Pemisahan Biomassa Dan Eksopolisakarida Porphyridium Cruentum Menggunakan Ultrafiltrasi Serta Pengaruhnya Terhadap Aktivitas Inhibisi Α Glukosidase
PEMISAHAN BIOMASSA DAN EKSOPOLISAKARIDA
Porphyridium cruentum MENGGUNAKAN ULTRAFILTRASI
SERTA PENGARUHNYA TERHADAP AKTIVITAS INHIBISI
α-GLUKOSIDASE
HASANAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Pemisahan Biomassa dan
Eksopolisakarida Porphyridium cruentum Menggunakan Ultrafiltrasi serta
Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase” adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
Hasanah
NIM C351130131
RINGKASAN
HASANAH. Pemisahan Biomassa dan Eksopolisakarida Porphyridium cruentum
Menggunakan Ultrafiltrasi serta Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi
α-Glukosidase. Dibimbing oleh IRIANI SETYANINGSIH dan UJU.
Porphyridium cruentum merupakan mikroalga merah uniseluler yang
menyekresikan eksopolisakarida (EPS) ke dalam medium kultivasi. Biomassa dan
EPS P. cruentum memiliki potensi untuk dikembangkan dalam bidang farmasi,
nutraseutika, serta kosmeseutika. Konsentrasi garam tinggi dan volume air yang
besar pada media kultivasi menyebabkan biaya produksi tinggi pada pemanenan
dan pemisahan EPS. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pengaruh membran
ultrafiltrasi (UF) terhadap karakteristik permeat (viskositas, pH, salinitas), kadar
abu dan kadar garam EPS, serta aktivitas inhibisi α-glukosidase pada pemanenan
dan pemisahan EPS. Penelitian yang dilakukan yaitu pengujian kandungan logam
berat pada air laut, kultivasi mikroalga P. cruentum menggunakan media Guillard
selama 40 hari, karakterisasi membran UF 0.05 dan 0.01 µm, pemanenan
menggunakan UF 0.05 µm, pemisahan EPS menggunakan UF 0.01 µm,
pengeringan biomassa dan EPS menggunakan freeze dryer.
Kandungan logam berat (Hg, As, Cd, Cu, Pb, Zn, Ni) air laut yang digunakan
masih berada dalam standar baku mutu untuk biota laut. Sel P. cruentum umur
40 hari berbentuk bulat, berwarna merah, dan diameternya 4.86-9.93 µm. Nilai OD,
pH, salinitas, dan viskositas P. cruentum berturut-turut 0.83 ± 0.004, 7.64 ± 0.005,
47.23 ± 0.05‰, 7.97 ± 0.25 cp.
Permeabilitas membran UF 0.05 µm (137.32 L/m2jam) lebih besar
dibandingkan membran UF 0.01 µm (62.38 L/m2jam). Nilai fluks kultur yang
dipanen menggunakan UF 0.05 µm mengalami penurunan dari 131.37 L/m2jam ke
94.75 L/m2jam dan rejeksi biomassa 96%. Membran UF 0.05 µm mampu menahan
biomassa P. cruentum. Fraksi retentat 1 (R1) dan permeat 1 (P1) dihasilkan pada
proses pemanenan. Fraksi retentat merupakan bagian yang tertahan di membran
sedangkan permeat merupakan bagian yang lolos dari membran. Nilai fluks pada
pemisahan EPS menggunakan UF 0.01 µm mengalami penurunan dari
58.11 L/m2jam ke 51.53 L/m2jam. Penurunan fluks menunjukkan fouling pada
membran UF. Fraksi retentat 2 (R2) dan permeat 2 (P2) dihasilkan pada proses
pemisahan EPS. Proses pemisahan EPS menyebabkan terjadinya penurunan
viskositas, salinitas, berat kering, kadar abu, dan kadar garam dari P1 ke P2.
Senyawa yang teridentifikasi menggunakan Fourier Transformed Infrared
(FTIR) pada P1 dan P2 adalah simetrik COO dan C-O dengan COOH serta COOasam uronik. Eksopolisakarida P. cruentum mengandung maltoheptosa yang dapat
berperan sebagai immunomodulator. Jumlah maltoheptosa yaitu P1 (12.42 g/L), R2
(14.19 g/L), dan P2 (16.11 g/L).
Nilai Inhibition Concentration (IC50) inhibisi α-glukosidase P. cruentum
yaitu P1 (419.06 µg/mL), R1 (425.48 µg/mL), P2 (178.67 µg/mL), dan R2
(502.25 µg/mL). Aktivitas inhibisi α-glukosidase terbaik pada P2 178.67 µg/mL.
Penggunaan membran UF pada proses pemisahan EPS memengaruhi komposisi
EPS sehingga juga berpengaruh terhadap aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Kata kunci : eksopolisakarida, α-glukosidase, P. cruentum, ultrafiltrasi
SUMMARY
HASANAH. Separation of Biomass and Exopolysaccharide of Porphyridium
cruentum Using Ultrafiltration and its effect on the Activity of α-glucosidase
Inhibition. Supervised by IRIANI SETYANINGSIH and UJU.
Porphyridium cruentum is unicellular red microalga secreted
exopolysaccharide (EPS) into culture medium. Biomass and EPS of P. cruentum
potential for pharmaceutical, nutraceutical, and cosmeceutical products.
Unfortunately, high concentration of salt and large volume of water in cultivation
media cause high costs of biomass harvesting and EPS separation. This study aims
to determine the effect of UF membrane to permeat (viscosity, pH, salinity), ash
and salt content of EPS, and the best α-glucosidase inhibition activity in harvesting
and EPS separation. This research include analysis content of heavy metals in sea
water, cultivation of P. cruentum using Guillard media for 40 days, characterization
of UF membrane 0.05 and 0.01 µm, harvesting using UF 0.05 µm, separation of
EPS using UF 0.01 µm, drying of biomass and EPS using freeze dryer.
Heavy metals content (Hg, As, Cd, Cu, Pb, Zn, Ni) in sea water met
standard for marine biota. Characteristics of P. cruentum cell for 40 days were
round, red, and size 4.86-9.93 μm. Optical density, pH, salinity, and viscosity in
culture were 0.83 ± 0.004, 7.64 ± 0.005, 47.23 ± 0.05‰ and 7.97 ± 0.25 cp
respectively.
Membrane permeability of UF 0.05 μm (137.32 L/m2 h bar) was higher
than UF 0.01 μm (62.38 L/m2 h bar). Culture flux was harvested using UF 0.05 μm
have decreasing from 131.37 to 94.75 L/m2h and biomass rejection 96%.
Membrane of UF 0.05 µm was able to retain biomass of P. cruentum. Retentate 1
(R1) and permeate 1 (P1) were produced in harvesting process. Retentate is part of
membrane that can be restrained while permeate is part of membran that can be
passed. Flux was separated using UF 0.01 μm have decreasing from 58.11 to 51.53
L/m2h. The decreasing of flux showed fouling in UF membrane. Retentate 2 (R2)
and permeate 2 (P2) was produced in EPS separation. Separation process using UF
led to decrease of viscosity, salinity, dry weight, ash content, and salt content from
P1 to P2.
Compounds identified by Fourier Transformed Infrared (FTIR) were
symetric COO- and C-O with –COOH and COO-uronic acid in P1 and P2.
Exopolysaccharide of P. cruentum mainly was composed by maltoheptosa so that
it is potential to be used immunomodulatory. The amount of maltoheptosa was P1
(12.42 g/L), R2 (14.19 g/L), and P3 (16.11 g/L).
Inhibition Concentration (IC50) values of P. cruentum α-glucosidase
inhibition were P1 (419.06 µg/mL), R1 (425.48 µg/mL), P2 (178.67 µg/mL), and
R2 (502.25 µg/mL). The best IC50 of α-glucosidase inhibiton was P2 178.67 µg/mL.
Using of UF membrane in EPS separation process affected on composition of EPS.
Change of EPS composition also affected on α-glucosidase inhibition activity.
Keywords : exopolysaccharide, α-glucosidase, P. cruentum, ultrafiltration
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PEMISAHAN BIOMASSA DAN EKSOPOLISAKARIDA
Porphyridium cruentum MENGGUNAKAN ULTRAFILTRASI
SERTA PENGARUHNYA TERHADAP AKTIVITAS INHIBISI
α-GLUKOSIDASE
HASANAH
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Tati Nurhayati, SPi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan
karuniaNya, sehingga penyusunan tesis ini dapat terselesaikan. Tema yang dipilih
dalam tesis ini adalah “Pemisahan Biomassa dan Eksopolisakarida Porphyridium
cruentum Menggunakan Ultrafiltrasi serta Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi
α-Glukosidase”.
Penulisan tesis ini mendapat banyak dukungan dari berbagai pihak. Pada
kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada pihak yang telah bersedia membantu, di antaranya adalah :
1 Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS dan Bapak Dr Eng Uju, SPi MSi sebagai dosen
pembimbing yang memberikan bimbingan, saran, motivasi, dan semangat
kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan dengan baik.
2 Prof Dr Joko Santoso sebagai Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan.
3 Dr Ir Wini Trilaksani, MSc sebagai Ketua Program Studi S2 Departemen
Teknologi Hasil Perairan.
4 Dr Tati Nurhayati, SPi MSi sebagai dosen penguji dalam sidang akhir tesis yang
memberikan banyak saran untuk perbaikan tesis ini.
5 Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi sebagai perwakilan dari Program Studi yang
bersedia memberikan masukan untuk perbaikan tesis ini.
6 Direktorat Perguruan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan beasiswa studi di
Pascasarjana IPB.
7 Kementerian Riset dan Teknologi (Kemenristek) dan Direktorat Perguruan
Tinggi (DIKTI) atas dana penelitian institusi tahun 2015 dengan judul
“Pengembangan Produk Biomedis Antidiabetes” kontrak nomor :
083/SP2H/PL/Dit.Litbamas/11/2015 tanggal 5 Februari 2015 dengan Dr
Desniar, SPi MSi sebagai ketua peneliti.
8 Kedua orang tua Gunarto dan Paijah, suami Yudhi Prasetyo, dan saudara Yuli
Minarsih, Sulastri dan Hariyanto yang memberikan banyak dukungan dan
semangat.
