Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing
dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
September 2008
Kurnia Panca Dewi
NRP G351060121
ABSTRACT
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about
genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to
observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral
characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two
stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female
flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP.
Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using
NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %)
were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of
dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten
accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group
consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri
and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including
Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang
and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50
respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA
differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The
first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and
Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including
Bengkulu and Bangka.
Keywords: physic nut, floral characters, AFLP method, genetic diversity.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan
Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan
keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah
satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak
pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat
diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat
dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah
tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga
jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA
yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan
yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,
keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya
perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar
melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu
dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang
program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular
DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi
Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember,
Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle
dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl
Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina.
Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap
preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan
untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi
jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi
jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis
keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
Hasil amplifikasi pita DNA pada analisis AFLP menggunakan primer Pst I
(P11) dan Mse I (M49) pada 10 aksesi jarak pagar menghasilkan jumlah pita
antara 50-255 pb adalah 582 pita dan jumlah pita antara 300-460 pb adalah 70.
Analisis AFLP dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar dapat
mendeteksi 91 lokus, yang terdiri atas 32 lokus ( 35.16%) bersifat monomorfisme,
dan 59 lokus (64.84%) bersifat polimorfisme. Nilai koefisien kemiripan
berdasarkan pita AFLP rentang nilainya berkisar 0.396-0.989. Dendrogram yang
dihasilkan dapat mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok pada
koefisien kemiripan 0.66. Hasil plot tiga dimensi berdasarkan Analisis Komponen
Utama (AKU) juga mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Madiun, Bengkulu, Jember, Bangka, Kediri dan
Ponorogo. Kelompok II terdiri dari aksesi Dompu, Lampung, Subang dan
Sukabumi. Aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang mengelompok
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang
berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram
yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada
koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga
menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga
mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II
terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan
adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80.
Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga
jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
Kata kunci: jarak pagar, karakter bunga, metode AFLP, keragaman genetik.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Penelitian
Nama
NRP
: Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha
curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)
: Kurnia Panca Dewi
: G351060121
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Ketua
Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
MS
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 28 Agustus 2008
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir. Muhammad Jusuf
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan
sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research
Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian
sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu
memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya
dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan
saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini.
3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis
untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa
Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas
kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini
dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB),
Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan
Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium.
7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas
bahan penelitian yang diberikan.
8. Suami dan anak-anakku tersayang atas dukungan, semangat dan kasih
sayang yang diberikan.
9. Ibu dan ayahku tercinta, serta kakak dan adik yang telah memberi
dorongan dan semangat serta kasih sayangnya.
10. Mbak Pepy, Pak Adi, Pak Mulya, Ibu Fitmawati, Mas Firdaus, Pak
Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU
dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis
sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat.
11. Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB.
Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing
dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
September 2008
Kurnia Panca Dewi
NRP G351060121
ABSTRACT
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about
genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to
observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral
characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two
stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female
flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP.
Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using
NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %)
were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of
dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten
accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group
consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri
and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including
Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang
and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50
respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA
differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The
first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and
Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including
Bengkulu and Bangka.
Keywords: physic nut, floral characters, AFLP method, genetic diversity.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan
Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan
keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah
satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak
pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat
diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat
dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah
tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga
jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA
yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan
yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,
keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya
perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar
melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu
dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang
program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular
DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi
Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember,
Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle
dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl
Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina.
Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap
preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan
untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi
jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi
jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis
keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
Hasil amplifikasi pita DNA pada analisis AFLP menggunakan primer Pst I
(P11) dan Mse I (M49) pada 10 aksesi jarak pagar menghasilkan jumlah pita
antara 50-255 pb adalah 582 pita dan jumlah pita antara 300-460 pb adalah 70.
Analisis AFLP dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar dapat
mendeteksi 91 lokus, yang terdiri atas 32 lokus ( 35.16%) bersifat monomorfisme,
dan 59 lokus (64.84%) bersifat polimorfisme. Nilai koefisien kemiripan
berdasarkan pita AFLP rentang nilainya berkisar 0.396-0.989. Dendrogram yang
dihasilkan dapat mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok pada
koefisien kemiripan 0.66. Hasil plot tiga dimensi berdasarkan Analisis Komponen
Utama (AKU) juga mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Madiun, Bengkulu, Jember, Bangka, Kediri dan
Ponorogo. Kelompok II terdiri dari aksesi Dompu, Lampung, Subang dan
Sukabumi. Aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang mengelompok
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang
berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram
yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada
koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga
menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga
mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II
terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan
adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80.
Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga
jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
Kata kunci: jarak pagar, karakter bunga, metode AFLP, keragaman genetik.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Penelitian
Nama
NRP
: Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha
curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)
: Kurnia Panca Dewi
: G351060121
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Ketua
Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
MS
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 28 Agustus 2008
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir. Muhammad Jusuf
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan
sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research
Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian
sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu
memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya
dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan
saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini.
3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis
untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa
Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas
kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini
dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB),
Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan
Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium.
7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas
bahan penelitian yang diberikan.
8. Suami dan anak-anakku tersayang atas dukungan, semangat dan kasih
sayang yang diberikan.
9. Ibu dan ayahku tercinta, serta kakak dan adik yang telah memberi
dorongan dan semangat serta kasih sayangnya.
10. Mbak Pepy, Pak Adi, Pak Mulya, Ibu Fitmawati, Mas Firdaus, Pak
Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU
dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis
sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat.
11. Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB.
Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 23 April 1972 dari ayah
Damanhuri dan ibu Zunariyah. Penulis merupakan anak kelima dari enam
bersaudara.
Tahun 1990 penulis lulus dari SMUN 10 Yogyakarta dan pada tahun yang
sama melanjutkan ke IKIP Negeri Yogyakarta, Fakultas Pendidikan MIPA.
Penulis memilih jurusan Biologi.
Pada tahun 1996 penulis memperoleh gelar Sarjana Pendidikan. Penulis
diangkat menjadi PNS di MAN Negara, Bali tahun 1997 dan mutasi ke MAN
Wates 2 Kulon Progo, Daerah Istimewa Yogyakarta pada tahun 2002. Penulis
diberi kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang Program Magister
Sains Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, Program studi Biologi
dengan mendapatkan Beasiswa Utusan Daerah dari Departemen Agama RI.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................
xv
PENDAHULUAN
Latar Belakang.....................................................................................
Tujuan Penelitian .................................................................................
1
3
TINJAUAN PUSTAKA
Asal dan Distribusi ..............................................................................
Karakter Bunga ....................................................................................
Analisis Genetik dengan Penanda Molekular........................................
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) .............................
4
4
5
6
BAHAN DAN METODE
Metode.................................................................................................
Penyiapan Bahan Tanaman ..................................................................
Pengamatan Karakter Bunga ................................................................
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga...................................................
Analisis AFLP......................................................................................
Isolasi DNA ...................................................................................
Analisis Polimorfisme DNA dengan AFLP ....................................
Restriksi DNA Genomik dan Ligasi Adaptor ............................
Amplifikasi Fragmen Hasil Restriksi ........................................
Analisis Similaritas dan Analisis Komponen Utama.............................
9
10
10
10
11
11
13
13
13
15
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakter Bunga ....................................................................................
