Identifikasi Dan Karakterisasi Substrat Antimikroba Dari Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Yang Diisolasi Dari Dadiah Dan Yogurt

IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI SUBSTRAT

ANTIMIKROBA DARI BAKTERI ASAM LAKTAT

KANDIDAT PROBIOTIK YANG DIISOLASI

DARI DADIAH DAN YOGURT

SKRIPSI NUR AMANAH

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011

RINGKASAN

Nur Amanah. D14063448. 2011. Identifikasi dan Karakterisasi Substrat Antimikroba dari Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik yang Diisolasi dari Dadiah dan Yogurt. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Pembimbing Utama : Dr. Ir. Rarah Ratih Adjie Maheswari, D.E.A. Pembimbing Anggota : Dra. Masniari Poeloengan, M.S.

Fermentasi menggunakan kultur starter Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan salah satu bentuk cara pengawetan paling tua yang dilakukan oleh manusia. Dadiah atau dadih adalah salah satu produk olahan susu kerbau yang difermentasi secara alami oleh bakteri asam laktat dan merupakan produk tradisional asal Sumatra Utara dan Sumatra Barat. Produk pangan yang difermentasi dengan BAL, di antaranya yogurt, pada beberapa tahun terakhir ini semakin banyak diperhatikan, sehubungan dengan kegunaannya sebagai pangan fungsional yang tidak hanya bertujuan untuk mengenyangkan, tetapi berpotensi untuk dapat dipromosikan bagi kesehatan manusia karena kehadiran BAL probiotik. Salah satu atribut penting suatu bakteri asam laktat digolongkan sebagai probiotik adalah kemampuan untuk memproduksi komponen antimikroba. Komponen antimikroba BAL memberikan perlindungan pada makanan dari kebusukan dan mikroorganisme patogen selama pengawetan, juga dalam saluran pencernaan manusia. Penelitian terdahulu telah berhasil mengisolasi Lactobacillus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01 dari dadiah dan Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01 (Maheswari, 2009) dan telah membuktikan kemampuan keempat isolat BAL tersebut bertahan dalam kondisi asam lambung, toleransi terhadap garam empedu serta antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol (Sunaryo, 2011). Salah satu syarat BAL asal dadiah dan yogurt dikelompokkan sebagai probiotik adalah kemampuannya untuk memproduksi substrat antimikroba yang bersifat antagonistik terhadap bakteri patogen, khususnya bakteriosin.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan identifikasi keberadaan substrat antimikroba yang dihasilkan isolat BAL asal dadiah (Lactobacillus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01) dan yogurt (Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01) meliputi asam organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin sebagai salah satu syarat pengelompokkannya ke dalam bakteri probiotik. Karakterisasi substrat antimikroba sebagai bakteriosin diuji melalui sifat stabilitasnya terhadap berbagai suhu, pH dan enzim proteolitik, serta sensitivitasnya terhadap ketiga bakteri patogen indikator (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enteritidis serotipe Typhimurium (S. Typhimurium) ATCC 14028 dan Escherichia coli ATCC 25922) dengan metode difusi sumur agar. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu Departemen IPTP, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Penelitian Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor mulai bulan Juni sampai bulan Oktober 2010.

Filtrat Bebas Sel (FBS) dari keempat isolat bakteri asam laktat yaitu L. plantarum D-01, L. lactis D-01, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 menunjukkan aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen indikator dengan

ii menghasilkan zona hambat di sekitar sumur difusi. Senyawa antimikroba yang dihasilkan diidentifikasi terdiri atas asam organik, hidrogen peroksida dan dibuktikan keberadaan bakteriosin melalui penurunan diameter zona hambat oleh aktivitas enzim proteolitik. Senyawa antimikroba dalam Filtrat Bebas Sel (FBS) dari spesies BAL yang berbeda nyata menghambat bakteri patogen S. Typhimurium ATCC 14028 dan Escherichia coli ATCC 25922 (P<0,01), serta Staphylococcus aureus ATCC 25923 (P<0,05). FBS dari L. lactis D-01 menghasilkan diameter penghambatan yang lebih kecil dibandingkan L. plantarum D-01, sedangkan FBS dari BAL asal yogurt B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 menghasilkan diameter penghambatan yang lebih besar dari BAL indigenous dadiah L. plantarum D-01 dan L. lactis D-01.

Substrat antimikroba dari keempat isolat BAL juga dinyatakan stabil selama penyimpanan pada (a) suhu ruang (25-30 oC) selama 5 hari, (b) suhu rendah (-18 dan 4 oC) dan (c) suhu pemanasan (63 oC-30 menit, 72 oC-15 detik dan pemanasan hingga 100 oC). Penghambatan substrat antimikroba terhadap bakteri patogen menjadi tidak stabil saat FBS dikondisikan pada pH yang berbeda, yaitu diameter zona hambat berkurang pada pH 5 dan tidak terdeteksi pada pH 7 dan pH 8. Diameter zona hambat tertinggi diperoleh pada pH 3. Perlakuan pemanasan dan penyimpanan pada suhu dan waktu yang berbeda menyebabkan adanya penurunan diameter zona hambat yang berbeda bila dibandingkan dengan kontrol yaitu FBS tanpa perlakuan. FBS dari isolat BAL yang berbeda menunjukkan kemampuan penghambatan terhadap BAL lainnya, yang mempertegas karakteristik bakteriosin yaitu mampu menghambat bakteri dengan kekerabatan yang dekat, meskipun besarnya penghambatan tidak berbeda secara signifikan (P>0,05).

Kata-kata kunci : identifikasi, karakterisasi, antimikroba, bakteri asam laktat, dadiah, yogurt.

ABSTRACT

Identification and Characterization of Antimicrobial Substrate Produced by Lactic Acid Bacteria Probiotic’s Candidate Isolated from Dadiah and Yogurt

Amanah, N., R. R. A. Maheswari, and M. Poeloengan

Probiotic has been defined as living microorganism that, when administered in adequate of amounts, confered a health benefit on the host. One of criterias that must be fulfilled by lactic acid bacteria as a probiotic is its ability to produce antimicrobial compounds that were capable inhibit toward pathogenic bacterias. Lactic acid bacteria (LAB) can be isolated from fermented milk. Maheswari (2008) isolated Lactobacillus plantarum D-01 and Lactococcus lactis D-01 from buffalo milk fermented called ‘dadiah’ traditionally produced by people from West and North Sumatra, and also isolated Bifidobacterium longum Y-01 and Lactobacillus acidophilus Y-01 from yogurt. Their potential as probiotic culture was interested to determine especially for their ability to produce antimicrobial substrate that inhibit pathogenic bacterias. Identification of nature and characterization of antimicrobial substrate produce by LABs tested for its stability at different pH and storage’s temperature, and proteolitic’s enzyme by agar well diffusion method. The culture supernatants inhibited toward Salmonella Ser. Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, and Staphylococcus aureus ATCC 25923. The supernatants showed an antimicrobial activity against phatogenic bacteria and identified as organic acid and hydrogen peroxide. The existance of proteinaceous antibacterial compound, which referred as bacteriosin, was proved through proteolityc activity on supernatants that resulted in decrease of zone inhibition diameters. Characterization determined that proteinaceous antibacterial compound was stable at room storage temperature within five days and at cold storage temperature within two weeks. Meanwhile, proteinaceous antibacterial compounds were not heat stable and not stable when adjusted in different pH, especially when adjusted in pH above 5. Four LABs tested could be considered as probiotic bacterias because all of LABs produced antimicrobial compounds consist of organic acid, hydrogen peroxide and bacteriosin that inhibited pathogenic indicator bacterias.

Keywords: identification, characterization, lactic acid bacteria, antimicrobial compounds

IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI SUBSTRAT

ANTIMIKROBA DARI BAKTERI ASAM LAKTAT

KANDIDAT PROBIOTIK YANG DIISOLASI

DARI DADIAH DAN YOGURT

NUR AMANAH D14063448

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada

Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011

Judul : Identifikasi dan Karakterisasi Substrat Antimikroba dari Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik yang Diisolasi dari Dadiah dan Yogurt Nama : Nur Amanah

NIM : D 14063448

Menyetujui,

Pembimbing Utama, Pembimbing Anggota,

(Dr. Ir. Rarah. R. A. Maheswari, DEA.) (Dra. Masniari Poeloengan, MS.) NIP. 19620504198703 2 002 NIP. 19510817 198103 2 001

Mengetahui Ketua Departemen,

Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

(Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.) NIP. 19591212198603 1 004

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 17 Agustus 1988 di Gresik. Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara, pasangan Syafarudin dan Bintrati Sri Utami. Riwayat pendidikan penulis dimulai dari Taman Kanak-Kanak Bhakti V Gresik (1992-1994), Sekolah Dasar Muhammadiyah I Gresik (1994-2000), MTs Pondok Pesantren Modern Islam Assalaam Solo (2000-2003), dan dilanjutkan ke Sekolah Menengah Atas Muhammadiyah I Gresik (2003-2006). Penulis kemudian masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur USMI (Ujian Masuk Seleksi IPB) pada tahun 2006 dan terdaftar sebagai mahasiswa pada Departemen Ilmu Produksi dan Tekonogi Peternakan, Fakultas Peternakan.

Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis aktif sebagai anggota organisasi himpunan daerah HIMASURYA. Penulis juga aktif dalam organisasi Himpunan Keprofesian HIMAPROTER (Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan) sebagai anggota divisi keprofesian periode 2007-2008 dan sekertaris divisi keprofesian merangkap sebagai anggota divisi animal breeding club periode 2008-2009, serta kepanitiaan kegiatan kampus lainnya. Penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Dasar Tekonolgi Hasil Ternak tahun ajaran 2008/2009, Ilmu dan Teknologi Pengolahan Susu dan Metodologi Rancangan Percobaan tahun ajaran 2009/2010. Penulis juga pernah mengikuti kegiatan pelatihan Hazard Analysis of Critical Control Point (HACCP) dan dinyatakan lulus bersertifikat pada tahun 2010.

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sebagai sarjana pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penelitian selama empat bulan dengan judul ”Identifikasi dan Karakterisasi Substrat Antimikroba dari Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik yang Diisolasi dari Dadiah dan Yogurt”, di bawah bimbingan Dr. Ir. Rarah Ratih Adjie Maheswari, DEA. dan dra. Masniari Poeloengan, MS.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis persembahkan kepada Sang Maha Pencipta, Pemilik dari segala ilmu, Allah Subhannahu Wata’ala karena limpahan nikmat, rahmat, dan karuniaNya yang lebih luas dari langit dan bumi sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya tulis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah mendukung baik secara moril maupun materil sehingga skripsi dengan judul ”Identifikasi dan Karakterisasi Substrat Antimikroba dari Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik yang Diisolasi dari Dadiah dan Yogurt” dapat diselesaikan.