9 Teman-teman Pasca THP 2013, THP angkatan 48, staf dan laboran atas bantuan
dan dukungannya.
Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan
khususnya dalam bidang perikanan dan kelautan.
Bogor, November 2016
Hasanah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
2
2
2
3
3
2 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Kerja
Kultivasi P. cruentum
Karakterisasi Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Pemanenan P. cruentum Menggunakan UF 0.05 µm
Pemisahan Eksopolisakarida Menggunakan UF 0.01 µm
Pengeringan Biomassa dan Ekspolisakarida P. cruentum
Prosedur Analisis
4
4
4
4
5
6
6
7
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kandungan Logam Berat pada Air Laut
Karakteristik P. cruentum
Karakteristik Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Karakteristik Permeat pada Pemanenan P. cruentum
Karakteristik Permeat pada Pemisahan Eksopolisakarida
Karakteristik Biomassa P. cruentum
Karakteristik Eksopolisakarida P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase
12
13
13
14
17
18
19
22
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
27
27
DAFTAR PUSTAKA
28
LAMPIRAN
33
RIWAYAT HIDUP
44
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Reaksi inhibisi α-glukosidase
Kandungan logam berat pada air laut
Karakteristik P1
Karakteristik P2
Karakteristik biomassa P. cruentum
Karakteristik komposisi kimia EPS P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase polisakarida
11
12
16
18
18
20
25
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Diagram alir kultivasi dan pemanenan P. cruentum
Skema proses pemanenan P. cruentum
Skema proses pemisahan EPS P. cruentum
Sel P. cruentum perbesaran 40 kali
Karakteristik membran UF 0.05 dan 0.01 µm pada berbagai tekanan
Fluks terhadap waktu pada proses pemanenan
Rejeksi biomassa pada proses pemanenan
VCF terhadap fluks pada proses pemanenan
Parameter fluks dengan (a) waktu (b) VCF pada berbagai tekanan
Gugus fungsi EPS P. cruentum
Jumlah EPS P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase biomassa dan EPS P. cruentum
Struktur EPS P. cruentum
Mekanisme akarbosa
5
6
7
13
14
15
16
16
17
21
22
23
24
24
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Komposisi media Guillard F/2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase biomassa (R1)
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase P1
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase R2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase P2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase akarbosa
35
35
37
38
40
41
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Porphyridium cruentum merupakan mikroalga merah uniseluler dengan
habitat di air laut, berbentuk bulat, dan selnya dikelilingi oleh eksopolisakarida
(EPS) (Richmond dan Hu 2013). Biomassa P. cruentum mengandung karbohidrat
32.1%, protein 34.1%, lipid, pigmen (klorofil, karotenoid, fikobilliprotein)
(Fuentes et al. 2000). Patel et al. (2013) melaporkan bahwa berat molekul EPS
2.39 x105 g/mol, mengandung tiga monosakarida netral utama yaitu galaktosa 40%,
xilosa 30%, glukosa 20%, dan satu asam glukuronik 10%.
Biomassa dan EPS P. cruentum dapat menurunkan glukosa darah.
Liu et al. (2005) melaporkan bahwa pemberian biomassa P. cruentum dengan
konsentrasi 600 dan 1200 mg/kg berat badan tikus diabetes selama 18 hari dapat
menurunkan glukosa darah dan meningkatkan aktivitas Superoxide Dismutase
(SOD). Jian et al. (2006) menyatakan bahwa pemberian EPS P. cruentum dengan
konsentrasi 150 dan 300 mg/kg berat badan tikus diabetes selama 21 hari dapat
menurunkan glukosa darah, meningkatkan aktivitas SOD, dan melindungi sel
pankreas.
Biomassa dan EPS P. cruentum memiliki potensi untuk dikembangkan
namun pemisahannya dalam skala besar dan kelimpahan garam yang tinggi pada
medium kultivasi menimbulkan masalah baru. Teknik pemanenan P. cruentum
yang sering digunakan saat ini adalah sentrifugasi. Sentrifugasi memerlukan energi
besar sehingga menyebabkan biaya produksi mahal untuk skala besar. Dassey dan
Theegala (2013) menyatakan untuk mendapatkan pemanenan mikroalga dengan
efisiensi 94% diperlukan energi 20 kW jam/m3. Ahmad et al. (2014) melaporkan
pemanenan mikroalga sebanyak 600 mL berturut-turut menggunakan sentrifugasi
dapat memisahkan biomassa 99% selama 30 menit, mikrofiltrasi (MF) 90-98%,
selama 40 menit dan koagulasi 70-80% selama 40 menit. Biomassa yang
didapatkan pada proses pemanenan menggunakan MF mendekati sentrifugasi.
Mikrofiltrasi dapat digunakan untuk pemanenan mikroalga dalam skala besar
karena biaya operasinya lebih murah. Bilad et al. (2014) menyatakan pemanenan
Phaedactylum tricornutum menggunakan MF Polyvinylidene Fluoride (PVDF-9)
memerlukan energi 0.27 kW jam/m3 dengan efisiensi 98%.
Mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi (UF) dapat digunakan untuk pemanenan
mikroalga Chlorella pyrenoidosa (Sun et al. 2013). Ultrafiltrasi memiliki ketahanan
terhadap fouling internal dan kemampuan menahan sel lebih baik dibandingkan MF
(Baker 2012). Ultrafiltrasi dapat dijadikan salah satu altenatif untuk pemanenan
P. cruentum. Wang et al. (2011) menyatakan proses pemisahan menggunakan UF
efektif jika memiliki nilai fluks dan selektifitas (rejeksi) tinggi. Nilai fluks
dipengaruhi oleh tekanan operasi dan fouling yang terjadi pada membran. Fluks
berkaitan dengan volume pada umpan. Penurunan volume umpan selama proses
operasi didefinisikan dengan Volume Concentration Factor (VCF).
Penggunaan ukuran membran UF dapat memengaruhi kemurnian
komponen aktif. Polisakarida yang dipisahkan dengan UF 3, 8, dan 12 kDa
memiliki kemurnian 51%, 51.5%, 53.4% (Sun et al. 2011). Aktivitas inhibisi
α-glukosidase dipengaruhi oleh kemurniannya. Ekstrak kasar Polyopes lancifolia
2
konsentrasi 5000 ppm mempunyai aktivitas inhibisi α-glukosidase sebesar 52.2%.
Inhibisi α-glukosidase fraksi etil asetat Polyopes lancifolia sebesar 52.4% (100
ppm) (Kim et al. 2010).
Teknik pemisahan dapat memengaruhi kualitas biomassa dan EPS,
komponen aktif, serta inhibisi α-glukosidase. Proses UF diduga akan memengaruhi
komposisi biomassa dan EPS P. cruentum sehingga juga berpengaruh terhadap
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pemanenan biomassa P. cruentum menggunakan
UF dilanjutkan pemisahan EPS dari permeat hasil pemanenan belum pernah diteliti.
Informasi aktivitas inhibisi α-glukosidase dari biomassa dan EPS P. cruentum
menggunakan proses UF belum pernah dilaporkan sehingga perlu dilakukan
penelitian tersebut.
Rumusan Masalah
Porphyridium cruentum dikultivasi menggunakan air laut sehingga
memiliki kelimpahan garam yang tinggi pada medium kultivasi dan menyebabkan
kadar garam dan abunya tinggi. Teknik pemanenan P. cruentum yang sering
digunakan saat ini adalah sentrifugasi. Sentrifugasi memerlukan energi besar
sehingga menyebabkan biaya produksi mahal untuk skala besar maka diperlukan
metode pemanenan yang tepat. Ultrafiltrasi merupakan salah satu alternatif metode
pemanenan yang dapat digunakan karena biayanya lebih murah, mudah
dioperasikan, dan dapat digunakan pada skala besar. Metode pemanenan dapat
memengaruhi rendemen, komponen aktif, dan aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Biomassa dan EPS P. cruentum menggunakan sentrifugasi diketahui memiliki
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pemanenan biomassa dan pemisahan EPS
menggunakan ultrafiltrasi diduga akan memengaruhi komposisi biomassa dan EPS
P. cruentum sehingga juga berpengaruh terhadap aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1 Menentukan pengaruh membran UF terhadap karakteristik permeat pada
pemanenan dan pemisahan EPS
2 Menentukan pengaruh membran UF terhadap kadar garam dan abu EPS
3 Menentukan pengaruh membran UF terhadap komposisi biomassa dan EPS
P. cruentum serta aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Hipotesis
Ukuran membran UF memengaruhi karakteristik permeat, kadar abu, kadar
garam, komposisi biomassa dan EPS, serta aktivitas inhibisi α-glukosidase
P. cruentum.
3
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian antara lain memberikan informasi karakteristik permeat
pada pemanenan dan pemisahan EPS menggunakan membran UF, mengetahui
pengaruh ukuran membran UF terhadap komposisi biomassa dan EPS serta
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Manfaat penelitian ini juga sebagai informasi
bahwa P. cruentum dapat dijadikan sebagai bahan baku farmasi yang potensial.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian dilakukan pada biomassa dan EPS P. cruentum. Ultrafiltrasi yang
digunakan berukuran 0.05 dan 0.01 µm. Pengujian yang dilakukan antara lain kadar
air, kadar garam, kadar abu, Optical Density (OD), salinitas, pH, viskositas, fluks,
rejeksi, VCF, gugus fungsi, identifikasi jenis dan jumlah gula sederhana EPS serta
aktivitas inhibisi α-glukosidase.
4
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2015 sampai dengan Januari
2016 di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan 2, Laboratorium Mikrobiologi
Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Studi Biofarmaka,
Laboratorium Botani dan Mikrobiologi, LIPI Cibinong, Laboratorium Badan
Pengkajian dan Penerapan Teknologi, PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroalga
P. cruentum diperoleh dari Laboratorium Marikultur Pusat Penelitian OseanografiLIPI Ancol, Jakarta Utara, air laut, media Guillard, etanol teknis 96%, enzim
α-glukosidase (Sigma), p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (Sigma), Bovine
Serum Albumin (BSA) (Sigma).