Analisis Penanda AFLP........................................................................
Analisis Karakter Bunga dan AFLP......................................................
17
19
25
SIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................
29
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
30
LAMPIRAN .................................................................................................
33
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
Rata - rata jumlah bunga jantan dan betina dari lima aksesi jarak
pagar 10 BST ..........................................................................................
18
Analisis komponen utama 10 aksesi jarak pagar menggunakan
penanda AFLP ........................................................................................
24
Nilai mutlak komponen utama terbesar dari 91 lokus hasil AFLP
dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar.................................
25
Analisis komponen utama lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan AFLP........................................................................
27
Nilai mutlak komponen utama terbesar berdasarkan karakter bunga
dan 91 lokus hasil AFLP dengan sepasang primer pada lima aksesi
jarak pagar ..............................................................................................
28
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang
membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina (d)
5
Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
Pemotongan DNA genom dengan enzim restriksi (1), ligasi adaptor (2),
dan amplifikasi selektif (3)......................................................................
8
Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.....................................................................
9
4
Sayatan melintang bunga lima aksesi jarak pagar ....................................
18
5
Hasil amplifikasi DNA genom jarak pagar dengan sepasang primer.
Aksesi Madiun (1), aksesi Dompu (2), aksesi Bengkulu (3), aksesi
Lampung (4), aksesi Bangka (5), aksesi Ponorogo (6), aksesi Kediri (7),
aksesi Jember (8), aksesi Subang (9), aksesi Sukabumi (10) ....................
21
Dendrogram 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP yang
dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02..
23
7
Plot tiga dimensi 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP ........
24
8
Dendrogram berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP
pada lima aksesi jarak pagar yang dianalisis dengan SAHN-UPGMA
pada program NTSYS-pc versi 2.02 ........................................................
26
Plot dua dimensi komponen utama berdasarkan karakter bunga dan
91 lokus AFLP pada lima aksesi jarak pagar ekstraksi KU 1 dengan
KU 2 yang dianalisis dengan multivariate pada program Minitab 14 .......
27
2
3
6
9
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Deskripsi ciri morfologi 10 aksesi jarak pagar pada 9 BST......................
33
2
Sembilan puluh satu lokus hasil AFLP ....................................................
34
3
Nilai koefisien kemiripan genetik 10 aksesi jarak pagar berdasarkan
AFLP ......................................................................................................
35
Koefisien kemiripan genetik lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP .................................................
35
Nilai heterozigositas 91 lokus hasil AFLP ..............................................
36
4
5
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman hayati
tumbuhan yang tinggi (Campbell et al. 2006). Hal itu merupakan keunggulan bagi
pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah satu tanaman non
pangan yang direkomendasikan adalah jarak pagar (Jatropha curcas L.). Biji jarak
pagar menghasilkan minyak nabati yang dapat dijadikan sumber energi
(Prihandana & Hendroko 2006).
Di Indonesia terdapat 4 spesies jarak yaitu jarak cina (Jatropha multifida),
jarak bali (Jatropha podagrica), jarak ulung (Jatropha gossypifolia) dan jarak
pagar (Jatropha curcas L.). Menurut Banerji et al. (1985) biji jarak pagar
mempunyai kandungan minyak tertinggi (40-60%) daripada jarak ulung (28.5%)
dan jarak cina (32.4%). Selain sebagai sumber energi alternatif, minyak jarak
pagar dapat juga digunakan dalam industri farmasi (Becker et al. 2005).
Jarak pagar tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian sekitar 500 m dpl.
Tanaman ini dapat tumbuh pada daerah dengan curah hujan 300-2380 mm/tahun.
Temperatur udara tahunan rata-rata yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
20-28 ºC. Tanaman ini dapat tumbuh pada berbagai struktur tanah seperti tanah
berbatu, tanah berpasir dan tanah liat. Menurut Alam (2005) pertumbuhan jarak
pagar di tanah gembur lebih baik daripada di tanah padat. Selain pada tanah subur
jarak pagar dapat tumbuh pada tanah yang ketersediaan air dan unsur-unsur
haranya terbatas (lahan marginal). Di Indonesia banyak terdapat lahan marginal
yang pemanfaatannya masih kurang optimal. Lahan marginal tersebut dapat
digunakan untuk mengembangkan jarak pagar sehingga tidak mengganggu
pengembangan tanaman pangan. Waktu yang paling baik untuk menanam jarak
pagar adalah pada musim kering atau sebelum musim hujan. Jarak pagar
membutuhkan air dan hara yang cukup untuk berproduksi secara optimal (Heller
1996; David et al. 2006).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan
terpisah tetapi masih di dalam satu infloresen. Tiap infloresen biasanya terdiri dari
1-5 bunga betina yang dikelilingi oleh 25-93 bunga jantan. Rasio bunga jantan
2
dibanding dengan bunga betina adalah 29:1 (Raju & Ezradanam 2002).
Berdasarkan hasil penelitian Bhattacharya et al. (2005) pada tiap infloresen
terdapat bunga jantan yang jumlahnya berkisar antara 17-105 dan bunga betina
yang jumlahnya berkisar 2-19. Pola penyerbukan pada jarak pagar dapat terjadi
secara geitonogami (penyerbukan tetangga) maupun xenogami (penyerbukan
silang)(Raju
&
Ezradanam
2002).
Adanya
penyerbukan
silang
dapat
menyebabkan terjadinya keragaman genetik.
Pengetahuan tentang variasi genetik sangat penting bagi program pemuliaan
karena memberikan dasar untuk pengembangan tanaman selanjutnya. Variasi
genetik dapat digunakan sebagai bahan seleksi genotipe yang dikehendaki.
Pengembangan bidang molekular dengan analisis DNA akhir-akhir ini sering
digunakan untuk mengkarakterisasi variasi genetik dan kekerabatan dalam satu
genus, spesies, kultivar atau aksesi. Informasi tentang keragaman genetik
merupakan modal dasar bagi para ahli pemuliaan dan genetika populasi dalam
pengembangan dan perbaikan tanaman, terutama sebagai langkah awal dalam
seleksi tanaman. Langkah ini penting terutama untuk membedakan individu dalam
spesies serta identifikasi genotipe secara tepat dan identifikasi gen-gen yang
berpotensi pembawa karakter unggul.
Keragaman genetik dapat dipelajari menggunakan penanda ciri morfologi
dan molekular yang meliputi penanda isozim dan penanda DNA. Penggunaan
isozim relatif lebih cepat, mudah dan murah, tetapi hasil polimorfisme enzim yang
diperoleh terbatas. Sedangkan penanda DNA dapat digunakan untuk menganalisis
keragaman genetik lebih baik karena hasilnya konsisten dan tidak dipengaruhi
oleh lingkungan (Melchinger 1990).
Saat ini terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi
keragaman genetik pada tingkat DNA. Metode Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dan
Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD) merupakan penanda-penanda DNA
yang banyak digunakan untuk mengkarakterisasi suatu populasi tanaman. Penanda
DNA yang tergolong mutakhir adalah AFLP. Teknik AFLP sedikit rumit karena
melibatkan enzim restriksi dan amplifikasi, tetapi jika dibandingkan dengan
RAPD tingkat konsistensi hasil jauh lebih tinggi. Teknologi AFLP telah
3
digunakan dalam studi keragaman intraspesies, misalnya pada kedelai, teh, kakao
dan kapas. Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan
kekerabatan yang sangat dekat antar genotipe, perbedaan antar klon dalam satu
kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau
adanya perbedaan genetik yang sangat kecil (Cabrita et al. 2001). Informasi
tentang variasi genetik sangat penting dalam program pemuliaan karena memberi
informasi agar dapat digunakan untuk seleksi tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mempelajari keragaman genetik aksesi jarak pagar
yang berasal dari berbagai wilayah Jawa, Sumatera dan Nusa Tenggara
berdasarkan karakter bunga dan DNA menggunakan teknik Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP).
