Colonization and proliferation of white Nile tilapia testicular cells transplanted into black Nile tilapia triploid

KOLONISASI DAN PROLIFERASI SEL TESTIKULAR IKAN

NILA PUTIH YANG DITRANSPLANTASIKAN KE

IKAN NILA HITAM TRIPLOID

ANNA OCTAVERA

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER

INFORMASI

Dengan in saya menyatakan bahwa tesis “Kolonisasi dan proliferasi sel testikular ikan nila putih yang ditransplantasikan ke ikan nila hitam triploid” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukkan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Mei 2012

Anna Octavera C151100161

ABSTRACT

ANNA OCTAVERA. Colonization and proliferation of white Nile tilapia testicular cells transplanted into black Nile tilapia triploid. Supervised by ALIMUDDIN and ODANG CARMAN.

The technology of fish testicular cells transplantation had been established to create a surrogate broodstock. This technology can also be utilized to generate YY-progenies that are useful to produce all-male fish. In this study, as a first step towards all-male tilapia production, white Nile tilapia testicular cells was transplanted into peritoneal cavity of triploid black tilapia larvae. A specific primer was designed to identify colonization and proliferation of transplanted cells in recipient fish using PCR method. Analysis of gonadosomatic index (GSI) was also performed to determine the transplanted cells proliferation in recipient gonad. The result of PCR analysis showed a specific DNA amplification product in the gonad of transplanted fish. The specific DNA donor was detected on the recipient gonad 90 dpt (days post transplantation) and it was not detected on 30 and 60 dpt. The GSI analysis showed that GSI recipient was increased and relatively similar with diploid non-transplanted Nile tilapia and it was higher than triploid non-transplanted Nile tilapia. These results showed that the donor cell could be colonized and proliferated in triploid black tilapia gonad. Thus, it is likely to obtain a broodstock that is able to produce donor-derived gamete in the near future.

RINGKASAN

ANNA OCTAVERA. Kolonisasi dan proliferasi sel testikular ikan nila putih yang ditransplantasikan ke ikan nila hitam triploid. Dibimbing oleh ALIMUDDIN and ODANG CARMAN

Teknologi transplantasi sel testikular sudah berkembang dalam pembuatan induk semang untuk rekayasa produksi benih ikan. Teknologi ini juga bisa diaplikasikan untuk membuat ikan YY yang berguna untuk memproduksi monoseks jantan. Dalam rangka pembuatan ikan nila putih YY langkah pertama yang dilakukan adalah mentransplantasikan sel testikular ikan nila putih ke ikan larva ikan nila hitam triploid, dan selanjutnya mengidentifikasi keberhasilan transplantasi. Marka diperlukan untuk mengidentifikasi kolonisasi, dan proliferasi sel donor. Marka yang dapat digunakan adalah pewarna sel PKH-26, dan marka molekuler spesifik ikan donor.

Marka molekuler diidentifikasi dengan menggunakan metode PCR dengan target DNA mitokondria (mtDNA). Sekuen mtDNA dari ikan nila hitam dan nila putih disejajarkan menggunakan program GENETYX versi 7.0 untuk mendesain primer spesifik untuk ikan nila putih yang selanjutnya dilakukan optimasi, dan uji sensitivitas PCR. Pada proses transplantasi, sel testikular ikan nila putih umur 4 bulan diambil, dan ditransplantasikan ke larva ikan nila triploid dengan metode mikroinjeksi. Ikan triploid diproduksi menggunakan kejutan panas. Deteksi kolonisasi dilakukan pada umur 1 bulan dengan melihat pendaran sel yang diwarnai PKH-26 di dalam gonad ikan nila hitam. Selanjutnya, proliferasi sel dideteksi menggunakan marka molekuler, dan perhitungan GSI pada umur 60, 90, dan 120 hari.

Hasil penelitian marka molekuler menunjukkan primer yang didesain berhasil membedakan DNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam. Pita DNA spesifik produk PCR berukuran sekitar 390 bp hanya terdapat pada ikan nila putih. Selanjutnya, sel testikular ikan nila putih berhasil terkolonisasi di dalam gonad ikan nila hitam yang ditunjukkan oleh adanya pendaran PKH-26 pada gonad ikan nila hitam resipien berumur 30 hari. Proliferasi sel spermatogonia ikan nila putih terlihat dengan adanya pita DNA spesifik ikan nila putih hasil PCR pada umur 90 hari, yang tidak dapat terdeteksi pada ikan umur 30 dan 60 hari. Selain itu, nilai GSI pada ikan nila hitam triploid yang ditransplantasi sama dengan ikan diploid, sedangkan ikan triploid yang tidak ditransplantasi memiliki GSI lebih kecil. Hal ini juga menunjukkan keberhasilan proliferasi sel spermatogonia ikan nila putih dalam gonad ikan nila hitam resipien.

©

Hak Cipta milik IPB, tahun 2012

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjaun suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KOLONISASI DAN PROLIFERASI SEL TESTIKULAR IKAN

NILA PUTIH YANG DITRANSPLANTASIKAN KE

IKAN NILA HITAM TRIPLOID

ANNA OCTAVERA

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Judul Tesis : Kolonisasi dan proliferasi sel testikular ikan nila putih yang ditransplantasikan ke ikan nila hitam triploid

Nama : Anna Octavera

NRP : C151100161

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc

Ketua Anggota

Mengetahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Ilmu Akuakultur

Prof. Dr. Enang Harris, M.S Dr.Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah TESIS ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2011 sampai Februari 2012 adalah reproduksi dan genetika ikan, dengan judul “Kolonisasi dan proliferasi sel testikular ikan nila putih yang ditransplantasikan ke ikan nila hitam triploid”.

Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan penelitian ini tidak semata didapatkan sendiri, melainkan dengan bantuan orang-orang sekitar. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc selaku Pembimbing I yang telah membimbing dan mengarahkan penulis selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini dan atas dukungan materil dan spiritual selama perkuliahan dan penelitian.

2. Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc selaku Pembimbing II yang telah membimbing dan mengarahkan penulis selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini.

3. Dr.Ir. M. Agus Suprayudi, M.Sc selaku penguji luar komisi atas saran dan pengarahannya dalam memperbaiki penulisan tesis.

4. Ibunda Aniar serta kakak-kakakku Anita dan Antoni serta adikku Andri yang telah memberi kasih sayang, doa restu, dukungan moril dan materil. 5. Mbak Lina dan Kang Dedi yang telah banyak membantu selama

penelitian.

6. Teman-teman S1, S2, dan S3 di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, teman-teman Ilmu Akuakultur 2010 serta semua pihak yang telah memberikan dukungan baik secara langsung maupun tidak langsung.

Penulis telah berusaha semaksimal mungkin dalam penyelesaian karya ilmiah ini. Dengan harapan, karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.

Bogor, Mei 2012 Anna Octavera

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sawahlunto, Sumatera Barat pada tanggal 24 Oktober 1984 dari Ayah Jamalis dan Ibu Aniar. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara.

Pendidikan formal yang dilalui penulis adalah SDN 02 Payakumbuh, Sumatera Barat pada tahun 1991-1997 dilanjutkan di SLTPN 1 Payakumbuh pada tahun 1997-2000, kemudian SMUN 2 Payakumbuh pada tahun 200 dan lulus tahun 2003. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk Institut Pertanian Bogor pada tahun yang sama dan memilih program studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pada tahun 2008 penulis menyelesaikan studi sarjana di IPB dan pada tahun 2010 melanjutkan di Sekolah Pascasarjana, Program Studi Ilmu Akuakultur, Institut Pertanian Bogor.

Untuk menyelesaikan studi di sekolah pascasarjana, penulis melakukan penelitian dengan judul tesis “Kolonisasi dan proliferasi sel testikular ikan nila

putih ke ikan nila hitam triploid”, di bawah bimbingan Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc dan Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

I. PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 2

1.3 Tujuan ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1 Ikan Nila ... 4

2.2 Transplantasi Sel Testikular ... 4

2.3 Marka Molekuler ... 8

2.4 Pewarna Sel PKH-26 ... 8

III. BAHAN DAN METODE ... .10

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... .10

3.2 Desain Marka Molekuler Ikan Nila Putih ... .10

3.2.1 Identifikasi DNA Spesifik Ikan Nila Putih ... .10

3.2.2 Desain Primer Spesifik. ... 10

3.2.3 Optimasi PCR ... 10

3.2.4 Uji Sensitivitas PCR ... 11

3.3 Persiapan Ikan Nila Hitam Resipien untuk Transplantasi... 11

3.3.1 Pemijahan Buatan Ikan Nila ... 11

3.3.2 Produksi Larva Ikan Nila Triploid ... 11

3.4 Persiapan Sel Testikular Ikan Donor ... 12

3.4.1 Disosiasi Sel Testikular Ikan Donor ... 12

3.4.1 Pewarnaan Sel Testikular Ikan Donor ... 13

3.5 Teknik Transplantasi, dan Perlakuan Penelitian ... 13

3.6 Deteksi Kolonisasi Sel Donor ... 14

3.7 Analisis Proliferasi Sel Donor ... 14

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 15

4.1 Hasil ... 14

4.1.1 Identifikasi Marka Molekuler Ikan Nila Putih ... 14

4.1.2 Transplantasi Sel Testikular... 17

4.2 Pembahasan... 21

V. KESIMPULAN... 26

DAFTAR PUSTAKA... 27

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Beberapa jenis ikan nila (Oreochromis niloticus)... 4 2 Visualisasi pendaran GFP pada sel spermatogonia yang ditransplantasi

berhasil terinkorporasi, terproliferasi, dan berdiferensiasi menjadi oosit..

5

3. Transplantasi sel germinal ikan rainbow trout pada larva ikan salmon masu... 5 4. Potensi aplikasi teknologi transplantasi sel testikular... 6 5. Produksi ikan monoseks dengan metode transplantasi sel testikular... 7 6. Perkembangan sel germinal donor (rainbow trout) pada ikan resipien

(salmon masu) dan hasil keturunan F1 ikan rainbow trout dari induk salmon masu... 7 7. Heatshock telur di dalam waterbath dan inkubasi penetasan telur dalam

akuarium... 12 8. Sel testikular ikan nila setelah pewarnaan dengan PKH-26... 13 9. Satu set alat mikroinjeksi dan penyuntikan larva ikan nila di rongga

peritoneal... 14 10. Elektroforegram mt-DNA ikan nila hitam dan ikan nila

putih... 15

11. Posisi primerforwarddanreversedari hasil penyejajaran mt-DNA ikan nila hitam dan ikan nila putih... 15 12. Elektroforegram mt-DNA ikan nila hitam (H1-H5) dan ikan nila putih

produk PCR menggunakan kombinasi primer MtTi-F2 dan MtTi-R1... 17 13. Elektroforegram dalam pengujian sensitivitas PCR... 17 14. Larva ikan nila hitam triploid. a) Larva tanpa fluorensensi; b) Larva

sebelum transplantasi; c) Larva sesaat setelah transplantasi... 18 15. Preparat kromosom ikan nila diploid dan triploid... 18 16. Fluoresensi PKH-26 di dalam gonad ikan nila hitam triploid transplan

umur 1 bulan... 19 17. Elektroforegram gonad ikan nila hitam 3n transplan umur 1 bulan... 19 18. Elektroforegram produk PCR menggunakan DNA dari gonad ikan nila

hitam triploid transplan umur 90 hari... 20 19. Nilai gonadosomatic index (GSI) ikan nila triploid dan diploid

transplan serta ikan nila triploid dan diploid tanpa transplantasi pada umur 60, 90, dan 120 hari... 20 20. Ukuran ikan dan gonad pada umur 60, dan 120 hari... 21

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Hasil sekuensing DNA ikan nila hitam dari arahforward... 33

2. Hasil sekuensing DNA ikan nila hitam dari arahreverse... 34

3. Hasil sekuensing DNA ikan nila putih dari arahforward... 35

4. Hasil sekuensing DNA ikan nila putih dari arahreverse... 36

5. Hasil alignment sekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari arahforward... 37

6. Hasil alignment sekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari arahreverse... 38

I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Transplantasi sel germinal atau germ cell transplantation (GCT) merupakan manipulasi sel germinal yang awalnya dipelopori oleh Brinster dkk. pada tahun 1994 (Majhi et al., 2009). Teknologi ini dilakukan dengan cara mentransplantasikan sel germinal yang berupa primordial germ cells (PGC) (Takeuchi et al., 2003) atau sel spermatogonia yang belum terdiferensiasi (Okutsu

et al., 2006a) ke dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor berdiferensiasi menjadi telur atau sperma ikan donor di dalam tubuh ikan resipien. Pemijahan ikan resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, menghasilkan ikan target (Okutsuet al., 2006a). Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan Takeuchi et al. (2003), dengan memproduksi ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) menggunakan induk semang ikan salmon masu (Oncorhynchus masou). Optimasi keberhasilan transplantasi dijelaskan oleh Okutsu et al. (2007) yaitu dengan menggunakan resipien triploid, dan dihasilkan 100% larva dari donor. Di Indonesia, teknologi ini sudah dicoba oleh Alimuddin

et al. (2010) dengan mentransplantasikan sel testikular ikan gurami ke larva ikan nila.