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah membran UF jenis propilen
0.05 µm dengan area permukaan efektif 0.45 m2 dan polisulfon 0.01 µm dengan
area permukaan efektif 0.25 m2 dari GDP Filter, Bandung, Indonesia, UV,
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), lampu neon Hannoch 40 watt,
refrigerator, spektrofotometer UV VIS RS (UV-2500) (Culver, USA), viscometer
brookfield FF-LV (Massachusett, USA), freeze dryer EYELA FDU 1200 (Tokyo,
Japan), Elisa reader EpochTm (Winooski, USA), Tensor 37 (USA), sentrifus dingin
Himac CR 21G (Ibaraki, Japan), salinometer (Multi 340i WTW 82362 Weilhem),
pH meter (Eutech 664416), stopwatch, alat gelas dan kultivasi.
Prosedur Kerja
Penelitian dibagi menjadi lima tahapan, yaitu : 1) pengujian kandungan
logam berat pada air laut dan kultivasi mikroalga P. cruentum 2) karakterisasi
membran UF 3) pemanenan menggunakan UF 0.05 µm 4) pemisahan EPS
menggunakan UF 0.01 µm 5) pengeringan biomassa dan EPS menggunakan freeze
dryer. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
Kultivasi P. cruentum
Air laut sebelum digunakan dilakukan pengujian logam berat dan jika
hasilnya masih dalam ambang batas yang diperbolehkan maka air laut dapat
digunakan untuk kultivasi. Kultivasi dilakukan dengan mencampurkan media
Guillard (Lampiran 1) dan stok P. cruentum sebanyak 25% (v/v) dengan air laut
75% (v/v). Kultivasi dilakukan selama 40 hari dengan penyinaran lampu dan aerasi
24 jam. Karakterisasi berupa pengukuran OD, pH, salinitas, viskositas, dan ukuran
sel dilakukan pada kultur P. cruentum umur 40 hari.
5
Porphyridium cruentum
Kultivasi selama 40 hari
R1 (Biomassa)
Pemanenan menggunakan
UF 0.05 µm
Freeze drying
R1 kering
(Biomassa)
Karakterisasi :
Berat kering
Kadar air
Kadar abu
Kadar garam
Inhibisi α-glukosidase
P1
(EPS)
R2
(EPS)
P2
(EPS)
Presipitasi
etanol
Presipitasi
etanol
R2 kering
(EPS)
Karakterisasi :
● Fluks
● Viskositas
● Rejeksi
● Salinitas
● VCF
● pH
● Jumlah sel (OD)
Presipitasi etanol
Pemisahan menggunakan
UF 0.01 µm
Freeze drying
Karakterisasi :
● Ukuran sel
● Jumlah sel (OD)
● Viskositas
● pH
● Salinitas
Freeze drying
Karakterisasi :
● Fluks
● VCF
● Viskositas
● Salinitas
● pH
P1 kering
(EPS)
Freeze drying
P2 kering
(EPS)
Karakterisasi :
Gugus fungsi
Jenis dan jumlah gula
Ket : P : Permeat
R : Retentat
EPS : Eksopolisakarida
Gambar 1 Diagram alir kultivasi dan pemanenan P. cruentum
Karakterisasi Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Akuades sebagai umpan dilewatkan pada membran UF. Proses UF
dilakukan pada tekanan transmembran 0.25-1.25 bar. Nilai permeabilitas membran
ditentukan dengan cara menghitung gradien plot grafik antara nilai fluks (J) sebagai
sumbu Y dan tekanan transmembran (∆P) sebagai sumbu X.
6
Pemanenan P. cruentum Menggunakan UF 0.05 µm
Pemanenan biomassa pada medium kultivasi dilakukan dengan mengambil
mikroalga umur 40 hari sebanyak 5 L sebagai umpan dan menggunakannya untuk
proses UF. Proses UF menghasilkan retentat 1 (R1), selanjutnya dikembalikan ke
dalam umpan sedangkan permeat 1 (P1) dipisahkan pada tempat yang berbeda.
Proses pemanenan dilakukan pada tekanan transmembran 1 bar. Skema proses
pemanenan biomassa P. cruentum dapat dilihat pada Gambar 2.
3
4
6
7
5
2
Keterangan :
1 Umpan
2 Pompa
3 Pressure gauge
4 Membran UF 0.05 µm
1
5
6
7
8
8
Retentat
Pressure gauge
Valve
Permeat
Gambar 2 Skema proses pemanenan P. cruentum menggunakan UF 0.05 µm
Pengukuran fluks, rejeksi, dan VCF dihitung pada selang satu menit sekali.
Total fraksi P1 di akhir pemanenan diukur nilai OD, viskositas, salinitas, dan pH.
Pencucian membran UF 0.05 µm dilakukan menggunakan air selama 1 jam
kemudian NaOH 1% selama 15 menit. Karakterisasi membran dilakukan kembali
menggunakan akuades. Membran UF dapat dilakukan untuk proses pemanenan
kembali apabila fluks sudah kembali seperti semula.
Pemisahan Eksopolisakarida Menggunakan UF 0.01 µm (Modifikasi Patel
et al. 2013)
Pemisahan EPS dilakukan dengan menyaring kembali P1 pada pemanenan
sebagai umpan. Umpan dilewatkan pada membran UF 0.01 µm menggunakan
tekanan transmembran 0.5, 1, dan 1.5 bar. Proses UF menghasilkan retentat 2 (R2),
selanjutnya dikembalikan ke dalam umpan sedangkan permeat 2 (P2) dipisahkan
pada tempat yang berbeda. Skema proses pemisahan EPS dengan membran UF 0.01
µm dapat dilihat pada Gambar 3. Pengukuran fluks dan VCF dihitung pada selang
5 menit sekali. Total fraksi P2 diukur nilai viskositas, salinitas, dan pH. Pencucian
membran UF 0.01 µm dilakukan menggunakan air selama 1 jam kemudian NaOH
1% selama 15 menit. Karakterisasi membran dilakukan kembali menggunakan
akuades. Membran UF dapat dilakukan untuk proses pemisahan EPS kembali
apabila fluks membran UF sudah kembali seperti semula.
7
3
6
7
4
5
2
8
1
Keterangan :
1 Umpan
2 Pompa
3 Pressure gauge
4 Membran UF 0.01 µm
5
6
7
8
Retentat
Pressure gauge
Valve
Permeat
Gambar 3 Skema proses pemisahan EPS P. cruentum menggunakan UF 0.01 µm
Pengeringan Biomassa dan Eksopolisakarida P. cruentum
Biomassa basah P. cruentum (R1) didapatkan dengan mengalirkan air laut
sebanyak 300 mL pada proses backwash membran UF. Biomassa basah
dikeringkan menggunakan freeze dryer sehingga diperoleh biomassa kering. Fraksi
P1, P2, dan R2 yang diperoleh ditambahkan etanol teknis 96% dengan rasio 1: 0.75.
Hasil presipitasi kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer selama 3 jam
untuk mendapatkan berat kering EPS. Biomassa dan EPS kering dianalisis berat
kering, kadar air, kadar abu, kadar garam, dan inhibisi α-glukosidase.
Eksopolisakarida dianalisis gugus fungsi dan diidentifikasi jenis serta jumlah gula
sederhananya.
Prosedur Analisis
Analisis Logam Berat Cd, Cu, Pb, Zn, Ni (APHA 2012, 3111-C)
Sampel air laut dimasukkan ke dalam botol polietilen yang telah diberi
label, selanjutnya sampel disaring dengan menggunakan kertas saring nekleopor
0.45 μm. Sampel air laut yang telah disaring kemudian di awetkan dengan
menggunakan HNO3 pekat hingga nilai pH air laut berada di bawah dua dan
disimpan.
Sampel air laut yang telah disaring sebanyak 200 mL, ditambahkan 1 mL
Ammonium Pyrrolidine Dithiocorbamate (APDC) 4% kemudian dikocok. Larutan
ditambahkan 10 mL Methyl Isobutyl Keton (MIBK), dikocok selama ± 30 s. Larutan
didiamkan sampai terdapat dua fase yaitu fase organik (bagian atas) dan fase
anorganik (bagian bawah). Fase organik diambil dan dimasukkan ke labu kemudian
dilakukan pengukuran dengan AAS untuk Cd, Cu, Pb, Zn, dan Ni.
8
Analisis Logam Berat Hg (APHA 2012, 3112-B)
Sampel air laut sebanyak 100 mL dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer
250 mL. Air laut ditambahkan 5 mL H2SO4, 2.5 mL HNO3, dan 15 mL KMNO4.
Larutan didiamkan selama 15 menit kemudian ditambahkan 8 mL K2S2O8 dan
dipanaskan selama 8 jam pada water bath dengan suhu 90 °C. Larutan didinginkan
pada suhu ruang. Larutan ditambahkan NaCl hidroksiamin untuk menurunkan
kelebihan KMnO4 kemudian ditambahkan 5 mL SnCl2. Larutan diukur dengan
menggunakan AAS.
Analisis Logam Berat As (APHA 2012, 3114-B)
Larutan As (III) sebanyak 10 mL dilarutkan ke dalam 1000 mL air yang
mengandung 5 mL HNO3 dan sebagai larutan standar (1mL = 0.100 µg As (III)).
Sampel air laut dan larutan standar masing-masing diambil 50 mL kemudian
ditambahkan 1 mL 2.5 N H2SO4 dan 5 mL dari 5% K2S2O8. Sampel dan standar
direbus selama 30-40 menit atau volume sampai 10 mL kemudian diencerkan
sampai 50 mL dan dilakukan pengukuran menggunakan AAS.
Analisis Kadar Air (SNI 01-2891-1992)
Prinsip analisis kadar air adalah mengetahui jumlah air yang terdapat pada
suatu bahan. Cawan porselen dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama
satu jam. Cawan porselen yang sudah dikeringkan dalam oven dimasukkan dalam
desikator (30 menit) kemudian ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 1-2 g dan
dimasukkan ke dalam cawan porselen yang sudah kering serta diketahui beratnya.