TINJAUAN PUSTAKA
Asal dan Distribusi
Jatropha curcas L. berasal dari Meksiko, Amerika Tengah, menyebar di
Malaka dan Filipina setelah tahun 1700-an (Heller 1996). Tumbuhan ini masuk ke
Indonesia selama periode penjajahan Jepang (1942-1945), penggunaan biji jarak
pagar pada waktu itu sebagai bahan bakar minyak (BBM). Saat ini jarak pagar
tumbuh menyebar di berbagai daerah di Indonesia. Beberapa nama lokal jarak
pagar adalah jarak kosta, kalake pagar (Sunda), jarak pager (Jawa), kalekhe
paghar (Madura), jarak pager (Bali), paku luba, jarak pageh (Nusa Tenggara),
paku kase (Timor), kuman nema (Alor), lulunan (Roti), jarak wolanda,
tondoutomene (Sulawesi), bintalo (Gorontalo), balacai (Manado), ai huwa
kamalo, kadoto (Maluku), nawaih nawas (Nangroe Aceh Darussalam) dan peleng
kaliki (Bugis) (Prihandana & Hendroko 2006). Selain itu, jarak pagar dikenal juga
sebagai castor oil plant karena bijinya menghasilkan minyak (Makkar et al.
1997).
Karakter Bunga
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan
yang terpisah di dalam satu karangan bunga. Pada umumnya dalam satu karangan
bunga terdapat 1 sampai 5 bunga betina yang dikelilingi oleh 25-93 bunga jantan.
Bunga jantan mekar terlebih dahulu sedangkan bunga betina mekar 2 sampai 6
hari setelah bunga jantan mekar (Raju & Ezradanam 2002). Bunga jantan
berukuran kecil, tidak berbau, berbentuk seperti genta, sedangkan bunga betina
berukuran lebih besar (Gambar 1). Kelopak dan mahkota bunga masing-masing
ada lima. Daun mahkota menyatu pada pangkal bunga. Benang sari membentuk
dua lingkaran, atas dan bawah masing-masing lingkaran terdiri atas lima buah.
Benang sari pada lingkaran bawah bebas tetapi pada lingkaran atas bersatu.
Kepala sari berwarna kuning, bagian dorsal melekat pada tangkai sari. Tangkai
putik tiga buah masing-masing bercabang dua untuk menyangga kepala putik.
Bakal buah mempunyai tiga karpel masing-masing dengan satu bakal biji. Kepala
putik reseptif pada saat antesis sampai 3 hari setelah antesis. Penyerbukan dibantu
5
oleh serangga penyerbuk (lebah dan semut) (Raju & Ezradanam 2002). Jarak
pagar biasanya berbunga pada akhir musim kering atau selama musim hujan,
tetapi dapat juga berbunga bergantung pada kondisi lingkungan.
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 1 Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang
membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina
(d).
Analisis Genetik dengan Penanda Molekular
Marka molekular telah banyak digunakan dalam penelitian berbagai disiplin
ilmu (taksonomi, filogeni, ekologi, genetika dan pemuliaan). Marka molekular
pada tingkat DNA mempunyai kelebihan dibandingkan dengan marka ciri
morfologi. Keuntungan penggunaan marka molekular adalah genotipe suatu
organisme dapat diuji secara langsung, jumlah polimorfisme yang ada tidak
terbatas, dan pengembangan teknik dapat menghasilkan marka yang sesuai
dengan tujuan penelitian (Weising et al. 1995). Penggunaan marka DNA dapat
mencerminkan perubahan pada tingkat DNA, perbedaan jarak genetik antara
individu lebih akurat daripada penggunaan marka ciri morfologi, karena fenotipe
yang sama dapat dimunculkan oleh genotipe yang berbeda (Serret et al. 1997).
Penanda
molekular mempunyai
peranan
yang
sangat
luas
untuk
memperbaiki efisiensi program pemuliaan tanaman. Marka molekular dalam
pemuliaan digunakan dalam analisis pautan dan pemetaan genetik, identifikasi
genotipe, estimasi keragaman genetik dan kekerabatan inter dan antar spesies atau
6
varietas (Weising et al. 1996). Menurut Ribaut dan Hoisington (1998) keragaman
genetik yang dihasilkan dari data sidikjari (fingerprinting) dapat digunakan dalam
pengelompokan tumbuhan. Informasi yang diperoleh dapat digunakan untuk
mengidentifikasi tetua yang paling sesuai untuk disilangkan. Pengukuran jarak
genetik berdasarkan marka DNA diperlukan untuk memproduksi kultivar hibrida.
Penanda molekular juga dapat digunakan untuk menentukan lokasi gen yang tepat
pada kromosom. Kelebihan utama dari pemuliaan tanaman menggunakan penanda
molekular dibandingkan seleksi konvensional adalah seleksi dapat dilakukan pada
tanaman yang masih muda, tanpa menunggu pertumbuhan generatif (Sanjaya
2002).
Dasar penanda molekular adalah polimorfisme pada tingkat protein atau
DNA. Polimorfisme yang terdeteksi oleh AFLP dan RFLP mengungkapkan
variasi ukuran berdasarkan situs restriksi. Polimorfisme berdasarkan RAPD
mencerminkan variasi sekuen DNA pada situs perlekatan primer (Powell et al.
1996). RFLP telah digunakan untuk mengevaluasi keragaman genetik pada
tanaman, tetapi analisis dengan RFLP membutuhkan DNA dalam jumlah banyak
dan kemurnian DNA yang tinggi, selain itu RFLP pada beberapa spesies tanaman
kurang baik karena polimorfisme yang terdeteksi rendah (Powell et al. 1996).
Teknik RFLP sangat menyita waktu dan relatif mahal, sehingga beberapa peneliti
cenderung menggunakan RAPD dan AFLP untuk pemetaan genetik (Ben Chaim
et al. 2001).
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Marka AFLP merupakan jenis marka yang didasarkan pada amplifikasi
selektif potongan DNA hasil restriksi genomik total dengan enzim restriksi
endonuklease (Vos et al. 1995). Sebenarnya marka ini mirip marka RAPD, tetapi
primernya spesifik dan jumlah pitanya lebih banyak. Marka AFLP dikategorikan
sebagai marka kodominan, walaupun pada kenyataannya seringkali diperlakukan
sebagai marka dominan. Hal ini dikarenakan kesulitan membedakan intensitas
pita dominan homozigot dengan heterozigot (Setiawan et al. 2000).
