Transformasi kedelai dengan gen proteinase inhibitor II melalui Agrobacterium dan penembakan partikel

TRANSFORMASI KEDELAI DENGAN GEN PROTEINASE

INHIBITOR II MELALUI AGROBACTERlUM DAN

PENEMBAKAN PARTIKEL

Oleh:
SAPTOWO Jt PARDAL

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2004

ABSTRAK
SAPTOWO J. PARDAL. Transformmi Kedelai Dengan Gen Proteinme Inhibitor 11
Meialrri Agrobacterium dun Penembakm Partrmkel (di bawah bimbingan GA.
Wattimena, Hajrial Aswidinnoor dan M.Herman).

Penelitian bertujuan untuk (I) mendapatkan protokol transformasi kedelai melalui
vektor Agrobacrer ium dan Penembakan Partikel yang terbaildoptimum, (2) untuk

mentransfer dan meregenerasikan eksplan kedelai hasil transformasi dengan gen pinII,
dan (3) untuk mendapatkan tanaman kedelai hasil tmnsformasi yang mengandung gen pin
Il dm tahan terhadap harna penggerek polong.
Penelitian terdiri dari tiga percobaan, yaitu (1) Transformasi kedelai dengan gen
gus, (2) Transformasi kedelai dengan gen proieinase inhibitor (pin) II, dan (3) Evaluasi
tanaman kedelai hasii transformasi. Penelitian rnenggudan dua varietas kedelai, yaitu
Wilis dan Tidar. Dua varietas ini dipilih karena menunjukkan respon regenerasi in vitro
yang cukup baik dan banyak ditanam petani, terutarna Wilis,
Pada penelitian prtama, sejumlah ekspian embrio muda dan kotiledon muda
umur 14-15 hari setelah pembungam (antksis) telah diinokulasi dengan A. tumefaciens
strain EHA 105 dengan plasmid pCambia 1301 yang mengandung gen g m (gen pelapor)
dan hph (gen ketahahanan terhadap higromisin). Perlakuan inokulasi meliputi kerapatan
bakteri (0,5; 1 ; 1,5), lama inokulasi (dishaker 60 clan 90 menit), dan lama ko-kultivasi (3
dan 5 h
i
)
.
Hasil uji gus menunjukkan bahwa perlakuan inokulasi yang terbaik adalah
dengan menggunakan kerapatan bakteri (ODm) = 1 (setara dengan 1 x 10' seVml), lama
inokulasi 90 menit dan lama ko-kdtivasi 5 had. Pada metode Penembakan Partikel, dua

macam eksplan kotiledon muda dan embrio muda ditembak dengan plasrnid pRQ-6 (
mengandung gen gus dan hpt 11). Perfakuan penembakan meliputi besarnya tekanan gas
Helium (1 I 0 0 dm 1300 psi), jarak ternbak (5 dan 7 cm),dan jumlah tembakan (1 dan 2
kali). Hasil menunjukkan bahwa perlakuan terbaik untuk penembakan adalah dengan
tekartan gas Helium sebesar 1 100 psi, jmak tembak 5 cm dan jumlah tembakan 1 atau 2
kali.
Pada penelitim kedua, sebanyak 1539 eksplan kotiledon muda kgdelai Wilis dan
984 eksplan Tidar telah diinokulasi dengan A. rtlrnefaciem yang mengandung plasmid
pGApinlI (gen pin II clan npt 11). H s i l regenerasi dan seleksi eksplan hail transformasi
pada media yang mengandung Kanarnisin 200 r
ng (spesifik unhk seleksi gen nptI0
menunjukkan bahwa eksplan W ilis lebih banyak menghasilkan tanaman regeneran, yaitu
sebanyak 8 tanaman (AW I -AWs), sedangkan Tidar hanya 1 tanaman (AT,). Pada metode
penernbakan, sebanyak 1 274 eksplan kotiledon muda kedelai W ilis dan 1 763 eksplan
Tidar telah ditembak dengan plasmid pTWa (mengandung gen pin I1 dan bar). Hasil
regenerasi dan seleksi eksplan hasil transformasi pa& media yang mengandung 3 mg/l
herbisida ~ a s t a(spesifik
~
untuk seleksi gen bar) menunjukkm bahwa Tidar dapat
menghasilkan 3 tanaman (TP,,

TP2, TP3), sedangkan Wilis hanya 2 tanaman (WPI,WP2).
Pada penelitian ketiga, analisis molekuler terhadap 9 tamman hasil transformasi
Agrobacterium (8 dari Wiiis dm 1 dari Tidar) dengan teknik Polymerase Chain Reaction
(PCR) menunjukkm hanya 1 sarnpel DNA tanaman positif mengandung gen pinH (600

bp), yaitu event ATl (Tidar). Analisis PCR terhadap 5 tanaman hasil transforrnasi
P e n e m b Partikel (2 dari Wilis dan 3 dari Tidar) menunjukkan hmya 1 tanaman
positif mengandung gen pinII, yaitu event WP2 (Wilis). Kemudian, andisis molekuler
terhadap progeni @I)dari event AT, dan WP2 (50 tanaman WP2 dan 40 tanaman ATI)
meaunjukkan bahwa ada beberap tanaman RI masih membawa gen pinII. Hal ini
menunjukkan bahwa gen pin11 diwariskan dari tanaman tehu 0 )ke progeninya (RI),
walaupun pola segregasinya tidak mengikuti hukum Mendel. Pada progeni WP;! hanya
diperoleh 3 sampel DNA positif gen pin11 (No. 44, 45, 46) dan 6 sampel dari progeni
ATI (No.6 , 9, 1 1, 20, 22, 25). Secara paralel tanaman kedelai RI ini juga dibioasai
terhadap larva penggerek polong (Etiella zinckenella, Tr.) di Fasilitas Uji Terbatas
(Biosafety Containment). Hasil pengamatan terhadap serangan polong dan biji setelah
panen menunjukkan bahwa tanaman W 2 R t terg~longagak peka (rata-rata polong
terserang= 45,4%), sedangkan tanaman AT1Rl tergolong p k a (rata-rata poiong
terserang=58,8%). Tanaman WPtas dan WPz4 merupakan event terbaik dari progeni
WP2 (tergolong ugak tahan dengan serangan polong 20??), dan ATI-1r merupakan event

terbaik dari progeni ATI (tergolong agak p e h dengan m g a n polong 30%). Ketiga
tanaman ini j uga menunjukkan hasil PCR positif mengandung genpinII.

Kata Kunci: transformasi, kedelai, proteinme inhibitor I . Agrubacterium, p n e m b a h n
partikel.

.Ilt..

