Xenotransplantation of giant gourami testicular germ cells into larvae of nile tilapia
XENOTRANSPLANTASI SEL TESTIKULAR
IKAN GURAMI KEPADA LARVA IKAN NILA
IRMA ANDRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa semua pernyataan
dalam disertasi saya yang berjudul :
Xenotransplantasi Sel Testikular Ikan Gurami kepada Larva Ikan Nila
merupakan hasil penelitian disertasi saya sendiri dengan pembimbingan oleh
komisi pembimbing terkecuali yang jelas ditunjukkan rujukannya. Disertasi ini
belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di
perguruan tinggi lain. Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan
secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Januari 2012
Irma Andriani
C161060081
i
ii
ABSTRACT
IRMA ANDRIANI. Xenotransplantation of Giant Gourami Testicular Germ
Cells into Larvae of Nile Tilapia. Under direction of ALIMUDDIN, KOMAR
SUMANTADINATA, and ITA DJUWITA.
We were attempting to develop testicular germ cell (TGC)
transplantation as a tool to produce surrogate broodstock of commercially
valuable fish and long generation time species. Giant gourami testis had been
used as a model for donor and Nile tilapia larvae as recipient. The research was
conducted to study the competency of giant gourami TGC as donor and Nile
tilapia larvae as recipient for xenotransplantation of giant gouramy TGC into
larvae of Nile tilapia. We developed TGC xenotransplantation system by some
steps as follow : 1) The characterization of spermatogonia to identify optimal
donor of giant gourami based on body weight using histological approach, 2) The
determination of dissociation method for giant gourami testicular tissue by
comparing two different composition of dissociation medium with 5 hours
incubation time, 3) Optimizing the timing of intraperitoneal TGC transplantation
into peritoneal cavity of 1, 3, 5 and 7 days post hatching (dph) recipient by
investigating the colonization efficiency of donor cell labelled PKH 26 fluorescent
membrane dye under fluorescent microscope and of molecular technique using
growth hormone of giant gourami specific primer, 4 ) Analyzing the proliferation
of spermatogonia colonized in recipient gonad using molecular approach, and 5)
The evaluation of TGC isolated from testis of giant gourami which preserved at
4 oC using NaCl 0.7% for 6, 12, 24 and 48 hours and then transplanted into
peritoneal cavity of recipient. The result showed that the donor with abundant
spermatogonia stem cell and A type spermatogonia (cell diameter = 14.43–20.53
µm) were found in giant gourami with body weight ranged from 500–1000 g. The
dissociation method produced high number of spermatogonia with high viability
was one used medium PBS containing trypsin, DNase, CaCl2, HEPES, FBS and
incubated for 3 hours. The highest colonization efficiency was observed at 3 dph
recipient (61.1±34.71%) suggesting that 3 dph Nile tilapia larvae was the
optimum recipient for transplantation. Intraperitoneally transplanted xenogenic
spermatogonia efficiently colonized the ovary as well with sex ratio male out of
female was 1:1, and possibly proliferated indicated by cell cluster forming and the
increase of DNA concentration of donor in recipient testis during time interval 1
month to 2 or 3 month pt. The successful colonization of spermatogonia isolated
from preserved testis were also observed with colonization efficiency not differed
significantly as from non preserved testis. In conclusion : the testis of giant
gouramy was composed of cells that had competency as donor for
xenotransplantation using Nile tilapia larvae as recipient.
Key words : xenotransplantation, testicular germ cell, giant gourami, Nile tilapia,
colonization efficiency, proliferation, preservation.
iii
iv
RINGKASAN
IRMA ANDRIANI. Xenotransplantasi Sel Testikular Ikan Gurami kepada Larva
Ikan Nila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN, KOMAR SUMANTADINATA, dan
ITA DJUWITA.
Lambatnya pertumbuhan ikan gurami (Osphronemus goramy) tidak hanya
berdampak pada lamanya ikan gurami mencapai ukuran konsumsi tetapi juga pada
lamanya ikan gurami mencapai ukuran induk (matang kelamin) sehingga
ketersediaan induk untuk menghasilkan benih ikan gurami menjadi terbatas.
Keterbatasan induk dan benih tentu saja menjadi kendala bagi kegiatan
peningkatan produksi ikan gurami.