Substansi skripsi ini terkait dengan karakteristik substrat antimikroba yang diproduksi oleh bakteri asam laktat yang telah diisolasi dari dadiah (olahan susu kerbau fermentasi) dan yogurt (olahan susu sapi fermentasi). Perkembangan teknologi saat ini lebih mengacu kepada penggunaan bahan tambahan pangan yang bersifat alami, termasuk di antaranya adalah bahan pengawet pangan. Proses fermentasi yang telah dilakukan dari jaman ke jaman merupakan salah satu cara pengawetan pangan, sehingga bakteri yang digunakan untuk fermentasi dapat disebut sebagai agen preservatif alami. Senyawa preservatif alami yang diproduksi oleh bakteri asam laktat dapat berupa substrat antimikroba yang dapat melawan bakteri patogen maupun mikroorganisme yang menyebabkan kebusukan pada pangan. Banyak penelitian telah berhasil mengidentifikasi senyawa antimikroba alami dari bakteri asam laktat. Studi tentang karakterisasi senyawa antimikroba bakteri asam laktat asal dadiah dan yogurt pada penelitian ini perlu dilakukan, sehingga dapat memberikan informasi salah satu kriteria BAL probiotik yaitu kemampuannya menghasilkan substrat antimikroba yang aktif menekan dan menghambat pertumbuhan patogen.

Penulis menyadari bahwa masih begitu banyak yang harus disempurnakan dalam penelitian maupun dalam penulisan skripsi ini. Semoga tulisan ini dapat menjadi sumber informasi dan digunakan sebagai bahan tafakkur kepada Allah SWT.

Bogor, Januari 2011

DAFTAR ISI

Halaman

RINGKASAN ... i

ABSTRACT ... iii

RIWAYAT HIDUP ... vi

KATA PENGANTAR ... vii

DAFTAR ISI ... viii

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 2

TINJAUAN PUSTAKA ... 3

Bakteri Asam Laktat ... 3

Probiotik ... 4

Dadiah ... 5

Antimikroba ... 6

Asam Organik ... 7

Bakteriosin ... 7

Hidrogen Peroksida ... 8

Enzim Proteolitik ... 9

Tripsin ... 9

Pepsin ... 10

Bakteri Patogen ... 10

Salmonella enteritidis ser. Typhimurium ... 11

Escherichia coli ... 11

Staphylococcus aureus ... 12

MATERI DAN METODE ... 13

Lokasi dan Waktu ... 13

Materi ... 13

Prosedur ... 13

Penelitian Pendahuluan ... 13

Preparasi Kultur Starter ... 13

Preparasi Bakteri Patogen ... 14

Penentuan Populasi BAL Indigenous Dadiah ... 14

Metode Hitungan Cawan ... 15

ix

Penelitian Utama ... 16

Identifikasi Substrat Antimikroba melalui Uji Konfrontasi antara Bakteri Asam Laktat asal Dadiah dan Yogurt dengan Bakteri Patogen Indikator ... 16

a. Asam Organik ... 17

Pengukuran pH ... 17

Total Asam Tertitrasi ... 17

b. Bakteriosin ... 18

Enzim Proteolitik ... 18

Uji Konfrontasi antar BAL ... 19

c. Hidrogen Peroksida ... 19

Karakterisasi Substrat Antimikroba melalui Pengujian Stabilitas Antimikroba pada Berbagai pH dan Suhu ... 19

Rancangan Percobaan ... 19

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22

Penelitian Pendahuluan ... 22

Uji Kemurnian Isolat Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Patogen Indikator ... 22

Penelitian Utama ... 25

Identifikasi Substrat Antimikroba melalui Uji Konfrontasi antara Bakteri Asam Laktat asal Dadiah dan Yogurt dengan Bakteri Patogen Indikator ... 26

Asam Organik ... 26

Bakteriosin ... 30

Pengujian Enzim Proteolitik ... 30

Konfrontasi FBS dari BAL dengan BAL Lainnya ... 34

Hidrogen Peroksida ... 35

Karakterisasi Substrat Antimikroba ... 36

Pengaruh Pengasaman pada Berbagai pH terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikroba dalam FBS terhadap Bakteri Patogen Indikator ... 37

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 37

Escherichia coli ATCC 25922 ... 38

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ... 39

Pengaruh Penyimpanan pada Suhu Rendah dan Waktu Simpan Berbeda terhadap Stabilitas Aktivitas Penghambatan Antimikroba dalam FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt terhadap Bakteri Patogen Indikator 41 S. Typhimurium ATCC 14028 ... 41

Escherichia coli ATCC 25922 ... 42

x Pengaruh Suhu Pemanasan Berbeda terhadap

Stabilitas Aktivitas Penghambatan Antimikroba dalam FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt terhadap

Bakteri Patogen Indikator ... 44

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 44

Escherichia coli ATCC 25922 ... 45

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ... 46

Pengaruh Lama Penyimpanan pada Suhu Ruang (27±1 oC) terhadap Stabilitas Aktivitas Penghambatan Antimikroba dalam FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt terhadap Bakteri Patogen Indikator 48

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 48

Escherichia coli ATCC 25922 ... 49

Staphylococcus aureus ATCC 25923 ... 51

KESIMPULAN DAN SARAN ... 53

Kesimpulan ... 53

Saran ... 53

UCAPAN TERIMA KASIH ... 54

DAFTAR PUSTAKA ... 55

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman 1. Karakteristik Isolat Bakteri Asam Laktat ... 24 2. Karakteristik Morfologi Bakteri Uji ... 25 3. Aktivitas Antagonistik BAL Dadiah dan Yogurt terhadap Bakteri

Patogen Indikator ... 26 4. Nilai pH dan TAT (total asam tertitrasi) masing-masing Isolat BAL 27 5. Standar Antibiogram Berdasarkan Zona Penghambatan Antibiotik .. 29 6. Rataan Diameter Penghambatan Filtrat Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt yang Mendapat Perlakuan Enzim Protease Berbeda

terhadap S.Typhimurium ATCC 14028 ... 31 7. Rataan Diameter Penghambatan Filtrat Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt yang Mendapat Perlakuan Enzim Protease Berbeda

terhadap E. coli ATCC 25922 ... 32 8. Rataan Diameter Penghambatan Filtrat Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt yang Mendapat Perlakuan Enzim Protease Berbeda

terhadap S.aureus ATCC 25923 ... 32 9. Rataan Diameter Zona Hambat antar BAL ... 34 10.Stabilitas Aktivitas Penghambatan FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt pada pH Berbeda terhadap S.Typhimurium ATCC 14028 ... 37 11.Stabilitas Aktivitas Penghambatan FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt pada pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 38 12.Stabilitas Aktivitas Penghambatan FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt pada pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 39 13.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt

setelah Pendinginan pada Suhu dan Lama Penyimpanan Berbeda

terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 41 14.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt

setelah Pendinginan pada Suhu dan Lama Penyimpanan Berbeda

terhadap E. coli ATCC 25922 ... 42 15.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan Yogurt setelah Pendinginan pada Suhu dan Lama Penyimpanan Berbeda

xii 16.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt setelah Pemanasan pada Suhu Berbeda terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 45 17.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt setelah Pemanasan pada Suhu Berbeda terhadap E. coli

ATCC 25922 ... 46 18.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt setelah Pemanasan pada Suhu Berbeda terhadap S. aureus

ATCC 25923 ... 47 19.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt selama Penyimpanan pada Suhu Ruang terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 48 20.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt selama Penyimpanan pada Suhu Ruang terhadap

E. coli ATCC 25922 ... 50 21.Rataan Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL Dadiah dan

Yogurt selama Penyimpanan pada Suhu Ruang terhadap

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman 1. Metode Pengukuran Zona Hambat ... 17 2. Produksi Gas H2O2 oleh Keempat Isolat BAL asal Dadiah dan Yogurt 36

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman 1. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 61 2. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028 ... 61 3. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL terhadap

E. coli ATCC 25922 ... 61 4. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap E.coli ATCC

25922 ... 61 5. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat BAL terhadap

S. aureus ATCC 25923 ... 61 6. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap S. aureus

ATCC 25923 ... 62 7. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. plantarum

D-01pada perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 62 8. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. plantarum D-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 62 9. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. lactis D-01

pada perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 62 10. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. lactis D-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 62 11. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat B. longum Y-01

pada perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 .... 63 12. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat B. longum Y-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 63 13. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. acidophilus

Y-01 pada perlakuan enzim terhadap S. Typhimurium ATCC

14028 ... 63 14. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat Lactobacillus acidophilus

xv 15. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. plantarum

D-01 pada perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 63 16. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. plantarum D-01 pada

perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 64 17. Uji Kruskal Wallis Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. lactis D-01

pada perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 64 18. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat B. longum Y-01

pada perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 64 19. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat B. longum Y-01 pada

perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 64 20. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. acidophilus

Y-01 pada perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 65 21. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. acidophilus Y-01 pada

perlakuan enzim terhadap E. coli ATCC 25922 ... 65 22. Uji Kruskal Wallis Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. plantarum

D-01 pada perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 65 23. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. lactis D-01

pada perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 65 24. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. lactis D-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 66 25. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat B. longum Y-01

pada perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 66 26. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat B. longum Y-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 66 27. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS Isolat L. acidophilus

Y-01 pada perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 66 28. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. acidophilus Y-01 pada

perlakuan enzim terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 67 29. Analisis Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum

D-01 terhadap isolat BAL lainnya ... 67 30. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 terhadap

xvi 31. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01

terhadap isolat BAL lainnya ... 67 32. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

terhadap isolat BAL lainnya ... 67 33. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 68 34. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. plantarum D-01 pada

pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 68 35. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada

pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 68 36. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. lactis D-01 pada pH

Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 68 37. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01 pada

pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 68 38. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat B. longum Y-01 pada pH

Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 69 39. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 69 40. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. acidophilus Y-01 pada

pH Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 69 41. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada pH Berbeda terhadap Escherichia coli ATCC 25922 ... 69 42. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat L. plantarum D-01 pada

pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 70 43. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada

pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 70 44. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. lactis D-01 pada

pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 70 45. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01 pada

pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 70 46. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL B. longum Y-01 pada

xvii 47. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 71 48. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. acidophilus Y-01

pada pH Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 71 49. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 71 50. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. plantarum D-01

pada pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 72 51. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada

pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 72

52. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. lactis D-01 pada

pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 72 53. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01 pada

pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 72 54. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL B. longum D-01 pada

pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 73 55. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 73 56. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. acidophilus Y-01

pada pH Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 73 57. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 73

58. Uji Kruskal Wallis Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada Penyimpanan Dingin Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC

14028 ... 74 59. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01 pada

Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. Typhimurium

ATCC 14028 ... 74 60. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 74

xviii 61. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS Isolat BAL L. acidophilus Y-01

pada Penyimpanan Dingin Berbeda terhadap S.Typimurium ATCC 14028 ... 74 62. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap E. coli ATCC