Teknologi transplantasi sel germinal dapat berguna untuk konservasi genetik ikan-ikan yang terancam punah dan sebagai induk pengganti (surrogate broodstock) dalam rekayasa produksi benih (Okutsu et al., 2006b). Selanjutnya Yoshizaki et al. (2010) menambahkan bahwa gonad resipien hasil transplantasi bersifat plastis. Sel spermatogonia dengan set kromosom XY yang disuntikkan ke ikan resipien dapat berkembang menjadi gamet jantan dan betina. Dengan demikian teknologi ini juga bisa dijadikan salah satu metode seks reversal alami tanpa penambahan hormon dan perlakuan suhu. Oleh karena itu dari fenomena ini akan diproduksi ikan nila betina fungsional sebagai langkah awal untuk pembuatan nilasupermale(set kromosom YY).

Ikan nila merupakan salah satu komoditas utama budidaya Indonesia. Berdasarkan hasil penelitian, ikan nila jantan lebih cepat tumbuh dibandingkan dengan nila betina (Anderson & Smithermann, 1978). Beberapa teknologi sudah dikembangkan untuk merekayasa pengembangan ikan nila jantan. Salah satunya

adalah ikan nila GESIT (genetically supermale Indonesian tilapia) yang menghasilkan sekitar 98% jantan (BPPT, 2009). Namun demikian dalam pembuatan ikan nila GESIT masih menggunakan hormon sintetik yang berpotensi adanya residu hormon (Gross-Sorokinet al., 2005).

Ikan nila memiliki beberapa jenis, di antaranya adalah ikan nila hitam, ikan nila putih, dan ikan nila merah. Ikan nila merah merupakan jenis yang paling banyak digemari oleh masyarakat Indonesia dan konsumen luar negeri seperti Amerika Serikat, Jepang, Taiwan, Arab Saudi, Kuwait, Singapura, dan beberapa negara di Eropa, karena ukuran dan berat tubuhnya mirip ikan kakap terutama yang berukuran 500 g/ekor (Josupeit, 2005). Ikan nila merah merupakan hasil persilangan antara ikan nila hitam, dan ikan nila putih (Sumantadinata, 2010). Ikan nila GESIT merupakan ikan nila hitam. Pada penelitian ini akan digunakan ikan nila putih untuk produksi betina fungsional dalam pembuatan ikan nila

supermale. Tujuan akhir penelitian ini adalah membuat induk ikan nila putih YY dengan metode transplantasi yang diharapkan akan menghasilkan ikan nila merah 100% kelamin jantan.

Kolonisasi sel donor dalam gonad resipien merupakan bukti langkah awal keberhasilan transplantasi (Okutsuet al. 2006a). Deteksi sel donor di dalam gonad resipien dapat dilakukan dengan cara: menggunakan marka gen GFP (green fluorescent protein), pewarna sel PKH-26, dan marka molekuler. Sel mengekspresikan gen GFP umumnya diperoleh dari ikan transgenik yang mengekspresikan gen GFP (Farlora et al., 2009). Hingga saat ini ikan nila transgenik GFP belum ada di Indonesia, sehingga tidak memungkinkan penggunaan marka GFP. Selain itu, aktivitas PKH-26 menurun setelah ikan berumur 1 bulan, karena tertutup oleh pigmen tubuh. Dengan demikian, pada penelitian ini akan dikembangkan marka molekuler untuk mendeteksi kolonisasi, proliferasi, dan diferensiasi sel testikular ikan nila putih sebagai donor.

1.2 Rumusan Masalah

Ikan nila jantan memiliki pertumbuhan sekitar 40% lebih cepat dibandingkan dengan yang betina (Anderson and Smitherman, 1978). Saat ini sudah dikembangkan ikan nila GESIT, yaitu ikan nila jantan super yang dapat menghasilkan sekitar 98% jantan (BPPT, 2009). Namun demikian dalam

pembuatan ikan nila GESIT menggunakan hormon sintetik yang berpotensi adanya residu yang merusak lingkungan (Gross-Sorokin et al., 2005). Teknologi transplantasi sel testikular ikan dapat dijadikan alternatif pembuatan ikan nila monoseks karena Yoshizaki et al. (2010) menerangkan bahwa gonad ikan hasil transplantasi bersifat plastis, yaitu sel donor bisa berkembang menjadi sperma dan telur, sedangkan kromosom kelaminnya tetap XY.

Ikan nila merah merupakan salah satu jenis dari ikan nila yang paling banyak digemari. Untuk membuat ikan nila merah dilakukan persilangan antara ikan nila hitam, dan putih (Sumantadinata, 2010). Ikan nila GESIT merupakan jenis dari nila hitam, sedangkan pada penelitian ini akan digunakan ikan nila putih untuk membuat betina fungsional. Persilangan ikan betina fungsional dengan ikan jantan normal akan menghasilkan supermale. Pada akhirnya benih monoseks jantan dapat dihasilkan dengan mengawinkan supermale dengan ikan betina normal.

Tahapan awal aplikasi teknologi transplantasi adalah mengidentifikasi sel donor di dalam gonad resipien. Untuk itu diperlukan suatu metode deteksi yang mudah diaplikasikan, seperti penggunaan marka molekuler. Oleh karena itu, pada penelitian ini dikembangkan marka molekuler yang dapat membedakan sel gonad ikan nila putih, dan ikan nila hitam, serta menganalisis keberhasilan transplantasi sel testikular ikan nila putih ke ikan nila hitam.

1.3 Tujuan dan Manfaat

Penelitian ini bertujuan untuk mendesain marka molekuler, dan menganalisis keberhasilan transplantasi sel testikular ikan nila putih dengan melihat kolonisasi, dan proliferasi sel donor. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat dijadikan sebagai pedoman dalam transplantasi sel testikular ikan nila putih dalam rangka pembuatan ikan nila putih YY. Ikan nila putih YY berguna untuk menghasilkan ikan nila merah monoseks jantan.

II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Ikan nila

Ikan nila (Oreochromis niloticus) merupakan jenis ikan air tawar yang berasal dari benua Afrika, dan telah masuk untuk dibudidayakan ke negara-negara sub-tropis, dan tropis sejak tahun 1960-an (Phillay & Kutty, 2005). Ikan nila memiliki beberapa jenis, seperti ikan nila hitam, ikan nila putih, dan ikan nila merah (Sumantadinata, 2010). Ikan nila merah merupakan jenis yang paling banyak digemari oleh masyarakat Indonesia dan konsumen luar negeri seperti Amerika Serikat, Jepang, Taiwan, Arab Saudi, Kuwait, Singapura, dan beberapa negara di Eropa karena ukuran dan berat tubuhnya mirip ikan kakap terutama yang berukuran 500 g/ekor (Josupeit, 2005). Ikan nila merah merupakan hasil persilangan antara ikan nila hitam, dan ikan nila putih (Sumantadinata, 2010).

Secara dimorfisme seksual ikan nila jantan memiliki keunggulan dari ikan nila betina. Pertumbuhan ikan nila jantan lebih cepat sekitar 40% dibandingkan dengan ikan nila betina (Anderson & Smithermann, 1978). Oleh karena beberapa rekayasa telah dilakukan untuk memproduksi ikan nila monoseks jantan.

Gambar 1. Beberapa jenis ikan nila (Oreochromis niloticus). a) Ikan nila hitam; b) Ikan nila putih; c) Ikan nila merah

2.2 Transplantasi Sel Testikular

Transplantasi sel germinal atau germ cell transplantation (GTC) merupakan manipulasi sel germinal yang awalnya dipelopori oleh Brinster dkk. pada tahun 1994 (Majhi et al., 2009). Teknologi ini dilakukan dengan cara mentransplantasikan sel germinal yang berupa primordial germ cells (PGC) (Takeuchi et al., 2003) atau sel spermatogonia yang belum terdiferensiasi (Okutsu

et al., 2006b) ke dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor berdiferensiasi menjadi telur atau sperma ikan donor di dalam tubuh ikan resipien (Gambar 2). Pemijahan ikan resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, menghasilkan ikan target (Okutsu et al., 2006a).

Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan Takeuchi et al. (2003), dengan memproduksi ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) menggunakan induk semang ikan salmon masu (Oncorhynchus masou). Di Indonesia, teknologi ini sudah dicoba oleh Alimuddin et al. (2010) dengan mentransplantasikan sel testikular ikan gurami ke larva ikan nila.

Gambar 2. Visualisasi pendaran GFP pada sel spermatogonia yang ditransplantasi berhasil terinkorporasi (A), terproliferasi (B), dan berdiferensiasi menjadi oosit (C) (Yoshizakiet al., 2011).

Transplantasi sel germinal menggunakan teknik mikroinjeksi dengan jarum mikro berupa gelas kapiler. Metode ini juga telah digunakan oleh Okutsu (2006a) untuk menginjeksikan sel germinal yang mengandungstem cellsdari ikan

rainbow troutdonor ke larva ikan salmon masu resipien (Gambar 3).

Gambar 3. Transplantasi sel germinal ikan rainbow trout pada larva ikan salmon masu (Okutsuet al., 2006a).

Okutsu et al. (2006b) menerangkan manfaat dari teknologi transplantasi sel testikular ini yaitu sebagai salah satu metode untuk memproduksi ikan transgenik, konservasi genetik ikan-ikan yang terancam punah, dan sebagai induk pengganti (surrogate broodstock) dalam rekayasa produksi benih (Gambar 4).

Gambar 4. Potensi aplikasi teknologi transplantasi sel testikular, a) untuk membuat produk transgenik; b) konservasi informasi genetik; dan c) rekayasa produksi benih dengan induk semang (surrogate broodstock).

Selanjutnya, Yoshizakiet al. (2010) menambahkan bahwa gonad resipien hasil transplantasi bersifat plastis. Sel spermatogonia dengan set kromosom XY yang disuntikkan ke ikan resipien akan berkembang menjadi gamet jantan dan betina sehingga bisa dijadikan sebagai salah satu metode dalam diferensiasi seksual (Gambar 5).

. Gambar 5. Produksi ikan monoseks dengan metode transplantasi sel testikular

(Yoshizakiet al., 2010).

Pengembangan teknologi transplantasi sel germinal selanjutnya adalah penggunaan ikan resipien triploid dalam produksi ikan target. Ikan triploid memiliki 3 set kromosom (3n) sehingga tidak memungkinkan terjadi perkembangan pada sel gonadnya. Artinya, ikan triploid adalah steril, dan tidak dapat menghasilkan keturunan (Hussain et al. 1996). Kelebihan penggunaan ikan steril (triploid) sebagai resipien adalah ikan ini tidak mampu mengembangkan sel gonadnya sendiri, sehingga kemungkinan perkembangan sel gonad ikan donor dalam tubuh ikan resipien akan semakin tinggi. Okutsu et al.(2007) telah berhasil memproduksi benih ikanrainbow troutdari induk ‘semang’ salmon masu triploid (Gambar 6).

Gambar 6. Perkembangan sel germinal donor (rainbow trout) pada ikan resipien (salmon masu) dan hasil keturunan F1 ikan rainbow trout dari induk salmon masu (Okutsuet al., 2007).

