Optimization of Electroporation with Green Fluorescent Protein Gene for Testicular Cell Transplant in Nile Tilapia
OPTIMASI ELEKTROPORASI DENGAN GEN GREEN
FLUORESCENT PROTEIN UNTUK TRANSPLANTASI SEL
TESTIKULAR IKAN NILA
EPRO BARADES
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Optimasi Elektroporasi
dengan Gen Green Fluorescent Protein untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan
Nila” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Epro Barades
NIM C151110151
RINGKASAN
EPRO BARADES. Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan Nila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan
AGUS OMAN SUDRAJAT.
Teknologi transplantasi merupakan suatu teknologi yang dapat menghasilkan
induk pengganti. Sel donor berupa sel germinal yang akan digunakan dalam
transplantasi diberi label agar dapat dibedakan dengan sel resipien. Umumnya sel
donor diperoleh dari ikan transgenik yang membawa marka atau diwarnai dengan
PKH-26. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh metode alternatif dalam
memberi label pada sel testikular dengan memanfaatkan elektroporasi untuk
memasukkan gen green fluorescent protein (GFP).
Metode dalam penelitian ini meliputi persiapan resipien, persiapan sel donor
dan transplantasi sel. Ikan resipien diperoleh dengan mengawinkan induk ikan nila
dengan perbandingan jantan dan betina 1:1. Sel donor merupakan sel hasil disosiasi
dari testikular ikan nila berumur 4 bulan. Sel donor tersebut dielektroporasi dengan
kepadatan sel 104 sel.µL-1, konsentrasi pJfKer-GFP 50 ng.µL-1, dan waktu kejut 20
ms pada tegangan listrik sebesar 0, 100, 200, dan 300 volt dengan ulangan sebanyak
tiga kali. Kemudian sel tersebut ditransplantasikan dengan cara menyuntikkan
0.5µL suspensi sel hasil elektroporasi yang membawa 5x103 sel ke dalam rongga
intraperitoneal ikan nila resipien yang berumur 3 hari setelah menetas. Parameter
yang diamati adalah kelangsungan hidup sel, persentase sel berpendar GFP, dan
kolonisasi sel pada ikan resipien.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelangsungan hidup sel antara kontrol
(0 volt) dengan perlakuan kejut 100 dan 200 volt tidak signifikan (p>0,05).
Kelangsungan hidup sel menurun secara signifikan pada perlakuan 300 volt
(p0,05) kecuali pada kontrol. Pada
perlakuan kontrol tidak terlihat adanya pendaran GFP, hal tersebut membuktikan
bahwa gen GFP tidak mampu melewati membran sel akibat kurang atau tidak
adanya tegangan listrik yang diberikan. Sementara itu, persentase kolonisasi sel
pada ikan hasil transplan setelah 50 hari pemeliharaan memberikan nilai tertinggi
pada perlakuan 200 volt (66,67%). Kesimpulan yang diperoleh dari hasil penelitan
adalah perlakuan elektroporasi dengan kejut listrik 100-200 volt dapat digunakan
untuk memberi label pada sel testikular yang akan ditransplantasikan.
Kata kunci : elektroporasi, GFP, ikan nila, label, transplantasi
SUMMARY
EPRO BARADES. Optimization of Electroporation with Green Fluorescent
Protein Gene for Testicular Cell Transplant in Nile Tilapia. Supervised by
ALIMUDDIN and AGUS OMAN SUDRAJAT.
Transplantation technology can be applied to generate surrogate fish
broodstock. Germinal cells as donor used in transplantation are labeled to
distinguish with endogenous cells. Donor cells are generally derived from
transgenic fish carrying a marker or cells labeled by PKH-26. This study was
performed to obtain an alternative method of labeling cells by using electroporation.