25922 ... 75 63. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada

Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 75 64. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01 pada

Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 75 65. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap E. coli ATCC

25922 ... 75 66. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. plantarum D-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. aureus

ATCC 25923 ... 75 67. Uji Kruskal Wallis Diameter Zona Hambat FBS L. lactis D-01 pada

Penyimpanan Dingin Berbeda terhadapS. aureus ATCC 25923 .... 76 68. Uji Kruskal Wallis Diameter Zona Hambat FBS B. longum Y-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. aureus

ATCC 25923 ... 76 69. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS L. acidophilus Y-01

pada Penyimpanan Suhu Rendah Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 76 70. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Pemanasan

Berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 76 71. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS BAL pada Pemanasan Berbeda

terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 77 72. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Pemanasan

Berbeda terhadap E. coli ATCC 25922 ... 77 73. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Pemanasan

Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 77 74. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Hari Simpan

xix 75. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS BAL pada Hari Simpan Berbeda

(H0-H5) terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 ... 78

76. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Hari simpan Berbeda (H0-H5) terhadap E. coli ATCC 25922 ... 79

77. Hasil Uji Tukey Konfrontasi FBS BAL pada Hari Simpan Berbeda (H0-H5) terhadap E. coli ATCC 25922 ... 79

78. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat FBS BAL pada Hari simpan Berbeda terhadap S. aureus ATCC 25923 ... 80

79. Penghambatan FBS dari Isolat BAL terhadap Bakteri Patogen Indikator ... 80

80. Penghambatan FBS isolat BAL Isolat pada perlakuan penambahan enzim terhadap Bakteri Patogen Indikator ... 82

81. Penghambatan Keempat Isolat BAL terhadap BAL lain ... 83

82. Komposisi de Man Rogosa Sharp Broth (MRS-B) ... 84

83. Komposisi Mueller Hinton Agar (MHA) ... 85

84. Komposisi Nutrient Broth (NB) ... 85

85. Komposisi MERCK Natrium/Sodium Chloride (NaCl) ... 85

86. Komposisi OXOID LP0011 Agar Bacteorogical (Agar No.1) ... 86

PENDAHULUAN Latar Belakang

Perkembangan teknologi dalam bidang pangan saat ini mendorong industri pangan untuk tidak hanya memproduksi pangan yang bersifat mengenyangkan, namun juga menghasilkan pangan yang bermanfaat bagi kesehatan konsumen, yang biasa dikenal sebagai pangan fungsional. Produk pangan fungsional bisa didapatkan dari pengolahan pangan dengan metode fermentasi. Fermentasi berbagai jenis makanan menggunakan bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu bentuk cara pengawetan paling tua yang dilakukan oleh manusia. Salah satu produk olahan susu kerbau yang difermentasi secara alami oleh bakteri asam laktat dan merupakan produk tradisional asal Sumatra Barat atau Sumatra Utara adalah dadih atau dadiah (Maheswari, 2008). Pengolahan dadiah secara tradisional masih belum terkontrol sehingga rentan akan kontaminasi oleh bakteri patogen. Metode pengolahan secara terkontrol diperlukan agar dapat meningkatkan kualitas produk tradisional dadiah tersebut, salah satunya dengan menambahkan kultur starter pada pembuatan dadiah. Kajian karakteristik kultur starter dadiah sebagai kandidat bakteri probiotik akan memberikan informasi yang berharga untuk menegaskan bahwa dadiah dapat digolongkan sebagai pangan fungsional yang dapat dikonsumsi secara luas oleh khalayak, sekaligus memberikan nilai tambah bagi produk susu fermentasi tradisional Indonesia.

Bakteri Asam Laktat (BAL) termasuk salah satu mikroorganisme yang biasa ditambahkan pada produk pangan fermentasi yang memiliki peranan untuk menjaga kesehatan saluran pencernaan, baik pada manusia ataupun hewan. Keragaman spesies dari starter BAL digunakan pada berbagai proses teknologi berbeda untuk menyediakan banyak jenis produk susu fermentasi. Pertumbuhan dan aktivitas BAL juga mempunyai efek penghambatan pada bakteri pembusuk maupun bakteri patogen, sebagai contoh Salmonella enteritidis ser. Typhimurium, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus (Nes dan Johnsborg, 2004; Rossland et al., 2003). Studi terhadap komponen aktif yang dihasilkan BAL, pada beberapa tahun terakhir ini semakin banyak dilakukan, sehubungan dengan kegunaannya sebagai pengganti bahan-bahan pengawet kimia pada produksi pangan yang bertujuan untuk memperpanjang umur simpan produk.

2 Probiotik menarik untuk diberi perhatian karena potensinya yang dapat dipromosikan bagi kesehatan manusia dan hewan. Beberapa efek positif dari probiotik pada manusia adalah menjaga dari infeksi saluran pencernaan, pengurangan laktosa intoleran, mengurangi sembelit, efek antikarsinogen, efek antikolestrolemik, sintesis nutrien, mencegah infeksi di saluran urin, dan kelamin dan efek stimulasi imun tubuh. Salah satu atribut penting suatu bakteri digolongkan sebagai probiotik adalah kemampuan untuk memproduksi komponen antimikroba. Komponen antimikroba BAL memberikan perlindungan pada makanan dari kebusukan dan mikroorganisme patogen melalui produksi asam organik, hidrogen peroksida, diasetil, komponen anti jamur seperti asam laktat atau asam fenulaktik dan bakteriosin.

Hasil isolasi BAL indigenous dadiah (Lactobacillus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01) dan asal yogurt (Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01) yang berperan dalam proses fermentasi dadih berhasil diperoleh Maheswari (2008) dan telah terbukti memiliki ketahanan dan toleransi hidup pada kondisi keasaman lambung yang berbeda, adanya garam empedu dan antibiotik kloramfenikol atau amoksisilin ditunjukkan oleh jumlah bakteri yang hidup adalah lebih dari 75% (Sunaryo, 2011). Keempat isolat BAL tersebut menarik untuk diteliti lebih lanjut mengenai kemampuannya dalam menghasilkan substrat antimikroba yang dapat memperpanjang masa simpan atau sebagai salah satu alternatif bahan pengawet alami pangan, khususnya bakteriosin.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kemampuan isolat BAL indigenous dadiah (Lactobacillus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01) dan asal yogurt (Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01) dalam memproduksi senyawa antimikroba yang meliputi asam organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin sebagai salah satu syarat dari kandidat bakteri probiotik. Karakterisasi substrat aktif sebagai bakteriosin diuji melalui stabilitasnya terhadap berbagai suhu dengan lama penyimpanan berbeda, pH yang berbeda dan enzim proteolitik berbeda dan sensitivitasnya terhadap ketiga bakteri patogen (Salmonella enteritidis ser. Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923).

3 TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Asam Laktat

Penggunaan bakteri asam laktat sebagai kultur starter dalam produksi daging fermentasi, produk-produk susu serta sayuran dan buah-buahan adalah salah satu metode pemrosesan pangan tertua yang digunakan untuk menstabilkan produk-produk pangan tersebut hingga diperoleh citarasa yang spesifik. Bakteri asam laktat juga disebut sebagai biopreservatif karena berkontribusi dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain khususnya patogen dan mampu membawa dampak positif bagi kesehatan manusia (Smid dan Gorris, 2007).

Bakteri asam laktat digunakan secara alami pada makanan fermentasi sehubungan dengan timbulnya cita rasa asam (asidifikasi) akibat dari produksi asam laktat dan asetat. Efek asam tersebut diakibatkan adanya konversi karbohidrat selama fermentasi. Hal tersebut merupakan karakteristik penting guna memperpanjang masa simpan dan keamanan produk (Vuyst dan Vandamme, 1994). Perlindungan makanan dari kebusukan dan mikroorganisme patogen oleh bakteri asam laktat (BAL) adalah melalui produksi asam organik, hidrogen peroksida, diasetil (Messens dan De Vugst, 2002), komponen anti jamur seperti asam laktat (Corsetti et al., 1998) atau asam fenulaktik (Lavermicocca et al., 2000) dan bakteriosin (Vuyst dan Vandamme, 1994).

Bakteri asam laktat mempunyai karakteristik morfologi, fisiologi dan metabolit tertentu. Deskripsi secara umum dari bakteri ini adalah termasuk dalam bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk bulat maupun batang, dan menghasilkan asam laktat sebagai mayoritas produk akhir selama memfermentasi karbohidrat (Axelsson, 1998). Bakteri asam laktat terbagi menjadi delapan genus antara lain Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium dan Corinobacterium. Berdasarkan tipe fermentasinya, bakteri asam laktat terbagi menjadi heterofermentatif dan homofermentatif. Kelompok homofermentatif menghasilkan asam laktat sebagai produk utama dari fermentasi gula, sedangkan kelompok heterofermentatif menghasilkan asam laktat dan senyawa lain yaitu CO2, etanol, asetaldehida, diasetil,

4 Bakteri asam laktat memproduksi berbagai komponen bermassa molekul rendah termasuk asam, alkohol, karbon dioksida, diasetil, hidrogen peroksida dan metabolit lainnya. Banyak metabolit mempunyai spektrum aktivitas yang luas melawan spesies lain dan produksi tersebut dipengaruhi secara luas oleh matriks makanan itu sendiri (Helander et al., 1997). Satu atribut penting dari bakteri asam laktat adalah kemampuannya memproduksi komponen antimikroba, khususnya bakteriosin yang potensial menjadi biopreservatif menggantikan pengawet kimiawi pada bahan makanan guna memperpanjang umur simpan produk. Kemampuan bakteriosin dalam melakukan aktivitasnya sebagai biopreservatif dicapai oleh efek penghambatannya terhadap mikroorganisme patogen yang berbahaya (Savadogo et a., 2006).

Probiotik

Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang dikonsumsi untuk memperbaiki secara keseimbangan mikroflora usus. Keseimbangan yang baik dalam ekosistem mikrobiota usus dapat menguntungkan kesehatan konsumen kita dan dapat dipengaruhi oleh konsumsi probiotik setiap hari. Pada saat ini ilmu pengetahuan dan teknologi dalam ilmu fisiologi human maupun mikroorganisme memungkinkan dengan tepat penentuan kriteria seleksi mikroorganisme dan yang secara ilmiah membuktikan aktivitasnya bagi promosi kesehatan. Kemampuan probiotik ini tidak terikat pada spesies, melainkan pada strain tertentu dalam suatu spesies. Karakterisitik probiotik yang diinginkan dari satu strain spesifik, misalnya:

1. Mempunyai kapasitas untuk bertahan hidup (survive), untuk melakukan kolonisasi (colonize), serta melakukan metabolisme (metabolize) dalam saluran cerna.

