Medium kultur yang telah diinokulasikan sebanyak 1 inokulum : kultur kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 105 rpm dengan suhu 37ºC selama 3 hari dan di-
sampling secara berkala setiap 12 jam selama 72 jam. Ekstrak kasar enzim CGT-ase
diperoleh melalui proses sentrifugasi.
6. Penentuan Pertumbuhan Sel, Uji Aktivitas dan Uji Kadar Protein Enzim
a. Penentuan Pertumbuhan Sel
Penentuan pertumbuhan sel ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan dari sel bakteri. Sebanyak 0,3 mL kultur dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2,7 mL
akuades lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm.
b. Penentuan Aktivitas Enzim CGT-ase
Aktivitas enzim CGT-ase dilakukan dengan menyiapkan ekstrak kasar enzim dari sampel kultur. Sampel kultur disentrifugasi dan supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar
enzim CGT-ase. Ekstrak kasar ini kemudian diuji aktivitas dan ditentukan kadar proteinnya. Aktivitas enzim CGT-ase diukur berdasarkan metode Kaneko et al. 1987 dan dimodifikasi
oleh Alves-Prado et al. 2008. Sebanyak 100 µL larutan enzim ditambahkan 800 µL soluble starch
1 yang disiapkan dalam buffer asetat 0.1 M dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 mL Na
2
CO
3
0.25 M kemudian ditambahkan 0.1 mL larutan fenolftalein 1 mM. Absorbansi diukur pada λ
maks
550 nm. Kontrol dibuat dengan cara menginaktifkan larutan enzim pada suhu 100ºC selama 30 menit,
dan selanjutnya diperlakukan sama dengan sampel.
c. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata
dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada
suhu kamar. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan akuades. Kontrol diperlakukan sama dengan perlakuan pada sampel. Pengukuran serapan dilakukan pada λ
maks
600 nm. Konsentrasi protein dihitung dengan mengekstrapolasi nilai absorban sampel terhadap kurva
standar BSA.
7. Diagram Alir Prosedur Penelitian