Saat ini berkembang satu sistem pembenihan untuk produksi ikan yang
lama matang kelamin yaitu benih diproduksi oleh induk lain atau induk pengganti
(surrogate broodstock). Untuk aplikasi sistem pembenihan ini dibutuhkan suatu
teknologi yang disebut xenotransplantasi sel testikular yaitu transplantasi sel
testikular yang berasal dari jenis ikan (donor) yang ingin diproduksi ke jenis ikan
(resipien) berbeda yang memiliki pertumbuhan cepat. Jika teknologi ini
diterapkan pada budidaya ikan gurami diharapkan sel spermatogonia dari
suspensi sel testikular ikan gurami yang ditransplantasikan akan tumbuh dan
berkembang bersama-sama dengan sel testikular resipien hingga dikeluarkan
sebagai sel gamet ikan gurami dalam waktu yang lebih cepat. Pada penelitian ini
resipien yang digunakan adalah ikan nila karena cepat matang kelamin, masa
rematurasi 2 bulan, viabilitas larva tinggi dan mudah beradaptasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kompetensi sel testikular ikan
gurami sebagai donor dan larva ikan nila sebagai resipien pada teknologi
xenotransplantasi sel testikular ikan gurami kepada larva ikan nila. Ruang
lingkup penelitian terdiri atas 5 tahap. Tahap 1: Identifikasi tipe sel
spermatogonia dan penentuan kelompok bobot tubuh ikan gurami yang dapat
dijadikan sebagai sumber sel spermatogonia, keduanya dilakukan dengan
pendekatan histologis. Tahap 2: Penentuan metode disosiasi yang optimum
dengan parameter pengamatan adalah jenis larutan disosiasi dan lama inkubasi
yang menghasilkan jumlah spermatogonia terbanyak dan viabilitas spermatogonia
tertinggi. Jenis larutan disosiasi yang diujikan adalah larutan A (tripsin dalam
larutan phosphate buffered saline/PBS) dan larutan B (tripsin dan DNase dalam
larutan PBS dilengkapi CaCl2, HEPES dan fetal bovine serum /FBS), sedangkan
lama inkubasi dalam larutan disosiasi yang diujikan adalah 1,2,3,4 dan 5 jam.
Tahap 3: Transplantasi sel testikular ikan gurami ke beberapa umur larva. Sel
hasil disosiasi diwarnai PKH 26 fluorescent membrane dye dan disuntikkan
secara intra peritoneal (i.p) pada beberapa kelompok umur larva ikan nila yaitu 1,
3, 5 dan 7 hari pascamenetas (hpm) sebanyak 20.000/0,5 µ L medium L15 per
larva. Parameter yang diamati adalah sintasan pascatransplantasi (pt) dan
efisiensi kolonisasi sel donor pada resipien. Umur resipien yang optimum adalah
yang memiliki sintasan dan efisiensi kolonisasi tertinggi dilakukan. Tahap 4:
Analisis proliferasi sel donor pada gonad resipien. Gonad resipien umur 1, 2 dan 3
bulan pt yang membawa sel donor dianalisis secara molekular menggunakan
primer spesifik growth hormone (GH) ikan gurami. Pita DNA hasil elektroforesis
dikuantifikasi menggunakan program unscan IT gel 6.1. Parameter yang diamati
v
adalah konsentrasi DNA gurami pada resipien umur 1,2 dan 3 bulan pt . Tahap 5:
Transplantasi sel testikular yang berasal dari sumber donor yang dipreservasi
dalam larutan fisiologis NaCl pada suhu 4 oC selama 24 dan 48 jam . Preservasi
dilakukan untuk mengatasi masalah sinkronisasi ketersediaan sel donor dan
resipien. Parameter yang diamati adalah viabilitas sel spermatogonia, kerusakan
histologis dan efisiensi kolonisasi sel donor pada resipien.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel spermatogonia ikan gurami yang
memiliki peluang terkolonisasi adalah sel spermatogonia tidak terdiferensiasi
yaitu sel punca spermatogonia (SSC) dan spermatogonia A (SpA) dengan
diameter sel berukuran 14,43–20,53 µm. Kelompok bobot tubuh ikan gurami
yang memiliki kelimpahan SSC dan SpA tertinggi adalah kelompok 500–1000 g
dengan frekuensi relatif rata-rata SSC dan SpA masing-masing 2,96±1,20% dan
23,23±3,75%.
Larutan disosiasi yang mengandung tripsin dan DNase (larutan B)
memberikan hasil disosiasi dengan jumlah sel spermatogonia yang lebih tinggi
dibandingkan larutan disosiasi yang mengandung tripsin saja (larutan A). Waktu
inkubasi yang optimum untuk disosiasi adalah 3 jam. Dengan demikian untuk
metode disosiasi jaringan testikular yang optimum untuk ikan gurami adalah
menggunakan larutan B yang terdiri atas tripsin dan DNase yang dilengkapi
CaCl2, HEPES dan FBS dalam larutan PBS dengan lama masa inkubasi jaringan
3 jam.