2. Mampu mempertahankan suatu keseimbangan mikroflora usus yang sehat melalui kompetisi dan inhibisi kuman-kuman patogen.

3. Dapat menstimulasi bangkitnya pertahanan imunitas, bersifat non-patogenik, dan non-toksik.

4. Harus mempunyai karakteristik teknologik yang baik, yaitu mampu bertahan hidup secara optimal dan stabil selama penyimpanan (storage) dan penggunaan (use) dalam bentuk preparat makanan yang didinginkan dan

5 dikeringkan, agar dapat disediakan secara massal dalam industri (Lisal, 2005).

Penggunaan mikroba hidup (probiotik) dalam proses fermentasi susu awalnya digunakan sebagai upaya untuk mencegah pertumbuhan jamur dan mengawetkan susu dan bukan dengan pertimbangan kesehatan. Campur tangan manusia berupa seleksi kelayakan konsumsi akhirnya menghasilkan beberapa jenis susu fermentasi, sehingga munculah produk-produk susu fermentasi tradisional di antaranya yogurt, koumis, kefir dan dadih.

Susu fermentasi sebagai probiotik efektif sangat dibutuhkan pada berbagai kondisi lingkungan dan kepentingan, sehingga mikroba yang digunakan sebagai probiotik yang efektif harus memiliki sifat-sifat sebagai berikut: 1) dapat bertahan hidup selama persiapan sampai produksi dengan skala industri; 2) stabil dan tetap hidup dalam jangka waktu lama pada periode penyimpanan dan kondisi lapangan; 3) dapat bertahan hidup, mampu bersaing, tidak hanya sekedar tumbuh dalam saluran pencernaan; dan 4) mampu menimbulkan efek yang menguntungkan bagi inang (Wahyudi dan Samsundari, 2008).

Dadiah

Dadiah merupakan produk susu fermentasi tradisional seperti yoghurt yang umumnya terdapat di daerah Sumatera Barat, yang proses pembuatannya sangat sederhana. Susu yang digunakan berasal dari susu kerbau yang diperah kemudian dimasukkan ke dalam tabung bambu dan ditutup dengan daun pisang atau plastik, selanjutnya dibiarkan atau difermentasi secara alami dalam suhu ruang selama satu hingga dua hari sehingga terbentuk gumpalan. Secara umum dadih mempunyai citarasa yang khas yaitu asam dan berwarna putih kekuning-kuningan, serta kental dengan aroma khas (percampuran aroma susu dan bambu) (Suryono, 2003).

Dadih yang diproduksi di Sumatera Barat dibuat dengan bahan dasar susu kerbau dengan mengandalkan jasad renik yang ada di alam sebagai inokulan atau tanpa menggunakan kultur starter tambahan. Mikroba diperkirakan dapat berasal dari daun pisang sebagai penutup bambu dan dari susu itu sendiri (Yudoamijoyo et al., 1983) serta dapat juga dari tabung bambu yang digunakan (Zakaria et al.,1998).

6 Antimikroba

Senyawa antimikroba adalah senyawa kimiawi atau biologis yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Komponen antimikroba terdapat dalam bahan pangan melalui salah satu dari berbagai cara, yaitu terdapat secara alamiah di dalam bahan pangan, ditambahkan secara sengaja ke dalam makanan dan terbentuk selama pengolahan atau oleh jasad renik yang tumbuh selama fermentasi pangan (Fardiaz, 1992). Suatu preservatif untuk memperpanjang masa simpan produk pangan harus memenuhi kriteria antara lain: 1) tidak mengubah flavor, bau dan tekstur bahan pangan, aman bagi konsumen dan efektif sebagai preservatif atau aman untuk dikonsumsi selama masa simpan tertentu; 2) preservatif harus mudah dikenali dan kadarnya dapat dipastikan secara pasti serta harus memenuhi kebutuhan yang diizinkan; 3) kualitas bahan pangan tidak merugikan konsumen; 4) ekonomis (Soeparno, 1994); dan 4) tidak menyebabkan timbulnya galur resisten dan diutamakan bersifat membunuh daripada hanya menghambat pertumbuhan mikroba (Frazier dan Westhoff, 1988).

Senyawa antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan mikroba), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang) dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, misalnya konsentrasi zat pengawet, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), sifat-sifat fisik dan kimia makanan, termasuk kadar air, pH, serta jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992).

Metabolit yang bersifat antimikrobial yang diproduksi oleh BAL dapat dibagi menjadi dua grup: 1) komponen bermassa molekul rendah (<1000 Da), misalnya asam organik yang mempunyai spektrum aksi yang luas dan 2) protein antimikrobial, dikenal sebagai bakteriosin (>1000 Da) yang secara relatif mempunyai aksi spesifik melawan organisme lain yang mempunyai hubungan dekat dan bakteri Gram positif lainnya (Collado et al., 2010).

7 Asam Organik

Asam organik (asetat, laktat, malat, sitrat dan sebagainya) merupakan substansi alami dari berbagai jenis makanan. Aksi antimikroba dari asam organik berdasarkan pada kemampuannya untuk menurunkan pH dalam pangan yang berfase air. Asam organik dalam pangan dapat berfungsi sebagai asidulan atau pengawet, sementara garamnya atau ester dapat menjadi antimikroba yang efektif pada pH yang mendekati netral. Asam laktat adalah produk utama pada pangan hasil fermentasi. Asam asetat, propionat, malat dan asam-asam lain dengan konsentrasi yang beragam juga dihasilkan tergantung jenis produk dan mikroorganisme yang digunakan (Roller, 2003).

Asam organik yang dihasilkan selama proses fermentasi pangan dapat menghambat banyak mikroorganisme melalui penurunan pH dan beraksi langsung sebagai antimikroba dalam bentuk yang tidak terdisosiasi. Produksi asam pada pangan hasil fermentasi bergantung pada bakteri asam laktat, terutama jenis Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus dan Leuconostoc. Asam organik dapat berfungsi sebagai asidulan pangan, flavoring dan pengawet sehingga akan meningkatkan pengawasan terhadap bakteri patogen dan meningkatkan umur simpan (Roller, 2003).

Mekanisme penghambatan bakteri oleh asam-asam organik berhubungan dengan keseimbangan asam-basa, penambahan proton dan produksi oleh energi sel. Keseimbangan asam-basa pada sel mikroba ditunjukkan dengan pH yang mendekati normal. Interaksi dengan senyawa kimia akan mengganggu keseimbangan asam-basa dan mengakibatkan kerusakan sel. Protein, asam nukleat dan fosfolipid dapat rusak oleh perubahan pH. Ketersediaan ion-ion logam akan mengganggu permeabilitas membran, karena membran kurang permeabel terhadap ion dibandingkan dengan molekul yang tidak bermuatan. Perubahan permeabilitas membran akan menghasilkan efek ganda, yaitu mengganggu transpor nutrisi ke dalam sel dan menyebabkan metabolit internal keluar dari sel (Davidson dan Branen, 1993).

Bakteriosin

Bakteriosin merupakan protein aktif biologikal atau kompleks protein yang menunjukkan aksi bakteri, biasanya berhubungan dengan spesiesnya. Bakteriosin pada umumnya dihasilkan oleh beberapa bakteri asam lakat telah banyak dilaporkan.

8 Beberapa strain bakteriosin yang diproduksi Lactobacillus plantarum sudah diisolasikan pada dua dekade terakhir dari lingkungan/ekologikal yang berbeda, termasuk ikan, buah, sayuran dan produk susu dan gandum.

Strain bakteri asam laktat menghasilkan komponen antimikroba yang tahan panas yang telah dibuktikan sebagai protein di alam, sehingga diperkenalkan sebagai bakteriosin. Bakteriosin aktif pada rentang pH yang luas dan melakukan penghambatan beberapa jumlah bakteri Gram positif termasuk Listeria ivanovii dan beberapa strain akteri patogen (Oh et al., 2000). Bakteriosin telah dikelompokkan pada tiga kelas utama berdasarkan komponen genetik dan kimianya (Klaenhamer et al., 1992). Kelas pertama adalah lantibiotik, yang terdiri atas peptida-peptida kecil dengan residu yang dikeringkan atau dimodifikasi seperti dehydroalanine dan lanthionine (Klaenhamer, 1993). Kelas kedua mencakup bakteriosin yang kecil dan stabil terhadap panas seperti pediocin A, leucocin A, lactacin F, lactococcins, carnobacteriocin A, BM1 dan BM2 (Jack et al., 1995). Kelas ketiga terdiri atas bakteriosin yang kecil dan kurang tahan terhadap panas seperti helveticin J (Klaenhamer et al., 1992).

Mekanisme aktivitas bakterisidal dari bakteriosin secara umum sebagai berikut (1) molekul bakteriosin mengalami kontak langsung dengan membran sel; (2) proses kontak ini mengganggu potensial membran berupa destabilisasi depolasrisasi membran sitoplasma, sehingga sel tidak mampu bertahan. Ketidakstabilan membran memberikan dampak pembentukan lubang atau pori pada membran sel melalui proses gangguan terhadap proton motive force (PMF) (Gonzalez et al., 1996).

Bakteriosin dapat bekerja pada bakteri patogen spesifik tanpa mengganggu mikrobiota yang menguntungkan. Bakteriosin bisa dianggap antibiotik, tetapi berbeda dari antibiotik yaitu : (a) bakteriosin disintetis pada ribosom, b) sel inang kebal terhadap bakteriosin, c) mode aksinya berbeda dari antibiotik, dan d) daya hambatnya sempit sehingga hanya mampu melawan bakteri yang berhubungan dekat dengan strainnya (Ouwehand dan Vesterlund, 2004).

Hidrogen Peroksida

Bakteri asam laktat memproduksi hidrogen peroksida di bawah kondisi pertumbuhan aerob dan berkurangnya katalase selular, pseudokatalase atau

9 peroksidase. Bakteri asam laktat mengekskresikan H2O2 tersebut sebagai alat

pelindung diri yang mampu bersifat bakteriostatik maupun bakterisidal. Hidrogen peroksida merupakan salah satu agen pengoksidasi yang kuat dan dapat dijadikan sebagai zat antimikroba melawan bakteri, fungi bahkan virus (Ray dan Bhunia 2008). Kemampuan bakterisidal dari H2O2 beragam tergantung pH, konsentrasi suhu, waktu

dan tipe serta jumlah mikroorganisme. Pada kondisi tertentu, spora bakteri ditemukan paling resisten terhadap H2O2, diikuti dengan bakteri Gram positif, bakteri

yang paling sensitif terhadap H2O2 adalah bakteri Gram negatif, terutama koliform

(Ouwehand dan Vesterlund, 2004).

Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan oksidator, bleaching agent dan anti

bakteri. Hidrogen peroksida murni tidak berwarna, berbentuk cairan seperti sirup dan memiliki bau yang menusuk. Kemampuan H2O2 untuk mengoksidasi

menyebabkan perubahan tetap pada sistem enzim sel mikroba sehingga digunakan sebagai antimikroba. Senyawa ini juga dapat terdekomposisi menjadi air dan oksigen. Perubahan kondisi lingkungan seperti pH dan suhu mempengaruhi kecepatan dekomposisi H2O2. Peningkatan suhu dapat meningkatkan keefisienan

dalam menghancurkan bakteri, sehingga kecepatan terdekomposisinya juga semakin cepat (Branen, 1993).

Enzim Proteolitik

Enzim proteolitik atau yang sering disebut dengan protease merupakan berbagai jenis enzim yang mencerna protein menjadi unit-unit yang lebih kecil dengan enzim secara umum bertugas sebagai katalisator dengan cara menurunkan energi aktivasi di dalam sel, bersifat khas (Murray, 2006) dan sebagai katalis pada pemecahan molekul protein dengan cara hidrolisis (Poedjiadi, 1994). Oleh karena yang dipecah adalah ikatan pada rantai peptida, maka enzim tersebut dinamakan peptidase. Enzim-enzim ini meliputi protease-protease pankreas, khimotripsin dan tripsin, bromelin, papain, fungal protease dan Serratia peptidase (Murray, 2006). Tripsin

Tripsin (EC 3.4.21.4) merupakan famili serin protease yang memecah protein pada gugus karboksil dari asam amino lisin dan arginin, kecuali protein tersebut diikuti oleh prolin. Tripsin dihasilkan oleh pankreas dalam bentuk tripsinogen yang tidak aktif. Tripsinogen tersebut kemudian disekresikan ke usus kecil, tempat enzim

10 enterokinase mengaktifkannya menjadi tripsin (Poedjiadi, 1994). Tripsin dapat mengaktivasi banyak tripsinogen menjadi tripsin secara autokatalis. Tripsin terdiri atas rantai tunggal polipeptida dari residu 223 asam amino. Bentuk asli tripsin didasarkan sebagai β-tripsin (Sigma-aldrich, 2010b). Tripsin bekerja optimal pada pH 8 dan suhu 50 oC. Tripsin sebaiknya disimpan pada suhu yang sangat rendah (antara -20 dan -80 oC) untuk menghindari terjadinya autolisis. Autolisis dapat dicegah juga dengan menyimpan tripsin pada pH 3.

Pepsin

Pepsin (EC 3.4.23.1) adalah suatu enzim yang berguna untuk memecah molekul protein menjadi molekul lebih kecil yaitu pepton dan proteosa. Enzim ini dihasilkan oleh sel-sel utama lambung dalam bentuk pepsinogen, yaitu calon enzim yang belum aktif. Pepsinogen ini kemudian diubah menjadi pepsin yang aktif dengan adanya HCl. Pepsin merupakan katalis untuk reaksi hidrolisis protein dan membentuk pepton dan proteosa (Poedjiadi, 1994).

Pepsin aktif pada pH 2-4 dan akan secara permanen inaktif pada pH 8,0 dan akan terdenaturasi secara permanen pada pH 8,5-11 pada temperatur ruang. Aktivitas maksimum pepsin mencapai 90% pada pH 1,5 (Sigma-Aldrich, 2010a). Pepsin memecah gugus protein terutama yang mengandung asam amino fenilalanin, triptofan dan tirosin. Pepsin banyak digunakan di laboratorium untuk analisis protein, persiapan keju dan bahan pangan lain.

Bomberg et al. (2004) dalam tulisannya menyatakan bahwa, sensivitas substansi antibakteri yang diproduksi oleh bakteri asam laktat terhadap α– khimotripsin, tripsin, pronase E, fisin, pepsin, papain dan lipase ditentukan dalam penanganan dan kondisi perbanyakan. Semua komponen secara keseluruhan maupun sebagian diinaktivasi oleh beberapa enzim proteolitik. Hal ini mengindikasikan bahwa komponen tersebut adalah protein alami. Komponen penghambat diproduksi oleh strain-strain yang ada dengan sensitivitas yang berbeda.

Bakteri Patogen

Bakteri patogen merupakan mikroorganisme indikator keamanan pangan. Bakteri patogen ini dapat dibedakan atas penyebab intoksikasi dan penyebab infeksi. Intoksikasi yaitu keracunan yang disebabkan oleh bakteri patogen yang berkembang di dalam bahan makanan dan menghasilkan toksin, sedangkan infeksi yaitu bakteri

11 yang menghasilkan racun di dalam saluran pencernaan. Salah satu penyebab pembusukan dan patogen tular makanan yaitu Staphylococcus aureus dan beberapa jenis Bacillus (Buckle et al., 2007).

Salmonella enteritidis serotipe Typhimurium

Salmonella merupakan bakteri Gram negatif, tidak membentuk spora, berbentuk batang, dapat memfermentasi glukosa dan biasanya disertai dengan pembentukan gas tetapi tidak memfermentasi laktosa maupun sukrosa (Frazier dan Westhoff, 1988). Salmonella sp. dapat tumbuh pada kisaran suhu 5 oC hingga 45-47

o

C dengan suhu optimum 35-37 oC. Salmonella sp. tumbuh pada tingkat keasaman antara 4,5-5,4 dengan pH optimumnya sekitar 7 dan pH minimumnya sekitar 4,5 (Ray dan Bhunia, 2008) serta kadar air minimum 0,94. Nilai pH minimum bervariasi tergantung pada suhu inkubasi, komposisi media, aw dan jumlah sel. Pada pH kurang

dari 4,0 dan lebih dari 9,0 Salmonella akan mati secara perlahan (Adam dan Moss, 2007).

Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang dengan ukuran 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, soliter maupun berkoloni, anaerobik fakultatif, dan katalase positif (Holt et al., 1994). Escherichia coli dipergunakan sebagai mikroba indikator terhadap kontaminasi feses pada air dan susu, termasuk dalam grup Enterobacteriaceae dan bersifat motil flagella peritrikus (Buckle et al., 2007). Escherichia coli dapat tumbuh optimum pada pH 7-7,5 dengan pH minimum 4 dan pH makksimum 8,5. Bakteri ini sensitif terhadap panas dan pada makanan yang mengalami pemanasan. Suhu optimum untuk pertumbuhannya adalah 37 oC dengan kisaran suhu 10-40 oC (Frazier dan Westhoff, 1988).

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) merupakan salah satu dari keempat kelompok bakteri patogenik indikator kontaminasi fekal dan penyebab diare, selain ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli), EIEC (Enteroinvasif Escherichia coli) dan VTEC (Escherichia coli penghasil verotoksin). Enteropathogenic Escherichia coli melekatkan diri pada sel mukosa usus kecil dan membentuk filamentus aktin pedestal sehingga menyebabkan diare cair (watery diarrehoae) yang bisa sembuh dengan sendirinya atau berlanjut menjadi kronis (Arifin, 2009).

12

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus termasuk family Micrococcaceae, merupakan bakteri gram posistif berbentuk kokus yang bergerombol seperti buah anggur dengan diameter berkisar 0,5-1,5 μm, tidak bergerak, tidak mempunyai kapsul, dan tidak berspora biasanya termasuk katalase positif. Sel bakteri ini akan terbunuh pada suhu 66 oC selama 12 menit, dan pada suhu 72 oC selama 15 detik. Staphylococcus aureus bersifat anaerobik fakulatif, namun tumbuh dengan cepat di bawah kondisi aerob. Tergolong dalam kelompok bakteri mesofilik dengan kisaran suhu untuk tumbuh 7 hingga 48 oC, dan tumbuh secara cepat pada kisaran suhu 20-37 oC . Bakteri ini dapat tumbuh secara relatif pada aw rendah (0,86) dan pH rendah (4,8),

dengan minimum pH 4 dengan kisaran pH 4,0-9,8 dengan pH optimum sekitar 7,0-7,8. Pertumbuhan pada pH mendekati 9,8 hanya mungkin apabila substratnya mempunyai komponen yang baik untuk pertumbuhannya (Supardi dan Sukamto, 1999; Holt et al., 1994), serta pada konsentrasi garam dan gula yang tinggi (15%) dan pada keberadaan NO2 (Ray dan Bhunia, 2008).

Kebanyakan galur Staphylococcus aureus bersifat patogen dan memproduksi enterotoksin yang tahan. Beberapa galur, terutama yang bersifat patogen, memproduksi koagulasi, bersifat proteolitik, lipolitik dan β-hemolitik. Bakteri ini sering terdapat pada pori-pori dan permukaan kulit, kelenjar keringat dan saluran usus serta dapat menyebabkan intoksikasi dan infeksi bisul, pneumonia dan mastitis pada hewan (Fardiaz, 1992).

METODE Lokasi dan Waktu

Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Penelitian Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor mulai bulan Juni 2010 sampai bulan Oktober 2010.

Materi

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat BAL indigenous dadiah (Lactobacilus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01), isolat BAL dari yogurt susu sapi (Bifidobacterium longum Y-01 dan Lactobacillus acidophilus Y-01), kultur bakteri uji (Salmonella enteritidis serotipe Typhimurium (S. Typhimurium) ATCC 14028, Eschericia coli ATCC 25922, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923), Bacteorogycal Agar (BA), de Man’s Rogosa Sharpe Broth (MRS-B), NaCl fisiologis 0.85%, aquadest, Mueller Hinton Agar (MHA), Nutrient Broth (NB), standar Mc Farland nomor 2, etanol Pro Analyzed (PA), Tris-HCl 0,05 mM pH 8, buffer 0,2 M sitrat pH 6.0, pepsin, tripsin, dan enzim katalase, PP 1%, NaOH 0,1 N, HCl 10 N dan NaOH 10 N.

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung reaksi, ruang steril, cawan Petri, corke borrer, jangka sorong, mikroskop, labu Erlenmeyer, buret, mikropipet, autoklaf, inkubator, refrigerator, freezer, vortex, spektrofotometer, sentrifuge, tabung Scott, termometer, tabung U, waterbath, spuit 5 cc, rotary evaporator dan timbangan analitik.

Prosedur

Penelitian ini meliputi dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama.

Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan meliputi persiapan starter, preparasi bakteri uji, dan pengukuran pH.

Preparasi Kultur Starter. Koloni yang telah dimurnikan ditumbuhkan pada agar miring sebagai stock culture. Kultur ditumbuhkan ke dalam media MRS-B steril

14 sebagai kultur induk (penambahan sebanyak 5%). Kultur starter diremajakan satu hingga dua minggu sekali untuk menjaga kesegarannya.

Preparasi Bakteri Patogen. Kultur bakteri patogen dipelihara dan diperbanyak dengan mengambil sebanyak satu massa Öse steril kultur bakteri stok dalam broth, diinokulasikan ke dalam 10 ml nutrient broth (NB), kemudian diinkubasi pada 37 oC selama 24 jam. Sebelum digunakan, kultur disimpan pada suhu 5 oC dan disegarkan kembali satu minggu sekali sebagai kultur stok.