Sel testikular ikan rainbow trout dapat berkembang secara normal di dalam gonad ikan salmon triploid, sedangkan spermatogonia ikan salmon triploid normal (steril) tidak berkembang (Gambar 6a). Terjadi perkembangan koloni oosit ikan rainbow troutpada ovary ikan salmon triploid setelah 17 bulan (Gambar 6b bawah), sedangkan pada ikan triploid normal tidak terjadi perkembangan ovari (Gambar 6b atas). Ekspresi GFP pada sel spermatogonia ikanrainbow troutdalam embrio salmon triploid merupakan bukti bahwa sel tersebut adalah sel donor (Gambar 6c). Selanjutnya melalui pembuahan telur oleh sperma, maka diperoleh juvenile ikanrainbow troutdari induk ‘semang’ ikan salmon (Gambar6d).

2.3 Marka Molekuler

Marka molekuler atau lebih dikenal dengan marker DNA sudah banyak digunakan untuk melihat keragaman dari beberapa spesies ikan (Tnanh et al., 2010). Pada transplantasi sel, marka molekuler digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan sel donor di dalam sel resipien dengan menggunakan primer spesifik. Menurut Okutsu et al.(2008) bahwa sel germinal donor ikanrainbow troutdapat diidentifikasi menggunakan primer spesifik berdasarkan sekuen gen vasa yang diamplifikasi dengan metode PCR, sehingga hanya DNA dari sel germinal ikan

rainbow trout saja yang dideteksi oleh primer tersebut. Dalam pengembangan marka molekuler ikan nila putih, dan ikan nila hitam dapat menggunakan metode SNP (single nucleotide polymorphism). SNP merupakan salah satu metode untuk skrining genom yang digunakan sebagai penanda yang terkait dengan lokus penanda karakter (quantitative trait loci; QTLs) (Gibson & Muse, 2004). Dari metode ini akan didapatkan perbedaan sekuen DNA yang selanjutnya dapat digunakan sebagai primer spesifik untuk mengidentifikasi DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam.

2.4 Pewarna Sel PKH-26

Pewarna sel PKH-26 merupakan bahan kimia yang dapat menandai sel sehingga sel dapat berpendar dalam jangka waktu tertentu. PKH-26 dapat digunakan untuk berbagai jenis sel. Selain itu, bahan kimia ini juga memiliki sifat yang kuat, tidak bocor ataupun transfer dari sel ke sel. Dalam berbagai penelitian,

PKH-26 sering digunakan untuk menandai sel seperti penandaan bakteri yang dilakukan oleh Kollner et al. (2002) yang melabeli bakteri Aeromonas salmonicida dalam penelitiannya untuk mengetahui antibodi monoklonal pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Selain itu, pada penelitian Fischer et al. (1998) PKH-26 digunakan untuk menandai eritrosit pada ikan koki Carassius auratus.

Terdapat tiga jenis kit PKH yang dapat digunakan untuk pelabelan sel antara lain PKH-2, PKH-67, dan PKH-26. PKH-2, dan PKH-67 merupakan pelabel sel berpendar hijau dengan eksitasi (490 nm) dan emisi (504 nm), sementara PKH-26 adalah berpendar merah dengan eksitasi (551 nm) dan emisi (567 nm).

III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2011 – Februari 2012, bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Desain Marka Molekuler Ikan Nila Putih 3.2.1 Identifikasi DNA Spesifik Ikan Nila Putih.

DNA genom diekstraksi dari jaringan ikan nila hitam, dan ikan nila putih menggunakan DNA purification KIT, QIAGEN (Maryland, USA). DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan PCR (polymerase chain reaction) dengan primer mtDNA-F: 5’- TMCTVACWTGAATTGGAGG– 3’ dan mtDNA-R: 5’-GCGGAGACTTGCATGTGTAA-3’. Reaksi PCR dalam 10 µl mengandung 1 µL bufer LA; 1 µL dNTPs mix; 1 µL MgCl2; 1 µL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05 µL LA Taq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan); dan 1 µL DNA. PCR dilakukan pada predenaturasi 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik,annealing62°C selama 30 detik dan ekstensi 72°C selama 90 detik, serta ekstensi akhir 72°C selama 3 menit. Selanjutnya hasil amplifikasi PCR disekuensing untuk mendapatkan sekuen mt-DNA ikan nila hitam, dan nila putih.

3.2.2 Desain Primer Spesifik

Sekuen mtDNA dari ikan nila hitam, dan ikan nila putih di-alignment

(disejajarkan) menggunakan program GENETYX versi 7.0. Selanjutnya dari hasil penyejajaran dipilih 2 pasang primerforwarddanreverseuntuk ikan nila putih. 3.2.3 Optimasi PCR.

Set primer digunakan dalam PCR untuk mendapatkan pasangan primer yang dapat membedakan antara ikan nila hitam, dan ikan nila putih. Optimasi PCR dilakukan dengan mengubah suhu annealing, dan lama waktu ekstensi, sehingga diperoleh program yang menghasilkan produk PCR spesifik ikan nila putih.

3.2.4 Uji Sensitivitas PCR.

Uji sensitivitas PCR dilakukan untuk memperoleh konsentrasi DNA terendah yang dapat menghasilkan produk PCR yang dapat terdeteksi dengan elektroforesis. DNA ikan nila hitam dengan konsentrasi 200 ng/µL dicampur dengan DNA ikan nila putih dengan konsentrasi 200 ng/µl. Selanjutnya DNA ikan nila putih diencerkan bertingkat, yaitu 100, 10, 1, dan 0,1 ng/µL dan dicampur dengan 200 ng/µ L DNA ikan nila hitam. DNA campuran ini digunakan dalam PCR, dan hasilnya diseparasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5%.

3.3 Persiapan Ikan Nila Hitam Resipien untuk Transplantasi

Ikan resipien yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan nila hitam triploid (steril) berumur 3 hari setelah menetas. Larva ikan nila yang digunakan masih memiliki kuning telur. Tahap persiapan ikan resipien meliputi pemijahan induk ikan nila secara buatan, proses triploidisasi, dan inkubasi telur hingga menetas menjadi larva dan siap digunakan untuk transplantasi.

3.3.1 Pemijahan Buatan Ikan Nila

Pemijahan buatan ikan nila dilakukan dengan mencampur sel telur, dan sel sperma dalam wadah berupa mangkok plastik. Langkah pertama yang dilakukan ialah memasukkan induk nila betina, dan jantan yang sudah matang kelamin dalam satu akuarium. Setelah 1-2 jam, kedua ikan akan melakukan pemijahan (spawning) dan pada saat inilah kedua induk tersebut diambil, dan gamet dikeluarkan dengan cara stripping. Sperma yang keluar disedot dengan syringe1 mL, sedangkan telur dikeluarkan pada mangkuk, dan diberi larutan fisiologis sebagai pengencer. Telur, dan sperma dimasukkan ke dalam sebuah wadah yang bebas dari air, kemudian dicampur merata menggunakan bulu ayam. Setelah itu, air ditambahkan secukupnya untuk mengaktifkan sperma sehingga fertilisasi telur terjadi.

3.3.2 Produksi Larva Ikan Nila Triploid

Proses triploidisasi dilakukan pada akuarium menggunakan kejutan panas (heat shock) pada suhu 40oC menggunakan waterbath (Gambar 7a). Kejutan panas dilakukan selama 4 menit terhadap embrio ikan nila umur 3 menit (Alimuddinet al., tidak dipublikasikan).

Inkubasi telur dilakukan pada saringan bulat yang diletakkan pada akuarium berisi air yang mengandung MB (biru metilena) dengan suhu berkisar 28-30oC. Akuarium diberi aerasi kuat agar telur tetap teraduk, dan pasokan oksigen tetap tersedia. Inkubasi embrio dilakukan selama 3-4 hari hingga menetas, dan siap untuk ditransplantasi dengan sel donor dari ikan nila putih (Gambar 7b).

Gambar 7.Heatshocktelur di dalamwaterbath(a), dan inkubasi untuk penetasan telur dalam akuarium (b).

3.4 Persiapan Sel Testikular Ikan Donor

Ikan donor yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan nila putih yang berumur sekitar 4 bulan. Prosedur persiapan sel testikular ikan donor meliputi disosiasi testis, dan pewarnaan sel testikular.

3.4.1 Disosiasi Sel Testikular Ikan Donor

Ikan donor ditimbang, dan dibedah untuk diambil testisnya. Bobot testis diukur untuk digunakan dalam penghitungan jumlah sel testikular yang terkandung. Sebelum dilakukan proses disosiasi, bagian permukaan luar testis dibersihkan menggunakan larutan bufer fosfat salin (PBS). Tahap pertama yang dilakukan adalah testis dipotong kecil – kecil dengan panjang sekitar 0,5 cm di cawan petri. Kemudian potongan testis dicacah sampai sedemikian kecil selama 3 – 5 menit. Setelah itu, 2 mL larutan tripsin 0,5% (dalam PBS) dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi potongan testis. Testis tersebut dicacah kembali sambil disedot-sedot menggunakan pipet untuk pengadukan. Selanjutnya, larutan hasil cacahan testis diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung mikro (microtube). Larutan cacahan testis yang terdapat dalam tabung mikro disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Supernatan yang terbentuk dibuang dan diganti dengan 1 μ L PBS. Hal ini dilakukan agar sel –sel

spermatogenik tidak rusak dan menghentikan proses disosiasi. Setelah itu, cairan diambil kembali menggunakan mikropipet sebanyak 1 μ L, diteteskan ke dalam gelas objek cekung dan dilakukan penghitungan jumlah sel. Sel dihitung menggunakan haemositometer untuk penentuan dosis transplantasi.

3.4.1 Pewarnaan Sel Testikular Ikan Donor

Metode pewarnaan sel pada penelitian ini menggunakan PKH-26 (SIGMA). PKH-26 adalah penanda yang mewarnai membran sel sehingga sel tersebut akan berpendar warna merah ketika diamati di bawah mikroskop fluoresens filter merah (Gambar 8b). Setelah sel testikular didisosiasi, sel dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Diluentdimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel sebanyak 3 kali volume sel (1 sel : 3 diluent). Pewarna PKH-26 dimasukkan sebanyak 3 μ L. Setelah pencampuran tersebut, sel di dalam tabung mikro didiamkan selama kurang lebih 10 menit. Kemudian sel disentrifugasi sebanyak dua kali dan supernatannya dibuang. Sel di dalam tabung mikro tersebut diisi kembali dengan larutan PBS sebanyak volume awal.

Gambar 8. Sel testikular ikan nila setelah pewarnaan dengan PKH-26; a) Tanpa fluoresensi; b) Dengan fluoresensi.

3.5 Teknik Transplantasi, dan Perlakuan Penelitian

Transplantasi sel dilakukan dengan menggunakan alat mikroinjektor (mikroskop Stemi DV4, Zeiss) (Gambar 9a). Ikan resipien ditransplantasi dengan dosis 5000 sel donor/0,5µL PBS/ekor ikan (Lacerdaet al., 2008). Sel diinjeksikan pada rongga peritoneal larva menggunakan jarum mikroinjeksi yang digerakkan secara manual dengan mikromanipulator. Transplantasi dilakukan pada larva berumur 3 hari setelah menetas (Gambar 9b).

a

Gambar 9. Satu set alat mikroinjeksi (a), dan penyuntikan larva ikan nila di rongga peritoneal (b).

3.6 Deteksi Kolonisasi Sel Donor

Deteksi kolonisasi sel donor dilakukan pada umur 30, 60, 90, dan 120 hari pascatransplantasi. Pada umur 30 hari sel donor dideteksi dengan menggunakan mikroskop fluoresens untuk melihat pendaran dari PKH-26. Selanjutnya deteksi sel donor dilakukan dengan menggunakan marka molekuler hasil penelitian sebelumnya. Gonad ikan transplan dibedah, dan DNA diekstraksi menggunakan kit seperti dijelaskan sebelumnya. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik ikan nila putih. Hasil PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1,5%.

3.7 Analisis Proliferasi Sel Donor

Proliferasi sel donor dianalisis dengan menggunakan PCR, dan penghitungan GSI (gonadosomatic index). Bobot tubuh dan gonad ikan hasil transplantasi (triploid, dan diploid), ikan triploid, dan diploid tanpa transplantasi diukur pada umur 60, 90, dan 120 hari. Selanjutnya DNA gonad diekstraksi, dan digunakan dalam amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik ikan nila putih. Hasil amplifikasi PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1,5%.