Teknik transplantasi menggunakan mikroinjeksi secara i.p menghasilkan
sintasan larva 24 jam pt berbeda nyata (P
IKAN GURAMI KEPADA LARVA IKAN NILA
IRMA ANDRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa semua pernyataan
dalam disertasi saya yang berjudul :
Xenotransplantasi Sel Testikular Ikan Gurami kepada Larva Ikan Nila
merupakan hasil penelitian disertasi saya sendiri dengan pembimbingan oleh
komisi pembimbing terkecuali yang jelas ditunjukkan rujukannya. Disertasi ini
belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di
perguruan tinggi lain. Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan
secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Januari 2012
Irma Andriani
C161060081
i
ii
ABSTRACT
IRMA ANDRIANI. Xenotransplantation of Giant Gourami Testicular Germ
Cells into Larvae of Nile Tilapia. Under direction of ALIMUDDIN, KOMAR
SUMANTADINATA, and ITA DJUWITA.
We were attempting to develop testicular germ cell (TGC)
transplantation as a tool to produce surrogate broodstock of commercially
valuable fish and long generation time species. Giant gourami testis had been
used as a model for donor and Nile tilapia larvae as recipient. The research was
conducted to study the competency of giant gourami TGC as donor and Nile
tilapia larvae as recipient for xenotransplantation of giant gouramy TGC into
larvae of Nile tilapia. We developed TGC xenotransplantation system by some
steps as follow : 1) The characterization of spermatogonia to identify optimal
donor of giant gourami based on body weight using histological approach, 2) The
determination of dissociation method for giant gourami testicular tissue by
comparing two different composition of dissociation medium with 5 hours
incubation time, 3) Optimizing the timing of intraperitoneal TGC transplantation
into peritoneal cavity of 1, 3, 5 and 7 days post hatching (dph) recipient by
investigating the colonization efficiency of donor cell labelled PKH 26 fluorescent
membrane dye under fluorescent microscope and of molecular technique using
growth hormone of giant gourami specific primer, 4 ) Analyzing the proliferation
of spermatogonia colonized in recipient gonad using molecular approach, and 5)
The evaluation of TGC isolated from testis of giant gourami which preserved at
4 oC using NaCl 0.7% for 6, 12, 24 and 48 hours and then transplanted into
peritoneal cavity of recipient. The result showed that the donor with abundant
spermatogonia stem cell and A type spermatogonia (cell diameter = 14.43–20.53
µm) were found in giant gourami with body weight ranged from 500–1000 g. The
dissociation method produced high number of spermatogonia with high viability
was one used medium PBS containing trypsin, DNase, CaCl2, HEPES, FBS and
incubated for 3 hours. The highest colonization efficiency was observed at 3 dph
recipient (61.1±34.71%) suggesting that 3 dph Nile tilapia larvae was the
optimum recipient for transplantation. Intraperitoneally transplanted xenogenic
spermatogonia efficiently colonized the ovary as well with sex ratio male out of
female was 1:1, and possibly proliferated indicated by cell cluster forming and the
increase of DNA concentration of donor in recipient testis during time interval 1
month to 2 or 3 month pt. The successful colonization of spermatogonia isolated
from preserved testis were also observed with colonization efficiency not differed
significantly as from non preserved testis. In conclusion : the testis of giant
gouramy was composed of cells that had competency as donor for
xenotransplantation using Nile tilapia larvae as recipient.
Key words : xenotransplantation, testicular germ cell, giant gourami, Nile tilapia,
colonization efficiency, proliferation, preservation.
iii
iv
RINGKASAN
IRMA ANDRIANI. Xenotransplantasi Sel Testikular Ikan Gurami kepada Larva
Ikan Nila. Dibimbing oleh ALIMUDDIN, KOMAR SUMANTADINATA, dan
ITA DJUWITA.
Lambatnya pertumbuhan ikan gurami (Osphronemus goramy) tidak hanya
berdampak pada lamanya ikan gurami mencapai ukuran konsumsi tetapi juga pada
lamanya ikan gurami mencapai ukuran induk (matang kelamin) sehingga
ketersediaan induk untuk menghasilkan benih ikan gurami menjadi terbatas.
Keterbatasan induk dan benih tentu saja menjadi kendala bagi kegiatan
peningkatan produksi ikan gurami.