Cawan berisi sampel dimasukkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3 jam
atau sampai beratnya konstan. Cawan dimasukkan ke dalam desikator (30 menit)
kemudian ditimbang. Kadar air dihitung dengan rumus:
W1
Kadar air (%) =
x 100%
W
Ket : W = Bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
W1 = Bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Analisis Kadar Abu (SNI 01-2891-1992, butir 6.1)
Sampel 3 g ditimbang ke dalam sebuah cawan porselen yang telah diketahui
bobotnya. Sampel diarangkan di atas nyala pembakar kemudian diabukan dalam
tanur listrik pada suhu maksimum 550 °C sampai pengabuan sempurna. Sampel
didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
dihitung dengan rumus :
W1 – W2
Kadar abu (%) =
x 100%
W
Ket : W = Bobot sampel sebelum diabukan (g)
W1 = Bobot sampel + cawan setelah diabukan (g)
W2 = Bobot cawan kosong (g)
9
Analisis Kadar Garam (SNI 01-2359-1991)
Sampel 3 g dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan
100 mL akuades secara bertahap dan larutan disaring. Filtrat yang dihasilkan
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades sampai tanda
tera. Larutan sampel 5 mL diambil dan dimasukkan ke labu Erlenmeyer dan
ditambahkan 3 mL larutan K2CrO4 2 % kemudian dilakukan titrasi dengan AgNO3
0.1 N sampai terbentuk endapan merah bata. Kadar garam dihitung dengan rumus
:
Kadar Garam (%) = (V AgNO3 × N AgNO3 × Mr.NaCl × fp × 100 %) / mg sampel
Analisis Ukuran Sel (Scheggia et al. 2008)
Kultur sel pada umur 40 hari diambil sebanyak 5 mL. Cairan diambil
menggunakan pipet tetes dan diletakkan pada kaca objek. Ukuran sel diamati
menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 kali.
Analisis Kepadatan Biomassa P. cruentum (Sobczuk et al. 2006)
Kultur P. cruentum umur 40 hari diambil sebanyak 5 mL dari akuarium.
Kultur kemudian dimasukkan ke dalam kuvet dengan air laut sebagai blanko.
Pengukuran OD P. cruentum dilakukan menggunakan spektofotometer pada
panjang gelombang 760 nm. Nilai yang tertera pada layar dicatat sebagai OD
P. cruentum.
Analisis Viskositas (Bhatnagar et al. 2014)
Viskositas medium kultivasi diukur menggunakan Viskometer FF LV.
Viskometer diletakkan pada posisi yang tepat kemudian spindel LV 1 dipasang ke
alat tersebut. Viskometer diturunkan sampai spindel tercelup pada batas yang
ditentukan. Viskometer dihidupkan dan spindel berputar dengan kecepatan 60 rpm
selama 1 menit. Angka yang tertera pada viskometer kemudian dibaca.
Analisis pH dan Salinitas
Permeat 1 dan P2 diambil sebanyak 30 mL. Permeat diukur menggunakan
pH meter dan salinometer. Kalibrasi pH meter dilakukan sebelum pengukuran
sampel. Pengukuran sampel menggunakan pH meter dilakukan dengan
mencelupkan elektroda ke dalam sampel, diputar-putar sampai homogen kemudian
tekan hold dan tunggu sampai angka pada layar stabil selanjutnya angka yang
tertera dicatat. Pengukuran salinometer dilakukan dengan mencelupkan elektroda
ke dalam sampel kemudian tekan run/enter sampai angka pada layar stabil
selanjutnya angka yang tertera dicatat.
Analisis Fluks (Wang et al. 2011)
Fluks adalah jumlah volume permeat yang melewati satuan luas membran
dalam waktu tertentu dengan adanya gaya dorong dalam hal ini berupa tekanan.
Secara sistematis fluks dirumuskan sebagai berikut :
10
J =
Q
A
Keterangan :
J = Fluks (L/m2jam)
Q = Aliran permeat per waktu
V = Volume permeat (L)
A = Luas permukaan membran (m2)
t = Waktu (jam)
V
=
Axt
=
Analisis Koefisien Rejeksi Biomassa (Wang et al. 2011)
Koefisien rejeksi adalah fraksi konsentrasi zat terlarut yang tidak menembus
membran, dan dirumuskan sebagai :
R = 1 - Cp
Cf
x 100%
Keterangan :
R = Koefisien rejeksi (%)
Cp = Konsentrasi zat terlarut dalam permeat (OD permeat)
Cf = Konsentrasi zat terlarut dalam umpan (OD umpan)
Analisis Volume Concentration Factor (Sun et al. 2013)
Volume Concentration Factor adalah penurunan volume umpan selama
proses operasi dan dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
V0
VCF = V0-Vt
Keterangan :
VCF = Volume Concentration Factor
V0
= Volume umpan pada waktu ke-0
Vt
= Volume umpan yang berkurang pada waktu ke-t
Analisis Inhibisi α-glukosidase (Gouda et al. 2015)
Pengujian inhibisi α-glukosidase menggunakan larutan blanko (B0), larutan
kontrol blanko (B1), larutan sampel (S0), dan larutan kontrol sampel (S1). Larutan
blanko dibuat dengan mencampurkan larutan 4 mM p-nitrophenyl
α-D-glucopyranoside (0.05 mL), 2 U/mL α-glukosidase (0.025 mL) dalam buffer
fosfat 0.05 M (pH 7) dan ditambahkan DMSO (1 mL). Perbedaan antara blanko dan
kontrol blanko adalah kontrol blanko tidak menggunakan enzim α-glukosidase.
Blanko dan kontrol blanko diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit dan reaksi
perubahan warna terjadi. Reaksi dihentikan dengan penambahan Na2CO3 0.2 M
(750 µL). Aktivitas enzim diukur pada absorbansi 405 nm.
Larutan sampel dibuat dengan mencampurkan larutan 4 mM p-nitrophenyl
α-D-glucopyranoside (0.05 mL), 2 U/mL α-glukosidase (0.025 mL) dalam buffer
fosfat 0.05 M (pH 7) dan ditambahkan sampel (1 mL). Perbedaan antara sampel
dan kontrol sampel adalah kontrol sampel tidak menggunakan enzim
α-glukosidase. Sampel dan kontrol sampel diinkubasi pada suhu 37 °C selama
15 menit dan reaksi perubahan warna terjadi. Reaksi dihentikan dengan
11
penambahan Na2CO3 0.2 M (750 µL). Aktivitas enzim diukur pada absorbansi
405 nm.
Konsentrasi larutan akarbosa 1% dibuat dari tablet Glucobay sebagai
standar. Tablet Glucobay dilarutkan dalam akuades dan HCl 2N (1:1) dengan
konsentrasi 1% (b/v), kemudian disentrifugasi dan supernatan diambil sebanyak
10 μL, lalu dimasukkan ke dalam campuran reaksi seperti dalam sampel. Reaksi
enzim selengkapnya untuk satu sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Reaksi inhibisi α-glukosidase
Jenis
Sampel
DMSO
Substrat
Enzim
Na2CO3
B0
B1
S0
1 mL
1mL
1mL
50 µL
50 µL
50 µL
25 µL
25 µL
Inkubasi 37 °C selama 15 menit
750 µL 750 µL
750 µL
S1
1 mL
50 µL
750 µL
Inhibisi α-glukosidase dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
Inhibisi (%) =
C-S
C
x 100%
Keterangan :
C
= Absorbansi blanko dikurangin kontrol blanko
S
= Absorbansi sampel dikurangin kontrol sampel
Analisis Gugus Fungsi (Mishra dan Jha 2009)
Gugus fungsi dari EPS dideteksi dengan Fourier Transformed Infrared
(FTIR). Pelet untuk analisis FTIR diperoleh dengan memasukkan 200 mg Kbr dan
2 mg sampel ke dalam mortar serta dicampurkan sampai homogen. Sampel
dipadatkan dan dimasukkan ke dalam Tensor 37. Pengukuran sampel uji dilakukan
pada bilangan gelombang antara 4000-500 cm-1. Spektra FTIR yang dihasilkan
menunjukkan puncak-puncak serapan bilangan gelombang dari sampel uji.
Gugus-gugus fungsi sampel uji ditentukan berdasarkan puncak serapan bilangan
gelombang yang terdeteksi.
Analisis Jenis dan Jumlah Gula Sederhana (modifikasi Emega et al. 2012)
Eksopolisakarida 0.6 g dihidrolisis dengan 2M H2SO4 30 mL selama
15 menit pada suhu 121 °C pada tabung gelas yang ditutup. Eksopolisakarida
terhidrolisis kemudian dinetralkan dengan NH4OH 14 M dan difilter dengan kertas
saring. Komposisi monosakarida ditentukan dengan KCKT menggunakan kolom
Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) dan detektor RI dengan rata-rata aliran 1
mL/menit pada suhu 35 °C dan fase gerak 0.008 N H2SO4. Volume diinjeksikan
20 µL. Area puncak diperkirakan sebagai komposisi monomer.
12
Analisis Data
Data yang didapatkan diolah secara deskriptif dan menggunakan standar
deviasi. Data inhibisi α-glukosidase dihitung persen inhibisi dan dilakukan regresi
linear serta ditentukan nilai IC50.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kandungan Logam Berat pada Air Laut
Logam berat adalah unsur-unsur kimia dengan densitas lebih besar dari
5 g/cm3, terletak di sudut kanan bawah pada sistem periodik unsur, mempunyai
afinitas yang tinggi terhadap S dan biasanya bernomor atom 22 sampai 92, dari
periode empat sampai tujuh (Setiawan 2013). Logam berat dapat mencemari air
laut. Air laut adalah suatu komponen yang berinteraksi dengan lingkungan daratan,
dimana buangan limbah dari daratan akan bermuara ke laut (Ika et al. 2012).
Biomassa dan EPS P. cruentum pada penelitian ini akan digunakan ke arah
farmasi sehingga harus aman dari logam berat. Media kultivasi mikroalga
P. cruentum menggunakan air laut sehingga perlu diketahui kadar kandungan
logam beratnya. Kandungan logam berat pada media air laut P. cruentum dapat
dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Kandungan logam berat pada air laut
No.