Pengujian yang dilakukan sebelum kultur BAL dan bakteri patogen digunakan adalah pengamatan morfologi didahului oleh pewarnaan Gram dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100. Pengujian pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kultur bakteri sebanyak satu massa Öse dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan kristal violet, dibiarkan selama 1 menit. Preparat selanjutnya dibilas dengan akuadestilata dan dikeringudarakan. Preparat yang sudah kering ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama ±1 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades dan preparat selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ±5 detik, dibilas kembali dengan akuadestilata dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ±30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah.

Karakteristik biokimia kultur bakteri salah satunya ditentukan melalui pengujian katalase dengan cara sebanyak satu jarum Öse kultur bakteri diambil dan dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H2O2. Apabila

dihasilkan gelembung-gelembung gas O2, maka bakteri yang diperiksa termasuk

kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak ada gelembung gas maka bakteri tersebut termasuk bakteri katalase negatif (Pelczar dan Chan, 2007).

Penentuan Populasi BAL Indigenous Dadiah. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui jumlah populasi BAL penghasil substrat antimikroba yang dihitung dengan pendekatan dua metode yaitu metode pour plate (hitungan cawan) dan metode turbidimetrik dengan spektrofotometer. Metode pour plate digunakan untuk

15 penentuan populasi BAL sebelum dan sesudah perlakuan, sedangkan metode turbidimetrik digunakan untuk penentuan perubahan populasi BAL selama perlakuan.

Metode Hitungan Cawan (Bakteriological Analytical Manual, 2001). Tahap ini diawali dengan pengenceran yang dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml sampel yang sudah homogen diambil dengan pipet steril, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer yaitu BPW, sehingga terbentuk pengenceran 10-1. Pengenceran terus dilakukan sampai pada pengenceran 10-9. Pemupukan dilakukan dengan pipet steril yaitu sebanyak 1 ml pada pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 dan 10-9 diambil dan dipindahkan ke dalam cawan Petri steril, serta dipupukkan secara duplo. Media agar sebanyak 15 ml dituangkankan ke dalam cawan Petri dan dihomogenkan sampai merata (metode tuang atau pour plate) dengan cara cawan digerakkan membentuk angka delapan. Cawan beserta isi diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37 |C selama 24-48 jam. Koloni mikroba yang terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC) dengan rumus sebagai berikut : Jumlah Populasi (cfu/ml) = N cawan

(n1 + (0,1 x n2)) x d

Keterangan :

N = Jumlah koloni yang berbeda dalam kisaran hitung (25-250 koloni) n1 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung

n2 = Jumlah cawan kedua yang koloninya dapat dihitung

d = Pengenceran pertama yang dihitung

Metode Turbidimetrik (Waluyo, 2008). Tahap ini diawali dengan penentuan korelasi antara nilai optical density (OD) dengan populasi bakteri hasil pemupukan dengan metode pour plate, melalui persamaan y = a + bx (y = jumlah populasi BAL, x = nilai OD bakteri dan a dan b = konstanta persamaan). Persamaan linier yang didapat (y = a + bx) ini digunakan dalam penentuan populasi awal isolat bakteri L. plantarum dan L. lactis D-01, B. longum dan L. acidophilus Y-01. Perhitungan sel bakteri pada penelitian ini menggunakan metode spektrofotometri. Jumlah bakteri

16 dihitung berdasarkan absorbansi dengan panjang gelombang 620 nm (modifikasi Cappucino dan Sherman, 2001).

Persamaan yang didapat dari kurva pertumbuhan Bifdobacterium longum adalah dengan variabel berupa banyaknya populasi bakteri (cfu/ml) yang dipupukkan dan perhitungan OD (optical density) menggunakan spektrofotometer dengan absorbansi 620 nm adalah y = 0,571x + 7,564 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,942, sedangkan Lactobacillus acidophilus adalah y = 1,812x + 7,205 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,976, Lactobacillus plantarum adalah y = 2,522x + 6,873 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,978, serta Lactococcus lactis adalah y = 7,074 + 1,169x dengan R2 = 0,936.

Penelitian Utama

Penelitian pendahuluan meliputi identifikasi substrat antimikroba (asam organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida) dan karakterisasi antimikroba melalui pengujian stabilitas substrat terhadap berbagai pH dan suhu.

Identifikasi Substrat Antimikroba melalui Uji Konfrontasi antara Bakteri Asam Laktat dengan Bakteri Patogen. Metode yang digunakan untuk uji konfontrasi keempat BAL terhadap berbagai bakteri uji adalah agar well difusion method (metode difusi sumur agar) sesuai dengan Héchard et al. (1992). Kultur bakteri uji berumur 24 jam dalam media NB diencerkan dalam NaCl fisiologis 0,85% untuk menghasilkan konsentrasi bakteri sebanding dengan larutan standar Mc Farland no.2 yang setara dengan tingkat populasi 108 cfu/ml, kemudian diencerkan hingga populasi mencapai 106 cfu/ml. Sebanyak 1 ml bakteri uji (106 cfu/ml) dipipet ke dalam cawan Petri dan ditambahkan Mueller Hinton Agar (MHA) sebanyak 15 ml, lalu dihomogenkan. Lubang berdiameter ± 7 mm dibuat setelah agar dalam cawan mengeras (modifikasi Nowroozi et al., 2004) menggunakan corke borer, kemudian dasar lubang dilapisi dengan Bacteorogical Agar (BA), FBS sebanyak 50 μl dari masing-masing BAL dipipet ke dalam masing-masing lubang sumur. Cawan beserta isi disimpan ke dalam refrigerator (suhu 4-7 oC) selama 1 jam untuk memberikan kesempatan FBS meresap ke dalam agar, sehingga akan memberikan aktivitas yang maksimal pada saat konfrontasi dengan bakteri uji. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18-24 jam, untuk pengujian kemampuan penghambatan

17 supernatan terhadap bakteri uji. Zona penghambatan yang terbentuk merupakan areal penghambatan substrat antimikroba BAL terhadap bakteri uji. Zona penghambatan berupa areal bening yang muncul di sekeliling sumur diamati dan diukur dengan jangka sorong. Setiap zona bening diukur diameternya sebanyak empat kali di tempat berbeda dan hasilnya dirata-ratakan kemudian dikurangi dengan diameter lubang (7 mm) (Gambar 1).Percobaan dilakukan dengan dua kali ulangan.

Keterangan:

A: Sumur untuk supernatant bebas sel (7 mm) B: Zona hambat (zona bening)

C: Cawan petri (media MHA)

Garis / / / Pengukuran diameter

zona bening

Gambar 1. Metode Pengukuran Zona Hambat

Beberapa peubah yang diuji dalam karakterisasi substrat antimikroba sebagai berikut: a. Asam Organik. FBS dari tiap BAL disiapkan sebelumnya dan diukur nilai

pH dan Total Asam Tertitrasi (% asam laktat).

- Pengukuran Nilai pH (Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Nilai pH diukur dengan pH-meter setelah terlebih dahulu dikalibrasi dengan buffer pH 4,0 dan 7,0. Kalibrasi dilakukan setiap saat akan melakukan pengukuran. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan elektroda ke dalam sampel setelah dibersihkan dengan aquades dan skala dibaca saat muncul kata ready atau angka penunjuk telah berada pada posisi tetap. - Total Asam Tertitrasi (Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Sampel

diambil sebanyak 10 ml, kemudian ditambahkan 3 tetes larutan indikator (PP 1%). Sampel kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda.

Perhitungan:

Jumlah Asam Tertritasi = b x c x 90.08 x 100% a

C B

18 dengan: a = volume sampel, dinyatakan dalam ml

b = volume larutan NaOH, dinyatakan dalam ml c = normalitas larutan NaOH

Tahap selanjutnya dilakukan uji konfrontasi FBS terhadap bakteri uji (S. Typhimurium, E. coli dan S. aureus) dengan metode difusi sumur agar. Jika ditemukan adanya zona hambat terhadap bakteri uji, membuktikan bahwa asam organik yang diproduksi merupakan salah satu senyawa antimikroba dari BAL tersebut.

b. Bakteriosin.

- Enzim Proteolitik (Modifikasi Oh et al., 2000). Masing-masing BAL diinokulasikan dalam media MRSB, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Sel-sel bakteri dipisahkan untuk didapatkan filtrat bebas sel (FBS) dengan disentrifugasi 6.000 g selama 20 menit pada suhu 4 oC. Filtrat masing-masing BAL diatur pada pH optimal tripsin, pepsin dan untuk kontrol, tiap FBS diatur pada pH 7 dengan penambahan NaOH 10 N untuk menghilangkan efek antimikroba dari asam organik di dalam substrat. FBS kemudian ditambah dengan etanol PA (pro analysis) dengan perbandingan 1:1, lalu dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 40-45 oC hingga kering dan ditambahkan aquadest steril untuk mendapatkan FBS terkonsentrasi menjadi 10 kalinya dari volume awal. FBS diberi perlakuan dengan penambahan enzim protease yang berbeda, pepsin dan tripsin (500 µg/ml). Tripsin pada buffer Tris-HCl 0,05 mM, pH 8 atau pepsin pada buffer 0.2 M sitrat pH 6.0 ditambahkan ke FBS dengan perbandingan FBS : enzim = 1:1 (v/v). FBS yang diberi perlakuan enzim pepsin diinkubasi pada suhu 37 oC, sedangkan untuk tripsin pada 25 oC masing-masing selama 1 jam. FBS yang telah mendapatkan perlakuan dengan enzim dikonfrontasikan dengan bakteri patogen indikator menggunakan metode difusi sumur agar (Savadogo et al., 2004). Jika zona hambat pada FBS yang diberi perlakuan enzim protease tidak terbentuk atau lebih kecil dari kontrol menandakan bahwa substrat antimikroba tersebut adalah protein atau dikenal sebagai bakteriosin.

19 - Uji Konfrontasi antar Bakteri Asam Laktat. Pengujian konfrontasi

antara sesama bakteri asam laktat asal dadih dilakukan untuk mengetahui sensitivitas antar isolat BAL satu dengan yang lainnya, bila ditumbuhkan secara bersamaan sebagai kultur campuran. Cara pengujian sama dengan uji konfrontasi dengan bakteri patogen, hanya isolat BAL digunakan sebagai pengganti bakteri patogen.

c. Hidrogen Peroksida (Modifikasi Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Keberadaan hidrogen peroksida (H2O2) dapat diuji dengan menggunakan uji

katalase. Uji dilakukan secara duplo dengan tiga kali ulangan. Pengujian dilakukan dengan cara menuangkan 15 ml kultur berumur 24 jam ke dalam tabung U lalu ditambahkan 0,013 g enzim katalase (LPS). Mulut tabung ditutup dengan sumbat kapas, kemudian dihomogenisasikan. Tabung U diinkubasi dengan kondisi berdiri pada suhu 37 oC selama 3-24 jam diamati. Adanya gas oksigen yang terbentuk setelah penambahan enzim katalase dalam media yang diinokulasikan BAL menandakan bahwa BAL menghasilkan senyawa antimikroba berupa hidrogen peroksida (H2O2).