Saat ini berkembang satu sistem pembenihan untuk produksi ikan yang
lama matang kelamin yaitu benih diproduksi oleh induk lain atau induk pengganti
(surrogate broodstock). Untuk aplikasi sistem pembenihan ini dibutuhkan suatu
teknologi yang disebut xenotransplantasi sel testikular yaitu transplantasi sel
testikular yang berasal dari jenis ikan (donor) yang ingin diproduksi ke jenis ikan
(resipien) berbeda yang memiliki pertumbuhan cepat. Jika teknologi ini
diterapkan pada budidaya ikan gurami diharapkan sel spermatogonia dari
suspensi sel testikular ikan gurami yang ditransplantasikan akan tumbuh dan
berkembang bersama-sama dengan sel testikular resipien hingga dikeluarkan
sebagai sel gamet ikan gurami dalam waktu yang lebih cepat. Pada penelitian ini
resipien yang digunakan adalah ikan nila karena cepat matang kelamin, masa
rematurasi 2 bulan, viabilitas larva tinggi dan mudah beradaptasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kompetensi sel testikular ikan
gurami sebagai donor dan larva ikan nila sebagai resipien pada teknologi
xenotransplantasi sel testikular ikan gurami kepada larva ikan nila. Ruang
lingkup penelitian terdiri atas 5 tahap. Tahap 1: Identifikasi tipe sel
spermatogonia dan penentuan kelompok bobot tubuh ikan gurami yang dapat
dijadikan sebagai sumber sel spermatogonia, keduanya dilakukan dengan
pendekatan histologis. Tahap 2: Penentuan metode disosiasi yang optimum
dengan parameter pengamatan adalah jenis larutan disosiasi dan lama inkubasi
yang menghasilkan jumlah spermatogonia terbanyak dan viabilitas spermatogonia
tertinggi. Jenis larutan disosiasi yang diujikan adalah larutan A (tripsin dalam
larutan phosphate buffered saline/PBS) dan larutan B (tripsin dan DNase dalam
larutan PBS dilengkapi CaCl2, HEPES dan fetal bovine serum /FBS), sedangkan
lama inkubasi dalam larutan disosiasi yang diujikan adalah 1,2,3,4 dan 5 jam.
Tahap 3: Transplantasi sel testikular ikan gurami ke beberapa umur larva. Sel
hasil disosiasi diwarnai PKH 26 fluorescent membrane dye dan disuntikkan
secara intra peritoneal (i.p) pada beberapa kelompok umur larva ikan nila yaitu 1,
3, 5 dan 7 hari pascamenetas (hpm) sebanyak 20.000/0,5 µ L medium L15 per
larva. Parameter yang diamati adalah sintasan pascatransplantasi (pt) dan
efisiensi kolonisasi sel donor pada resipien. Umur resipien yang optimum adalah
yang memiliki sintasan dan efisiensi kolonisasi tertinggi dilakukan. Tahap 4:
Analisis proliferasi sel donor pada gonad resipien. Gonad resipien umur 1, 2 dan 3
bulan pt yang membawa sel donor dianalisis secara molekular menggunakan
primer spesifik growth hormone (GH) ikan gurami. Pita DNA hasil elektroforesis
dikuantifikasi menggunakan program unscan IT gel 6.1. Parameter yang diamati
v
adalah konsentrasi DNA gurami pada resipien umur 1,2 dan 3 bulan pt . Tahap 5:
Transplantasi sel testikular yang berasal dari sumber donor yang dipreservasi
dalam larutan fisiologis NaCl pada suhu 4 oC selama 24 dan 48 jam . Preservasi
dilakukan untuk mengatasi masalah sinkronisasi ketersediaan sel donor dan
resipien. Parameter yang diamati adalah viabilitas sel spermatogonia, kerusakan
histologis dan efisiensi kolonisasi sel donor pada resipien.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel spermatogonia ikan gurami yang
memiliki peluang terkolonisasi adalah sel spermatogonia tidak terdiferensiasi
yaitu sel punca spermatogonia (SSC) dan spermatogonia A (SpA) dengan
diameter sel berukuran 14,43–20,53 µm. Kelompok bobot tubuh ikan gurami
yang memiliki kelimpahan SSC dan SpA tertinggi adalah kelompok 500–1000 g
dengan frekuensi relatif rata-rata SSC dan SpA masing-masing 2,96±1,20% dan
23,23±3,75%.
Larutan disosiasi yang mengandung tripsin dan DNase (larutan B)
memberikan hasil disosiasi dengan jumlah sel spermatogonia yang lebih tinggi
dibandingkan larutan disosiasi yang mengandung tripsin saja (larutan A). Waktu
inkubasi yang optimum untuk disosiasi adalah 3 jam. Dengan demikian untuk
metode disosiasi jaringan testikular yang optimum untuk ikan gurami adalah
menggunakan larutan B yang terdiri atas tripsin dan DNase yang dilengkapi
CaCl2, HEPES dan FBS dalam larutan PBS dengan lama masa inkubasi jaringan
3 jam.
Teknik transplantasi menggunakan mikroinjeksi secara i.p menghasilkan
sintasan larva 24 jam pt berbeda nyata (P