1
2
3
4
5
6
7
Parameter
Raksa (Hg)
Arsen (As)
Kadmium (Cd)
Tembaga (Cu)
Timbal (Pb)
Seng (Zn)
Nikel (Ni)
Ket : DL
BM
Satuan
µg/L
µg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
DL
0.020
0.044
0.001
0.003
0.006
0.004
0.003
Sampel
Porphyridium cruentum MENGGUNAKAN ULTRAFILTRASI
SERTA PENGARUHNYA TERHADAP AKTIVITAS INHIBISI
α-GLUKOSIDASE
HASANAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Pemisahan Biomassa dan
Eksopolisakarida Porphyridium cruentum Menggunakan Ultrafiltrasi serta
Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase” adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
Hasanah
NIM C351130131
RINGKASAN
HASANAH. Pemisahan Biomassa dan Eksopolisakarida Porphyridium cruentum
Menggunakan Ultrafiltrasi serta Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi
α-Glukosidase. Dibimbing oleh IRIANI SETYANINGSIH dan UJU.
Porphyridium cruentum merupakan mikroalga merah uniseluler yang
menyekresikan eksopolisakarida (EPS) ke dalam medium kultivasi. Biomassa dan
EPS P. cruentum memiliki potensi untuk dikembangkan dalam bidang farmasi,
nutraseutika, serta kosmeseutika. Konsentrasi garam tinggi dan volume air yang
besar pada media kultivasi menyebabkan biaya produksi tinggi pada pemanenan
dan pemisahan EPS. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pengaruh membran
ultrafiltrasi (UF) terhadap karakteristik permeat (viskositas, pH, salinitas), kadar
abu dan kadar garam EPS, serta aktivitas inhibisi α-glukosidase pada pemanenan
dan pemisahan EPS. Penelitian yang dilakukan yaitu pengujian kandungan logam
berat pada air laut, kultivasi mikroalga P. cruentum menggunakan media Guillard
selama 40 hari, karakterisasi membran UF 0.05 dan 0.01 µm, pemanenan
menggunakan UF 0.05 µm, pemisahan EPS menggunakan UF 0.01 µm,
pengeringan biomassa dan EPS menggunakan freeze dryer.
Kandungan logam berat (Hg, As, Cd, Cu, Pb, Zn, Ni) air laut yang digunakan
masih berada dalam standar baku mutu untuk biota laut. Sel P. cruentum umur
40 hari berbentuk bulat, berwarna merah, dan diameternya 4.86-9.93 µm. Nilai OD,
pH, salinitas, dan viskositas P. cruentum berturut-turut 0.83 ± 0.004, 7.64 ± 0.005,
47.23 ± 0.05‰, 7.97 ± 0.25 cp.
Permeabilitas membran UF 0.05 µm (137.32 L/m2jam) lebih besar
dibandingkan membran UF 0.01 µm (62.38 L/m2jam). Nilai fluks kultur yang
dipanen menggunakan UF 0.05 µm mengalami penurunan dari 131.37 L/m2jam ke
94.75 L/m2jam dan rejeksi biomassa 96%. Membran UF 0.05 µm mampu menahan
biomassa P. cruentum. Fraksi retentat 1 (R1) dan permeat 1 (P1) dihasilkan pada
proses pemanenan. Fraksi retentat merupakan bagian yang tertahan di membran
sedangkan permeat merupakan bagian yang lolos dari membran. Nilai fluks pada
pemisahan EPS menggunakan UF 0.01 µm mengalami penurunan dari
58.11 L/m2jam ke 51.53 L/m2jam. Penurunan fluks menunjukkan fouling pada
membran UF. Fraksi retentat 2 (R2) dan permeat 2 (P2) dihasilkan pada proses
pemisahan EPS. Proses pemisahan EPS menyebabkan terjadinya penurunan
viskositas, salinitas, berat kering, kadar abu, dan kadar garam dari P1 ke P2.
Senyawa yang teridentifikasi menggunakan Fourier Transformed Infrared
(FTIR) pada P1 dan P2 adalah simetrik COO dan C-O dengan COOH serta COOasam uronik. Eksopolisakarida P. cruentum mengandung maltoheptosa yang dapat
berperan sebagai immunomodulator. Jumlah maltoheptosa yaitu P1 (12.42 g/L), R2
(14.19 g/L), dan P2 (16.11 g/L).
Nilai Inhibition Concentration (IC50) inhibisi α-glukosidase P. cruentum
yaitu P1 (419.06 µg/mL), R1 (425.48 µg/mL), P2 (178.67 µg/mL), dan R2
(502.25 µg/mL). Aktivitas inhibisi α-glukosidase terbaik pada P2 178.67 µg/mL.
Penggunaan membran UF pada proses pemisahan EPS memengaruhi komposisi
EPS sehingga juga berpengaruh terhadap aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Kata kunci : eksopolisakarida, α-glukosidase, P. cruentum, ultrafiltrasi
SUMMARY
HASANAH. Separation of Biomass and Exopolysaccharide of Porphyridium
cruentum Using Ultrafiltration and its effect on the Activity of α-glucosidase
Inhibition. Supervised by IRIANI SETYANINGSIH and UJU.
Porphyridium cruentum is unicellular red microalga secreted
exopolysaccharide (EPS) into culture medium. Biomass and EPS of P. cruentum
potential for pharmaceutical, nutraceutical, and cosmeceutical products.
Unfortunately, high concentration of salt and large volume of water in cultivation
media cause high costs of biomass harvesting and EPS separation. This study aims
to determine the effect of UF membrane to permeat (viscosity, pH, salinity), ash
and salt content of EPS, and the best α-glucosidase inhibition activity in harvesting
and EPS separation. This research include analysis content of heavy metals in sea
water, cultivation of P. cruentum using Guillard media for 40 days, characterization
of UF membrane 0.05 and 0.01 µm, harvesting using UF 0.05 µm, separation of
EPS using UF 0.01 µm, drying of biomass and EPS using freeze dryer.
Heavy metals content (Hg, As, Cd, Cu, Pb, Zn, Ni) in sea water met
standard for marine biota. Characteristics of P. cruentum cell for 40 days were
round, red, and size 4.86-9.93 μm. Optical density, pH, salinity, and viscosity in
culture were 0.83 ± 0.004, 7.64 ± 0.005, 47.23 ± 0.05‰ and 7.97 ± 0.25 cp
respectively.
Membrane permeability of UF 0.05 μm (137.32 L/m2 h bar) was higher
than UF 0.01 μm (62.38 L/m2 h bar). Culture flux was harvested using UF 0.05 μm
have decreasing from 131.37 to 94.75 L/m2h and biomass rejection 96%.
Membrane of UF 0.05 µm was able to retain biomass of P. cruentum. Retentate 1
(R1) and permeate 1 (P1) were produced in harvesting process. Retentate is part of
membrane that can be restrained while permeate is part of membran that can be
passed. Flux was separated using UF 0.01 μm have decreasing from 58.11 to 51.53
L/m2h. The decreasing of flux showed fouling in UF membrane. Retentate 2 (R2)
and permeate 2 (P2) was produced in EPS separation. Separation process using UF
led to decrease of viscosity, salinity, dry weight, ash content, and salt content from
P1 to P2.
Compounds identified by Fourier Transformed Infrared (FTIR) were
symetric COO- and C-O with –COOH and COO-uronic acid in P1 and P2.
Exopolysaccharide of P. cruentum mainly was composed by maltoheptosa so that
it is potential to be used immunomodulatory. The amount of maltoheptosa was P1
(12.42 g/L), R2 (14.19 g/L), and P3 (16.11 g/L).
Inhibition Concentration (IC50) values of P. cruentum α-glucosidase
inhibition were P1 (419.06 µg/mL), R1 (425.48 µg/mL), P2 (178.67 µg/mL), and
R2 (502.25 µg/mL). The best IC50 of α-glucosidase inhibiton was P2 178.67 µg/mL.
Using of UF membrane in EPS separation process affected on composition of EPS.
Change of EPS composition also affected on α-glucosidase inhibition activity.
Keywords : exopolysaccharide, α-glucosidase, P. cruentum, ultrafiltration
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PEMISAHAN BIOMASSA DAN EKSOPOLISAKARIDA
Porphyridium cruentum MENGGUNAKAN ULTRAFILTRASI
SERTA PENGARUHNYA TERHADAP AKTIVITAS INHIBISI
α-GLUKOSIDASE
HASANAH
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Tati Nurhayati, SPi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan
karuniaNya, sehingga penyusunan tesis ini dapat terselesaikan. Tema yang dipilih
dalam tesis ini adalah “Pemisahan Biomassa dan Eksopolisakarida Porphyridium
cruentum Menggunakan Ultrafiltrasi serta Pengaruhnya terhadap Aktivitas Inhibisi
α-Glukosidase”.
Penulisan tesis ini mendapat banyak dukungan dari berbagai pihak. Pada
kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada pihak yang telah bersedia membantu, di antaranya adalah :
1 Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS dan Bapak Dr Eng Uju, SPi MSi sebagai dosen
pembimbing yang memberikan bimbingan, saran, motivasi, dan semangat
kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan dengan baik.
2 Prof Dr Joko Santoso sebagai Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan.
3 Dr Ir Wini Trilaksani, MSc sebagai Ketua Program Studi S2 Departemen
Teknologi Hasil Perairan.
4 Dr Tati Nurhayati, SPi MSi sebagai dosen penguji dalam sidang akhir tesis yang
memberikan banyak saran untuk perbaikan tesis ini.
5 Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi sebagai perwakilan dari Program Studi yang
bersedia memberikan masukan untuk perbaikan tesis ini.
6 Direktorat Perguruan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan beasiswa studi di
Pascasarjana IPB.
7 Kementerian Riset dan Teknologi (Kemenristek) dan Direktorat Perguruan
Tinggi (DIKTI) atas dana penelitian institusi tahun 2015 dengan judul
“Pengembangan Produk Biomedis Antidiabetes” kontrak nomor :
083/SP2H/PL/Dit.Litbamas/11/2015 tanggal 5 Februari 2015 dengan Dr
Desniar, SPi MSi sebagai ketua peneliti.
8 Kedua orang tua Gunarto dan Paijah, suami Yudhi Prasetyo, dan saudara Yuli
Minarsih, Sulastri dan Hariyanto yang memberikan banyak dukungan dan
semangat.
9 Teman-teman Pasca THP 2013, THP angkatan 48, staf dan laboran atas bantuan
dan dukungannya.
Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan
khususnya dalam bidang perikanan dan kelautan.