Karakterisasi Substrat Antimikroba melalui Pengujian Stabilitas Antimikroba pada Berbagai Level pH dan Suhu (Modifikasi Wolf dan Gibbons, 1996).

a. FBS dikondisikan pada empat level pH yang berbeda (3,0; 5,0; 7,0; 8,0) dan diuji konfrontasi terhadap bakteri patogen dengan metode difusi sumur agar.

b. FBS dikondisikan pada lima level suhu yang berbeda (-20 oC dan 4 oC dan disimpan selama 0, 7 dan 14 hari; 25-30 oC dan disimpan selama 1,2,3,4 dan 5 hari berturut-turut; 64±1oC selama 30 menit; 74±1oC selama 15 detik; dan dipanaskan hingga 100 oC). Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi sumur agar.

Rancangan Percobaan

Penelitian utama terbagi menjadi dua tahap, yaitu identifikasi substrat antimikroba dan uji stabilitas substrat antimikroba probiotik terhadap berbagai kondisi pH, suhu dan lama penyimpanan.

20 1. Identifikasi substrat antimikroba dari bakteri asam laktat asal dadiah dan

yogurt

a. Asam Organik, menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. b. Bakteriosin.

- Pengujian adanya protein aktif (bakteriosin) melalui uji dengan enzim proteolitik (tripsin dan pepsin) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah.

- Pengujian kemampuan penghambatan antar bakteri asam laktat menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah.

2. Karakterisasi substrat antimikroba keempat bakteri probiotik

a. Uji stabilitas terhadap empat level pH yang berbeda (3,0; 5,0; 7,0; 8,0), menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah.

b. Uji stabilitas terhadap dua level penyimpanan suhu rendah yang berbeda (-18, 4 oC) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah.

c. Uji stabilitas terhadap tiga level suhu pemanasan yang berbeda (64±1oC, 74±1oC, 100 oC) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial. d. Uji stabilitas pada penyimpanan suhu ruang selama lima hari

menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial. Masing-masing perlakuan mendapat dua kali ulangan. Persamaan model rancangannya menurut Steel dan Torrie (1995) 1. Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Searah

Yij = μ + αi + εij

Keterangan:

Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

μ = Nilai rataan umum

αi = Pengaruh level perlakuan penghambatan substrat dari tiap isolat BAL

(a) bakteri uji (S. Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923)

(b) penyimpanan suhu rendah yang berbeda (-20 dan 4 oC) (c) masing-masing isolat BAL

(d) enzim yang berbeda (pepsin dan tripsin)

21 εij = Galat percobaan akibat pada ulangan ke-j dari perlakuan ke-i

Rancangan percobaan dapat berubah bila data yang diperoleh tidak memenuhi uji asumsi, yaitu dengan rancangan non parametrik Kruskall-Wallis.

2. Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Faktorial Yijk = μ + αi + βi + (αβ)ij+ εijk

Keterangan :

Yijk = Respon pengamatan pada perlakuan ke-i, perlakuan ke-j dan ulangan ke-k

μ = Nilai rataan umum αi = Pengaruh perlakuan

a) penyimpanan suhu ruang pada hari yang berbeda (H0-H5) b) perlakuan suhu pemanasan yang berbeda (64±1o_{C, 74±1}o_{C, 100}o

C)

βj = Pengaruh perlakuan Bakteri Asam Laktat yang berbeda (Lactobacillus

acidophilus Y-01, Lactobacilus plantarum D-01, Lactococcus lactis D-01 dan Bifidobacterium longum Y-01)

(αβ)ij = Pengaruh interaksi perlakuan ke-i dan perlakuan ke-j

εij = Galat percobaan pengaruh perlakuan ke-i, j dan ulangan ke-k

Data yang diperoleh akan dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA), hasil yang berbeda nyata diuji lanjut dengan Uji Tukey dan interpretasi data dilakukan secara deskriptif (Steel dan Torie, 1995).

HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan bertujuan untuk memeriksa karakteristik morfologis dan kemurnian isolat bakteri yang digunakan. Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah (a) BAL indigenous dadiah meliputi Lactobacillus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01 dan (b) BAL asal yogurt meliputi Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01. Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enteritidis serotipe Typhimurium ATCC 14028 dan Escherichia coli ATCC 25922. Karakteristik morfologis yang diamati meliputi bentuk dan susunan sel-sel bakteri secara mikroskopik, dilakukan dengan bantuan pewarnaan Gram. Karakteristik kimia diamati melalui uji katalase.

Uji Kemurnian Isolat Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Patogen Indikator Kultur BAL yang digunakan pada penelitian ini merupakan kelompok bakteri Gram positif berbentuk basil (batang) yang meliputi Lactobacillus plantarum D-01, Lactobacillus acidophilus Y-01 dan Bifidobacterium longum Y-01, sedangkan Lactococcus lactis D-01 mempunyai bentuk kokus (bulat). Bakteri uji yang digunakan merupakan kelompok bakteri Gram negatif berbentuk batang, meliputi S. Typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922, sedangkan S. aureus ATCC 25923 merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus.

Teknik pewarnaan yang biasa dilakukan untuk membedakan bakteri secara morfologis adalah pewarnaan Gram. Teknik pewarnaan gram diberi nama setelah teknik ini digunakan oleh seorang fisikawan Denmark, Christian Gram, orang yang pertama kali menyarankan teknik ini untuk digunakan pada tahun 1884. Menurut Alcamo (1983), prosedur teknik ini berbeda sejak bakteri dibedakan ke dalam dua grup berdasarkan reaksinya, namun, Black (2005) juga menyatakan bahwa berdasarkan reaksinya terhadap pewarnaan gram, organisme dibedakan menjadi empat grup, yaitu (1) organisme gram positif, yang dinding sel nya mempertahankan warna ungu Kristal violet, (2) organisme gram negatif, yang dinding selnya tidak mempertahankan warna ungu dari kristal violet, (3) organisme gram non-reaktif , yang tidak berwarna ataupun sangat sedikit terwarnai, (4) organisme gram-variabel,

23 yang terwarnai tidak merata karena kehilangan kemampuannya untuk memberi aksi secara jelas terhadap pewarnaan gram, biasanya terjadi pada organisme dari kultur yang berumur lebih dari 48 jam dan terkadang tepat berumur 24 jam.

Bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tinggi di dinding sel, sehingga alkohol melarutkan lipid dan menyebabkan kebocoran pada kompleks kristal violet-iodin sehingga bakteri dalam kelompok ini berwarna kemerahan akibat pewarnaan gram. Bakteri gram positif yang mempunyai lipid yang sedikit pada dinding sedikit lebih rentan terhadap alkohol dan berwarna biru keunguan. Teori lain menyatakan bahwa peptidoglikan ditemukan pada konsentrasi tinggi pada dinding bakteri gram positif memerangkap kompleks Kristal violet-iodine di dalam banyak ikatan silangnya, sedangkan bakteri Gram negatif memiliki peptidoglikan rendah dan sedikit ikatan silang dibandingkan bakteri gram positif sehingga menyebabkan kehilangan zat warna secara cepat (Alcamo, 1983).

Hasil pewarnaan dan pengamatan morfologi sel di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 menunjukkan bahwa baik substrat keempat isolat BAL maupun bakteri uji yang digunakan seragam dan berwarna sama, sedangkan uji katalase yang dilakukan menunjukkan bahwa keempat isolat BAL yang digunakan bersifat katalase negatif. Hal tersebut menunjukkan baik keempat isolat BAL maupun bakteri uji masih homogen dan tidak tercemar. Hasil pengamatan morfologi keempat isolat BAL dan ketiga bakteri uji disajikan dan di Tabel 1 dan 2.

Ray dan Bhunia (2008); Pelczar dan Chan (2007), menyatakan bahwa Lactococcus termasuk bakteri gram positif berbentuk ovoid (bulat-lonjong) terdapat dalam rantai dengan diameter 0,5-1,0 µm, tidak berspora, bersifat fakultatif anaerobik, dan non motil terdapat di susu mentah dan sayuran, beberapa mempunyai range yang relatif besar melawan bakteri gram positif. Genus Lactobacillus termasuk grup bakteri gram positif yang hampir seluruhnya berbentuk batang, biasanya non motil (tidak bergerak), tidak berspora, bersifat anaerob fakultatif, serta sangat bervariasi baik secara morfologikal, pertumbuhan, dan karakteristik metabolisnya. Bifidobacterium longum merupakan bakteri gram positif berbentuk batang terdapat sebagai sel tunggal atau rantai dengan ukuran yang bervariasi, tidak membentuk spora, tidak bergerak, dan bersifat anaerobik meskipun beberapa dapat menoleransi O2 dalam persentasi CO2.

24 Tabel 1. Karakteristik Isolat Bakteri Asam Laktat

Isolat BAL Pewarnaan Gram

Uji Katalase

Morfologi

Gambar Morfologi

Lactobacillus plantarum

D-01

Gram positif Negatif

Berbentuk batang, susunan rantai

pendek

Lactobacillus acidophilus

D-01

Gram positif Negatif

Berbentuk batang, susunan rantai

pendek

Bifidobacterium longum

Y-01

Gram positif Negatif

Berbentuk batang, susunan rantai

pendek

Lactococcus lactis Y-01

Gram positif Negatif

Berbentuk bulat, susunan rantai

pendek

S.Typhimurium termasuk kelompok bakteri gram negatif bersifat anaerobik fakultatif yang berbentuk batang ukuran medium (1x4 µm), biasanya bersifat motil (bergerak) dan mesofilik. Escherichia coli termasuk kelompok bakteri gram negatif bersifat anaerobik fakultatif yang berbentuk batang (1x3 µm), bersifat motil maupun non motil dan mesofilik. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus yang bergerombol seperti bentuk anggur, tidak bergerak, dan bersifat anaerobik fakultatif atau mikroaerofilik (Ray dan Bhunia, 2008; Pelczar dan Chan 2007).