Keunggulan teknik AFLP menurut Vos et al. (1995) antara lain tidak
memerlukan informasi sekuen dari genom dan perangkat (kit) oligonukleotida
7
yang sama ketika dilakukan analisis dan dapat diamplifikasikan pada semua
organisme termasuk tanaman, hasil amplifikasinya bersifat stabil, tingkat
pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi, memiliki efisiensi yang sangat
tinggi dalam pemetaan lokus karena sekali amplifikasi dapat meliputi beberapa
lokus, dapat digunakan untuk menganalisis sidik jari semua DNA dengan
mengabaikan kompleksitas dan asal usulnya, serta dapat bertindak sebagai
jembatan antara peta genetik dan peta fisik pada kromosom. Keterbatasan teknik
AFLP adalah cara aplikasinya relatif lebih rumit, sehingga memerlukan waktu
lebih lama dan keterampilan khusus, serta alat dan bahan yang sangat mahal.
Walaupun analisis AFLP relatif lebih mahal dibandingkan dengan analisis RAPD,
namun lokus yang diperoleh dalam tiap reaksi lebih banyak (Powell et al. 1996).
AFLP merupakan suatu teknik analisis DNA berbasis PCR (Polymerase
Chain Reaction). Sebelum amplifikasi PCR, DNA genom dipotong dengan dua
enzim restriksi. Prosedur tersebut melibatkan beberapa tahap yang dimulai dengan
memotong DNA genomik dengan sepasang enzim restriksi, satu enzim memotong
jarang/rare cutter (karena mempunyai situs pengenalan 6 pasang basa/pb) dan
satu enzim memotong sering/frequent cutter (mempunyai situs pengenalan 4 pb).
Selanjutnya adaptor oligonukleotida diligasikan untuk menghasilkan potongan
fragmen sebagai DNA cetakan dalam PCR (Van Eck et al. 1995). Sekuen adaptor
dan situs restriksi di dekatnya bertindak sebagai tempat perlekatan primer untuk
reaksi amplifikasi terhadap fragmen tersebut. Nukleotida selektif terletak pada
ujung 3' primer PCR, sehingga hanya dapat mengawali sintesis DNA dari satu
bagian situs restriksi tersebut (Gambar 2). Hanya fragmen restriksi yang
nukleotidanya mengapit situs restriksi yang cocok dengan nukleotida selektif
yang akan diamplifikasi (Vos et al. 1995).
Reaksi amplifikasi pada AFLP umumnya menggunakan dua primer. Desain
primer yang baik merupakan faktor yang sangat menentukan dalam amplifikasi
PCR. AFLP fingerprinting untuk genom yang kompleks pada umumnya
melibatkan reaksi amplifikasi sebanyak dua tahap yaitu reaksi preamplifikasi dan
reaksi amplifikasi. Preamplifikasi dilakukan dengan dua primer AFLP yang
memiliki satu nukleotida selektif, kemudian hasil reaksi diencerkan dan
digunakan sebagai cetakan untuk reaksi amplifikasi berikutnya (Vos et al. 1995).
8
Polimorfisme terdeteksi berupa ada atau tidaknya fragmen sehingga
merupakan marka dominan. Metode AFLP menghasilkan sejumlah besar fragmen
DNA, tanpa memerlukan pengetahuan tentang sekuen nukleotida. Setiap pasangan
primer selektif dapat memvisualisasikan sekitar 50-100 fragmen DNA hasil
restriksi pada sekuensing gel. Oleh karena setiap fragmen dianggap mewakili satu
karakter tertentu, maka sejumlah besar karakter dapat divisualisasikan untuk
setiap pasangan primer (Haris 2006).
Keberhasilan teknik AFLP juga dipengaruhi oleh keberhasilan teknik PCR.
Teknik PCR didasarkan pada prinsip amplifikasi sekuen DNA secara enzimatis
(in vitro). Amplifikasi sekuen DNA genom pada mesin PCR melibatkan
pengaturan suhu yang terjadi secara berulang. Reaksi terdiri dari denaturasi DNA
menjadi utas tunggal (suhu 94 ºC), penempelan primer (annealing) pada sekuen
DNA genom (suhu 56 ºC), dan pemanjangan primer (elongation) pada suhu 72 ºC.
Pengulangan siklus 25-50 kali akan meningkatkan jumlah fragmen DNA yang
diamplifikasi secara eksponensial (Weising et al. 1995).
Mse I adaptor
G
CAT
DNA genom
Enzim restriksi
(Mse I dan Eco R I)
dan DNA ligase
(1)
Restriksi dan ligasi
Pemotongan Mse I
Eco R I adaptor
AATTG
C
pemotongan Eco RI
Eco RI adaptor
Mse I adaptor
G
CAT
GTAA
CATT
(2)
AATTG
C
GAATTG
CTTAAC
Amplifikasi selektif
primer Mse I
CATTGTA
(3)
GTAACAT
CATTGTA
CGAGAATTG
GCTCTTAAC
CGAGAATTG
primer Eco R I
Gambar 2 Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
Pemotongan DNA genom dengan enzim restriksi (1), ligasi adaptor
(2), dan amplifikasi selektif (3).
BAHAN DAN METODE
Metode
Identifikasi keragaman genetik jarak pagar dilakukan menggunakan karakter
bunga dan DNA dengan teknik AFLP. Penelitian dilakukan mengikuti bagan alir
yang tertera pada Gambar 3.
Penyiapan bahan tanaman
Identifikasi keragaman genetik
Karakter bunga :
Jumlah bunga jantan
Jumlah bunga betina
Daun dari tanaman berumur 2
bulan diambil untuk analisis
DNA dengan teknik AFLP
Teknik AFLP:
Isolasi DNA
Restriksi DNA dan
ligasi adaptor
Amplifikasi fragmen
hasil restriksi
Analisis data karakter bunga dan
AFLP :
Analisis similaritas
Analisis Komponen Utama
Keragaman genetik jarak pagar
Gambar 3
Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.
10
Penyiapan Bahan Tanaman
Bahan tanaman berupa 10 aksesi jarak pagar yang meliputi aksesi Madiun,
Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan
Sukabumi (Lampiran 1). Biji jarak pagar dikecambahkan dengan cara meletakkan
biji pada bak plastik yang telah dilapisi dengan kertas tissu basah. Selanjutnya biji
ditutup kembali dengan kertas tissu basah dan dibiarkan pada suhu ruang selama
dua minggu. Setelah dua minggu kecambah dipindahkan ke polibag ukuran 5x15
cm (0.5 kg) yang berisi tanah latosol dan pupuk kandang dengan perbandingan
1:1, kemudian tanaman diletakkan di rumah kaca. Setelah satu bulan tanaman
dipindahkan ke polibag berukuran 25x50 cm (10 kg) yang berisi tanah dan pupuk
kandang dengan perbandingan 1:1.
Pengamatan Karakter Bunga
Pengamatan karakter bunga dimulai pada saat tanaman mulai berbunga yaitu
4 bulan setelah tanam (BST). Karakter bunga yang diamati adalah rasio bunga
jantan dan betina. Penghitungan rasio bunga jantan dan betina berdasarkan pada
jumlah infloresen yang muncul selama bulan Mei sampai Oktober 2007.
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga
Bunga difiksasi di dalam larutan FAA [5 bagian formalin, 5 bagian asam
asetat glasial, 90 bagian alkohol 70% (v/v)]. Sampel yang telah difiksasi selama
24 jam di dalam larutan FAA, didehidrasi dengan larutan seri n-Butanol III–VII
masing-masing selama 1 jam (Nakamura 1995). Parafin diinfiltrasikan secara
bertahap, dengan cara menambahkan parafin ke dalam n-Butanol p.a. dengan
perbandingan 1:1 dan disimpan di dalam oven pada suhu ruang selama 12 jam.