3.8 Analisis Data

Keberhasilan transplantasi ditentukan dari persentase kolonisasi sel ikan donor di dalam gonad resipien, sedangkan proliferasi sel dilihat dari peningkatan nilai GSI, dan hasil PCR setiap bulannya. Semua data disajikan dalam bentuk gambar, dan dianalisis secara deskriptif.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Marka Molekuler Ikan Nila Putih

Kandidat marka molekuler untuk ikan nila putih didesain dari sekuen mtDNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam. mtDNA dari ikan nila putih, dan ikan nila hitam diamplifikasi dengan PCR (Gambar 10), dan selanjutnya disekuensing untuk mendapatkan sekuen mtDNA (Lampiran 1;2;3;4).

Gambar 10. Elektroforegram mtDNA ikan nila hitam (H1-H5), dan ikan nila putih (P1-P5) produk PCR menggunakan primer universal ikan nila. M= marka DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR target.

Gambar 11. Posisi primerforward, danreverse(ditunjukkan dengan tanda panah) dari hasil penyejajaran mtDNA ikan nila hitam dan ikan nila putih.

Kandidat marka molekuler ditentukan dari homologi sekuen, dan perbedaan nukleotida di ujung 3’. Dari hasil penyejajaran (Lampiran 5; 6) diperoleh homologi sekuen yang cukup tinggi (sekitar 90%), sehingga kandidat marka ditentukan dari perbedaan nukleotida di ujung 3’, khususnya guanin (G), dan sitosin (C). Hasil penyejajaran menunjukkan beberapa daerah yang berbeda di ujung 3’ (Gambar 11). Dua pasang primer untuk ikan nila putih didesain, yaitu MtTi-F1: 5’-TCCTATATAAATACATACAAC-3’, dan MtTi-R1: 5’-ACA CACATTAAGTAATATAAC-3’; MtTi-F2: 5’-ACCCACCATCCTATCTTCCG-3’, dan MtTi-R2: 5’-CTCGTGCATTGATA GTACTAG-3’. Set primer tersebut digunakan dalam amplifikasi PCR untuk mencari pasangan primer yang dapat membedakan ikan nila hitam, dan ikan nila putih. Empat kombinasi pasangan primer dilakukan untuk mendapatkan primer yang spesifik untuk ikan nila putih. Berdasarkan suhu annealing dari sekuen primer diperoleh kombinasi program PCR (Tabel 1). Dari hasil PCR, kombinasi primer MtTi-F2 dan MtTi-R1 dapat dijadikan marka molekuler pembeda DNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam (Gambar 12).

Tabel 1. Kondisi PCR untuk kombinasi pasangan primer

Program PCR Kombinasi primer MtTi-F1dan MtTi-R1 MtTi-F2dan MtTi-R2 MtTi-F1dan MtTi-R2 MtTi-F2dan MtTi-R1 Pre-denaturasi 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit Denaturasi 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik Annealing 47°C; 30 detik 54°C; 30 detik 47°C; 30 detik 47°C; 30 detik Ekstensi 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik Final ekstensi 72°C;

3 menit 72°C; 3 menit 72°C; 3 menit 72°C; 3 menit

Gambar 12. Elektroforegram mtDNA ikan nila hitam (H1-H5), dan ikan nila putih (P1-P5), produk PCR menggunakan kombinasi primer MtTi-F2, dan MtTi-R1. M= marker DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik ikan nila putih.

Pengujian sensitivitas PCR dilakukan untuk mengetahui kemampuan primer spesifik yang dijadikan sebagai marka molekuler dalam mendeteksi konsentrasi terendah DNA ikan nila putih di dalam DNA ikan nila hitam. Dari hasil pengujian diperoleh rasio terendah yang dapat dideteksi dengan marka molekuler, yaitu 10 : 200 ng/µL (Gambar 13) yang berarti konsentrasi DNA ikan nila putih terendah yang dapat dideteksi oleh marka molekuler adalah 10 ng/µL di dalam 200 ng/µL DNA ikan nila hitam.

Gambar 13. Elektroforegram dalam pengujian sensitivitas PCR. 200-0.1 = rasio konsentrasi DNA ikan nila putih : ikan nila hitam. M = marker DNA. Produk PCRdiseparasi sebanyak 3 μ L.Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih. 4.1.2 Transplantasi sel testikular

Pendaran PKH-26 di dalam larva (Gambar 14) terdeteksi sesaat setelah penyuntikan. Hal ini menunjukkan keberhasilan penyuntikan. Selanjutnya larva triploid dipastikan dengan melihat preparat kromosom. Dari 5 individu yang

dianalisis, semuanya menunjukkan adanya 3 kromosom berukuran besar dengan jumlah kromosom 66 (Gambar 15). Hal ini berarti ikan tersebut semuanya triploid.

Gambar 14. Larva ikan nila hitam triploid. a) Larva tanpa fluoresensi; b) Larva sebelum transplantasi; c) Larva sesaat setelah transplantasi.

Gambar 15. Preparat kromosom ikan nila diploid, dan triploid Tanda panah menunjukkan kromosom berukuran besar yang menjadi penanda tingkat ploidi pada ikan nila.

Kolonisasi sel ikan nila putih di dalam gonad ikan nila hitam triploid pada umur 30 hari dapat terdeteksi menggunakan mikroskop fluoresens (Gambar 16). Pendaran PKH-26 di dalam gonad (Gambar 16) menunjukkan sel testikular ikan nila putih berhasil terkolonisasi di dalam gonad ikan nila hitam triploid dengan persentase kolonisasi 80%. Akan tetapi, dari hasil PCR tidak terlihat adanya produk amplifikasi DNA ikan nila putih di dalam gonad ikan nila hitam triploid (Gambar 17). Selanjutnya, hasil amplifikasi DNA dari gonad ikan umur 60 hari, masih menunjukkan hasil yang sama dengan umur 30 hari, yaitu tidak adanya hasil amplifikasi DNA ikan nila putih di dalam gonad ikan nila triploid transplan.

Gambar 16. Fluoresensi PKH-26 di dalam gonad ikan nila hitam triploid transplan umur 1 bulan. (kiri: foto gonad dengan menggunakan filter fluoresens; kanan: foto gonad tanpa menggunakan filter fluoresens).

Gambar 17. Elektroforegram gonad ikan nila hitam 3n transplan umur 1 bulan. M= Marker. 1-9 = DNA gonad ikan nila triploid transplant. P= DNA ikan nila putih. H= DNA ikan nila hitam. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih.

Pada identifikasi gonad ikan umur 90 hari terlihat adanya hasil amplifikasi DNA ikan nila putih (Gambar 18). Selanjutnya, nilai GSI ikan nila triploid transplan lebih tinggi daripada ikan nila triploid tanpa transplantasi (Gambar 19).

Kontrol

3n transplan

Gambar 18. Elektroforegram produk PCR menggunakan DNA dari gonad ikan nila hitam triploid transplan umur 90 hari (1=5). P= DNA ikan nila putih. H= DNA ikan nila hitam. M= marker DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih.

Gambar 19. Nilai gonadosomatic index (GSI) ikan nila triploid (3nT), dan diploid (2nT) transplan, serta ikan nila triploid (3nK), dan diploid (2nK) tanpa transplantasi pada umur 60, 90, dan 120 hari.

Pada penampakan gonad ikan umur 90, dan 120 hari (Gambar 20) terlihat perbedaan ukuran yang nyata antara gonad ikan nila triploid hasil transplantasi dengan gonad ikan nila triploid tanpa transplantasi. Ukuran gonad ikan nila triploid hasil transplantasi relatif sama dengan gonad ikan nila diploid normal.

Gambar 20. Ukuran ikan dan gonad pada umur 60, dan 120 hari. 3nT= gonad ikan nila triploid transplant. 3nK= gonad ikan nila tanpa transplantasi. 2nT= gonad ikan nila diploid transplant. 2nK= gonad ikan nila diploid tanpa transplantasi.

4.2 Pembahasan

Transplantasi sel testikular ikan nila putih ke larva ikan nila hitam triploid berhasil dilakukan. Sel testikular ikan nila putih sebagai donor berhasil terkolonisasi, dan terproliferasi di dalam gonad ikan nila hitam sebagai resipien. Okutsu et al. (2006a) menyebutkan bahwa keberhasilan transplantasi sel dapat dilihat dari kolonisasi, proliferasi, dan diferensiasi sel donor di dalam gonad resipien. Pada penelitian ini, analisis keberhasilan transplantasi hanya sampai pada tahap proliferasi sel donor. Transplantasi ikan nila putih ke ikan nila hitam ini termasuk transplantasi intra-spesies (spesies sama). Berdasarkan penelitian Okutsu et al (2006a) yang mentransplantasikan sel testikular ikan rainbow trout

ke ikan salmon masu, salmon masu berhasil memproduksi sperma dan sel telur ikan rainbow trout. Transplantasi yang dilakukan Okutsu et al. (2006a) ini termasuk ke dalam transplantasi inter-spesies (spesies beda). Oleh karena itu, transplantasi ikan nila putih ke ikan nila hitam adalah berhasil, dan sel testikular ikan nila putih sangat besar potensinya untuk terdiferensiasi di dalam gonad ikan nila hitam.

Pada penelitian ini kolonisasi, dan proliferasi dideteksi dengan menggunakan pewarna sel (26) dan marka molekuler ikan nila putih.

PKH-26 merupakan pewarna sel yang dapat berpendar sehingga dapat dijadikan sebagai marka dalam proses transplantasi. Akan tetapi, aktivitas dari PKH-26 menurun setelah 33 hari (Yazawa et al., 2010) sehingga penggunaan marka molekuler dikatakan lebih aplikatif. Pada penelitian ini, marka molekuler ikan nila putih berhasil didesain, dan digunakan sebagai marka dalam deteksi keberhasilan transplantasi. Penggunaan marka molekuler ini sudah dikembangkan oleh Okutsu et al. (2008). Sel germinal donor ikan rainbow trout dapat diidentifikasi menggunakan primer spesifik berdasarkan sekuen gen vasa yang diamplifikasi dengan metode PCR, sehingga hanya DNA dari sel germinal ikan rainbow trout

saja yang dideteksi oleh primer tersebut. Selain itu, Achmad et al. (2009) juga berhasil menemukan marka molekuler untuk mendeteksi keberadaan sel germinal ikan gurami di dalam gonad ikan nila.

Dalam pembuatan marka molekuler ikan nila putih digunakan metode SNPs (single nucleotide polymorphisms). Salah satu fungsi dari SNPs adalah dapat dijadikan sebagai marka molekuler untuk mengidentifikasi karakter tertentu dari organisme (Brutlag, 2010). Mitokondria dapat dijadikan sebagai salah satu target gen yang bisa dijadikan alternatif marka dengan metode SNPs ini. PCR menjadi salah satu faktor penting dalam perkembangan metode ini (Saiki et al., 1985) karena data sekuen dari organisme diperlukan untuk membuat sekuen primer spesifik untuk lokus gen tertentu (Kwok & Chen, 2003). Pada penelitian ini produk PCR dari mitokondria ikan nila putih dan hitam (Gambar 10) disekuensing untuk mendapatkan sekuen nukleotida yang berbeda. Dari hasil penyejajaran sekuens ikan nila putih dan hitam (Gambar 11) dengan program GENETYX versi 7.0 diperoleh beberapa daerah yang berbeda untuk dijadikan primer spesifik.

Penentuan pembuatan primer spesifik dilihat dari perbedaan basa nukleotida di ujung 3. Sekuen nukleotida di ujung 3’ sangat penting saat

annealingdan ekstensi primer dengan DNA polimerase pada awal PCR (Onodera, 2007). Basa nukleotida G dan C merupakan basa yang memiliki tiga ikatan hidrogen, sehingga lebih stabil dibandingkan dengan basa adenin (A) dan timin (T) dengan dua ikatan hidrogen (Griffiths et al., 2005). Berdasarkan hal tersebut maka telah didapatkan 2 set kandidat primer spesifik sebagai marka molekuler

pembeda DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam. Dari 2 set kandidat primer dilakukan optimasi PCR dengan mengubah suhu annealing dan waktu ekstensi (pemanjangan). Annealingmerupakan tahapan penempelan primer dalam tahapan PCR. Kesesuaian suhu annealing menjadi kunci dalam spesifitas penempelan primer terhadap cetakan/template (Rasmussen, 1992). Suhu annealing diperoleh dari persentase jumlah nukleotida G dan C dalam primer. Semakin banyak G dan C dalam primer, primer tersebut akan berikatan lebih kuat dengan komplemennya. Oleh karena itu, suhuannealingyang digunakan menjadi lebih tinggi bila jumlah GC lebih banyak (Dale & Schantz, 2002). Suhu annealing yang didapatkan setelah melihat persentase G dan C adalah 47°C, 54°C dan 69°C. Kisaran suhu

annealing ini masih termasuk dalam kisaran suhu annealing yang direkomendasikan oleh Walker and Rapley (2002). yaitu 40-60°C.