The method in this study includes the preparation of the recipient, the donor
cell preparation and cell transplantation. Recipient was obtained by mating tilapia
males and females with a ratio of 1:1. Testicular cells were taken from 4-month-old
Nile tilapia. Electroporation was performed with testicular cell density of 104
cells.µL-1, pJfKer-GFP concentration of 50 ng.µL-1, and a pulse length of 20 ms at
0, 100, 200, and 300 volts. In amount of 5x103 cells at 0.5 µL electroporated
testicular cells were then injected into the intraperitoneal cavity of 3-day-old Nile
tilapia larva. The parameters measured were cell survival, the percentage of GFP
fluorescent cells, and cell colonization in recipient fish.
The results showed that survival of the electroporated cells with 100 and 200
volts was similar (p>0.05), and higher than that of 300 volt treatment (p 0.05) except for
the control. In the control treatment luminescence GFP was not visible, it is proved
that the GFP gene was not able to pass through the cell membrane in the absence of
an electric voltage. Percentage colonization of transplanted cells in the fish after 50
days of rearing gave the highest value at 200 volts (66.67%). As conclusion,
electroporation within 100-200 volt was a suitable tool to label testicular cells for
transplantation.
Keyword: electroporation, GFP, label, Nile tilapia, transplantation
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
OPTIMASI ELEKTROPORASI DENGAN GEN GREEN
FLUORESCENT PROTEIN UNTUK TRANSPLANTASI SEL
TESTIKULAR IKAN NILA
EPRO BARADES
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Dosen penguji luar komisi: Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi, MSi
Judul Tesis : Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan Nila
Nama
: Epro Barades
NIM
: C151110151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Alimuddin, SPi, MSc
Ketua
Dr Ir Agus Oman Sudrajat, MSc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Widanarni, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 06 Februari 2014
Tanggal Lulus:
Judul Tesis : Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular limn Nila
: Epro Barades
Nama
NIM
: C151110151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
,
ｃｊ｟ｉＭｾ＠
Dr Alimuddin, SPi, MSc
Ketua
DrIr
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dr Ir Widanarni, MSi
Tanggal Ujian: 06 Februari 2014
Tanggal Lulus :
ｾ＠
6 FEB 2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2013 sampai dengan
Agustus 2013, bertempatdi Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme
Akuatik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Institut Pertanian Bogor adalah optimasi elektroporasi dengan gen green
fluorescent protein untuk transplantasi sel testikular ikan nila.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Alimuddin, SPi, MSc dan
Bapak Dr Ir Agus Oman Sudrajat, MSc selaku pembimbing yang telah banyak
memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staff dan
teman-teman dari Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik,
serta teman-teman seperjuangan AKU 2011 baik angkatan ganjil maupun genap
yang telah memberi dukungan dan bantuan dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, istri, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2014
Epro Barades
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan dan Manfaat Penelitian
1
1
1
2
TINJAUAN PUSTAKA
Transplantasi Sel
Marka Molekuler, Pewarna Sel PKH-26, dan GFP
Elektroporasi
2
2
4
6
METODE
Persiapan Resipien
Persiapan Sel Donor
Teknik Transplantasi
Deteksi Kolonisasi Sel Donor
Analisis Statistik
6
6
7
7
8
8
HASIL
Persentase Kelangsungan Hidup (KH)
Jumlah sel berpendar GFP
Kolonisasi sel testikular
8
8
9
9
PEMBAHASAN
11
SIMPULAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR GAMBAR
1 Transplantasi sel germinal rainbow trout (Yoshizaki et al. 2010a) 4
2 Sel germinal ikan nila yang diberi label PKH-26 sebelum
ditransplantasikan. Kiri : tanpa filter; kanan : dengan filter PKH-26
(Lacerda et al. 2006).
5
3 Populasi PGC yang membawa gen GFP dari genital ridges ikan
rainbow trout . Kiri : tanpa filter; kanan : dengan filter GFP (Takeuchi
et al.2002).