Kemudian disimpan lagi di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama 24 jam.
Parafin yang bercampur dengan dehidran diganti dengan parafin murni dan
disimpan di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama tiga hari. Sampel kemudian
ditanam di dalam parafin. Blok sampel diiris dengan ketebalan 10
m
menggunakan mikrotom putar (Yamato RV-240). Pita parafin yang diperoleh
direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan larutan albumin-gliserin
dan dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 40 ºC selama 3 sampai 5 jam.
11
Sampel diwarnai dengan safranin 2% (b/v) di dalam air dan fastgreen 0.5% (b/v)
di dalam alkohol 95% (v/v).
Analisis AFLP
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB (Cetil
Trimetil Amonium Bromida) menurut Doyle dan Doyle (1987) yang dimodifikasi
yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Sebanyak 0.5 g daun jarak
pagar ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dalam lumpang porselin
sampai menjadi serbuk. Selanjutnya serbuk daun dimasukkan ke dalam tabung
ependorf yang berisi 600 µl campuran bufer ekstrak [CTAB 2% (b/v), EDTA
(Ethylene Diamine Tetra Acetic) 0.02 M, Tris-HCl 1 M pH 8, NaCl 1.4 M dan
PVP 1% (b/v)] serta 2 l β-merkaptoetanol. Ekstrak diinkubasi pada suhu 65 ºC
selama 1 jam. Pemurnian dilakukan di dalam campuran larutan kloroform dan
isoamil alkohol (CIAA) dengan perbandingan 24:1 sebanyak 1 kali volume
ekstrak. Campuran larutan digoyang merata dengan cara dibolak-balikkan secara
perlahan. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm (Jouan BR4i) pada
suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil kemudian ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 0.7 kali volume, serta dibolak balik secara perlahan.
Ekstrak diinkubasikan di freezer selama 2 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan yang
diperoleh dibuang dan endapan dibilas dengan 500
l alkohol 70% (v/v).
Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm
dengan suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang dan endapan
dikeringkan dengan vakum sampai kering. Pelet yang diperoleh disuspensikan
dengan 50 l ddH2O. Ekstrak ditambah dengan 1 kali volume campuran larutan
PCI (fenol:kloroform:isoamilalkohol) dengan perbandingan 25:24:1, selanjutnya
digerakkan bolak-balik. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm
pada suhu 20 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil, kemudian ditambah
dengan 0.1 kali volume sodium asetat 3 M pH 5.2 dan alkohol absolut sebanyak 2
kali volume. Ekstrak kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ºC. Larutan
disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ºC.
Supernatan dibuang, selanjutnya endapan yang diperoleh dibilas dengan 500 µl
12
alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan
kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v)
dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan vakum sampai kering. Endapan
disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Selanjutnya ditambahkan 0.1 kali RNAse (10
mg/ml), diinkubasi pada suhu 37 ºC selama semalam. Ekstrak yang diperoleh
disimpan sebagai stok pada suhu -20 ºC.
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi RNA dalam larutan.
Jumlah RNA yang banyak akan mempengaruhi hasil absorbansi yang diamati
pada panjang gelombang 260 nm dengan menggunakan spektrofotometer.
Kemurnian DNA ditentukan berdasarkan tingkat kontaminasi protein dalam
larutan dengan membandingkan nilai OD260 dengan OD280. Molekul DNA
dikatakan murni apabila rasio keduanya berada antara 1.8 sampai 2.0. Jika nilai
rasio lebih kecil dari 1.8 maka di dalam larutan tersebut masih terkontaminasi
protein atau fenol dalam larutan, dan nilai rasio yang lebih besar dari 2
menunjukkan adanya akumulasi RNA yang tercampur DNA. Hal ini
mengharuskan dilakukan pemurnian kembali menggunakan RNAse. Kemurnian
DNA yang tinggi akan menghasilkan cetakan yang baik pada proses PCR. Prinsip
kerja spektrofotometer adalah iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh
nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida
secara maksimal dicapai pada panjang gelombang 260 nm, dan penyerapan
maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Kepadatan optik
(optical density) yang disebut OD260 sama dengan 1, maka konsentrasinya se
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing
dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
September 2008
Kurnia Panca Dewi
NRP G351060121
ABSTRACT
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about
genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to
observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral
characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two
stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female
flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP.
Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using
NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %)
were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of
dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten
accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group
consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri
and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including
Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang
and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50
respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA
differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The
first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and
Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including
Bengkulu and Bangka.
Keywords: physic nut, floral characters, AFLP method, genetic diversity.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan
Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan
keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah
satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak
pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat
diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat
dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah
tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga
jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA
yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan
yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,
keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya
perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar
melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu
dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang
program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular
DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi
Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember,
Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle
dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl
Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina.
Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap
preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan
untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi
jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi
jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis
keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
Hasil amplifikasi pita DNA pada analisis AFLP menggunakan primer Pst I
(P11) dan Mse I (M49) pada 10 aksesi jarak pagar menghasilkan jumlah pita
antara 50-255 pb adalah 582 pita dan jumlah pita antara 300-460 pb adalah 70.
Analisis AFLP dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar dapat
mendeteksi 91 lokus, yang terdiri atas 32 lokus ( 35.16%) bersifat monomorfisme,
dan 59 lokus (64.84%) bersifat polimorfisme. Nilai koefisien kemiripan
berdasarkan pita AFLP rentang nilainya berkisar 0.396-0.989. Dendrogram yang
dihasilkan dapat mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok pada
koefisien kemiripan 0.66. Hasil plot tiga dimensi berdasarkan Analisis Komponen
Utama (AKU) juga mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Madiun, Bengkulu, Jember, Bangka, Kediri dan
Ponorogo. Kelompok II terdiri dari aksesi Dompu, Lampung, Subang dan
Sukabumi. Aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang mengelompok
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang
berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram
yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada
koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga
menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga
mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II
terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan
adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80.
Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga
jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
Kata kunci: jarak pagar, karakter bunga, metode AFLP, keragaman genetik.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Penelitian
Nama
NRP
: Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha
curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)
: Kurnia Panca Dewi
: G351060121
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Ketua
Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
MS
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 28 Agustus 2008
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir. Muhammad Jusuf
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan
sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research
Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian
sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu
memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya
dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan
saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini.
3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis
untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa
Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas
kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini
dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB),
Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan
Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium.
7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas
bahan penelitian yang diberikan.
8. Suami dan anak-anakku tersayang atas dukungan, semangat dan kasih
sayang yang diberikan.
9. Ibu dan ayahku tercinta, serta kakak dan adik yang telah memberi
dorongan dan semangat serta kasih sayangnya.
10. Mbak Pepy, Pak Adi, Pak Mulya, Ibu Fitmawati, Mas Firdaus, Pak
Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU
dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis
sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat.
11. Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB.
Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi
Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan
Karakter Bunga dan DNA Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing
dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
September 2008
Kurnia Panca Dewi
NRP G351060121
ABSTRACT
KURNIA PANCA DEWI. Genetic Diversity Identification of Physic nut
based on Floral Characters and DNA using AFLP Method. Under direction of
UTUT WIDYASTUTI and JULIARNI.