25 Tabel 2. Karakteristik Morfologi Bakteri uji

Isolat BAL Pewarnaan

Gram

Morfologi

Gambar Morfologi

S. Typhimurium ATCC

14028 Gram negatif

Berbentuk batang, susunan rantai

pendek

Escherichia coli ATCC

25922 Gram negatif

Berbentuk batang, susunan rantai

pendek

Staphylococcus aureus

ATCC 25923 Gram positif

Berbentuk bulat, susunan bergerombol membentuk anggur

Penelitian Utama

Penelitian utama adalah karakterisasi senyawa antimikroba dari isolat bakteri asam laktat indigenous dadiah dan yogurt yang meliputi (a) asam-asam organik, (b) hidrogen peroksida dan (c) bakteriosin. Keberadaan senyawa antimikroba ini penting untuk memenuhi salah satu persyaratan BAL sebagai kandidat bakteri probiotik. Keberadaan bakteriosin sebagai substrat aktif penghambat bakteri patogen indikator diuji melalui stabilitasnya terhadap berbagai suhu pemanasan, pH, dan enzim proteolitik serta sensitivitas substrat terhadap bakteri patogen indikator.

26 Identifikasi Substrat Antimikroba melalui Uji Konfrontasi antara FBS Bakteri Asam Laktat asal Dadiah dan Yogurt dengan Bakteri Patogen Indikator

Substrat antimikroba yang terdapat dalam Filtrat Bebas Sel (FBS) didapatkan dengan memisahkan sel-sel bakteri melalui sentrifugasi dengan kecepatan putaran 6000g/menit pada suhu 4oC selama 20 menit (Oh et al., 2000). Uji konfrontasi menggunakan metode difusi sumur agar (Héchard et al., 1992). Zona bening yang terbentuk pada uji antagonistik menunjukkan aktivitas penghambatan dari FBS masing-masing BAL terhadap masing-masing bakteri patogen indikator.

Asam Organik. Aktivitas substrat antimikroba BAL dipengaruhi oleh pH FBS karena adanya asam organik yang dihasilkan isolat BAL selama fermentasi yaitu meliputi asam laktat untuk kelompok homofermentatif atau asam laktat dan asam organik lainnya untuk kelompok heterofermentatif. Zona hambat yang terbentuk pada uji antagonistik disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3. Aktivitas Antagonistik BAL Dadiah dan Yogurt terhadap Bakteri Patogen Indikator

Kultur BAL

Diameter Penghambatan (mm) S. Typhimurium

ATCC 14028

E. coli ATCC 25922

S. aureus ATCC 25923 L. plantarum D-01 11,84C ± 0,34 12,64B ± 0,28 11,32ab ± 1,32 L. lactis D-01 9,73D ± 0,02 10,81C ± 0,17 9,40b ± 0,52 B. longum Y-01 13,13B ± 0,19 14,71A ± 0,45 13,37a ± 0,47 L. acidophillus Y-01 15,35A ± 0,28 15,13A ± 0,32 11,86ab ± 0,18 Keterangan: Besarnya diameter zona hambat tidak termasuk diameter lubang sumur (7 mm)

Superskrip (A,B) pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)

Superskrip (a,b) pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) Hasil uji antagonistik menunjukkan bahwa isolat BAL dadiah maupun yogurt mampu menghasilkan penghambatan pada tiap bakteri patogen indikator. Jenis kultur BAL memberikan diameter zona hambat yang berbeda terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922 (P<0.01), maupun S. aureus ATCC 25923 (P<0.05). FBS dari L. acidophilus Y-01 menghasilkan diameter penghambatan terbesar terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922, dibandingkan dengan FBS dari ketiga BAL lainnya, sedangkan FBS L. lactis D-01 menghasilkan penghambatan terkecil dibandingkan ketiga FBS BAL lainnya.

27 Pengamatan secara deskriptif mendapatkan bahwa rataan zona hambat yang dihasilkan dari FBS BAL terhadap bakteri patogen indikator Gram negatif (S. Typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922) adalah lebih besar dibandingkan untuk bakteri Gram positif(S. aureus ATCC 25923). Hasil tersebut dikuatkan oleh pernyataan Ray dan Bhunia (2008), bahwa pada umumnya bakteri Gram negatif lebih sensitif pada pH rendah dibandingkan bakteri Gram positif. Perbedaan besarnya penghambatan isolat BAL terhadap bakteri patogen indikator yang berbeda dapat disebabkan bakteri asam laktat, terutama spesies lactobacilli, memiliki efektifitas yang tinggi melawan bakteri Gram negatif dibandingkan bakteri Gram positif (Annuk, 2003).

Diameter penghambatan yang dihasilkan terhadap bakteri patogen indikator disebabkan oleh senyawa penghambat yang terkandung di dalam komponen antimikrobial intraselular, salah satunya adalah asam organik. Asam organik disekresikan di dalam proses fermentasi karbohidrat oleh BAL yang diduga sebagai senyawa antimikrobial utama yang bertanggung jawab atas penghambatan melawan patogen. Aktivitas antimikrobial dari asam organik mengacu pada penurunan pH dan adanya asam dalam bentuk terdisosiasi.

Frobisher et al. (1974) menyatakan, bahwa pada pengukuran nilai pH, yang diukur adalah konsentrasi ion hidrogen yang ada dalam bentuk terdisosiasi. Pada pengukuran total asam yang terukur adalah jumlah hidrogen total (dalam bentuk terdisosiasi dan tidak terdisosiasi). Keasaman berhubungan terbalik dengan pH, sistem yang mempunyai keasaman tinggi memiliki pH yang rendah (Ray dan Bhunia, 2008). Nilai pH dan TAT masing-masing FBS isolat BAL disajikan pada Tabel 4. B. longum Y-01 memiliki pH terendah di antara ketiga isolat BAL lainnya, sedangkan L. lactis D-01 memiliki nilai TAT tertinggi di antara ketiganya.

Tabel 4. Nilai pH dan TAT (total asam tertitrasi) masing-masing isolat BAL

Isolat BAL pH TAT (% asam laktat)

L. plantarum D- 01 4,16±0,1 1,44±0,1 L. lactis D- 01 4,24±0,1 3,24±0,1

B. longum Y-01 4,06±0,1 2,70±0,1

81 e. Konfrontasi FBS L. lactis D-01

terhadap E. coli ATCC 25922 f. Konfrontasi FBS L. plantarum

D-01 terhadap E. coli ATCC 25922

g. Konfrontasi FBS L.achidophyllus

Y-01 terhadap E. coli ATCC 25922

i. Konfrontasi FBS B. longum

Y-01 terhadap E. coli ATCC 25922

k. Konfrontasi FBS L. lactis D-01 terhadap S. aureus ATCC 25923 l. Konfrontasi FBS L. plantarum

D-01 terhadap S. aureus ATCC 25923

82 Lampiran 80. Penghambatan FBS isolat BAL Isolat pada perlakuan penambahan

enzim terhadap Bakteri Patogen Indikator

m. Konfrontasi FBS L. achidophyllus

Y-01 terhadap S. aureus ATCC 25923

o. Konfrontasi FBS B. longum

Y-01 terhadap S. aureus ATCC 25923

Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap E. coli ATCC 25922

Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap S. aureus ATCC 25923

83 Keterangan: perlakuan a) enzim tripsin, b) enzim pepsin, c) kontrol, d) buffer 6, e)

buffer 8

Lampiran 81. Penghambatan Keempat Isolat BAL terhadap BAL lain Konfrontasi FBS Isolat BAL terhadap

S. Typhimurium ATCC 14028

L. lactis D-01 vs

L. plantarumD-01

B. longum Y-01 vs

L. plantarumD-01

L. acidophilus Y-01 vs

L. plantarum D-01

L. plantarum D-01 vs

B. longum Y-01

L. lactis D-01 vs

B. longum Y-01

L. acidophilus Y-01 vs

84 Lampiran 82. Komposisi OXOID CM0359 M.R.S. Broth (de Man Rogosa, Sharpe)

Peptone 10,0

Lab-lemco’ Powder 8,0 Yeast extract 4,0

Glucosa 20,0

Sorbitan mono-oleate 1 ml

Di-potassium hydrogen phosphate 2,0 Sodium acetate 3 H2O 5,0

Triammonium citrate 2.0

Magnesium sulphatte 7 H2O 2,0 Magnesium sulphatte 4 H2O 0,05 Cara Pembuatan:

Sebanyak 52 gram media MRS-B dicampur ke dalam 1000 ml akuadestilata, diaduk hingga tercampur rata, lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

pH 6,2 ± 0,2 pada 25oC

B. longum Y-01 vs

L. acidophilusY-01

L. lactis D-01 vs

L. acidophilus Y-01

L. plantarum D-01 vs

L. acidophilusY-01

L. plantarum D-01 vs

L. lactis D-01

B. longum Y-01 vs

L. lactisD-01

L. acidophilus Y-01 vs

85 Lampiran 83. Komposisi OXOID CM0337 Mueller-Hinton Agar (MHA)

Beef dehydratre infusion from 300,0 Casein hydrolysate 17,5

Starch 1,5 Agar 17,0

Cara Pembuatan:

Sebanyak 38 gram media MHA dicampur ke dalam 1000 ml akuadestilata, diaduk dan dipanaskan hingga medidih untuk melarutkan media secara menyeluruh. Media yang sudah dituangkan ke dalam botol Scott disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

pH 7,3 ± 0,2 pada 25oC

Lampiran 84. Komposisi DifcoTM Nutrient Broth (NB)

Beef extract 3,0 g

Peptone 5,0 g Cara Pembuatan :

Sebanyak 8 gram media NB dicampur ke dalam 1000 ml akuadestilata, diaduk dan dipanaskan hingga medidih agar tercampur rata. Media yang sudah dituangkan ke dalam tabung reaksi @ 9 ml, disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

pH 6,8 ± 0,2

Lampiran 85. Komposisi MERCK Natrium/Sodium Chloride (NaCl) M = 56,44 g/mol

Cara Pembuatan:

Sebanyak 0,85 gram media NaCl dicampur ke dalam 100 ml akuadestilata (untuk membuat larutan NaCl fisiologi 0,85%) lalu diaduk. Media yang sudah dituangkan ke dalam tabung reaksi @ 9 ml, disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media NaCl dapat langsung digunakan dengan mendinginkannya terlebih dahulu hingga suhunya 30 oC atau dapat disimpan pada suhu refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan.

86 Lampiran 86. Komposisi OXOID LP0011 Agar Bacteorogical (Agar No.1)

Cara Pembuatan :

Sebanyak 15 gram media BA dicampur ke dalam 1000 ml akuadestilata, diaduk dan dipanaskan hingga medidih untuk melarutkan media secara menyeluruh. Media yang sudah dituangkan ke dalam botol Scott disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o

C selama 15 menit. pH 6.0 - 7.5 (1% solution)

Lampiran 87. Komposisi Buffered Peptone Water (BPW) Peptone 10,0 Sodium chloride 5,0

Di-sodium phosphate 3,5

Potassium dihydrogen phosphate 1,5 Cara Pembuatan :

Sebanyak 20 gram BPW dicampur ke dalam 1000 ml akuadestilata, diaduk sampai tercampur rata, kemudian dimasukkan sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.