5
4 Spermatogonia (GFP-positif) yang ditransplantasikan melalui rongga
intraperitoneal menyatu di dalam ovari resipien (Yoshizaki et al. 2010)
6
5 Persentase sel testikular ikan nila yang hidup pascaelektroporasi
dengan tegangan listrik yang berbeda. Huruf berbeda di atas bar
menunjukkan berbeda nyata (p
FLUORESCENT PROTEIN UNTUK TRANSPLANTASI SEL
TESTIKULAR IKAN NILA
EPRO BARADES
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Optimasi Elektroporasi
dengan Gen Green Fluorescent Protein untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan
Nila” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Epro Barades
NIM C151110151
RINGKASAN
EPRO BARADES. Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan Nila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan
AGUS OMAN SUDRAJAT.
Teknologi transplantasi merupakan suatu teknologi yang dapat menghasilkan
induk pengganti. Sel donor berupa sel germinal yang akan digunakan dalam
transplantasi diberi label agar dapat dibedakan dengan sel resipien. Umumnya sel
donor diperoleh dari ikan transgenik yang membawa marka atau diwarnai dengan
PKH-26. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh metode alternatif dalam
memberi label pada sel testikular dengan memanfaatkan elektroporasi untuk
memasukkan gen green fluorescent protein (GFP).
Metode dalam penelitian ini meliputi persiapan resipien, persiapan sel donor
dan transplantasi sel. Ikan resipien diperoleh dengan mengawinkan induk ikan nila
dengan perbandingan jantan dan betina 1:1. Sel donor merupakan sel hasil disosiasi
dari testikular ikan nila berumur 4 bulan. Sel donor tersebut dielektroporasi dengan
kepadatan sel 104 sel.µL-1, konsentrasi pJfKer-GFP 50 ng.µL-1, dan waktu kejut 20
ms pada tegangan listrik sebesar 0, 100, 200, dan 300 volt dengan ulangan sebanyak
tiga kali. Kemudian sel tersebut ditransplantasikan dengan cara menyuntikkan
0.5µL suspensi sel hasil elektroporasi yang membawa 5x103 sel ke dalam rongga
intraperitoneal ikan nila resipien yang berumur 3 hari setelah menetas. Parameter
yang diamati adalah kelangsungan hidup sel, persentase sel berpendar GFP, dan
kolonisasi sel pada ikan resipien.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelangsungan hidup sel antara kontrol
(0 volt) dengan perlakuan kejut 100 dan 200 volt tidak signifikan (p>0,05).
Kelangsungan hidup sel menurun secara signifikan pada perlakuan 300 volt
(p0,05) kecuali pada kontrol. Pada
perlakuan kontrol tidak terlihat adanya pendaran GFP, hal tersebut membuktikan
bahwa gen GFP tidak mampu melewati membran sel akibat kurang atau tidak
adanya tegangan listrik yang diberikan. Sementara itu, persentase kolonisasi sel
pada ikan hasil transplan setelah 50 hari pemeliharaan memberikan nilai tertinggi
pada perlakuan 200 volt (66,67%). Kesimpulan yang diperoleh dari hasil penelitan
adalah perlakuan elektroporasi dengan kejut listrik 100-200 volt dapat digunakan
untuk memberi label pada sel testikular yang akan ditransplantasikan.
Kata kunci : elektroporasi, GFP, ikan nila, label, transplantasi
SUMMARY
EPRO BARADES. Optimization of Electroporation with Green Fluorescent
Protein Gene for Testicular Cell Transplant in Nile Tilapia. Supervised by
ALIMUDDIN and AGUS OMAN SUDRAJAT.
Transplantation technology can be applied to generate surrogate fish
broodstock. Germinal cells as donor used in transplantation are labeled to
distinguish with endogenous cells. Donor cells are generally derived from
transgenic fish carrying a marker or cells labeled by PKH-26. This study was
performed to obtain an alternative method of labeling cells by using electroporation.
The method in this study includes the preparation of the recipient, the donor
cell preparation and cell transplantation. Recipient was obtained by mating tilapia
males and females with a ratio of 1:1. Testicular cells were taken from 4-month-old
Nile tilapia. Electroporation was performed with testicular cell density of 104
cells.µL-1, pJfKer-GFP concentration of 50 ng.µL-1, and a pulse length of 20 ms at
0, 100, 200, and 300 volts. In amount of 5x103 cells at 0.5 µL electroporated
testicular cells were then injected into the intraperitoneal cavity of 3-day-old Nile
tilapia larva. The parameters measured were cell survival, the percentage of GFP
fluorescent cells, and cell colonization in recipient fish.