ABSTRACT
SAPTOWO J. PARDAL. Soybean Transformation wwilk Proteinme Inhibitor 11 Gene
Through Agrobacterirurt and Particle Bombardment (Supervised by GA. Watthem,
Hajrial Aswidinnoor and M. Herman).
The objectives of these research were (1) to obtain the best protocols of soybean
transformation using Agrobacterhm-mediated bransformation and Particle Bombardment,
(2) to transfer and regenerate soybean explants transformed with the proteinase inhibitor
I1 gene, and to obtain soybean plants that contained the proteinme inhibitor II gene and
resistant to pod barer.
Research was included three experiments i.e 1) Soybean transformation using gus
gen, 2) Soybean trmsfarmation using proteinase inhibitor (pin) II gene, and 3)
Evaluation of soybean transformant plants. Two soybean cdtivars (Wilis and Tidar)

were used in this experiments. Both cdtivars were chosen because it shown good
response on early in vitro plant regeneration study and very popular to the farmers,
especially cv. Wilis.
On the first activity, soybean explants were inoculated with A. tumefaciens strain
EHA 105 which is contained plasmid pCambia 1301 with p s gene in T-DNA region.
The treatments were included an optical density (0.5; 1 and 1.5), inoculation time (60 and
90 minutes), co-cultivation time (3 and 5 days) and type of explants (young embryo and
cotyledon). Result indicated that the best protocol for inoculation was using young
cotyledon as explants with 1 x 10' celYrnl of Agrobacterium for 90 minutes inoculation
and 5 days co-cdtivation. While on the particle bombardment method, young embryos
and cotyledons were bombarded with pRQ6 plasmid. Treatment were included Helium
gas pressure (1 100 and 1300 psi), shooting distance ( 5 and 7 cm) and number of
bombardment (once and twice). The best treatment was using young cotyledon as
explant, bombarded once or twice with gold particles at 1 100 psi of the Helium gas
pressure and 5 crn of shooting distance.
On the second activity, 1539 young cotyledon explants from Wilis and 984
explants from Tidar were inoculated with A. tumefaciens which is contained proteinase
inhibitor II gene on plasmids pGApin LI construct. Result from plant regeneration and
selection of tsansformant explants on media with 200 mgA Kariamycine (spesific for nptII
gene selection) indicated that c.v Wilis were better than Tidar, because its produced more

plantlets/plants 8 plants (coded: A W I-AW8), while Tidar produced only one plant (coded:
AT& On the Particle Bombardment experiments, 1274 young cotyledon explants of
Wilis and 1763 explants of Tidar were bombarded using gold particle coated with pTWa
plasmids (contained pinn and bar genes). Result of plant regeneration and selection of
transformant explants on media with 3 m g ~ lBasta (spesific for bar gene selection)
indicated that cv. Tidar produced three plants (TPI-TP3)while cv.Wi1is produced only 2
plants (WPI and WP2).
On the third activity, transformant plants were evaluated through molecular and
bioassay analysis. Molecular analysis of nine soybean plants obtained from
Agrobacterium-mediated transformation (8 Wilis and 1 Tidar) using Polymerase Chain
Reaction (PCR)technique indicated that only event ATI (Tidar) was positive to pin I1

gene test, while 8 plants from event AW (Wilis) were negative. PCR test of five soybean
plants obtained from bombardments experiments (2 Wilis and 3 Tidar ) indicated that no
plants were positive to pin 11 gene, except WP2 (Wilis). Seeds fiom these positive plants
were collected for further evaluation. Furthermore, PCR test of 50 WPtRl plants and 40
AT1 R1plants indicated that there were several of Rl plants still positive on PCR test. Jt
indicated that the proteinase inhibitor II gene was transmitted from parent plants (h)
to
the progeny @I). There were three DNA samples of WPzRl(No. 44,45,46) and six DNA

samples of ATIRl(No. 6, 9, 11,20,22,25) were positive to pin I1 gene. Those R I plants
were also challenged to pod borer (Etielfa zinckenella, Tr.) larvae in the Biosafety
Containment. Observation on pod and seed damages percentage after harvesting
indicated that WP2 progeny were categoried into rather susceptible to pod borer (pod
damages = 45.4%), while AT1 progeny were susceptible to pod borer @od damages =
58.8%). WP2aS and W 2 - 4 6 were the best event of WP2 progeny (categoried into rather
resistant to pod borer with 20°/0 pod damages) and ATI-11was the best event of ATl
progeny (categoried into rather susceptible to pod born with 30% pod damages). those
piants were also positive on PCR test.

Keywordr : tramformation, soybean, prole inase inhi bitorIl, Agrobacterium, particle

bombardment.

Lembar Pernyataan

Saya menyatakan dengan seknar-benarnya bahw segala pernyataan Marn
disertasi saya yang berjudul:

"TRANSFORMASI KEDELAI DENGAN GEN PROTEINASE INHIBITOR I1

MELALUI AGROBACTERIUM DAN PENEMBAKAN PARTIKELn

adalah gagasan atau hasil penelitian disertasi saya sendiri dengan bimbingan Komisi
Pembimbing, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Disertasi ini belurn
pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di Perguruan Tinggi lain.

Semw data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelss dan dapat

diperiksa kebenarannya.

Saptowo J. Pardal

TRANSFORMASI KEDELAI DENGAN GEN

PROTEINASE INHIBITOR I1 MELALUI AGROBACTERIUM
DAN PENEMBAKAPJ PARTIKEL

Oleh:
SAPTOW0 J. PARDAL

Diserhsi
Sebagai salah satu syamt untnk memperoleh gelar doktor

Pada Sekolah Pasmarjam Institut Pertsnian Bogor

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2004

: Transformrmsi Kedelai dengan Gen Protinase Inhibitor II

Judul Disertasi

melalui Agrobacterium dan Penembakan Partikel.
Nama Mahasiswa

: Saptowo Jumali Pardal

NRF

: 975100

Program Studi

: Agronomi

Menyetujui :
1, Komisi Pembimbing

Prof.Dr.1r. G.A. Wattimena, MSc.
Ketua

Dr. Ir. M. Herman. MSc.

Dr. Ir. Hajrioll Aswidinnoor, MSc.

Anggota

Anggota

2. Ketua Program Studi Agronomi

$3-

Dr. Ir. Hairial Aswidinnoor, MSc.

Tanggal Lulus : 27 Januari 2004
...

Vlll

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kota Sukoharj&olo, Propinsi Jawa Tengah pada tanggal 12
Jdi 1963 dan merupakan anak ketujuh dmi sembilan h u d a r a dari ayah W.
Ponomuwono (almarhum tahun 2002) dan ibu Mursiyem ( h h u m a h tahun 1980).

Pada tanggal 26 Juni 1 988 penulis menikah dengan Retno Sri Titi Lestari dan kini telah
dikaruniai tiga anak bernarna Rizka Tarnania Saptari, Aditya Rahmat Saputro, dan
Septrian Adhi Saputro.

Penulis menarnatkan sekolah dasar di SD Negeri Jetis I Sukoharjo pada tahun

1975, Sekolah Menengah Pertarna di SMP Negeri I Sukohajo pada tahun 1979 dm
Sekolah Menengah Atas (SMA) Negeri 111 Surakarta pada tahun 1982. Selepas dari SMA
penulis kuliah S 1 di Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada-Yogyakarta clan lulus
pada tahun 1987. Seteiah ldus S1 penulis langsung diterirna bekerja di Balai Penelitian

Tanaman Pangan (BALITTAN) Bogor, tepatnya pada tanggal 1 Nopember 1987. Penulis
mulai merintis penelitian Bioteknologi, khususnya di bidang Kultur Jaringan Tanaman
Pangan. Pada tahun 1989, penulis mengikuti program training tentang Teknik Kultur
Jaringan Tanaman di Kagawa, Jepang s e l m 8 bulan. Kemudian pada tahun 1990

penulis mendapt kesempatan tugas belajar S2 dari Badan Litbang Pertanian melalui
proyek ARMPI di Program Pascasarjana IPB,program studi Agronomi dan lulus pada
tahun 1993. Tahun 1 994 penulis mengikuti training tentang Tmsformasi Genetik di ICI
Seed Iowa-Amerika Serikat selama 1 tahun. Kemudian pa& tahun 1998, penulis tugas
belajar S3 di IPB atas biaya dari Badan Litbang Pertanian melalui proyek ARMPII.
Hingga kini penulis merupakan staf peneliti di Balai Penelitian Bioteknologi dan

Surnberdaya Genetik Pertanian (BALITBIOGEN) Bogor.