Bogor, November 2016
Hasanah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
2
2
2
3
3
2 METODE
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Kerja
Kultivasi P. cruentum
Karakterisasi Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Pemanenan P. cruentum Menggunakan UF 0.05 µm
Pemisahan Eksopolisakarida Menggunakan UF 0.01 µm
Pengeringan Biomassa dan Ekspolisakarida P. cruentum
Prosedur Analisis
4
4
4
4
5
6
6
7
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kandungan Logam Berat pada Air Laut
Karakteristik P. cruentum
Karakteristik Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Karakteristik Permeat pada Pemanenan P. cruentum
Karakteristik Permeat pada Pemisahan Eksopolisakarida
Karakteristik Biomassa P. cruentum
Karakteristik Eksopolisakarida P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase
12
13
13
14
17
18
19
22
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
27
27
DAFTAR PUSTAKA
28
LAMPIRAN
33
RIWAYAT HIDUP
44
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Reaksi inhibisi α-glukosidase
Kandungan logam berat pada air laut
Karakteristik P1
Karakteristik P2
Karakteristik biomassa P. cruentum
Karakteristik komposisi kimia EPS P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase polisakarida
11
12
16
18
18
20
25
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Diagram alir kultivasi dan pemanenan P. cruentum
Skema proses pemanenan P. cruentum
Skema proses pemisahan EPS P. cruentum
Sel P. cruentum perbesaran 40 kali
Karakteristik membran UF 0.05 dan 0.01 µm pada berbagai tekanan
Fluks terhadap waktu pada proses pemanenan
Rejeksi biomassa pada proses pemanenan
VCF terhadap fluks pada proses pemanenan
Parameter fluks dengan (a) waktu (b) VCF pada berbagai tekanan
Gugus fungsi EPS P. cruentum
Jumlah EPS P. cruentum
Inhibisi α-glukosidase biomassa dan EPS P. cruentum
Struktur EPS P. cruentum
Mekanisme akarbosa
5
6
7
13
14
15
16
16
17
21
22
23
24
24
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Komposisi media Guillard F/2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase biomassa (R1)
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase P1
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase R2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase P2
Perhitungan IC50 inhibisi α-glukosidase akarbosa
35
35
37
38
40
41
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Porphyridium cruentum merupakan mikroalga merah uniseluler dengan
habitat di air laut, berbentuk bulat, dan selnya dikelilingi oleh eksopolisakarida
(EPS) (Richmond dan Hu 2013). Biomassa P. cruentum mengandung karbohidrat
32.1%, protein 34.1%, lipid, pigmen (klorofil, karotenoid, fikobilliprotein)
(Fuentes et al. 2000). Patel et al. (2013) melaporkan bahwa berat molekul EPS
2.39 x105 g/mol, mengandung tiga monosakarida netral utama yaitu galaktosa 40%,
xilosa 30%, glukosa 20%, dan satu asam glukuronik 10%.
Biomassa dan EPS P. cruentum dapat menurunkan glukosa darah.
Liu et al. (2005) melaporkan bahwa pemberian biomassa P. cruentum dengan
konsentrasi 600 dan 1200 mg/kg berat badan tikus diabetes selama 18 hari dapat
menurunkan glukosa darah dan meningkatkan aktivitas Superoxide Dismutase
(SOD). Jian et al. (2006) menyatakan bahwa pemberian EPS P. cruentum dengan
konsentrasi 150 dan 300 mg/kg berat badan tikus diabetes selama 21 hari dapat
menurunkan glukosa darah, meningkatkan aktivitas SOD, dan melindungi sel
pankreas.
Biomassa dan EPS P. cruentum memiliki potensi untuk dikembangkan
namun pemisahannya dalam skala besar dan kelimpahan garam yang tinggi pada
medium kultivasi menimbulkan masalah baru. Teknik pemanenan P. cruentum
yang sering digunakan saat ini adalah sentrifugasi. Sentrifugasi memerlukan energi
besar sehingga menyebabkan biaya produksi mahal untuk skala besar. Dassey dan
Theegala (2013) menyatakan untuk mendapatkan pemanenan mikroalga dengan
efisiensi 94% diperlukan energi 20 kW jam/m3. Ahmad et al. (2014) melaporkan
pemanenan mikroalga sebanyak 600 mL berturut-turut menggunakan sentrifugasi
dapat memisahkan biomassa 99% selama 30 menit, mikrofiltrasi (MF) 90-98%,
selama 40 menit dan koagulasi 70-80% selama 40 menit. Biomassa yang
didapatkan pada proses pemanenan menggunakan MF mendekati sentrifugasi.
Mikrofiltrasi dapat digunakan untuk pemanenan mikroalga dalam skala besar
karena biaya operasinya lebih murah. Bilad et al. (2014) menyatakan pemanenan
Phaedactylum tricornutum menggunakan MF Polyvinylidene Fluoride (PVDF-9)
memerlukan energi 0.27 kW jam/m3 dengan efisiensi 98%.
Mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi (UF) dapat digunakan untuk pemanenan
mikroalga Chlorella pyrenoidosa (Sun et al. 2013). Ultrafiltrasi memiliki ketahanan
terhadap fouling internal dan kemampuan menahan sel lebih baik dibandingkan MF
(Baker 2012). Ultrafiltrasi dapat dijadikan salah satu altenatif untuk pemanenan
P. cruentum. Wang et al. (2011) menyatakan proses pemisahan menggunakan UF
efektif jika memiliki nilai fluks dan selektifitas (rejeksi) tinggi. Nilai fluks
dipengaruhi oleh tekanan operasi dan fouling yang terjadi pada membran. Fluks
berkaitan dengan volume pada umpan. Penurunan volume umpan selama proses
operasi didefinisikan dengan Volume Concentration Factor (VCF).
Penggunaan ukuran membran UF dapat memengaruhi kemurnian
komponen aktif. Polisakarida yang dipisahkan dengan UF 3, 8, dan 12 kDa
memiliki kemurnian 51%, 51.5%, 53.4% (Sun et al. 2011). Aktivitas inhibisi
α-glukosidase dipengaruhi oleh kemurniannya. Ekstrak kasar Polyopes lancifolia
2
konsentrasi 5000 ppm mempunyai aktivitas inhibisi α-glukosidase sebesar 52.2%.
Inhibisi α-glukosidase fraksi etil asetat Polyopes lancifolia sebesar 52.4% (100
ppm) (Kim et al. 2010).
Teknik pemisahan dapat memengaruhi kualitas biomassa dan EPS,
komponen aktif, serta inhibisi α-glukosidase. Proses UF diduga akan memengaruhi
komposisi biomassa dan EPS P. cruentum sehingga juga berpengaruh terhadap
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pemanenan biomassa P. cruentum menggunakan
UF dilanjutkan pemisahan EPS dari permeat hasil pemanenan belum pernah diteliti.
Informasi aktivitas inhibisi α-glukosidase dari biomassa dan EPS P. cruentum
menggunakan proses UF belum pernah dilaporkan sehingga perlu dilakukan
penelitian tersebut.
Rumusan Masalah
Porphyridium cruentum dikultivasi menggunakan air laut sehingga
memiliki kelimpahan garam yang tinggi pada medium kultivasi dan menyebabkan
kadar garam dan abunya tinggi. Teknik pemanenan P. cruentum yang sering
digunakan saat ini adalah sentrifugasi. Sentrifugasi memerlukan energi besar
sehingga menyebabkan biaya produksi mahal untuk skala besar maka diperlukan
metode pemanenan yang tepat. Ultrafiltrasi merupakan salah satu alternatif metode
pemanenan yang dapat digunakan karena biayanya lebih murah, mudah
dioperasikan, dan dapat digunakan pada skala besar. Metode pemanenan dapat
memengaruhi rendemen, komponen aktif, dan aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Biomassa dan EPS P. cruentum menggunakan sentrifugasi diketahui memiliki
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Pemanenan biomassa dan pemisahan EPS
menggunakan ultrafiltrasi diduga akan memengaruhi komposisi biomassa dan EPS
P. cruentum sehingga juga berpengaruh terhadap aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1 Menentukan pengaruh membran UF terhadap karakteristik permeat pada
pemanenan dan pemisahan EPS
2 Menentukan pengaruh membran UF terhadap kadar garam dan abu EPS
3 Menentukan pengaruh membran UF terhadap komposisi biomassa dan EPS
P. cruentum serta aktivitas inhibisi α-glukosidase.
Hipotesis
Ukuran membran UF memengaruhi karakteristik permeat, kadar abu, kadar
garam, komposisi biomassa dan EPS, serta aktivitas inhibisi α-glukosidase
P. cruentum.
3
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian antara lain memberikan informasi karakteristik permeat
pada pemanenan dan pemisahan EPS menggunakan membran UF, mengetahui
pengaruh ukuran membran UF terhadap komposisi biomassa dan EPS serta
aktivitas inhibisi α-glukosidase. Manfaat penelitian ini juga sebagai informasi
bahwa P. cruentum dapat dijadikan sebagai bahan baku farmasi yang potensial.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian dilakukan pada biomassa dan EPS P. cruentum. Ultrafiltrasi yang
digunakan berukuran 0.05 dan 0.01 µm. Pengujian yang dilakukan antara lain kadar
air, kadar garam, kadar abu, Optical Density (OD), salinitas, pH, viskositas, fluks,
rejeksi, VCF, gugus fungsi, identifikasi jenis dan jumlah gula sederhana EPS serta
aktivitas inhibisi α-glukosidase.
4
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2015 sampai dengan Januari
2016 di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan 2, Laboratorium Mikrobiologi
Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Studi Biofarmaka,
Laboratorium Botani dan Mikrobiologi, LIPI Cibinong, Laboratorium Badan
Pengkajian dan Penerapan Teknologi, PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroalga
P. cruentum diperoleh dari Laboratorium Marikultur Pusat Penelitian OseanografiLIPI Ancol, Jakarta Utara, air laut, media Guillard, etanol teknis 96%, enzim
α-glukosidase (Sigma), p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (Sigma), Bovine
Serum Albumin (BSA) (Sigma).