Ekstensi merupakan tahapan pemanjangan sekuen nukleotida. Lama waktu ekstensi ditentukan dari panjang target DNA hasil amplifikasi. Secara umum, untuk setiap 1 kilo basa (kb) panjang produk PCR dibutuhkan lama waktu ekstensi 1 menit (Erlich, 1989). Dari rancangan primer dapat diprediksi panjang target DNA yaitu sekitar 400 – 600 bp. Dari suhu annealing dan lama waktu ekstensi dirancang program PCR sesuai dengan kombinasi primer masing-masingnya (Tabel 1). Dari hasil PCR, kombinasi primer MtTi-F2 dan MtTi-R1 dapat dijadikan marka molekuler pembeda DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam (Gambar 12) sedangkan hasil PCR dari kombinasi pasangan primer yang lain tidak menunjukkan spesifitas produk ikan nila hitam dan ikan nila putih (Lampiran 7).

Pengujian sensitivitas PCR dilakukan untuk mengetahui kemampuan primer spesifik yang dijadikan sebagai marka molekuler, dalam mendeteksi konsentrasi terendah DNA ikan nila putih di dalam DNA ikan nila hitam. Hasil pengujian sensitivitas PCR ini menunjukkan konsentrasi DNA ikan nila putih terendah yang masih dapat diamplifikasi oleh PCR yaitu sebesar 10 ng/µL di dalam 200 ng/µL DNA ikan nila hitam (Gambar 13). Kemampuan deteksi ini relatif lebih rendah dari pada yang dilaporkan oleh Karanis et al. (2007) dalam pendeteksian oosit Cryptosporidium, yaitu 4 ng/μ L. Hasil ini juga lebih rendah dari pada yang dilaporkan oleh Achmad et al. (2009) yaitu 1 ng/ μ L dalam

membedakan DNA ikan gurami di dalam DNA ikan nila. Homologi sekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam relatif tinggi sehingga cukup sulit dalam menentukan primer spesifik. Jika dibandingkan dengan marka ikan gurami yang dilaporkan Achmad et al. (2009) bahwa homologi sekuen gen GH (growth hormone) yang dijadikan target marka, relatif rendah sehingga primer yang didesain dapat lebih spesifik. Rasmussen (1992) menambahkan bahwa sensitivitas PCR dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni sekuen dan konsentrasi primer, konsentrasi DNA cetakan, dan suhuannealing. Selanjutnya marka molekuler ikan nila putih ini dijadikan sebagai pendeteksi keberhasilan transplantasi sel testikular ikan nila putih ke ikan nila hitam.

Dari hasil penelitian ini diperoleh persentase keberhasilan kolonisasi sebesar 80%. Dari 5 ekor gonad resipien yang diperiksa pendaran PKH-26nya terdapat 4 ekor yang positif berpendar (Gambar 16). Pendaran PKH-26 pada gonad resipien pada umur 30 hari (Gambar 16) menunjukkan sel testikular ikan nila putih berhasil terkolonisasi di dalam gonad resipien. Hasil yang sama juga dilaporkan pada transplantasi intra-spesies rainbow trout yaitu kolonisasi terjadi pada 20 hari setelah transplantasi (Okutsu et al., 2006; Yano et al., 2008). Hasil kolonisasi ini menunjukkan bahwa sel testikular yang ditransplantasikan ke larva resipien tidak ditolak oleh sistem imun dari resipien dan selanjutnya berhasil terinkorporasi ke dalam genital ridge. Larva yang baru menetas belum memiliki sistem imun dan sel T (Manning & Nakanishi, 1996) dan dari fenomena ini transplantasi sel testikular lebih efektif jika dilakukan pada stadia larva karena tidak terjadi penolakan sel eksogenus dari dalam tubuh larva (Yoshizaki et al., 2011). Selanjutnya sel testikular yang mengandungspermatogonial stem cellyang disuntikkan pada rongga peritoneal larva ini akan bermigrasi ke genital ridge

dengan gerakan kemotaksis oleh pseudopia (Raz, 2004).

Proliferasi sel testikular ikan hasil transplantasi ditunjukkan oleh hasil elektroforesis produk PCR pada umur 90 hari (Gambar 18). Pada umur 30 hari pita positif DNA ikan nila putih tidak terlihat (Gambar 17) dan mulai terlihat pada umur 90 hari. Secara visualisasi pendaran GFP yang ditunjukkan oleh Yoshizaki et al. (2011) terlihat pada saat kolonisasi (inkorporasi) hanya satu sel yang ada di genital ridge selanjutnya spermatogonial stem cell akan

memperbanyak diri (proliferasi) dan selanjutnya berdiferensiasi. Oleh karena itu pada hasil transplantasi pada penelitian ini, marka molekuler belum bisa mendeteksi sel ikan nila putih karena jumlahnya masih sedikit, selanjutnya pada umur 90 hari sel testikular ikan nila putih berhasil terproliferasi sehingga dapat terdeteksi pada PCR. Keberhasilan proliferasi ini juga ditunjukkan pada peningkatan nilai GSI ikan nila triploid transplan dari umur 60, 90 dan 120 hari (Gambar 18). Peningkatan nilai GSI ikan nila triploid transplan relatif hampir sama dengan nilai GSI ikan nila diploid. Sehingga dapat dikatakan gonad ikan nila triploid transplan dapat berkembang secara normal dengan membawa sel testikular dari ikan donor.

Dari nilai GSI juga dapat dilihat perbedaan perkembangan gonad ikan nila triploid transplan dengan non transplan. Hussainet al. (1996) melaporkan bahwa perkembangan gonad ikan nila triploid tidak sama dengan ikan nila diploid. Sperma yang dihasilkan ikan nila triploid tidak fungsional sehingga tidak bisa digunakan untuk pembuahan. Oleh karena itu ikan hasil triploidisasi dikatakan sebagai ikan steril. Dari hasil penelitian ini, nilai GSI ikan nila triploid non transplan paling rendah dibandingkan dengan ikan nila triploid transplan dan diploid transplan. Hal ini menunjukkan ikan nila triploid non-transplan tidak mengalami perkembangan gonad. Selanjutnya, untuk ikan nila triploid transplan dapat dikatakan perkembangan gonadnya hampir sama dengan ikan diploid. Hasil ini juga didukung oleh visualisasi ukuran gonad (Gambar 20). Ukuran gonad ikan nila triploid transplan relatif sama dengan ukuran gonad diploid. Hasil yang serupa juga dilaporkan oleh Okutsu et al. (2007) bahwa terdapat perbedaan perkembangan gonad antara resipien triploid dengan triploid non-transplan (Gambar 6).

Selanjutnya dari hasil penelitian ini, maka transplantasi ikan nila untuk dijadikan sebagai salah satu metode seks reversal dalam rangka pembuatan ikan nila supermale(YY) menjadi mungkin. Selain itu, hasil penelitian ini juga dapat dijadikan sebagai model dalam perkembangan transplanstasi sel testikular di Indonesia sesuai dengan tujuan-tujuan dari transplantasi seperti pembuatan ikan transgenik, konservasi informasi genetik ikan-ikan terancam punah dan rekayasa produksi benih (surrogate broodstock) (Okutsuet al., 2006b).

V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Marka molekuler ikan nila putih berhasil didesain dan dapat digunakan untuk membedakan sel testikular ikan nila putih di dalam tubuh ikan nila hitam. Selanjutnya sel testikular ikan nila putih berhasil terkolonisasi dan terproliferasi di dalam gonad ikan nila hitam triploid.

5.2 Saran

Uji fungsional gamet ikan nila hitam triploid perlu dilakukan untuk memperoleh induk ikan nila resipien yang dapat menghasilkan sperma dan telur ikan nila putih. Analisis kadar dan jenis hormon perlu dilakukan untuk mengkaji regulasi hormonal pada ikan nila triploid transplan.

DAFTAR PUSTAKA

Achmad A, Alimuddin, Carman O, Arfah H, dan Zairin MJr. 2009. Penggunaan gen GH sebagai marka molekuler DNA gurami, Osphronemus goramy

dalam pengembangan teknologisurrogate broodstock. Jurnal Perikanan 6 (2): 157-160

Alimuddin, Zairin MJr, dan Arfah H. 2010. Teknologi transplantasi sel testicular dalam rekayasa produksi benih ikan gurami (Osphronemus goramy): optimasi transplantasi menggunakan sel donor dari ikan gurami muda dan resipien ikan triploid. Laporan akhir penelitian. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi.

Anderson CE, and Smitherman RO. 1978. Production of normal male and androgen sex reversed Tilapia aurea and T. nilotica fed a commercial catfish diet in ponds. In “Culture of Exotic Fishes" (W. L. Shelton and J. H. Grover, eds.). pp 34- 42. Fish Cul. Sect., Am. Fish. Soc., Auburn, Alabama

BPPT. 2009. Press tour ke pusat pengembangan ikan nila gesit. Kerjasama BPPT, IPB, dan DKP. www.bppt.go.id. [17 Februari 2012].

Brutlag D. 2010. Simple nucleotide polymorphisms (SNPs). Computational molecular biology biochem 218 – biomedical informatics 231. Stanford University.

Dale JW and Schantz MV. 2002. From genes to genomes: concepts and applications of DNA technology. John Wiley & Sons Ltd, England.

Erlich HA. 1989. PCR technology principles and application for DNA amplification. M Stockton Press, New York.

Farlora R, Kobayashi S, Franca LR, Batloumi SR, Lacerda SMSN, and Yoshizaki G. 2009. Expression of GFP in transgenic tilapia under the control of the medaka β-actin promoter: establishment of a model system for germ cell transplantation.Anim. Reprod.6: 450-459.

Fischer U, Ototake M, Nakanishi T. 1998. In-vitro cell mediated cytotoxicity against allogeneic erythrocytes in gimbuna crucian carp and goldfish using a non-radioactiveassay.Dev. Comp.Immunol. 22: 195–206.

Gibson G, Muse SV. 2004. A primer of genome science. Sinauer Associates, Sunderland. 378p.

Griffith AJF, Wessler SR, Lewontin RC, Gelbart WM, Suzuki DT, and Miller JH. 2005. An introduction to genetic analysis. W.H. Freeman and Company. America.

Gross-Sorokin MY, Roast SD, Brighty GC. 2005. Assessment of feminization of male fish in english rivers by the environment agency of England and Wales.Environmental Health Perspectives114: 147-151.

Hussain M.G, Penman MJ and McAndrew BJ. 1996. Effects of triploidy on sexual maturation and reproduction in Nile tilapia, Oreochromis niloticus L. p. 320-325. In Pullin RSV, Lazard J, Legendre M, Amon Kothias JB and Pauly D (eds.). The Third International Symposium on Tilapia In Aquaculture. ICLARM Conf. Proc. 41: 575 p

Josupeit H. 2005. World market of tilapia. Volume 79, Globefish. FAO's Fishery Industries Division, Rome, Italy.

Karanis P, Thekisoe O, Kiouptsi K, Ongerth J, Igarashi I, and Inoue N. 2007. Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of Cryptosporidium

oocysts in fecal and water samples. Applied and Environmental Microbiology73(17): 5660–5662.

Kollner B, WasserrabB, KotterbaG, and Fischer U. 2002. Evaluation of immune functions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)- how can environmental influences be detected?Toxicology Letters, 131: 83–95

Kwok PY and Chen X. 2003. Detection of single nucleotide polymorphisms.

Lacerda SMSN, Batlouni SR, Assis LH, Resende FM, Campos-Silva SM, Campos-Silva R, Segatelli TM, and França LR. 2008. Germ cell transplantation in tilapia (Oreochromis niloticus).Cybium,32(2): 115-118.