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Ailah SWT atas h a t dan karunianya,
sehingga penulis berhasil menyelesaikan disertasi yang berjudd: Transformasi Kedelai

dengan Gen Proteinme Inhibitor I1 melalui Agrobacferiurn dan Penembakan Partikel.
Disertasi ini berisi beberapa hasil penelitian yang merupakan bagian dari proyek
penelitian APBN di Bditbiogen tentang Kultur jaringan dan transfomasi kedelai dengan
gen proteinase inhibitor I1 untuk ketahanan terhadap hama penggerek polong kedelai

(1996-2003). Disertasi ini terdiri dari 7 bab dm lampiran yang memuat tentang hasil
penelitian tmmformasi kedelai dengan gen proteinme inhibitor I1 rnelalui Agrobacterium

clan Penembakan Partikel serta evaluasi tanaman hasil transformasi dm progeninya.
Penulis sangat menyadari bahwa penelitian dan disertasi ini masih banyak

k e k m g a n dan kelernahannya dikarenakan penelitian regenerasi tanaman kedelai secara
in vitro masib sangat sulit d m rendah tingkat keberhasilmya. Demikian juga penelitian

tentang transformasi tanaman kedelai masih sangat terbatas, khususnya di Indonesia ha1

ini baru dilakukau oleh beberapa orang saja. Bahkan untuk mforrnasi kedelai dengan
gen proteinme inhibitorll bam pertama kali dilakukan baik di dunia maupun di

Indonesia. Pendis berharap semoga hasil penelitian ini ada manfaatnya paling tidak dapat
memacu penelitian serupa di masa-masa mendatang, tentunya dengm perenanam clan
metode penelitian yang lebih baik clan terarah.

Ddarn pelaksmaan penelitian dan penulisan disertasi ini penuIis banyak
rnendapatkan bantuan dari berbagai fihak baik berupa materi, fikiran maupun saran-saran

dan bimbingan. Untuk itu, melaiui tulisan ini pendis dengan tulus menyampaikan ucapan
terima kasih kepada:

1. Bapak Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena, MSc sebagai Ketua Komisi Pembimbing yang

telah banyak memberikan bimbingan, arahan dan dorongan semangat sejak
penyusunan usulan penelitian, pelaksanaan dm penulisan disertasi.
2. Bapak

Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, MSc. sebagai anggota komisi sekaligus ketua

program shldi Agronomi Pascasarajana IPB yang telah banyak memkrikan bmtuan
berupa bimbingan, masukan dan amhm kepada penulis dengan penuh kesabaran,

kearifan dan keterbukaan.
3. Bapak

Dr. Ir. M. Herman,

MSc. sebagai anggota komisi pembimbing dm

penanggung jawab RPTP Transformasi Kedelai di Balitbiogen yang telah

mengijinkan penulis untuk menggudcan

proyek penelitian beliau sebga

bahan disertasi clan juga bantuan lain berupa bimbingan dan &an

yang sangat

berarti bagi penyelesaian program doktor ini.
4. Kepala Balitbiogen Bogor yang telah memberi ijin tugas belajar dan fasiiitas untuk

penelitian kepada penulis, sehingga penulis dapat melaksanakan kuliah dan penelitian

dengan tenang dan lancar.
5. Kepala Proyek ARMP II Badan Litbang Pertmian di Jakarta yang telah memberikan
beasiswa program doktor kepada penulis.

6. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB yang telah memberikan ijin clan kesempatan kepada
penulis unhk rnengikuti program doktor di program studi Agronomi.
7. Kedua orang tuaku yang tercinta, Bapak W. Ponomurwono dan Ibu Mursiyem

(dmarhurn) yang telah membesarkan dan mendidik penulis dengan penuh semangat,
kesabaran, pengurbanan dan kasih sayang yang tiada terbalaskan.

8. Kedua me-u

yang tercinta, Bapak Saslrosupadmo (almarhum) dan Ibu Suratni

yang banyak memberikan dorongan semangat kepada penulis ddam menyelesaikan

studi S3 ini.

9. Istriku tercinta, Retno Sri Titi Lestari yang selalu setia mendampingi dan memberikm
dorongan semangat kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan studi S3 ini

dengan tenang dan lancar.
10. Rekan-reh sekerja, Drs. Edy Listanto, Dra. Diani Damayanti, Slarnet Ssi., Tri

Indraini R. Utami, SP., Umar, Muslih, Riri, Endang Ibrahim dan semua fihak yang

telah ikut membantu kelancaran pelaksanaan penelitian ini.
Akhimya, hampan penulis semoga semua amal baik dari rnereka yang telah
membantu penulis mendapatkan pahala yang beriipat ganda dari Allah SWT, amin.

Bogor, Januari 2004

Penulis,

Saptowo J. Pardal

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................

.

BAB I PENDMULUAN
Latar Belakang .......................................................................................
Tujuan Penelitian ...................................................................................
Hipotesis ................................................................................................
Kegunaan Penelitian ..............................................................................
Kerangka Pemikiran ..............................................................................
Alur Penelitian .......................................................................................

BAB I1.TINJAUAN PUSTAKA
Kedelai ........................... ........................................................................
Bama Penggerek Polong Kedelai .........................
. . . .......................
Protease dm Protease inhibitor ...........................................................
Regenerasi Tanaman Kedelai In Vitro ..................................................
Transfomasi Kedelai .............................................................................
Transformasi Kedelai dengan Agrobacterium .......................................
Transforrnasi Kedelai dengan Penembakan Partikel .............................
Gen PenandaPenyeleksi ........................................................................

xvii

1

4
5

5
6
7

8
12
15

20
24
26
31

36

.

BAB 111 TRANSFORMASI DAN REGENERASI TANAMAN KEDELAI
DENGAN GEN GUS DAN PROTEINASE INHIBTOR 11
Pendahuluan ...........................................................................................
Bahan dan Metode .................................................................................
Hasil dan Pembahasan .....................................................................
Kesimpulan ............................................................................................

BAB IV.EVALUASI TANAMAN KEDELAI HASIL TRANSFORMASI
Pendahuluan ...........................................................................................
Bahan dan Metode .................................................................................
Hasil dan Pembahasan ...........................................................................
Kesimpulan ............................................................................................

.

37
38
44
66

67
68
72
81

BAE V PEMBAHASAN UMUM ...................................................................

82

BAB VI . KESIMPULAN U M U M DAN SARAN
Kesimpulan Umum ................................................................................
Saran .......................................................................................................