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah membran UF jenis propilen
0.05 µm dengan area permukaan efektif 0.45 m2 dan polisulfon 0.01 µm dengan
area permukaan efektif 0.25 m2 dari GDP Filter, Bandung, Indonesia, UV,
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), lampu neon Hannoch 40 watt,
refrigerator, spektrofotometer UV VIS RS (UV-2500) (Culver, USA), viscometer
brookfield FF-LV (Massachusett, USA), freeze dryer EYELA FDU 1200 (Tokyo,
Japan), Elisa reader EpochTm (Winooski, USA), Tensor 37 (USA), sentrifus dingin
Himac CR 21G (Ibaraki, Japan), salinometer (Multi 340i WTW 82362 Weilhem),
pH meter (Eutech 664416), stopwatch, alat gelas dan kultivasi.
Prosedur Kerja
Penelitian dibagi menjadi lima tahapan, yaitu : 1) pengujian kandungan
logam berat pada air laut dan kultivasi mikroalga P. cruentum 2) karakterisasi
membran UF 3) pemanenan menggunakan UF 0.05 µm 4) pemisahan EPS
menggunakan UF 0.01 µm 5) pengeringan biomassa dan EPS menggunakan freeze
dryer. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
Kultivasi P. cruentum
Air laut sebelum digunakan dilakukan pengujian logam berat dan jika
hasilnya masih dalam ambang batas yang diperbolehkan maka air laut dapat
digunakan untuk kultivasi. Kultivasi dilakukan dengan mencampurkan media
Guillard (Lampiran 1) dan stok P. cruentum sebanyak 25% (v/v) dengan air laut
75% (v/v). Kultivasi dilakukan selama 40 hari dengan penyinaran lampu dan aerasi
24 jam. Karakterisasi berupa pengukuran OD, pH, salinitas, viskositas, dan ukuran
sel dilakukan pada kultur P. cruentum umur 40 hari.
5
Porphyridium cruentum
Kultivasi selama 40 hari
R1 (Biomassa)
Pemanenan menggunakan
UF 0.05 µm
Freeze drying
R1 kering
(Biomassa)
Karakterisasi :
Berat kering
Kadar air
Kadar abu
Kadar garam
Inhibisi α-glukosidase
P1
(EPS)
R2
(EPS)
P2
(EPS)
Presipitasi
etanol
Presipitasi
etanol
R2 kering
(EPS)
Karakterisasi :
● Fluks
● Viskositas
● Rejeksi
● Salinitas
● VCF
● pH
● Jumlah sel (OD)
Presipitasi etanol
Pemisahan menggunakan
UF 0.01 µm
Freeze drying
Karakterisasi :
● Ukuran sel
● Jumlah sel (OD)
● Viskositas
● pH
● Salinitas
Freeze drying
Karakterisasi :
● Fluks
● VCF
● Viskositas
● Salinitas
● pH
P1 kering
(EPS)
Freeze drying
P2 kering
(EPS)
Karakterisasi :
Gugus fungsi
Jenis dan jumlah gula
Ket : P : Permeat
R : Retentat
EPS : Eksopolisakarida
Gambar 1 Diagram alir kultivasi dan pemanenan P. cruentum
Karakterisasi Membran UF 0.05 dan 0.01 µm
Akuades sebagai umpan dilewatkan pada membran UF. Proses UF
dilakukan pada tekanan transmembran 0.25-1.25 bar. Nilai permeabilitas membran
ditentukan dengan cara menghitung gradien plot grafik antara nilai fluks (J) sebagai
sumbu Y dan tekanan transmembran (∆P) sebagai sumbu X.
6
Pemanenan P. cruentum Menggunakan UF 0.05 µm
Pemanenan biomassa pada medium kultivasi dilakukan dengan mengambil
mikroalga umur 40 hari sebanyak 5 L sebagai umpan dan menggunakannya untuk
proses UF. Proses UF menghasilkan retentat 1 (R1), selanjutnya dikembalikan ke
dalam umpan sedangkan permeat 1 (P1) dipisahkan pada tempat yang berbeda.
Proses pemanenan dilakukan pada tekanan transmembran 1 bar. Skema proses
pemanenan biomassa P. cruentum dapat dilihat pada Gambar 2.
3
4
6
7
5
2
Keterangan :
1 Umpan
2 Pompa
3 Pressure gauge
4 Membran UF 0.05 µm
1
5
6
7
8
8
Retentat
Pressure gauge
Valve
Permeat
Gambar 2 Skema proses pemanenan P. cruentum menggunakan UF 0.05 µm
Pengukuran fluks, rejeksi, dan VCF dihitung pada selang satu menit sekali.
Total fraksi P1 di akhir pemanenan diukur nilai OD, viskositas, salinitas, dan pH.
Pencucian membran UF 0.05 µm dilakukan menggunakan air selama 1 jam
kemudian NaOH 1% selama 15 menit. Karakterisasi membran dilakukan kembali
menggunakan akuades. Membran UF dapat dilakukan untuk proses pemanenan
kembali apabila fluks sudah kembali seperti semula.
Pemisahan Eksopolisakarida Menggunakan UF 0.01 µm (Modifikasi Patel
et al. 2013)
Pemisahan EPS dilakukan dengan menyaring kembali P1 pada pemanenan
sebagai umpan. Umpan dilewatkan pada membran UF 0.01 µm menggunakan
tekanan transmembran 0.5, 1, dan 1.5 bar. Proses UF menghasilkan retentat 2 (R2),
selanjutnya dikembalikan ke dalam umpan sedangkan permeat 2 (P2) dipisahkan
pada tempat yang berbeda. Skema proses pemisahan EPS dengan membran UF 0.01
µm dapat dilihat pada Gambar 3. Pengukuran fluks dan VCF dihitung pada selang
5 menit sekali. Total fraksi P2 diukur nilai viskositas, salinitas, dan pH. Pencucian
membran UF 0.01 µm dilakukan menggunakan air selama 1 jam kemudian NaOH
1% selama 15 menit. Karakterisasi membran dilakukan kembali menggunakan
akuades. Membran UF dapat dilakukan untuk proses pemisahan EPS kembali
apabila fluks membran UF sudah kembali seperti semula.
7
3
6
7
4
5
2
8
1
Keterangan :
1 Umpan
2 Pompa
3 Pressure gauge
4 Membran UF 0.01 µm
5
6
7
8
Retentat
Pressure gauge
Valve
Permeat
Gambar 3 Skema proses pemisahan EPS P. cruentum menggunakan UF 0.01 µm
Pengeringan Biomassa dan Eksopolisakarida P. cruentum
Biomassa basah P. cruentum (R1) didapatkan dengan mengalirkan air laut
sebanyak 300 mL pada proses backwash membran UF. Biomassa basah
dikeringkan menggunakan freeze dryer sehingga diperoleh biomassa kering. Fraksi
P1, P2, dan R2 yang diperoleh ditambahkan etanol teknis 96% dengan rasio 1: 0.75.
Hasil presipitasi kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer selama 3 jam
untuk mendapatkan berat kering EPS. Biomassa dan EPS kering dianalisis berat
kering, kadar air, kadar abu, kadar garam, dan inhibisi α-glukosidase.
Eksopolisakarida dianalisis gugus fungsi dan diidentifikasi jenis serta jumlah gula
sederhananya.
Prosedur Analisis
Analisis Logam Berat Cd, Cu, Pb, Zn, Ni (APHA 2012, 3111-C)
Sampel air laut dimasukkan ke dalam botol polietilen yang telah diberi
label, selanjutnya sampel disaring dengan menggunakan kertas saring nekleopor
0.45 μm. Sampel air laut yang telah disaring kemudian di awetkan dengan
menggunakan HNO3 pekat hingga nilai pH air laut berada di bawah dua dan
disimpan.
Sampel air laut yang telah disaring sebanyak 200 mL, ditambahkan 1 mL
Ammonium Pyrrolidine Dithiocorbamate (APDC) 4% kemudian dikocok. Larutan
ditambahkan 10 mL Methyl Isobutyl Keton (MIBK), dikocok selama ± 30 s. Larutan
didiamkan sampai terdapat dua fase yaitu fase organik (bagian atas) dan fase
anorganik (bagian bawah). Fase organik diambil dan dimasukkan ke labu kemudian
dilakukan pengukuran dengan AAS untuk Cd, Cu, Pb, Zn, dan Ni.
8
Analisis Logam Berat Hg (APHA 2012, 3112-B)
Sampel air laut sebanyak 100 mL dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer
250 mL. Air laut ditambahkan 5 mL H2SO4, 2.5 mL HNO3, dan 15 mL KMNO4.
Larutan didiamkan selama 15 menit kemudian ditambahkan 8 mL K2S2O8 dan
dipanaskan selama 8 jam pada water bath dengan suhu 90 °C. Larutan didinginkan
pada suhu ruang. Larutan ditambahkan NaCl hidroksiamin untuk menurunkan
kelebihan KMnO4 kemudian ditambahkan 5 mL SnCl2. Larutan diukur dengan
menggunakan AAS.
Analisis Logam Berat As (APHA 2012, 3114-B)
Larutan As (III) sebanyak 10 mL dilarutkan ke dalam 1000 mL air yang
mengandung 5 mL HNO3 dan sebagai larutan standar (1mL = 0.100 µg As (III)).
Sampel air laut dan larutan standar masing-masing diambil 50 mL kemudian
ditambahkan 1 mL 2.5 N H2SO4 dan 5 mL dari 5% K2S2O8. Sampel dan standar
direbus selama 30-40 menit atau volume sampai 10 mL kemudian diencerkan
sampai 50 mL dan dilakukan pengukuran menggunakan AAS.
Analisis Kadar Air (SNI 01-2891-1992)
Prinsip analisis kadar air adalah mengetahui jumlah air yang terdapat pada
suatu bahan. Cawan porselen dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama
satu jam. Cawan porselen yang sudah dikeringkan dalam oven dimasukkan dalam
desikator (30 menit) kemudian ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 1-2 g dan
dimasukkan ke dalam cawan porselen yang sudah kering serta diketahui beratnya.