Physic nut could be an alternative material for biofuel. Information about
genetic diversity of physic nut is still limited. The aim of this research was to
observe genetic diversity of several accessions of physic nut based on floral
characters and DNA using AFLP method. This research were carried out in two
stages, the first stage was analysing floral characters such as male and female
flower ratio, while the second stage was analysing DNA diversity using AFLP.
Phenetic analysis based on floral characters and DNA were done by using
NTSYS-pc 2.02 and Minitabs 14 programme.
The amplified products using AFLP provided 91 loci, 32 loci (35.16 %)
were monomorphic and 59 loci (64.84 %) were polymorphic. The result of
dendrogram cluster analysis based on DNA characters differentiated ten
accessions into two groups with 0.66 coefficient similarity. The first group
consisted of six accessions including Madiun, Bangka, Jember, Bengkulu, Kediri
and Ponorogo, while the second group consisted of four accessions including
Dompu, Lampung, Subang and Sukabumi. Accessions Dompu, Lampung, Subang
and Sukabumi were in one group due to had loci number in 30, 43 and 50
respectively.
Dendrogram of cluster analysis based on floral characters and DNA
differentiated five accessions into two groups with 0.65 coefficient similarity. The
first group consisted of three accessions including Dompu, Lampung and
Sukabumi, while the second group consisted of two accessions including
Bengkulu and Bangka.
Keywords: physic nut, floral characters, AFLP method, genetic diversity.
RINGKASAN
KURNIA PANCA DEWI. Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA Menggunakan
Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan JULIARNI.
Keanekaragaman hayati di Indonesia sangat tinggi, yang merupakan
keunggulan bagi pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah
satu kelompok tanaman non pangan yang direkomendasikan adalah tanaman jarak
pagar (Jatropha curcas L.) karena bijinya menghasilkan minyak nabati yang dapat
diolah menjadi bahan bakar minyak (biodiesel). Keragaman genetik dapat
dipelajari menggunakan penanda morfologi dan molekular (protein dan DNA).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan terpisah
tetapi masih di dalam satu infloresen. Jarak pagar mempunyai jumlah bunga
jantan yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah bunga betina. Penanda DNA
yang tergolong mutakhir adalah Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan kekerabatan
yang sangat dekat antar genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,
keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau adanya
perbedaan genetik yang sangat kecil. Penelitian tentang variasi genetik jarak pagar
melalui penggunaan marka molekular masih sangat terbatas. Oleh karena itu
dalam upaya mendapatkan informasi genetik yang akurat untuk menunjang
program pemuliaan tanaman jarak pagar, maka penggunaan penanda molekular
DNA untuk analisis keragaman tanaman jarak pagar perlu dilakukan.
Bahan tanaman yang digunakan berupa 10 aksesi jarak pagar yaitu aksesi
Madiun, Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember,
Subang dan Sukabumi. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB menurut Doyle
dan Doyle yang dimodifikasi yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl
Pyrrolidon). Karakter bunga yang diamati yaitu rasio bunga jantan dan betina.
Analisis AFLP menggunakan enzim restriksi Pst I dan Mse I. Tahap
preamplifikasi menggunakan primer Pst I (P00) dan Mse I (M02), sedangkan
untuk amplifikasi selektif menggunakan primer Pst I berlabel IRD 700 dan primer
Mse I yang tidak dilabel. Sembilan puluh satu karakter hasil AFLP pada 10 aksesi
jarak pagar dan dua karakter bunga dengan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi
jarak pagar digunakan untuk menganalisis keragaman genetik. Analisis
keragaman menggunakan program NTSYS-pc 2.02 dan Minitabs 14.
Hasil amplifikasi pita DNA pada analisis AFLP menggunakan primer Pst I
(P11) dan Mse I (M49) pada 10 aksesi jarak pagar menghasilkan jumlah pita
antara 50-255 pb adalah 582 pita dan jumlah pita antara 300-460 pb adalah 70.
Analisis AFLP dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar dapat
mendeteksi 91 lokus, yang terdiri atas 32 lokus ( 35.16%) bersifat monomorfisme,
dan 59 lokus (64.84%) bersifat polimorfisme. Nilai koefisien kemiripan
berdasarkan pita AFLP rentang nilainya berkisar 0.396-0.989. Dendrogram yang
dihasilkan dapat mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok pada
koefisien kemiripan 0.66. Hasil plot tiga dimensi berdasarkan Analisis Komponen
Utama (AKU) juga mengelompokkan 10 aksesi menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Madiun, Bengkulu, Jember, Bangka, Kediri dan
Ponorogo. Kelompok II terdiri dari aksesi Dompu, Lampung, Subang dan
Sukabumi. Aksesi Dompu, Lampung, Sukabumi dan Subang mengelompok
berdasarkan tidak adanya lokus ke 30, 43 dan 50. Hasil analisis berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada lima aksesi jarak pagar yang
berbunga mempunyai nilai koefisien kemiripan berkisar 0.398-0.949. Dendrogram
yang dihasilkan berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP pada
koefisien kemiripan 0.65 mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga
menjadi dua kelompok. Plot dua dimensi berdasarkan AKU juga
mengelompokkan lima aksesi jarak pagar yang berbunga menjadi dua kelompok.
Kelompok I terdiri dari aksesi Dompu, Lampung dan Sukabumi. Kelompok II
terdiri dari aksesi Bengkulu dan Bangka. Kelompok II mengelompok berdasarkan
adanya lokus ke 17, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 43, 48, 64, 65, 75, 77, 78, 79 dan 80.
Terdapat keragaman genetik jarak pagar berdasarkan karakter bunga (rasio bunga
jantan dan betina) dan 91 lokus hasil AFLP.
Kata kunci: jarak pagar, karakter bunga, metode AFLP, keragaman genetik.
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulis kritik, atau tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GENETIK JARAK PAGAR
(Jatropha curcas L.) BERDASARKAN KARAKTER BUNGA
DAN DNA MENGGUNAKAN TEKNIK AMPLIFIED
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP)
KURNIA PANCA DEWI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Penelitian
Nama
NRP
: Identifikasi Keragaman Genetik Jarak Pagar (Jatropha
curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)
: Kurnia Panca Dewi
: G351060121
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Ketua
Dr.Ir. Juliarni, M.Agr.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
MS
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,
Tanggal Ujian: 28 Agustus 2008
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir. Muhammad Jusuf
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan
sejak bulan Febuari 2007 sampai Mei 2008 ini berjudul Identifikasi Keragaman
Genetik Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Berdasarkan Karakter Bunga dan DNA
Menggunakan Teknik Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca, Laboratorium Biotechnology Research
Indonesian-The Netherlands (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi, dan Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen
Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian
sampai penyusunan tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada:
1. Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si, Ketua Komisi Pembimbing yang selalu
memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya
dengan sebaik-baiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian.
2. Dr.Ir. Juliarni, M.Agr, Anggota Komisi Pembimbing atas bimbingan dan
saran yang telah diberikan selama penelitian hingga selesainya tesis ini.
3. Dr.Ir. Muhammad Jusuf, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan
masukan yang diberikan.
4. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis
untuk mengikuti program S-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa
Utusan Daerah.
5. Project HI-LINK DIKTI, PT.TIMAH Kabupaten Bangka Induk atas
kepercayaan dan bantuan yang telah diberikan sehingga penelitian ini
dapat terlaksana dengan baik.
6. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB),
Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan Departemen Biologi dan
Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor atas kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium.
7. Unit Usaha Jasa dan Industri (unit Uji), Departemen Biologi, IPB atas
bahan penelitian yang diberikan.
8. Suami dan anak-anakku tersayang atas dukungan, semangat dan kasih
sayang yang diberikan.
9. Ibu dan ayahku tercinta, serta kakak dan adik yang telah memberi
dorongan dan semangat serta kasih sayangnya.
10. Mbak Pepy, Pak Adi, Pak Mulya, Ibu Fitmawati, Mas Firdaus, Pak
Muzuni, Retno, Ucu serta rekan-rekan lain di laboratorium BIORIN PAU
dan rekan-rekan BUD DEPAG angkatan 2006 yang tidak bisa penulis
sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan dan semangat.
11. Drs.Much.Machsun, M.Pdi, Kepala MAN 2 Wates Kulon Progo atas izin
dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB.
Akhirnya semoga tulisan ini bermanfaat.
Bogor, September 2008
Kurnia Panca Dewi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 23 April 1972 dari ayah
Damanhuri dan ibu Zunariyah. Penulis merupakan anak kelima dari enam
bersaudara.
Tahun 1990 penulis lulus dari SMUN 10 Yogyakarta dan pada tahun yang
sama melanjutkan ke IKIP Negeri Yogyakarta, Fakultas Pendidikan MIPA.
Penulis memilih jurusan Biologi.
Pada tahun 1996 penulis memperoleh gelar Sarjana Pendidikan. Penulis
diangkat menjadi PNS di MAN Negara, Bali tahun 1997 dan mutasi ke MAN
Wates 2 Kulon Progo, Daerah Istimewa Yogyakarta pada tahun 2002. Penulis
diberi kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang Program Magister
Sains Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, Program studi Biologi
dengan mendapatkan Beasiswa Utusan Daerah dari Departemen Agama RI.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................
xv
PENDAHULUAN
Latar Belakang.....................................................................................
Tujuan Penelitian .................................................................................
1
3
TINJAUAN PUSTAKA
Asal dan Distribusi ..............................................................................
Karakter Bunga ....................................................................................
Analisis Genetik dengan Penanda Molekular........................................
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) .............................
4
4
5
6
BAHAN DAN METODE
Metode.................................................................................................
Penyiapan Bahan Tanaman ..................................................................
Pengamatan Karakter Bunga ................................................................
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga...................................................
Analisis AFLP......................................................................................
Isolasi DNA ...................................................................................
Analisis Polimorfisme DNA dengan AFLP ....................................
Restriksi DNA Genomik dan Ligasi Adaptor ............................
Amplifikasi Fragmen Hasil Restriksi ........................................
Analisis Similaritas dan Analisis Komponen Utama.............................
9
10
10
10
11
11
13
13
13
15
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakter Bunga ....................................................................................
Analisis Penanda AFLP........................................................................
Analisis Karakter Bunga dan AFLP......................................................
17
19
25
SIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................
29
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
30
LAMPIRAN .................................................................................................
33
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
Rata - rata jumlah bunga jantan dan betina dari lima aksesi jarak
pagar 10 BST ..........................................................................................
18
Analisis komponen utama 10 aksesi jarak pagar menggunakan
penanda AFLP ........................................................................................
24
Nilai mutlak komponen utama terbesar dari 91 lokus hasil AFLP
dengan sepasang primer pada 10 aksesi jarak pagar.................................
25
Analisis komponen utama lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan AFLP........................................................................
27
Nilai mutlak komponen utama terbesar berdasarkan karakter bunga
dan 91 lokus hasil AFLP dengan sepasang primer pada lima aksesi
jarak pagar ..............................................................................................
28
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang
membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina (d)
5
Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
Pemotongan DNA genom dengan enzim restriksi (1), ligasi adaptor (2),
dan amplifikasi selektif (3)......................................................................
8
Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.....................................................................
9
4
Sayatan melintang bunga lima aksesi jarak pagar ....................................
18
5
Hasil amplifikasi DNA genom jarak pagar dengan sepasang primer.
Aksesi Madiun (1), aksesi Dompu (2), aksesi Bengkulu (3), aksesi
Lampung (4), aksesi Bangka (5), aksesi Ponorogo (6), aksesi Kediri (7),
aksesi Jember (8), aksesi Subang (9), aksesi Sukabumi (10) ....................
21
Dendrogram 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP yang
dianalisis dengan SAHN-UPGMA pada program NTSYS-pc versi 2.02..
23
7
Plot tiga dimensi 10 aksesi jarak pagar berdasarkan penanda AFLP ........
24
8
Dendrogram berdasarkan karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP
pada lima aksesi jarak pagar yang dianalisis dengan SAHN-UPGMA
pada program NTSYS-pc versi 2.02 ........................................................
26
Plot dua dimensi komponen utama berdasarkan karakter bunga dan
91 lokus AFLP pada lima aksesi jarak pagar ekstraksi KU 1 dengan
KU 2 yang dianalisis dengan multivariate pada program Minitab 14 .......
27
2
3
6
9
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Deskripsi ciri morfologi 10 aksesi jarak pagar pada 9 BST......................
33
2
Sembilan puluh satu lokus hasil AFLP ....................................................
34
3
Nilai koefisien kemiripan genetik 10 aksesi jarak pagar berdasarkan
AFLP ......................................................................................................
35
Koefisien kemiripan genetik lima aksesi jarak pagar berdasarkan
karakter bunga dan 91 lokus hasil AFLP .................................................
35
Nilai heterozigositas 91 lokus hasil AFLP ..............................................
36
4
5
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman hayati
tumbuhan yang tinggi (Campbell et al. 2006). Hal itu merupakan keunggulan bagi
pengembangan bahan bakar yang berasal dari tumbuhan. Salah satu tanaman non
pangan yang direkomendasikan adalah jarak pagar (Jatropha curcas L.). Biji jarak
pagar menghasilkan minyak nabati yang dapat dijadikan sumber energi
(Prihandana & Hendroko 2006).
Di Indonesia terdapat 4 spesies jarak yaitu jarak cina (Jatropha multifida),
jarak bali (Jatropha podagrica), jarak ulung (Jatropha gossypifolia) dan jarak
pagar (Jatropha curcas L.). Menurut Banerji et al. (1985) biji jarak pagar
mempunyai kandungan minyak tertinggi (40-60%) daripada jarak ulung (28.5%)
dan jarak cina (32.4%). Selain sebagai sumber energi alternatif, minyak jarak
pagar dapat juga digunakan dalam industri farmasi (Becker et al. 2005).
Jarak pagar tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian sekitar 500 m dpl.
Tanaman ini dapat tumbuh pada daerah dengan curah hujan 300-2380 mm/tahun.
Temperatur udara tahunan rata-rata yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
20-28 ºC. Tanaman ini dapat tumbuh pada berbagai struktur tanah seperti tanah
berbatu, tanah berpasir dan tanah liat. Menurut Alam (2005) pertumbuhan jarak
pagar di tanah gembur lebih baik daripada di tanah padat. Selain pada tanah subur
jarak pagar dapat tumbuh pada tanah yang ketersediaan air dan unsur-unsur
haranya terbatas (lahan marginal). Di Indonesia banyak terdapat lahan marginal
yang pemanfaatannya masih kurang optimal. Lahan marginal tersebut dapat
digunakan untuk mengembangkan jarak pagar sehingga tidak mengganggu
pengembangan tanaman pangan. Waktu yang paling baik untuk menanam jarak
pagar adalah pada musim kering atau sebelum musim hujan. Jarak pagar
membutuhkan air dan hara yang cukup untuk berproduksi secara optimal (Heller
1996; David et al. 2006).