89
90

BAB VII. DAFTAR PUSTAKA ............................................................... ........

91

LAMPIMN ........................................................................................................ 104

xiv

DAFTAR TABEL
Teks
-

Halaman

Hasil uji GUS positif pada eksplan embrio muda kedelai hasil
transfonnasi melalui Agrobacterium tumefaciens ..................................

45

H a i l uji GUS positif pada eksplan kotiledon muda kedelai hasil
transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens ..................................

45

Hasil uji GUS positif pada eksplan embrio muda kedelai hasil
transformasi melalui Penembakan Partikel ............................................

49

Hasil uji GUS positif pada eksplan kotiledon muda kedelai hasil
transformasi melalui Penembakan Partikel ...........................................
Hasil regenerasi dan seleksi eksplan kotiledon muda kedelai hasil
transformasi Agmbacterium pada media yang mengandung Kanamisin
200 mg/l ..................................................................................................

Hasil regenerasi dan seleksi eksplan kotiledon muda kedelai hasil
transformasi melalui Penembakan Partikel tahap I pada media yang
mengandung Basta 3 mgll ......................................................................

Hasil regenerasi clan seleksi eksplan kotiledon muda kedelai hasil
transformasi melalui Penembztkan Partikel tahap 11 pada media yang
mengandung Basta 3 mgA ......................................................................
Hasil uji PCR pada tanaman kedelai hasil transfomasi melalui A.
tumefacien ..............................................................................................
Hasil uji PCR pada tanaman kedelai hasil transformasi melalui
Penembakan Parti kel ..............................................................................
Hasil uji PCR pada tanaman kedelai WPzRl dan ATt R1......................
Hasil bioasai kedelai WP2R1 dan ATI R Iterhadap E. zinckenella, Tr. ..

Lam~iran

Hdaman

I.

Komposisi media kultur untuk transformasi kedelai ..............................

105

2.

Hasil uji bioasai 50 tanaman kedelai WP2Rl terhadap larva E.
zinckenella. Tr. di FUT Balitbio .............................. ..............................

108

Hasil uji bioasai 30 tanaman kedelai ATIRl terhadap larva E.
zinckenella. Tr. di FUT Bditbio ............................................................

109

Hasil analisis chi-square terhadap data hasil PCR galur W 2 R I d m
ATIRl.....................................................................................................

110

5.

Deskripsi varietas kedelai Wilis .............................................................

111

6.

Deskripsi varietas kedelai Tidar .............................................................

112

3.

4.

13. Hasil uji bioasai tanaman kedelai R1hasil transfomasi terhadap Efiella
zincknella, Tr. di Fasilitas Uji Terbatas, Balitbiogen...............
.
......... . .

81

I . Tanaman kedelai sebagai sumber ekspian dan cara penendaan bunga

mekar ..................,....................,
...............,...............,.......

113

2. Polong muda kedelai umur 14- 15 hari setelah anthesis ...... ............ .........

114

............................,..........

115

3. Peta plasrnidpCambia 130 1 (gen gus dan hph)

4. Peta plasmid pRQ-6 (gen gus dan hph) ................,....................

.....,..... ...

116

5. Peta plasmid pGApinIl (gen pinn dm nptII) clan plasmids pTW-a (gen
pinlI dan bar) .............................,.......... ..................- ..........................- ......

117

6. Mesin penembak gen (gene gun) d m mekanisme kerjanya .....................

118

7. Prosedur pembuatan suspensi emas ........,,......., ........,......

.

.......................

119

8. Prosedur pelekatan (presipitasi)DNA pada partikel emas ......................

120

9. Larva, pupa dan imago Etiella zinekenella,Tr. di lab. Semngga N T

.
.
....................... ...............................

Balitbiogen Bogor ......................

+.

xvi ii

121

BAB I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kedelai merupakan komoditas pangan prioritas k d u a setelah padi di Indonesia.
Kebutuhan akan kedelai semakin meningkat, sedangkan produksi kedelai nasiond belurn

mencukupi. Usaha peningkatan p d u k s i kedelai terus dilakukan, namun masih banyak
kendala yang dihadapinya. Salah satu kendala yang sangat besar adalah serangan hama

kedelai.

Penggerek polong (Efiella zinchnella, Treitschke) merupakan hama penting
kedelai yang masih sulit dikendalikan (MsMfoto et al., 1991; Nurdin et al., 1995;).
Serangan hama ini mengakibatkan polong kedelai berlubang dan biji rusak/habis dimakan

oleh larva serangga ini, sehingga dapat menunrnkan hasil kedelai. Rata-rata luas areal
serangan selcitar 1 1 -000ha setiap tahunnya dengan mta-rata kehilangan hasil berkisar 2040% berdasarkan hasil uji lapang. Bahkan, intensitas serangan dapat mencapai 90%
apabila tidak dilakukan pengendalian (Nurdin, 1 984).
Pengendalian hama penggerek polong urnmya dilakukan secara kimiawi

dengan pestisida ataupun secara biologis dengan musuh alami. Namun cara pengendalian
ini klum memkrikan h i 1 yang diharapkan (Nurdin et al.,1995). Pengendalian hama
dengan pestisida kurang afektif dan kurang arnan terhadap lingkungan. Kurang efektif

karena larva penggerek polong biasanya menggerek masuk ke dalarn polong untuk
memakan biji kedelai, sehingga sulit dikenali serangannya dari luar dan sulit dijangkau
oleh pestisida. Kurang aman karena residu pestisida yang dihasilkan akan
mencernarilmerusak lingkungan.

Penggunaan varietas kedelai tahan hama penggerek polong merupakan altematif

cara pengendalian hama yang lebih murah, efektif dan aman terhadap lingkungan.
Penggunaan varietas than dapat mengurangi aplikasi pestisida, sehingga dapat

menghemat biaya p d u k s i dan mengurangi bahaya residu yang sering ditimbulkan oleh
bahan aktif pestisida. Pada sistem pertanian yang berkelanjutan, cam inilah yang sangat
sesuai (Soekarna dan Warnoto, 1985;

1 990).

Turnipseed, S.G. dan M. Kogan, 1987; Sticklen,

Namun, perakitan varietas kedelai khan melalui persilangan biasa sering

menghadapi kendala dengan belum diketernukannya varietas kedelai yang betul-betul

tahan terhadap penggerek polong yang dapat d i j a d h sebagai surnber gen ketahanan
(Tenghno et al., 1985;

Nurdin, 1984). S e h y a k delapn varietas kedelzti yang

dinyatakan relatif tahan terhrldap penggerek polong (diuji di Mojokerto, jawa Timur),

ternyata setelah diuji coba talc satupun menunjukkan ke-

yang tinggi terhadap

penggerek polong (Tengkano et al., 1985). Djuwarso er al., (1 994) telah melakukan

skrining ketdman terhadap 339 galur kedelai dalm dua m u s h kemarau berturut-turut

di daerah Iampung (1 991- 1992), ternyata juga tidak ada satupun galur yang memiliki

ketahrtnan terhadap penggerek polong (rata-ratamengalami kerusakan polong 60%).
Adanya

kemajuan teknologi

pataman,

khususnya bidang

bioteknologi

memunglunkan orang untuk menghasilkan kultivar tanaman tahan sifat tertentu melalui
rekayasa genetika (Hilder et al., 1993; Christou, 1994; Herman, 1996). Beberapa gen

ketahanan terhrtdap sifat tertentu, s e m i gen cry (Bt), Mitinuse, dan protense inhibitor
(pin) kini sudah berhasil diisolasi dan bahkan telah banyak digunakan untuk transformasi

genetik tanaman sehingga diperoleh tanaman transgenik yang tahan terhadap sifat
tertentu (Sticklen, 1990; Asano et al., 1991 ;Herman, 1996).