Cawan berisi sampel dimasukkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3 jam
atau sampai beratnya konstan. Cawan dimasukkan ke dalam desikator (30 menit)
kemudian ditimbang. Kadar air dihitung dengan rumus:
W1
Kadar air (%) =
x 100%
W
Ket : W = Bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
W1 = Bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Analisis Kadar Abu (SNI 01-2891-1992, butir 6.1)
Sampel 3 g ditimbang ke dalam sebuah cawan porselen yang telah diketahui
bobotnya. Sampel diarangkan di atas nyala pembakar kemudian diabukan dalam
tanur listrik pada suhu maksimum 550 °C sampai pengabuan sempurna. Sampel
didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
dihitung dengan rumus :
W1 – W2
Kadar abu (%) =
x 100%
W
Ket : W = Bobot sampel sebelum diabukan (g)
W1 = Bobot sampel + cawan setelah diabukan (g)
W2 = Bobot cawan kosong (g)
9
Analisis Kadar Garam (SNI 01-2359-1991)
Sampel 3 g dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan
100 mL akuades secara bertahap dan larutan disaring. Filtrat yang dihasilkan
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades sampai tanda
tera. Larutan sampel 5 mL diambil dan dimasukkan ke labu Erlenmeyer dan
ditambahkan 3 mL larutan K2CrO4 2 % kemudian dilakukan titrasi dengan AgNO3
0.1 N sampai terbentuk endapan merah bata. Kadar garam dihitung dengan rumus
:
Kadar Garam (%) = (V AgNO3 × N AgNO3 × Mr.NaCl × fp × 100 %) / mg sampel
Analisis Ukuran Sel (Scheggia et al. 2008)
Kultur sel pada umur 40 hari diambil sebanyak 5 mL. Cairan diambil
menggunakan pipet tetes dan diletakkan pada kaca objek. Ukuran sel diamati
menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 kali.
Analisis Kepadatan Biomassa P. cruentum (Sobczuk et al. 2006)
Kultur P. cruentum umur 40 hari diambil sebanyak 5 mL dari akuarium.
Kultur kemudian dimasukkan ke dalam kuvet dengan air laut sebagai blanko.
Pengukuran OD P. cruentum dilakukan menggunakan spektofotometer pada
panjang gelombang 760 nm. Nilai yang tertera pada layar dicatat sebagai OD
P. cruentum.
Analisis Viskositas (Bhatnagar et al. 2014)
Viskositas medium kultivasi diukur menggunakan Viskometer FF LV.
Viskometer diletakkan pada posisi yang tepat kemudian spindel LV 1 dipasang ke
alat tersebut. Viskometer diturunkan sampai spindel tercelup pada batas yang
ditentukan. Viskometer dihidupkan dan spindel berputar dengan kecepatan 60 rpm
selama 1 menit. Angka yang tertera pada viskometer kemudian dibaca.
Analisis pH dan Salinitas
Permeat 1 dan P2 diambil sebanyak 30 mL. Permeat diukur menggunakan
pH meter dan salinometer. Kalibrasi pH meter dilakukan sebelum pengukuran
sampel. Pengukuran sampel menggunakan pH meter dilakukan dengan
mencelupkan elektroda ke dalam sampel, diputar-putar sampai homogen kemudian
tekan hold dan tunggu sampai angka pada layar stabil selanjutnya angka yang
tertera dicatat. Pengukuran salinometer dilakukan dengan mencelupkan elektroda
ke dalam sampel kemudian tekan run/enter sampai angka pada layar stabil
selanjutnya angka yang tertera dicatat.
Analisis Fluks (Wang et al. 2011)
Fluks adalah jumlah volume permeat yang melewati satuan luas membran
dalam waktu tertentu dengan adanya gaya dorong dalam hal ini berupa tekanan.
Secara sistematis fluks dirumuskan sebagai berikut :
10
J =
Q
A
Keterangan :
J = Fluks (L/m2jam)
Q = Aliran permeat per waktu
V = Volume permeat (L)
A = Luas permukaan membran (m2)
t = Waktu (jam)
V
=
Axt
=
Analisis Koefisien Rejeksi Biomassa (Wang et al. 2011)
Koefisien rejeksi adalah fraksi konsentrasi zat terlarut yang tidak menembus
membran, dan dirumuskan sebagai :
R = 1 - Cp
Cf
x 100%
Keterangan :
R = Koefisien rejeksi (%)
Cp = Konsentrasi zat terlarut dalam permeat (OD permeat)
Cf = Konsentrasi zat terlarut dalam umpan (OD umpan)
Analisis Volume Concentration Factor (Sun et al. 2013)
Volume Concentration Factor adalah penurunan volume umpan selama
proses operasi dan dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
V0
VCF = V0-Vt
Keterangan :
VCF = Volume Concentration Factor
V0
= Volume umpan pada waktu ke-0
Vt
= Volume umpan yang berkurang pada waktu ke-t
Analisis Inhibisi α-glukosidase (Gouda et al. 2015)
Pengujian inhibisi α-glukosidase menggunakan larutan blanko (B0), larutan
kontrol blanko (B1), larutan sampel (S0), dan larutan kontrol sampel (S1). Larutan
blanko dibuat dengan mencampurkan larutan 4 mM p-nitrophenyl
α-D-glucopyranoside (0.05 mL), 2 U/mL α-glukosidase (0.025 mL) dalam buffer
fosfat 0.05 M (pH 7) dan ditambahkan DMSO (1 mL). Perbedaan antara blanko dan
kontrol blanko adalah kontrol blanko tidak menggunakan enzim α-glukosidase.
Blanko dan kontrol blanko diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit dan reaksi
perubahan warna terjadi. Reaksi dihentikan dengan penambahan Na2CO3 0.2 M
(750 µL). Aktivitas enzim diukur pada absorbansi 405 nm.
Larutan sampel dibuat dengan mencampurkan larutan 4 mM p-nitrophenyl
α-D-glucopyranoside (0.05 mL), 2 U/mL α-glukosidase (0.025 mL) dalam buffer
fosfat 0.05 M (pH 7) dan ditambahkan sampel (1 mL). Perbedaan antara sampel
dan kontrol sampel adalah kontrol sampel tidak menggunakan enzim
α-glukosidase. Sampel dan kontrol sampel diinkubasi pada suhu 37 °C selama
15 menit dan reaksi perubahan warna terjadi. Reaksi dihentikan dengan
11
penambahan Na2CO3 0.2 M (750 µL). Aktivitas enzim diukur pada absorbansi
405 nm.
Konsentrasi larutan akarbosa 1% dibuat dari tablet Glucobay sebagai
standar. Tablet Glucobay dilarutkan dalam akuades dan HCl 2N (1:1) dengan
konsentrasi 1% (b/v), kemudian disentrifugasi dan supernatan diambil sebanyak
10 μL, lalu dimasukkan ke dalam campuran reaksi seperti dalam sampel. Reaksi
enzim selengkapnya untuk satu sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Reaksi inhibisi α-glukosidase
Jenis
Sampel
DMSO
Substrat
Enzim
Na2CO3
B0
B1
S0
1 mL
1mL
1mL
50 µL
50 µL
50 µL
25 µL
25 µL
Inkubasi 37 °C selama 15 menit
750 µL 750 µL
750 µL
S1
1 mL
50 µL
750 µL
Inhibisi α-glukosidase dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
Inhibisi (%) =
C-S
C
x 100%
Keterangan :
C
= Absorbansi blanko dikurangin kontrol blanko
S
= Absorbansi sampel dikurangin kontrol sampel
Analisis Gugus Fungsi (Mishra dan Jha 2009)
Gugus fungsi dari EPS dideteksi dengan Fourier Transformed Infrared
(FTIR). Pelet untuk analisis FTIR diperoleh dengan memasukkan 200 mg Kbr dan
2 mg sampel ke dalam mortar serta dicampurkan sampai homogen. Sampel
dipadatkan dan dimasukkan ke dalam Tensor 37. Pengukuran sampel uji dilakukan
pada bilangan gelombang antara 4000-500 cm-1. Spektra FTIR yang dihasilkan
menunjukkan puncak-puncak serapan bilangan gelombang dari sampel uji.
Gugus-gugus fungsi sampel uji ditentukan berdasarkan puncak serapan bilangan
gelombang yang terdeteksi.
Analisis Jenis dan Jumlah Gula Sederhana (modifikasi Emega et al. 2012)
Eksopolisakarida 0.6 g dihidrolisis dengan 2M H2SO4 30 mL selama
15 menit pada suhu 121 °C pada tabung gelas yang ditutup. Eksopolisakarida
terhidrolisis kemudian dinetralkan dengan NH4OH 14 M dan difilter dengan kertas
saring. Komposisi monosakarida ditentukan dengan KCKT menggunakan kolom
Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) dan detektor RI dengan rata-rata aliran 1
mL/menit pada suhu 35 °C dan fase gerak 0.008 N H2SO4. Volume diinjeksikan
20 µL. Area puncak diperkirakan sebagai komposisi monomer.
12
Analisis Data
Data yang didapatkan diolah secara deskriptif dan menggunakan standar
deviasi. Data inhibisi α-glukosidase dihitung persen inhibisi dan dilakukan regresi
linear serta ditentukan nilai IC50.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kandungan Logam Berat pada Air Laut
Logam berat adalah unsur-unsur kimia dengan densitas lebih besar dari
5 g/cm3, terletak di sudut kanan bawah pada sistem periodik unsur, mempunyai
afinitas yang tinggi terhadap S dan biasanya bernomor atom 22 sampai 92, dari
periode empat sampai tujuh (Setiawan 2013). Logam berat dapat mencemari air
laut. Air laut adalah suatu komponen yang berinteraksi dengan lingkungan daratan,
dimana buangan limbah dari daratan akan bermuara ke laut (Ika et al. 2012).
Biomassa dan EPS P. cruentum pada penelitian ini akan digunakan ke arah
farmasi sehingga harus aman dari logam berat. Media kultivasi mikroalga
P. cruentum menggunakan air laut sehingga perlu diketahui kadar kandungan
logam beratnya. Kandungan logam berat pada media air laut P. cruentum dapat
dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Kandungan logam berat pada air laut
No.
1
2
3
4
5
6
7
Parameter
Raksa (Hg)
Arsen (As)
Kadmium (Cd)
Tembaga (Cu)
Timbal (Pb)
Seng (Zn)
Nikel (Ni)
Ket : DL
BM
Satuan
µg/L
µg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
DL
0.020
0.044
0.001
0.003
0.006
0.004
0.003
Sampel