Majhi SK, Hattori RS, Yokota M, Watanabe S, and Strussmann CA. 2009. Germ cell transplantation using sexually competent fish: an approach for rapid propagation of endangered and valuable germline. Department of Marine Bioscience, Tokyo University of Marine Science and Technology, Tokyo, Japan.

Manning MJ, Nakanishi T. 1996. The specific immune system: cellular defenses. In Iwama G, Nakanishi T (Eds.). The fish immune system. Academic Press, New York, pp. 159–205.

Okutsu T, Suzuki K, Takeuchi Y, Takeuchi T, and Yoshizaki. 2006a.Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Department of Marine Biosciences, Tokyo University of Marine Science and Technology, Japan.

Okutsu T, Yano A, Nagasawa K, Shikina S, Kobayashi T, Takeuchi Y, and Yoshizaki G. 2006b. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopreservation and transplantation.J. Reprod. Dev., 52: 685.

Okutsu T, Shikina S, Kanno M, Takeuchi Y, and Yoshizaki G. 2007. Production of trout offspring from triploid salmon parents.Science, 317:1517.

Okutsu T, Takeuchi Y, and Yoshizaki G. 2008. Spermatogonial transplantation in fish: Production of trout offspring from salmon parents. In: Tsukamoto K, Kawamura T, Takeuchi T, Beard TD, Kaiser MD. (Eds.). Fisheries for global Welfare and environment, 5th World Fisheries Congress. Terrapub, p 209-219

Onodera K. 2007. Selection for 3-end triplets for polymerase chain reaction primers. In Yuryev A. (ed). 2007. Methods in molecular biology: PCR primer design. Humana Press,Totowa, NJ402: 415p.

Phillay TVR, and Kutty MN. 2005. Aquaculture principles and practices. Bleckwall publishing. 624p

Rasmussen R. 1992. Optimizing rapid cycle DNA amplification reactions. The RapidCylist Newsletter1(1): 77-83.

Raz, E., 2004. Guidance of primordial germ cell migration. Curr. Opin. Cell. Biol. 16: 169–173.

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, and Arnheim N. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.

Sumantadinata K. 2010. Teknologi produksi benih unggul ikan nila merah hibrida monoseks jantan. 102 Inovasi Indonesia, halaman 62-63.

Takeuchi Y, Yoshizaki G, and Takeuchi T. 2003. Generation of live fry from intraperitoneally transplanted primordial germ cells in rainbow trout. Tokyo University of Marine Science and Technology, Japan.

Thanh NM, Barnes AC, Mather PB, Li Y, and Lyons RE. 2010. Single nucleotide polymorphisms in the actin and crustacean hyperglycemichormone genes and their correlation with individual growth performance in giant freshwater prawnMacrobrachium rosenbergii.Aquaculture, 301: 7–15. Walker JM and Rapley R. 2002. Molecular biology and biotechnology fourth

edition.The Royal Society of Chemistry. 555 p.

Yano A, Suzuki K, Yoshizaki G. 2008. Flow-cytometric isolation of testicular germ cells from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) carrying the green fluorescent protein gene driven by trout vasa regulatory regions. Biol. Reprod,78: 151–158.

Yazawa R, Takeuchi Y, Higuchi K, Yatabe T, Kabeya N, Yoshizaki G. 2010. Chub mackerel gonads support colonization, survival, and proliferation

of intraperitoneally transplanted xenogenic germ cells.Bio. Reprod. 82(5): 896-904.

Yoshizaki G, Okutsu T, Ichikawa M, Hayashi M, and Takeuchi Y. 2010. Sexual plasticity of rainbow trout germ cells.Anim. Reprod., 7: 187-196.

Yoshizaki G, Fujinuma K, Iwasaki Y, Okutsu T, Shikina S, Yazawa R, and Takeuchi Y. 2011. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comparative Biochemistry and Physiology, Part D 6 : 55–61

Lampiran 5. Hasilalignmentsekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari arahforward

Nila hitam 3 f.gnu 1 CCCCCGATTGACCCC-TTCGTCATTATTGGCCAAATCGCATCTTTCCTCTACTTCTCCCT 59 Nila putih 7 f.gnu 1 GCCCCGGTTGACCCCCTTCGTCATTATTGGCCAAATTGCATCTTTCCTCTACTTCTTCCT 60

CCCCG TTGACCCC TTCGTCATTATTGGCCAAAT GCATCTTTCCTCTACTTCT CCT

CCCCG TTGACCCC TTCGTCATTATTGGCCAAAT GCATCTTTCCTCTACTTCT CCT

Nila hitam 3 f.gnu 60 CTTCCTCGTTTTCGCCCCCATCACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGATACTG 119 Nila putih 7 f.gnu 61 CTTCCTCGTTCTCGCCCCTATTACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGACACTG 120

CTTCCTCGTT TCGCCCCAT ACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGA ACTG

CTTCCTCGTT TCGCCCCAT ACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGA ACTG Nila hitam 3 f.gnu 120 CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC179 Nila putih 7 f.gnu 121 CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC180

CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC

Nila hitam 3 f.gnu 180 TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT 239 Nila putih 7 f.gnu 181 TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT 240

TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT

Nila hitam 3 f.gnu 240 TCTAACTTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAAATACAATACATATATGT 299 Nila putih 7 f.gnu 241 TCTAATTTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAA-TACAATGCATATATGT 299

TCTAATTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAATACAAT CATATATGT TCTAATTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAATACAAT CATATATGT

Nila hitam 3 f.gnu 300 ATTATCACCATTATTTTATTTCAAACATATCCTATATATAAATACATACAACTCTTAAAA359 Nila putih 7 f.gnu 300 ATTATCACCATTATTTTATATCAAACATATCCTATATATAAATACATACTTTT-TTAAAA358

ATTATCACCATTATTTTAT TCAAACATATCCTATATATAAATACATAC T TTAAAA ATTATCACCATTATTTTAT TCAAACATATCCTATATATAAATACATAC T TTAAAA

Nila hitam 3 f.gnu 360 AACATACACTGTTTTCCCACATATTTGTCATCAACATCTATAACTAAGAAGAACATAAAC 419 Nila putih 7 f.gnu 359 GACATCCACTGCTCCCCCACATATTTGCCAACAACATTTACAACTAAGAGAAACATAAAC 418

ACAT CACTG T CCCACATATTTG CA CAACAT TA AACTAAGA AACATAAAC

ACAT CACTG T CCCACATATTTG CA CAACAT TA AACTAAGA AACATAAAC

Nila hitam 3 f.gnu 420 CAATAAATGAAATATTCCAATAACGATTAAATACCACTGAACGATAGTTTAAGACCGAAC 479 Nila putih 7 f.gnu 419 CAGTAAATGGAACTTTCCAAAAACATTTCAAAACCACTAAACGACAGTTTAAGACCGAAC 478

CA TAAATG AA TTCCAA AAC TTAA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAAC CA TAAATG AA TTCCAA AAC TTAA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAAC

Nila hitam 3 f.gnu 480 ACAACTCTCATACAGTTAAGATATACCAAGTACCCAACATCCTATACTTCTAAATTATTT539 Nila putih 7 f.gnu 479 ACAACTCTCATAC-GTTAAGATATACCAAGTACCCACCATCCTATACTTCCGAATTATTT537

ACAACTCTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTT

ACAACTCTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTT

Nila hitam 3 f.gnu 540 AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCCTATATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG 599 Nila putih 7 f.gnu 538 AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTTCTCAATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG 597

AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG

AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG Nila hitam 3 f.gnu 600 GACAATTATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA 659 Nila putih 7 f.gnu 598 GACAGTTATTCGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA 657

GACA TTATTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA

GACA TTATTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA

Nila hitam 3 f.gnu 660 GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT 719 Nila putih 7 f.gnu 658 GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT 717

GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT

GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT

Nila hitam 3 f.gnu 720 CAATACATACTCCTCATTACCCAACATGCCGGGCGTTCTTTCCAGAGGATAGGGGGTTTC 779 Nila putih 7 f.gnu 718 TAATACATACTCCTCGTTACCCACCATGCCGGGCGTTCTTTCCAGGGTGTGGGGGGTT-C 776

AATACATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTTC

AATACATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTTC

Nila hitam 3 f.gnu 780 TCTTTTTTTTTTTCCTTTCATTTGGCATCTCAGAGTGCATACAGAAAT-GACAGACAAGG838 Nila putih 7 f.gnu 777 TCTTTTTTTTTTTCCTTTCACTTGACATTTCAGAGTGCATACAGAAAAAGACAGACAAGG836

TCTTTTTTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGG

TCTTTTTTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGG Nila hitam 3 f.gnu 839 TTGAACATTTTCCTTGCTTGGAGGTAAATAGTATGAATGATAGA-AGACATTGATA-GAA896 Nila putih 7 f.gnu 837 TTGAACATTTTCCTTGCTTGAACGGAAATAGTATGAATGGTGGTTAGATATTATTAAGAA896

TTGAACATTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAA

TTGAACATTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAA

Nila hitam 3 f.gnu 897 GTATTGCATAACTG-ATATCTAGAGCATAAAGTTCAATCAAATATTTCAATTTTCCTCCA 955 Nila putih 7 f.gnu 897 GAATTGCATAACTGGATATCTAGAGCATAAAGTTTAATCAAA-ATTTTAATTTTC-TCCT 954

G ATTGCATAACTG ATATCTAGAGCATAAAGTTAATCAAA ATTTAATTTTC TCC

G ATTGCATAACTG ATATCTAGAGCATAAAGTTAATCAAA ATTTAATTTTC TCC

Nila hitam 3 f.gnu 956 AATTTTCCTATTATTC-TTCGGTTTTTTCGCGCG-TAAACCCCCCCT-ACCCCCCCAAAA1012 Nila putih 7 f.gnu 955 AATTTTTCTATTAACCCTTCGGTTTTTGCGCGCGGTAAACCCCCCCTTACCCCCCCAAAA1014

AATTTTCTATTA C TTCGGTTTTT CGCGCG TAAACCCCCCCT ACCCCCCCAAAA AATTTTCTATTA C TTCGGTTTTT CGCGCG TAAACCCCCCCT ACCCCCCCAAAA

Nila hitam 3 f.gnu 1013 -CTCC-AAAGATC-CTAAA-ACTCCTGCAAACCCCCC--GGAAACAGGAAAAGCTCTTA- 1065 Nila putih 7 f.gnu 1015 ACTCCTAAAAATCTCTAAATATTCCTGCAAACCCCCCCGGAAAACGGGAAAAGCTTCTAG 1074

CTCCAAA ATC CTAAA ATCCTGCAAACCCCCC G AAAC GGAAAAGCT TA

CTCCAAA ATC CTAAA ATCCTGCAAACCCCCC G AAAC GGAAAAGCT TA

Nila hitam 3 f.gnu 1066 AATTGACTTTTAGC-GCTTTAGTTTAGGCAGGTTAAATA-ACTTAAGTGGTGGTAATGGC 1123 Nila putih 7 f.gnu 1075 AAGTAACTTTCACCCGCTTTAATAATTGCATAAAAAATTTACTTAAGTGGGGGAAATCCA 1134

AA T ACTTTA C GCTTTA T GCA AAAT ACTTAAGTGG GG AAT

AA T ACTTTA C GCTTTA T GCA AAAT ACTTAAGTGG GG AAT

Nila hitam 3 f.gnu 1124 AGATATTATCATGGCCCGGGCCATA-ATTCCAAGTGGGGGTATTTAAATTTTT--- 1175 Nila putih 7 f.gnu 1135 AGAACCTACAAAGGCACGAGTCATGTATCCCAAGTGGGTGGGTAAAAAATTAATTAAAAA1194

AGA TA A GGC CG GCAT AT CCAAGTGGG G T AAATT

AGA TA A GGC CG GCAT AT CCAAGTGGG G T AAATT

Nila hitam 3 f.gnu 1175 --- 1175

Lampiran 6. Hasilalignmentsekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari arah reverse

Nila hitam 3 r.gnu 1 GGTTTTTTAAACCGGAATTGGGAAGGTTAAAGTCCTTCCTTATTGGCTTCAAAGGAAAAG 60 Nila putih 7 r.gnu 1 ---AATCCCTTCCCTAACCCTTTCAAAAAAAAAA31