Gen proteinase inhibitor (pin) mempakan gen pengkode senyawa anti nutrisi yang

&pat menghambat kerja ensirn proteolitik (proteinase) di dalam perut serangga (Ryan,
1990). Gen ini dapat digunakan dalarn perakitan tanaman transgenik tahan terhdap hama

tertentu (Hilder et al., 1993). Apabila gen ini berhasil ditransfer ke ddam kromosom
tamman dan diekspresikan dengan

baik, maka serangga yang memakan tanaman

transgenik tersebut akan terganggu sistem pencernaannya, terharnbat pertumbuhannya
dan akhirnya mati j ika level penghambatannya tinggi (Jhonson, et al., 1 990).

Serine proteinase inhibitors (tripsin dan kimotripsin inhibitor) telah menunjukkan

keefektifannya menghambat perkembangan lama beberapa jenis Lepidoptera, diantaranya
Ostriniu mbilalis (Steffens et al., 1978; Larocque dan Houseman, I 990), Manduca sexta

(Shukle dan Murdock, 1983), Heliothw zea dm Spodoptera exigua (Broadway clan
Duffey, 1986) dan juga Heliocoverpa armigera (Johnson et al., 1993). Contoh

keberhasilan penggunaan gen proteinase inhibitor untuk transfomasi genetik tamman
antara lain padi oleh Xu, et al., ( 1 996) dan ubi jalar oleh Newell, ef al., (1 995) (dengan

gen tripsin inhibitor cowpea). Kemudian Jhonson, et al., (1 990) menggunakan gm
proteinase inhibitor I dan II pada tanaman tembakau.
Saat ini telah banyak dikembangkan metode tramforrnasi genetik &naman,
dintaranya yang paling banyak digunakan adalah dengan vektor Agrobacterium dan gene
gun (particle bombardment) (Hinchee et al., 1 988; Klein et al., 1988; Sauter et al., 1991).

Durt teknik transformasi ini masing-masing memiliki kelebihan dan k e k m g m . Metode
Agrobncteriurn merupakan teknik transfer gen secara alami (ti& langsung) yang sangat
sederhana dan murah, karena pada prinsipnya gen interest disisipkan ke plasmid T-DNA
Agro bacterium Idu diinokulasikan ke jaringan target yang telah dilukai. Namun

kelemahannya W w a tidak semua jenis tanaman dapat diinfeksi oleh Agrobacferium,

sehingga aplikasinya sangat terbatas pada beberapa jenis tanaman saja. Sedangkan
penembakan partikel merupakan teknik transfer gen secara langsung yang sangat praktis
dan efektif. Gen interest ditembakkan secara mekanik dengan mesin penembak, sehingga

teknik ini dapat diterapkan pa& hampir semua jenis tanaman yang sebelumnya tidak
ciapat dilakukan dengan Agrobacferium (Finer and McMullen, 199 1). Namun, tehik ini

memerlukan partikel pembawa DNA yang inert (emc1s/hrngsten) dan mesin penembak
(gene gun) yang mahal harganya, sehingga biaya operasionalnya sangat mahal (Finer er
ai., 1996). Pada penelitian telah dilakukan transfer gen proteinase inhibitor @in) I1

kentang ke dalm tanaman kedelai melalui Agrobacterium tumefuciens dan penembadan
partikel.

1.2. Tujuan Penelitian:

Tujuan utama dari penelitian transformasi kedelai dengan gen proteinase inhibitor
I1 ini adalah sebtgai berikut:
1.

Untuk mendapatkan protoko1 transfomasi kedelai rnelalui vektor
Agrobacterium dan penernbakan partikel yang optimum (terbaik).

2.

Untuk mentransfer gen pinU ke dalam tanman kedeiai melalui vektor
Agrobacterium dan Penembakan Partikel dan meregenerasib eksplan hasil

transformasi secara in vitro.
3. Untuk mendapatkan tanaman kedelai hasil transformasi yang mengandung

gen pin I1 dan tahan terhadap harna penggerek polong.

1 3 . Hipotesa:
1. Metode tmnsformasi, genotipe tanarnan clan jenis eksplan diduga akan

mempengaruhi hasil trmsformasi kedelai.
2. Gen proteinme inhibitor Il kentang kemungkinan besar dapat ditransfer ke

dalam tanaman kedelai rnelalui Agrobacterium ataupun penembakan partikel

dan eksplan transforman tersebut diduga dapat diregenerasikan menjadi
tanaman.
3. Diantars tanaman kedelai hasil transformmi baik melalui Agrobacterium

maupun penembakan partikel kemungkinan ada yang mengandung gen pinU
dm tahan terhadap hama penggerek polong.

1.4. Kegunaan Penelitian

Penelitian transformasi genetik kedelai kultivar Indonesia untuk ketahanan
terhadap harna penggerek polong (Etiella zinckenella, Tr.) secam ilmiah akan &pat

menarnbah pengetahuan di bidang rekayasa genetika tanaman kedelai

dan clapat

rnenambah keragaman genetik kedelai di Indonesia.
Sedangkan secara umurn apabila penelitian ini berhasil akan dihasilkan tanaman
kedelai transgenik yang memiliki ketahanan terhadap hama penggerek polong yang

sampai saat ini masih sdit dikendalikan S a r a konvensional, sehingga dapat

meningkatkan produksi kede1ai tanpa rnerusak lingkungan.

1. Penggerek polong (EtQlla zinckenella, Tr.) merupakan salah satu harna penting

pada kedelai yang hingga saat ini masih sulit dikendalikan. Pengendalian
dengan insektisida kurang efektif dm kurang arnan terhadap lingkungan.
2. Penggunaan varietas kedelai tahan merupakan cara pengendzllian harna yang

sesuai dengan prinsip PHT (Pengendalian Harna Terpadu) karena lebih prakhs,
efektif d m aman terhadap lingkungan.

3. Metode pemuliaan untuk mendapatkan varietas tahan tqpntung pada tujuan,
surnber gen dan elastisitas biologis dari tanaman yang akan dimuliakan.
4. Sumber gen ketahanan terhadap penggerek plong belum didapatkan pada

plasma nutfah kedelai hingga saat ini, sehingga merupakan ken&

daIam

perakitan varietas tahan.
5. Perakitan varietas kedeld tahan penggerek polong melalui teknik rekayasa

genetika merupakan alternatif yang cukup baik. Penyisipan gen kehhmm
serangga seperti gen proteinme inhibitor I1 (pinII) ke dalam genom kedelai

melalui teknik trmsformasi sangat memunglunkan untuk menghasilkan
tamman kedeli transgenik tahan hama penggerek plong.
6. Transformasi kedelai dengan gen pinll belum pernah dilakukan. Pada

penelitian ini dilakukan transformmi meldui Agrobacterium dan Penembakan

Partikel pada varietas Wilis dan Tidar ymg rentan tahadap penggerek polong.