The results showed that survival of the electroporated cells with 100 and 200
volts was similar (p>0.05), and higher than that of 300 volt treatment (p 0.05) except for
the control. In the control treatment luminescence GFP was not visible, it is proved
that the GFP gene was not able to pass through the cell membrane in the absence of
an electric voltage. Percentage colonization of transplanted cells in the fish after 50
days of rearing gave the highest value at 200 volts (66.67%). As conclusion,
electroporation within 100-200 volt was a suitable tool to label testicular cells for
transplantation.
Keyword: electroporation, GFP, label, Nile tilapia, transplantation
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
OPTIMASI ELEKTROPORASI DENGAN GEN GREEN
FLUORESCENT PROTEIN UNTUK TRANSPLANTASI SEL
TESTIKULAR IKAN NILA
EPRO BARADES
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Dosen penguji luar komisi: Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi, MSi
Judul Tesis : Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular Ikan Nila
Nama
: Epro Barades
NIM
: C151110151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Alimuddin, SPi, MSc
Ketua
Dr Ir Agus Oman Sudrajat, MSc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Widanarni, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 06 Februari 2014
Tanggal Lulus:
Judul Tesis : Optimasi Elektroporasi dengan Gen Green Fluorescent Protein
untuk Transplantasi Sel Testikular limn Nila
: Epro Barades
Nama
NIM
: C151110151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
,
ｃｊ｟ｉＭｾ＠
Dr Alimuddin, SPi, MSc
Ketua
DrIr
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dr Ir Widanarni, MSi
Tanggal Ujian: 06 Februari 2014
Tanggal Lulus :
ｾ＠
6 FEB 2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2013 sampai dengan
Agustus 2013, bertempatdi Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme
Akuatik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Institut Pertanian Bogor adalah optimasi elektroporasi dengan gen green
fluorescent protein untuk transplantasi sel testikular ikan nila.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Alimuddin, SPi, MSc dan
Bapak Dr Ir Agus Oman Sudrajat, MSc selaku pembimbing yang telah banyak
memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staff dan
teman-teman dari Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik,
serta teman-teman seperjuangan AKU 2011 baik angkatan ganjil maupun genap
yang telah memberi dukungan dan bantuan dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, istri, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2014
Epro Barades
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan dan Manfaat Penelitian
1
1
1
2
TINJAUAN PUSTAKA
Transplantasi Sel
Marka Molekuler, Pewarna Sel PKH-26, dan GFP
Elektroporasi
2
2
4
6
METODE
Persiapan Resipien
Persiapan Sel Donor
Teknik Transplantasi
Deteksi Kolonisasi Sel Donor
Analisis Statistik
6
6
7
7
8
8
HASIL
Persentase Kelangsungan Hidup (KH)
Jumlah sel berpendar GFP
Kolonisasi sel testikular
8
8
9
9
PEMBAHASAN
11
SIMPULAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
RIWAYAT HIDUP
16
DAFTAR GAMBAR
1 Transplantasi sel germinal rainbow trout (Yoshizaki et al. 2010a) 4
2 Sel germinal ikan nila yang diberi label PKH-26 sebelum
ditransplantasikan. Kiri : tanpa filter; kanan : dengan filter PKH-26
(Lacerda et al. 2006).
5
3 Populasi PGC yang membawa gen GFP dari genital ridges ikan
rainbow trout . Kiri : tanpa filter; kanan : dengan filter GFP (Takeuchi
et al.2002).
5
4 Spermatogonia (GFP-positif) yang ditransplantasikan melalui rongga
intraperitoneal menyatu di dalam ovari resipien (Yoshizaki et al. 2010)
6
5 Persentase sel testikular ikan nila yang hidup pascaelektroporasi
dengan tegangan listrik yang berbeda. Huruf berbeda di atas bar
menunjukkan berbeda nyata (p