AA CCTTCC TA TTCAAA AAAA AA CCTTCC TA TTCAAA AAAA

Nila hitam 3 r.gnu 61 GGATTTTTAACCCCTA-CCCCTTAATTCCCCAAAGCT-AGGATTCTTAACTT-AAACTAT 117 Nila putih 7 r.gnu 32 GGAATTTTAACCCTTAACCCCTTAATTCCCAAAAGGTTAGGAATTTTAATTTTAAATTAT 91

GGA TTTTAACCC TA CCCCTTAATTCCC AAAG T AGGA T TTAA TT AAA TAT

GGA TTTTAACCC TA CCCCTTAATTCCC AAAG T AGGA T TTAA TT AAA TAT

Nila hitam 3 r.gnu 118 TTTTTGGCCGAG-TTTTGCCTC-CATGCAAAATACAATACA-ATTATGTATTAT---CCC 171 Nila putih 7 r.gnu 92 TTTTTTGCCGAGGTTTTGCCTTTCATGCAAATACCAATGCCTAATATGTTTTTTTCCCCC 151

TTTTT GCCGAG TTTTGCCT CATGCAAA CAAT C A TATGT TT T CCC

TTTTT GCCGAG TTTTGCCT CATGCAAA CAAT C A TATGT TT T CCC

Nila hitam 3 r.gnu 172 CATTATTTTATTTCAAACATATCCTATATATAAA-TACATACAACTCTTAAAAAACATAC 230 Nila putih 7 r.gnu 152 TTTTTTTTTTTTTCCAACATATCCCTAATATAAAATACATACTTTT-TTAAAAGACATCC 210

TT TTTT TTTC AACATATCC ATATAAA TACATAC T TTAAAA ACAT C

TT TTTT TTTC AACATATCC ATATAAA TACATAC T TTAAAA ACAT C

Nila hitam 3 r.gnu 231 ACTGTTTTCCC-ACATATTTGTCATCAACATCTATAACTTAGAAGAACATAAACCCATAA 289 Nila putih 7 r.gnu 211 ACTGGTTCCCCCACATATTTGCCAACAACATTTACAACTAAGAGAAACATAAACCAGTAA 270

ACTG TT CCC ACATATTTG CA CAACAT TA AACT AGA AACATAAACC TAA ACTG TT CCC ACATATTTG CA CAACAT TA AACT AGA AACATAAACC TAA

Nila hitam 3 r.gnu 290 ATGAAATATTCCAATAACGATTAAATACCACTGAACGATAGTTTAAGACCGAACACAACT 349 Nila putih 7 r.gnu 271 ATGGAACTTTCCAAAAACATTTCAAAACCACTAAACGACAGTTTAAGACCGAACACAACT 330

ATG AA TTCCAA AAC TT AA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAACACAACT

ATG AA TTCCAA AAC TT AA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAACACAACT

Nila hitam 3 r.gnu 350 CTCATACAGTTAAGATATACCAAGTACCCAACATCCTATACTTCTAAATTATTTAATGTA 409 Nila putih 7 r.gnu 331 CTCATAC-GTTAAGATATACCAAGTACCCACCATCCTATACTTCCGAATTATTTAATGTA 389

CTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTTAATGTA

CTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTTAATGTA

Nila hitam 3 r.gnu 410 GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCCTATATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACAAT 469 Nila putih 7 r.gnu 390 GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTTCTCAATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACAGT 449

GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATT CT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACA T

GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATT CT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACA T

Nila hitam 3 r.gnu 470 TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA 529 Nila putih 7 r.gnu 450 TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA 509

TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA

TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA

Nila hitam 3 r.gnu 530 ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTTATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGTCAATAC 589 Nila putih 7 r.gnu 510 ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGTTAATAC 569

ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTT ATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT AATAC

ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTT ATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT AATAC

Nila hitam 3 r.gnu 590 ATACTCCTCATTACCCAACATGCCGGGCGTTCTTTCCAGAGGATAGGGGGTTTCTCTTTT 649 Nila putih 7 r.gnu 570 ATACTCCTCGTTACCCACCATGCCGGGCGTTCTTTCCAGGGTGTGGGGGGTT-CTCTTTT 628

ATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTT CTCTTTT

ATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTT CTCTTTT

Nila hitam 3 r.gnu 650 TTTTTTTCCTTTCATTTGGCATCTCAGAGTGCATACAGAAATGACAGACAAGGTTGAACA 709 Nila putih 7 r.gnu 629 TTTTTTTCCTTTCACTTGACATTTCAGAGTGCATACAGAAAAGACAGACAAGGTTGAACA 688

TTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGGTTGAACA

TTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGGTTGAACA

Nila hitam 3 r.gnu 710 TTTTCCTTGCTTGGAGGTAAATAGTATGAATGATAGA-AGACATTGATA-GAAGTATTGC 767 Nila putih 7 r.gnu 689 TTTTCCTTGCTTGAACGGAAATAGTATGAATGGTGGTTAGATATTATTAAGAAGAATTGC 748

TTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAAG ATTGC

TTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAAG ATTGC

Nila hitam 3 r.gnu 768 ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTTCAATCAAATATTTCAATTTTCTCCTAATTTTTCT 827 Nila putih 7 r.gnu 749 ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTTTAATCAAA-ATTTTAATTTTCTCCTAATTTTTCT 807

ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTT AATCAAA ATTT AATTTTCTCCTAATTTTTCT

ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTT AATCAAA ATTT AATTTTCTCCTAATTTTTCT

Nila hitam 3 r.gnu 828 ATTATTCTTCGGTTTTTTCGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT 887 Nila putih 7 r.gnu 808 ATTAACCTTCGGTTTTTGCGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT 867

ATTA CTTCGGTTTTT CGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT

ATTA CTTCGGTTTTT CGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT

Nila hitam 3 r.gnu 888 CTAATACTCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGTGACTTTTAGCGCTT 947 Nila putih 7 r.gnu 868 CTAATATTCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGTAACTTTCAGCGCTT 927

CTAATA TCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGT ACTTT AGCGCTT

CTAATA TCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGT ACTTT AGCGCTT

Nila hitam 3 r.gnu 948 TAGTTTATGCATGTTATATTACTTAATGTGTGTATATGCAGTATTATCAATGCACGGGCC 1007 Nila putih 7 r.gnu 928 TAATATATGCATAAAATATTACTTAATGTGTGTATATCTAGTACTATCAATGCACGAGTC 987

TA T TATGCAT ATATTACTTAATGTGTGTATAT AGTA TATCAATGCACG G C

TA T TATGCAT ATATTACTTAATGTGTGTATAT AGTA TATCAATGCACG G C

Nila hitam 3 r.gnu 1008 ATATATCCAATGTGTGTATATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC 1067 Nila putih 7 r.gnu 988 ATGTATCCAATGTGTGTGTATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC 1047

AT TATCCAATGTGTGT TATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC

AT TATCCAATGTGTGT TATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC

Nila hitam 3 r.gnu 1068 TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC 1127 Nila putih 7 r.gnu 1048 TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC 1107

TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC

TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC

Nila hitam 3 r.gnu 1128 TTGGTCCTGACTT-ACTTCAGTT-GAAACCC 1156 Nila putih 7 r.gnu 1108 TTGGTCCTGACTTTACTTCAGTTTGAAACCC 1138

TTGGTCCTGACTT ACTTCAGTT GAAACCC

Lampiran 7. Elektroforegram hasil PCR kombinasi primer yang tidak spesifik a. Primer MtTi-F1 dan Mt-Ti-R1

b. Primer MtTi-F1 dan MtTi-R1

Lampiran 5. Hasil

alignment

sekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari

arah

forward

Nila hitam 3 f.gnu 1 CCCCCGATTGACCCC-TTCGTCATTATTGGCCAAATCGCATCTTTCCTCTACTTCTCCCT 59 Nila putih 7 f.gnu 1 GCCCCGGTTGACCCCCTTCGTCATTATTGGCCAAATTGCATCTTTCCTCTACTTCTTCCT 60

CCCCG TTGACCCC TTCGTCATTATTGGCCAAAT GCATCTTTCCTCTACTTCT CCT

CCCCG TTGACCCC TTCGTCATTATTGGCCAAAT GCATCTTTCCTCTACTTCT CCT

Nila hitam 3 f.gnu 60 CTTCCTCGTTTTCGCCCCCATCACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGATACTG 119 Nila putih 7 f.gnu 61 CTTCCTCGTTCTCGCCCCTATTACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGACACTG 120

CTTCCTCGTT TCGCCCCAT ACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGA ACTG

CTTCCTCGTT TCGCCCCAT ACCGGCTGGCTAGAAAACAAAATCCTTGAATGA ACTG

Nila hitam 3 f.gnu 120 CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC179 Nila putih 7 f.gnu 121 CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC180

CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC CACTAGTAGCTCAGCACCAGAGCGCCGGTCTTGTAAACCGGATGTCGAAGGTTAAAGTCC Nila hitam 3 f.gnu 180 TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT 239 Nila putih 7 f.gnu 181 TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT 240

TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT TTCCTACTGCTTCAAAGAAAAGGGATTTTAACCCTACCCCTAACTCCCAAAGCTAGGAT

Nila hitam 3 f.gnu 240 TCTAACTTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAAATACAATACATATATGT 299 Nila putih 7 f.gnu 241 TCTAATTTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAA-TACAATGCATATATGT 299

TCTAATTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAATACAAT CATATATGT TCTAATTAAACTATTCTTTGCCGAGCTCTGCCTTCATGCAAATACAAT CATATATGT

Nila hitam 3 f.gnu 300 ATTATCACCATTATTTTATTTCAAACATATCCTATATATAAATACATACAACTCTTAAAA359 Nila putih 7 f.gnu 300 ATTATCACCATTATTTTATATCAAACATATCCTATATATAAATACATACTTTT-TTAAAA358

ATTATCACCATTATTTTAT TCAAACATATCCTATATATAAATACATAC T TTAAAA ATTATCACCATTATTTTAT TCAAACATATCCTATATATAAATACATAC T TTAAAA

Nila hitam 3 f.gnu 360 AACATACACTGTTTTCCCACATATTTGTCATCAACATCTATAACTAAGAAGAACATAAAC 419 Nila putih 7 f.gnu 359 GACATCCACTGCTCCCCCACATATTTGCCAACAACATTTACAACTAAGAGAAACATAAAC 418

ACAT CACTG T CCCACATATTTG CA CAACAT TA AACTAAGA AACATAAAC

ACAT CACTG T CCCACATATTTG CA CAACAT TA AACTAAGA AACATAAAC Nila hitam 3 f.gnu 420 CAATAAATGAAATATTCCAATAACGATTAAATACCACTGAACGATAGTTTAAGACCGAAC 479 Nila putih 7 f.gnu 419 CAGTAAATGGAACTTTCCAAAAACATTTCAAAACCACTAAACGACAGTTTAAGACCGAAC 478

CA TAAATG AA TTCCAA AAC TTAA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAAC CA TAAATG AA TTCCAA AAC TTAA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAAC Nila hitam 3 f.gnu 480 ACAACTCTCATACAGTTAAGATATACCAAGTACCCAACATCCTATACTTCTAAATTATTT539 Nila putih 7 f.gnu 479 ACAACTCTCATAC-GTTAAGATATACCAAGTACCCACCATCCTATACTTCCGAATTATTT537

ACAACTCTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTT ACAACTCTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTT

Nila hitam 3 f.gnu 540 AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCCTATATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG 599 Nila putih 7 f.gnu 538 AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTTCTCAATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG 597

AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG AATGTAGTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAG

Nila hitam 3 f.gnu 600 GACAATTATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA 659 Nila putih 7 f.gnu 598 GACAGTTATTCGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA 657

GACA TTATTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA GACA TTATTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCA

Nila hitam 3 f.gnu 660 GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT 719 Nila putih 7 f.gnu 658 GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT 717

GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT GGTCCAATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATCGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT

Nila hitam 3 f.gnu 720 CAATACATACTCCTCATTACCCAACATGCCGGGCGTTCTTTCCAGAGGATAGGGGGTTTC 779 Nila putih 7 f.gnu 718 TAATACATACTCCTCGTTACCCACCATGCCGGGCGTTCTTTCCAGGGTGTGGGGGGTT-C 776

AATACATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTTC

AATACATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTTC Nila hitam 3 f.gnu 780 TCTTTTTTTTTTTCCTTTCATTTGGCATCTCAGAGTGCATACAGAAAT-GACAGACAAGG838 Nila putih 7 f.gnu 777 TCTTTTTTTTTTTCCTTTCACTTGACATTTCAGAGTGCATACAGAAAAAGACAGACAAGG836

TCTTTTTTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGG TCTTTTTTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGG

Nila hitam 3 f.gnu 839 TTGAACATTTTCCTTGCTTGGAGGTAAATAGTATGAATGATAGA-AGACATTGATA-GAA896 Nila putih 7 f.gnu 837 TTGAACATTTTCCTTGCTTGAACGGAAATAGTATGAATGGTGGTTAGATATTATTAAGAA896

TTGAACATTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAA TTGAACATTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAA

Nila hitam 3 f.gnu 897 GTATTGCATAACTG-ATATCTAGAGCATAAAGTTCAATCAAATATTTCAATTTTCCTCCA 955 Nila putih 7 f.gnu 897 GAATTGCATAACTGGATATCTAGAGCATAAAGTTTAATCAAA-ATTTTAATTTTC-TCCT 954

G ATTGCATAACTG ATATCTAGAGCATAAAGTTAATCAAA ATTTAATTTTC TCC

G ATTGCATAACTG ATATCTAGAGCATAAAGTTAATCAAA ATTTAATTTTC TCC Nila hitam 3 f.gnu 956 AATTTTCCTATTATTC-TTCGGTTTTTTCGCGCG-TAAACCCCCCCT-ACCCCCCCAAAA1012 Nila putih 7 f.gnu 955 AATTTTTCTATTAACCCTTCGGTTTTTGCGCGCGGTAAACCCCCCCTTACCCCCCCAAAA1014

AATTTTCTATTA C TTCGGTTTTT CGCGCG TAAACCCCCCCT ACCCCCCCAAAA AATTTTCTATTA C TTCGGTTTTT CGCGCG TAAACCCCCCCT ACCCCCCCAAAA

Nila hitam 3 f.gnu 1013 -CTCC-AAAGATC-CTAAA-ACTCCTGCAAACCCCCC--GGAAACAGGAAAAGCTCTTA- 1065 Nila putih 7 f.gnu 1015 ACTCCTAAAAATCTCTAAATATTCCTGCAAACCCCCCCGGAAAACGGGAAAAGCTTCTAG 1074

CTCCAAA ATC CTAAA ATCCTGCAAACCCCCC G AAAC GGAAAAGCT TA

CTCCAAA ATC CTAAA ATCCTGCAAACCCCCC G AAAC GGAAAAGCT TA

Nila hitam 3 f.gnu 1066 AATTGACTTTTAGC-GCTTTAGTTTAGGCAGGTTAAATA-ACTTAAGTGGTGGTAATGGC 1123 Nila putih 7 f.gnu 1075 AAGTAACTTTCACCCGCTTTAATAATTGCATAAAAAATTTACTTAAGTGGGGGAAATCCA 1134

AA T ACTTTA C GCTTTA T GCA AAAT ACTTAAGTGG GG AAT AA T ACTTTA C GCTTTA T GCA AAAT ACTTAAGTGG GG AAT

Lampiran 6. Hasil

alignment

sekuen DNA ikan nila putih dan ikan nila hitam dari

arah

reverse

Nila hitam 3 r.gnu 1 GGTTTTTTAAACCGGAATTGGGAAGGTTAAAGTCCTTCCTTATTGGCTTCAAAGGAAAAG 60 Nila putih 7 r.gnu 1 ---AATCCCTTCCCTAACCCTTTCAAAAAAAAAA31

AA CCTTCC TA TTCAAA AAAA AA CCTTCC TA TTCAAA AAAA

Nila hitam 3 r.gnu 61 GGATTTTTAACCCCTA-CCCCTTAATTCCCCAAAGCT-AGGATTCTTAACTT-AAACTAT 117 Nila putih 7 r.gnu 32 GGAATTTTAACCCTTAACCCCTTAATTCCCAAAAGGTTAGGAATTTTAATTTTAAATTAT 91

GGA TTTTAACCC TA CCCCTTAATTCCC AAAG T AGGA T TTAA TT AAA TAT GGA TTTTAACCC TA CCCCTTAATTCCC AAAG T AGGA T TTAA TT AAA TAT

Nila hitam 3 r.gnu 118 TTTTTGGCCGAG-TTTTGCCTC-CATGCAAAATACAATACA-ATTATGTATTAT---CCC 171 Nila putih 7 r.gnu 92 TTTTTTGCCGAGGTTTTGCCTTTCATGCAAATACCAATGCCTAATATGTTTTTTTCCCCC 151

TTTTT GCCGAG TTTTGCCT CATGCAAA CAAT C A TATGT TT T CCC

TTTTT GCCGAG TTTTGCCT CATGCAAA CAAT C A TATGT TT T CCC Nila hitam 3 r.gnu 172 CATTATTTTATTTCAAACATATCCTATATATAAA-TACATACAACTCTTAAAAAACATAC 230 Nila putih 7 r.gnu 152 TTTTTTTTTTTTTCCAACATATCCCTAATATAAAATACATACTTTT-TTAAAAGACATCC 210

TT TTTT TTTC AACATATCC ATATAAA TACATAC T TTAAAA ACAT C

TT TTTT TTTC AACATATCC ATATAAA TACATAC T TTAAAA ACAT C

Nila hitam 3 r.gnu 231 ACTGTTTTCCC-ACATATTTGTCATCAACATCTATAACTTAGAAGAACATAAACCCATAA 289 Nila putih 7 r.gnu 211 ACTGGTTCCCCCACATATTTGCCAACAACATTTACAACTAAGAGAAACATAAACCAGTAA 270

ACTG TT CCC ACATATTTG CA CAACAT TA AACT AGA AACATAAACC TAA ACTG TT CCC ACATATTTG CA CAACAT TA AACT AGA AACATAAACC TAA

Nila hitam 3 r.gnu 290 ATGAAATATTCCAATAACGATTAAATACCACTGAACGATAGTTTAAGACCGAACACAACT 349 Nila putih 7 r.gnu 271 ATGGAACTTTCCAAAAACATTTCAAAACCACTAAACGACAGTTTAAGACCGAACACAACT 330

ATG AA TTCCAA AAC TT AA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAACACAACT ATG AA TTCCAA AAC TT AA ACCACT AACGA AGTTTAAGACCGAACACAACT

Nila hitam 3 r.gnu 350 CTCATACAGTTAAGATATACCAAGTACCCAACATCCTATACTTCTAAATTATTTAATGTA 409 Nila putih 7 r.gnu 331 CTCATAC-GTTAAGATATACCAAGTACCCACCATCCTATACTTCCGAATTATTTAATGTA 389

CTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTTAATGTA

CTCATAC GTTAAGATATACCAAGTACCCA CATCCTATACTTC AATTATTTAATGTA

Nila hitam 3 r.gnu 410 GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTCCTATATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACAAT 469 Nila putih 7 r.gnu 390 GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATTTCTCAATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACAGT 449

GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATT CT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACA T GTAAGAGCCCACCATCAGTTGATT CT ATGTTAACGGTTCTTGAAGGTCAAGGACA T

Nila hitam 3 r.gnu 470 TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA 529 Nila putih 7 r.gnu 450 TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA 509

TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA TATTTGTGGGGGTTTCACTAATTGAATTATTCCTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCA

Nila hitam 3 r.gnu 530 ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTTATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGTCAATAC 589 Nila putih 7 r.gnu 510 ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTTCATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGTTAATAC 569

ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTT ATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT AATAC

ATAATTGTTATAATTCCCCATTCTTT ATTGACGCTTGCATAAGTTAATGGTGT AATAC Nila hitam 3 r.gnu 590 ATACTCCTCATTACCCAACATGCCGGGCGTTCTTTCCAGAGGATAGGGGGTTTCTCTTTT 649 Nila putih 7 r.gnu 570 ATACTCCTCGTTACCCACCATGCCGGGCGTTCTTTCCAGGGTGTGGGGGGTT-CTCTTTT 628

ATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTT CTCTTTT ATACTCCTC TTACCCA CATGCCGGGCGTTCTTTCCAG G T GGGGGTT CTCTTTT

Nila hitam 3 r.gnu 650 TTTTTTTCCTTTCATTTGGCATCTCAGAGTGCATACAGAAATGACAGACAAGGTTGAACA 709 Nila putih 7 r.gnu 629 TTTTTTTCCTTTCACTTGACATTTCAGAGTGCATACAGAAAAGACAGACAAGGTTGAACA 688

TTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGGTTGAACA TTTTTTTCCTTTCA TTG CAT TCAGAGTGCATACAGAAA GACAGACAAGGTTGAACA

Nila hitam 3 r.gnu 710 TTTTCCTTGCTTGGAGGTAAATAGTATGAATGATAGA-AGACATTGATA-GAAGTATTGC 767 Nila putih 7 r.gnu 689 TTTTCCTTGCTTGAACGGAAATAGTATGAATGGTGGTTAGATATTATTAAGAAGAATTGC 748

TTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAAG ATTGC

TTTTCCTTGCTTG A G AAATAGTATGAATG T G AGA ATT TA GAAG ATTGC Nila hitam 3 r.gnu 768 ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTTCAATCAAATATTTCAATTTTCTCCTAATTTTTCT 827 Nila putih 7 r.gnu 749 ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTTTAATCAAA-ATTTTAATTTTCTCCTAATTTTTCT 807

ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTT AATCAAA ATTT AATTTTCTCCTAATTTTTCT ATAACTGATATCTAGAGCATAAAGTT AATCAAA ATTT AATTTTCTCCTAATTTTTCT

Nila hitam 3 r.gnu 828 ATTATTCTTCGGTTTTTTCGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT 887 Nila putih 7 r.gnu 808 ATTAACCTTCGGTTTTTGCGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT 867

ATTA CTTCGGTTTTT CGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT ATTA CTTCGGTTTTT CGCGCGTAAACCCCCCCTACCCCCCCAAAACTCCTAAGATCT

Nila hitam 3 r.gnu 888 CTAATACTCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGTGACTTTTAGCGCTT 947 Nila putih 7 r.gnu 868 CTAATATTCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGTAACTTTCAGCGCTT 927

CTAATA TCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGT ACTTT AGCGCTT

CTAATA TCCTGCAAACCCCCCGGAAACAGGAAAAGCTCTAGAAGT ACTTT AGCGCTT

Nila hitam 3 r.gnu 948 TAGTTTATGCATGTTATATTACTTAATGTGTGTATATGCAGTATTATCAATGCACGGGCC 1007 Nila putih 7 r.gnu 928 TAATATATGCATAAAATATTACTTAATGTGTGTATATCTAGTACTATCAATGCACGAGTC 987

TA T TATGCAT ATATTACTTAATGTGTGTATAT AGTA TATCAATGCACG G C

TA T TATGCAT ATATTACTTAATGTGTGTATAT AGTA TATCAATGCACG G C Nila hitam 3 r.gnu 1008 ATATATCCAATGTGTGTATATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC 1067 Nila putih 7 r.gnu 988 ATGTATCCAATGTGTGTGTATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC 1047

AT TATCCAATGTGTGT TATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC

AT TATCCAATGTGTGT TATTATATTATTATAATATTGCACATGCTAGCGTAGCTTAAC Nila hitam 3 r.gnu 1068 TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC 1127 Nila putih 7 r.gnu 1048 TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC 1107

TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC

TAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGACGGACCCTAGAAAGGCCCCGTAAGCACAAAGGC Nila hitam 3 r.gnu 1128 TTGGTCCTGACTT-ACTTCAGTT-GAAACCC 1156 Nila putih 7 r.gnu 1108 TTGGTCCTGACTTTACTTCAGTTTGAAACCC 1138

TTGGTCCTGACTT ACTTCAGTT GAAACCC

Lampiran 7. Elektroforegram hasil PCR kombinasi primer yang tidak spesifik

a. Primer MtTi-F1 dan Mt-Ti-R1

b. Primer MtTi-F1 dan MtTi-R1