Kedua varietas ini dipilih karena mudah diregenerasikan secara in vitro dan
banyak ditanam oleh petani.

7. Pengujian tanaman kedelai hasil transformasi dapat dilakukan secara molekuler

dan bioasai. Seluruh tahapan penelitian ini dirangkum di dalam Bagan Alir
Penelitian (Gambar 1) berikut ini.

1.6. Alur Penelitian

Tanaman ~ e d e l a i
di rumah kaca

Polong Mada
(umur 14-15 hari setelah anthark)
Isolasi dan sterilisasi eksplan
Kotiledon Muda

\

1
(
hokulasi A. tumefackm

Penembakan Partikel

Regenerasi & Seleksi

Regenerasi & Seleksi

Uji PCR

Tanaman kedelai R1

terhadnp larva Etiella sp.
Gambar 1. Bagan Alir Penelitian Transformasi Kedelai

BAB 11. TINJAUAN PUSTAKA
11.1. Kedelai
a. Biologi Kedelai

Kedelai diperkirakan k a s a l dari jenis Glycine soja yang banyak turnbuh liar di
Cina, Manchuria dan Korea. Tanaman ini tumbuh merambat dan kulit bijinya sangat

tebal (Basuki, 1991). Kedelai merupakan tanaman semusim, berupa semak rendah,
tumbuh tegak, berdaun lebat dengan beragam morfologi. Tinggi tanaman berkisar
antara 10-200 cm. Jumlah cabang tergantung kultivar dan lingkungan hidup. Kedelai

memiliki 4 tipe dam, yaitu kotiledon (dam biji), b u n primer derhana, daun bertiga
(trifoliate) dan profila (Hidajat, 1985). Bunga termasuk tipe sempurna, besarnya antara

3-7mrn, berwarna ungu atau putih. Penyerbukan terjadi saat bunga masih tertutup.
Polong pertama m u n d sekitar 10-14 hari setelah bunga pertama dan jumlah polong
beragam antara 2-20 dalam setiap kelompok bunga Tiap polong dapat berisi 1-5 biji,
tetapi umumnya 2-3 biji. Polong muda berwarna hijau dan ditumbuhi trikoma. Polong
tua bemama antara kuning hingga kuning kelabu, coklat atau hitam.

Kedelai dapat tumbuh dengan baik pada suhu 25-30°C, tetapi optimal pada suhu
30°C. Kedelai yang tumbuh baik di daerah a i m sedang tic&& dapat tumbuh baik di

daerah iklim tropis. Perbedam ini mempengaruhi tingkat produksi. Kedelai clapat

tumbuh clan berp~oduksidengan baik pada ketinggian 0-1500 meter. Produksi kedelai

lebih tinggi pada dataran tinggi. Cahaya juga mernpunyai penman yang sangat ksar

dalarn proses fisiologis tanaman, seperti fotosintesis, respirasi, pertumbuhan dan
perkembangan tamman. intensitas cahaya dan panjang hari wtoperiodtsitas)

mempengaruhi perhmbuhan dan hasil kedelai. Semakin pendek panjang hari akan

mempercepat waktu berbunga dan panen.

b. Pemuliaan Kedelai
Pemuliaan kedelai di Indonesia mulai dilakukan secara sistematik pada tahun
1 9 1 5 oleh Koch dengan melakukan seleksi pada vztrietas-varietas daerah. Pada tahun
19 1 8 mulai dirnasukkan varietas-varietas berdaya hasil tinggi dari Manchuria, Jepang,

Taiwan dan Amerika Utara. Dua varietas dari Taiwan, yaitu Otan dan Botan (tercatat
sebagai No.16 dan 17) mempunyai arti penting dalam pemdiaan karena sebagi
pangkal tolak perakitan varietas selanjutnya. Seleksi dari varietas No. 16

menghasilkan varietas No. 27 clan dari No. 1 7 dihasilkan No. 28 dan No. 29. Dari
varietas-varietas daerah, terpilih satu varietas yang berasal dari Ciomas Bogor clan

dicatat sebagai No. 30. Dengan hasil-hasil tersebut, Lembaga Penelitian De

Onderafdeling Selectie plan Eeybrige Gewassen van Het Lundbouwkundig Instifuut

Bogor padzt waktu itu, mempunyai enam varietas sebagai modal untuk pekejaan
pemuliaan selanjutnya.
Perakitan varietas kedelai unggul &pat dilakukan melalui tiga cam, yaitu

pemasukan varietas dari luar (introduks9, selelcsi dan persilangan (hibridismzJ.Untuk
seleksi hanya akan berhasil apabila pada bahan yang akan diselelcsi terdapat
keragaman dan dan sifat-sifat genetis yang diinginkan. Keberhasilan pemuliaan

ditentukan oleh adanya variabilitas genetik yang luas clan cara seleksi yang digunakan

untuk menimbulkan perubahan fiekuensi gen. Hal tersebut menunjukkan betapa
pentingnya populasi dasar sebagai sumber dalam perakitan varietas, sedangkan seleksi

harus menjadi jalan untuk memperiuas dan mempertahankan variabilitas genetik agar
sumber tersebut @at

dimanfaatkan dalam jangka waktu lama (Sumamo h l a m

Somaatmadja et al., 1985).
Keragarnan genetik dapat ditimbulkan melalui persilangan, radiasi dan
penggunaan zat kimia (mutugenesis). Sifat-sifat yang diperlukan untuk pembentukan
suatu varietas unggul tersebar dalam koleksi plasma nutfah yang ada. Melalui

persilangan konvensiond akan diperoleh populasi dasar banr yang menjadi wadah
(reservoir) bam hagi keragaman genotip untuk pekerjaan pemuliaan selanjutnya.

Pemilihan varietas-varietas induk yang baik merupakm syarat utarna dalam
pembentukm populasi c b r . Untuk perakitrtn varietas tahan hama penyalut midnya
dapat dilakukan melalui persilangan apabila tersedia varietdplasma nutfah yang

memiliki ketahanan terhadap hama penyakit yang diingmkan (Somaatmadja &lam
Somaatmadja et ai., 1985).

Perakitan varietao kedelai dengan metode pemuliaan non konvensiond seperh

kultur antera, kamgaman somaklonal, hibridisasi somatik dm transformasi genetik
belum banyak dilakukan di Indonesia.
Varietas Wilis dm Tidar merupakan varietas kedelai yang paling banyak

ditanam petani di Indonesia karma keduanya memiliki urnur genjah dan produksi
yang tinggi. Varietas Wilis dilepas pada tahun 1983 yang merupakm hasil seleksi
keturunan persilangan antars varietas Orba x No.1682 oleh Sumamo dkk (Hanarida et

al., 2003). Varietas ini diantaranya memiliki sifat-sifat sebagai berikut:
1. Tinggi tanaman 40-50 cm dengan hasil rata-rata sebesar 1,6 tonha biji kering.

