduksi. DP pada sampel
segar sebesar 12.776 artinya pada sampel

9

tersebut menghasilkan 12.776 polimer hasil
dari
degradasi
polisakarida
menjadi
oligosakarida atau gula sederhana yang
dipotong oleh enzim amilase tipe endo secara
acak.
Kandungan gula reduksi pada sampel hasil
freeze dry mengalami kenaikan yaitu sebesar
9647.5 ppm dengan kandungan gula total
sebesar 69000 ppm. DP yang dihasilkan lebih
baik yaitu sebesar 7.152. Pada sampel yang
diberi vacuum evaporator gula reduksinya
lebih meningkat menjadi 14908.3 ppm dengan
nilai gula total sebesar 69540 ppm. DP yang
diperoleh sebesar 4.664.
Sampel hasil hidrolisis setelah di freeze dry
dan evaporasi memiliki kandungan gula
reduksi lebih tinggi dikarenakan air yang
terkandung
pada
sampel
mengalami
penguapan dan sampel mengalami pemekatan
yang menyebabkan konsentrasinya menjadi
meningkat sehingga gula-gula sederhana lebih
banyak terbentuk. DP yang dihasilkan juga
lebih baik karena oligosakarida memiliki DP
lebih besar dari 2 dan kurang dari 10
(2