2. Umur berbunga 39 hari dan urnur matang 88 hari.

3. Warm bunga ungu, warna polong tua coklat tua, warm kulit biji kuning dan

bentuk biji oval agak pipih.
4. Kadar protein 37%, War lemak 18%, memiliki sifat tahan rebah

dan agak

tahan terhadap penyakit karat dan virus.
5. Dapat diregenerasikan secara in vitro (Pardal et ul., 1994; ParM et nl., 1W7).
Varietas Tidar dilepas pa& tahun 1987 merupakan hasil mutasi dari B- 1682 yang

dilakukan di AVRDC, Taiwan oleh Sumarno dkk (Hanarida et al., 2003). Varietas ini

memiliki sifat-sifat diantarmya sebagai berikut:
1. Tinggi tanaman 40-60 cm dengan hail rata-rata 1,4 tonha.
2. Umur berbunga 35 hari dan umur matang 75 hari.
3. Warm bunga ungu, warm polong tua coklat tua, kulit biji hijau kekuningan.

4. Kadar protein 37%, lemak 2W!,agak tahankarat dam dan Idat bi bit.
5 . Dapat diregenerasikan secara in vitro (Pardal et al., 1997).

Deskripsi lengkap dari kedelai varietas Wilis dan Tidar disajikan pada Tabel Lampiran

5 dan Tabel Lampiran 6 (Hanarida et al. 2003).

c. Produksi Kedelai

Praduksi kedelai dalam negeri saat ini rnasih belum mencukupi kebutuhan
nasional, sehingga jurnlah impr meningkat terus (Abdulrachman el al., 1999). Selma
sepuluh tahun terakhir ( 1 989- 1 999) produksi kedelai secara nasional mengalami

peningkatan (Manurung, 1 999). Pada tahun 1 999 produksi mencapai 1 .382 j uta ton,
sedangkan tahun sebelumnya hanya 1.305 juta ton. Kenaikan produksi sekitar 0,077
juta ton ini disebabkan oleh penambahan luas panen dm hasil kedelai per hektar, yaitu

dari 1.09juta ha dengan hasil 1.193 to per ha menjadi 1.15 juta ha dengan hasil 1.201
ton per ha (Biro Pusat Statistik, i 999 dan 2000).

11.2. Hama fenggerek Polong Kedelai
a. Biologi

Penggerek polong kedelai yang juga dikenal dengan nama "Lima Bean Pod
Borer" dm "Pea Pod Borer", termasuk ke dalam famili Pyralidae dari ordo
Lepidoptera. Di Indonesia, hama ini ada dua jenis yaitu Etiella zinckenella Treitschke
dan Etiella hobsoni (Butler). Kedua jenis penggerek piong ini tidak mudah

di bedakan, baik secara morfologi rnaupun tingkah lakunya. Perbedaan yang diketahui

hingga saat ini adalah adanya garis putih pada bagian pinggir sayap dari E.
zinckenelIa, sedangkan pada E. hobsoni tidak ada. Selain itu pupa dari E. zinckenella
b e r u k m sedikit lebih besar dari E hobsoni (Naito dan Harnoto, 1984).
Telur penggerek polong berbentuk lonjong seperti buah alpukat berukuran 0,6
x 0,3

mm. Telur diletakkan terpencar atau merupakan kelompok kecil (4- 15 butir)

pa& bagian bawah daun, kelopak bunga atau polong. Telur berwama putih menglulap

dm sehari kemudian menjadi kern&-m&.

Telur yang akan menetas b a r n

jingga dan telur menetas setelah berumur 3-4 hari (Nurdin er a/., 1995). Ulat yang

baru menetas (neonate) barns putih kekuningan dm kemudian berubah menjadi
hijau dengan garis merah mernanjang. Ulat instar 1 clan 2 menggerek kulit polong,
kemudian masuk menggerek biji dan hidup di dalam biji. Setelah instar 2, dat hidup

di luar biji. Ddarn satu polong sering dijumpai lebih dari 1 ekor ulat. Ulat instar akhir
mempunyai panjang 13- 1 5 mm dengan lebar 2-3 rnm. Kepompong berwarna coklat

dengan panjang 8-10 mm dan lebar 2 mm. Setelah 9-1 5 hari, kepompong berubah

menjadi ngengat. Ngengat E zinckenella M a m a keabu-abuan dan mempunyai garis
putih pada sayapnya (Marwoto et a/., 199 1).
b. Serangan

Penggerek polong E. zinckenella tersebar luas di s e l h dunia. Selain

menyerang kedelai, harna ini dapat pula menyerang Crotalaria juncea, C.

usarumoensis, C.striafa, Vigna sinemis, Cassia spp., Dolichos spp., Tephrosia spp.,

dan Phaseolus lunatus.
Penggerek polong merusak pada stadia larva. Larva yang baru menetas akan

memilih tempat di mana polong akan digerek, kemudian membuat benang pintal untuk
selubung dan selanjutnya menggerek polong. Waktu yang diperlukan untuk proses ini

Iebih h a n g satu setengah jam. Selubung putih tersebut sering masih tampak sampai
beberapa hari setelah larva masuk ke dalam polong. Setelah selubung hilang, jdan

masuk terlihat dengan adanya bintik berwarna coklat tua. Lawa insfar satu yang teIah
menggerek polong selanjutnya menggerek biji dan hidup di dalam biji. Dari luar biji
tarnpak kepalanya bergerak-gerak dan membayang melalui kulit biji. Setelah berganti

kulit larva hidup di luar biji atau rnencari polong sehat untuk diserang (Naito et a!.,
1983).

Selarna masa pertumbuhan larva penggerek polong dapat merusak lebih dari
satu polong. Larva berpindah ke polong lain dengan cara membuat lubang gerekan

baru untuk k e l w dan rnasuk ke polong lain dengan membuat lubang baru. Serangan
pada polong kedua ditandai dengan adanya lubang gerekan yang kntuknya bundar
pada kulit polong. Menurut Tengkano et a]., (1991), pada polong yang terserang dan

telah ditinggalkan oleh larva penggerek polong dijumpai dua lubang gerekan dan
butir-butir kotoran berwarna kuning atau coklat muda yang terikat satu sama lainnya
oleh benang pintal. Sisa biji setelah dimakan juga sering dijumpai dalam polong yang
terserang. Aki bat serangan penggerek, polong kedelai menjadi kempis karena bijinya

dimakan habis atau sebagian, dan &pat pula gugur. Secara visual mirip dengan tanda
serangan pengisap polong. Serangan penggerek polong akan menurunkan hasil

kedelai, baik secara kuantitatif maupun kualitatif.
c. Pengendalian

Cara pengendalian hama penggerek polong kedeiai umumnya dilakukan secara

kimia dengan pemakaian insektisida. Cam ini mudah dilakukan dan hasihya dapat
segera diketahui. Akan tetapi, cam ini menimbdkm dampak negatif seperti timbulnya

resistensi dan resurjensi harna terhadap insektisida tertentu, matinya serangga berguna,

dan merusak lingkungan. Disamping itu, keberfiasilannya kadang-Mang tidak seperti

yang diharapkan, padahal biayanya cukup tinggi (Nurdin el al., 1995). Oleh karma itu
perlu diterapkan metode pengendalian hama secara twpadu (PHT), yaitu cara
pengendalian dengan memadukan komponen-kornpnen pengendalian yang sesuai,

secara ekonomi menguntungkan dan secara sosial d a p t diterima serta berwawasan
lingkungan (Turnipseed dan Kogan, 1987).

Beberapa komponen PHT yang dapat diterapkan antara lain meliputi cara
krcocok tanam, cara kimiawi, cara biologi, dm penggunaan varietas tahan. Cara
yang terakhir m e r u p a h komponen pokok dalam PHT. Cara ini mudah dilakukan,
tidak berdampak negatif terhadap lingkungan dan sesuai dengan m - c a r a
pengendalian lainnya. Namun hingga saat ini belum berhasil ditemukan varietas

kedelai yang ktul-betul tahan tefhadap penggerek polong (Nurdin

et

al., 1995).

Skrining ketahanan terhadap 33 9 galurlvarietas kedelai selama dua musirn kemarau
berturut-turut di Larnpung, tidak satupm menunjukkan ketahanan terhadap penggerek

polong (Djuwarso

et

al., 1994). Beberap varietas yang dikatakan tahan seperti

varietas Guntur dan No. 29 (Djuwarso dm Naito, 199I), pada uji konfirmasi ternyata
tidak menunjukkan ketahanan yang tinggi terhadap penggerek polong (Nurdin ec al.,
1995).

a. Prolease

Prodease merupakan ensim yang mengkatalis pelepasan mtai peptida dan
asam amino dari protein dan ensim ini banyak terdapat di dalarn perut/midgut

serangga (Hilder ef al., 1 993). Ensim ini dikelompokkan menjadi dua macam, yaitu

endopepiiduse yang dapat memotong mtai protein pada situs spesifik, dan

eksopeptidase yang dapat memotong/memisahkan asam amino dari ujung C atau N
terminal. Proteinuse rnerupakanproieme yang bersifat endopeptidase.

Telah diketahui sejak lama bahwa seperti vertebrata, serangga hanya memiliki
serin proteinme seperti tripsin drtn kimotripsin, d m aspart&proteinme seperti pepsin.

Proteinase ini optimal aktivitasnya pada pH basa antara 8- 1 1 3 . Namun studi terbaru

menunjukkan bahwa pada perut serangga juga dijurnpai kelas lain protease (Wolfson
dan Murdock, 1 990; Christeller ef al., I 992). Kelas protease ini termasuk sistein
(thiol) proleinase dan asprial (kcrrboksil) proteinuse. Serangga yang banyak

rnenggunakan sistein proleinuse

untuk pencemaan protein adalah kelompok

Coleoptera yang memiliki pH lebih asam (pH 5-7). Sedangkan aspartat profeinase

aktif p d a pH dibawah 43. Berkenaan dengan hal ini telah diduga bahwa penggunaan
sistein proteinae merupakan proses adaptasi dari m g g a herbivora sehingga tetap

dapat mernakan biji kacang-kacangan (Iegum) dan jaringan tamman lain yang secara
almi merniliki kandungan serin proteinase inhibitor yang tinggi (Ryan, 1990).
b. Proieme inhibiior

Protease inhibitor (PI) merupakan protein/ensim yang secara konstitutif
terdapat di berbagai bagim tanaman atau dapat diinduksi produksinya oleh adanya
serangan herbivora. Protease inhibitor tanaman bervariasi ukurannya dari 400080.000 Monomer (Richardson, 1 997),tetapi biasanya sekitar 8000-20+000Monomer
misahya serin protswe inhibitors p d a legurn. Beberapa dari inhibitor hi, terutama
yang memiliki k

t molekul subunitnya sekitar 10.000 biasanya mampu menghambat

dua macam ensirn setiap molekul inhibitornya. Jenis inhibitor ini dikenal s e w tipe

" double heacled' atau Bowmun-Birk. Sebagai contoh inhibitor Bowman-Birk dari
kedelai @at maghambat tripsin dan kimotripsin (Seidl dan Liener, 1971). Tetapi ada
juga inhibitor tipe ini yang hanya maghambat satu jenis ensim, misalnya inhibitor
Bowman-Birk cowpea hanya menghambat tripsin.
Aktivitas proteme inhibitor sangat tergantung p d a pH. Umurnnya aktivitas

inbibitor akan tinggi p&

pH netral dan akan menurun pada pH asadrendah hingga

pH 3. Mekanisme keja dari protease inhibitor addah bersaing antara molekul

inhibitor dan substrat yang memiliki situs penempelan (binding site) sama {Hilder et
al., 1993).
Tanaman kentang dan tomat memiliki dua macarn seril~eproteinase inhibitor
yang sangat kuat yang disebut Inhibitor I (8 100 Monomer) dm Inhibitor I1 (Monomer

12.300 Monomer) (Plunkett el ai., 1982). Inhibitor I merniliki saw sisi aktif yang

menghambat kimotripsin clan ssdikit tripsin, sedan*

Inhibitor I1 rnemiliki dua sisi

aktif yang dapat menghambat tripsin clan hotripsin. Kedua inhibitor disintesis
sebagai prekursor dan mengalami rnodifikasi p& post-mlasi (Cleveland et al.,
1 987) membentuk protein jadi yang akan disimpan di dalam vakuola (Shurnway er al.,
1970).

c. Proferne inhibitor sebagai senyawa pertahanan ( p ~ o t e ~agenl)
w
Studi tentang pe@

protease inhibitor tanaman terhadap serangan harna

mulai dilakukan polda awal tahun 1947 oleh Mickel dan Standish yang mengamati
adanya p e r t u m b h tidak normal larva hama tertentu yang diturnbuthn p d a ekstmk

kedelai. Kemudian studi tersebut mengilhami Lipke dan stafnya ( tahun 1954 ) untuk
mempelajari toksisitas inhibitor kedelai terhadap perkembangan Tribolium conyhsum
(hama umum biji kedelai) (Hilder et al., 1993). Meskipun hasilnya negatif terhadap
tripsin inhibitor, studi

ini menunjukkan adanya inhibitor spesifik terhadap ensim

pencernaan larva TriboIiunr. Selanjutnya inhibitor ini berhasil diisolasi dan temyah

dapat maghambat dengan sempurna proses pencemaan protein (proteolisis) di perut

(midgut) larva ?i corijiuurn dan T. castamurn (Birk et al., 19631, tetapi tidak aktif
terhadap tripsin dan kimotripsin mamalia.

Studi lain menunjukkan bahwa protease inhibitor pada Vigna unguicmrlata juga
dapat berperan sebagai antimetabolik terhadap

perkembangan larva ?i confusum

ketika diujikan dalarn rnakanan buatan (Gatehouse dan Hilder, 1 98 8). Applebaum et
al. 1964 (Hilder et al., 1993) mendemontrasikan bahwa inhibitor pada lima bean,

ovomucoid, kunitz inhibitor kedelai, dm Bowman-Birk inhibitor kedeIai dapat

menghambat salah satu protease midgut yang diisolasi dari larva Tenebrio molitar
yang diketahui mengandung ensim menyerupai tripsin dan kimotripsin (Zwilling,

1 968). Kunitz inhibitor selanjutnya juga