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan
terpisah tetapi masih di dalam satu infloresen. Tiap infloresen biasanya terdiri dari
1-5 bunga betina yang dikelilingi oleh 25-93 bunga jantan. Rasio bunga jantan
2
dibanding dengan bunga betina adalah 29:1 (Raju & Ezradanam 2002).
Berdasarkan hasil penelitian Bhattacharya et al. (2005) pada tiap infloresen
terdapat bunga jantan yang jumlahnya berkisar antara 17-105 dan bunga betina
yang jumlahnya berkisar 2-19. Pola penyerbukan pada jarak pagar dapat terjadi
secara geitonogami (penyerbukan tetangga) maupun xenogami (penyerbukan
silang)(Raju
&
Ezradanam
2002).
Adanya
penyerbukan
silang
dapat
menyebabkan terjadinya keragaman genetik.
Pengetahuan tentang variasi genetik sangat penting bagi program pemuliaan
karena memberikan dasar untuk pengembangan tanaman selanjutnya. Variasi
genetik dapat digunakan sebagai bahan seleksi genotipe yang dikehendaki.
Pengembangan bidang molekular dengan analisis DNA akhir-akhir ini sering
digunakan untuk mengkarakterisasi variasi genetik dan kekerabatan dalam satu
genus, spesies, kultivar atau aksesi. Informasi tentang keragaman genetik
merupakan modal dasar bagi para ahli pemuliaan dan genetika populasi dalam
pengembangan dan perbaikan tanaman, terutama sebagai langkah awal dalam
seleksi tanaman. Langkah ini penting terutama untuk membedakan individu dalam
spesies serta identifikasi genotipe secara tepat dan identifikasi gen-gen yang
berpotensi pembawa karakter unggul.
Keragaman genetik dapat dipelajari menggunakan penanda ciri morfologi
dan molekular yang meliputi penanda isozim dan penanda DNA. Penggunaan
isozim relatif lebih cepat, mudah dan murah, tetapi hasil polimorfisme enzim yang
diperoleh terbatas. Sedangkan penanda DNA dapat digunakan untuk menganalisis
keragaman genetik lebih baik karena hasilnya konsisten dan tidak dipengaruhi
oleh lingkungan (Melchinger 1990).
Saat ini terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi
keragaman genetik pada tingkat DNA. Metode Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dan
Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD) merupakan penanda-penanda DNA
yang banyak digunakan untuk mengkarakterisasi suatu populasi tanaman. Penanda
DNA yang tergolong mutakhir adalah AFLP. Teknik AFLP sedikit rumit karena
melibatkan enzim restriksi dan amplifikasi, tetapi jika dibandingkan dengan
RAPD tingkat konsistensi hasil jauh lebih tinggi. Teknologi AFLP telah
3
digunakan dalam studi keragaman intraspesies, misalnya pada kedelai, teh, kakao
dan kapas. Penanda AFLP dapat digunakan untuk mengenali hubungan
kekerabatan yang sangat dekat antar genotipe, perbedaan antar klon dalam satu
kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit atau
adanya perbedaan genetik yang sangat kecil (Cabrita et al. 2001). Informasi
tentang variasi genetik sangat penting dalam program pemuliaan karena memberi
informasi agar dapat digunakan untuk seleksi tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mempelajari keragaman genetik aksesi jarak pagar
yang berasal dari berbagai wilayah Jawa, Sumatera dan Nusa Tenggara
berdasarkan karakter bunga dan DNA menggunakan teknik Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP).
TINJAUAN PUSTAKA
Asal dan Distribusi
Jatropha curcas L. berasal dari Meksiko, Amerika Tengah, menyebar di
Malaka dan Filipina setelah tahun 1700-an (Heller 1996). Tumbuhan ini masuk ke
Indonesia selama periode penjajahan Jepang (1942-1945), penggunaan biji jarak
pagar pada waktu itu sebagai bahan bakar minyak (BBM). Saat ini jarak pagar
tumbuh menyebar di berbagai daerah di Indonesia. Beberapa nama lokal jarak
pagar adalah jarak kosta, kalake pagar (Sunda), jarak pager (Jawa), kalekhe
paghar (Madura), jarak pager (Bali), paku luba, jarak pageh (Nusa Tenggara),
paku kase (Timor), kuman nema (Alor), lulunan (Roti), jarak wolanda,
tondoutomene (Sulawesi), bintalo (Gorontalo), balacai (Manado), ai huwa
kamalo, kadoto (Maluku), nawaih nawas (Nangroe Aceh Darussalam) dan peleng
kaliki (Bugis) (Prihandana & Hendroko 2006). Selain itu, jarak pagar dikenal juga
sebagai castor oil plant karena bijinya menghasilkan minyak (Makkar et al.
1997).
Karakter Bunga
Jarak pagar adalah tanaman monoecius, memiliki bunga betina dan jantan
yang terpisah di dalam satu karangan bunga. Pada umumnya dalam satu karangan
bunga terdapat 1 sampai 5 bunga betina yang dikelilingi oleh 25-93 bunga jantan.
Bunga jantan mekar terlebih dahulu sedangkan bunga betina mekar 2 sampai 6
hari setelah bunga jantan mekar (Raju & Ezradanam 2002). Bunga jantan
berukuran kecil, tidak berbau, berbentuk seperti genta, sedangkan bunga betina
berukuran lebih besar (Gambar 1). Kelopak dan mahkota bunga masing-masing
ada lima. Daun mahkota menyatu pada pangkal bunga. Benang sari membentuk
dua lingkaran, atas dan bawah masing-masing lingkaran terdiri atas lima buah.
Benang sari pada lingkaran bawah bebas tetapi pada lingkaran atas bersatu.
Kepala sari berwarna kuning, bagian dorsal melekat pada tangkai sari. Tangkai
putik tiga buah masing-masing bercabang dua untuk menyangga kepala putik.
Bakal buah mempunyai tiga karpel masing-masing dengan satu bakal biji. Kepala
putik reseptif pada saat antesis sampai 3 hari setelah antesis. Penyerbukan dibantu
5
oleh serangga penyerbuk (lebah dan semut) (Raju & Ezradanam 2002). Jarak
pagar biasanya berbunga pada akhir musim kering atau selama musim hujan,
tetapi dapat juga berbunga bergantung pada kondisi lingkungan.
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 1 Bunga jantan (a), bunga betina (b) jarak pagar, gambar penampang
membujur bunga jantan (c) dan penampang membujur bunga betina
(d).
Analisis Genetik dengan Penanda Molekular
Marka molekular telah banyak digunakan dalam penelitian berbagai disiplin
ilmu (taksonomi, filogeni, ekologi, genetika dan pemuliaan). Marka molekular
pada tingkat DNA mempunyai kelebihan dibandingkan dengan marka ciri
morfologi. Keuntungan penggunaan marka molekular adalah genotipe suatu
organisme dapat diuji secara langsung, jumlah polimorfisme yang ada tidak
terbatas, dan pengembangan teknik dapat menghasilkan marka yang sesuai
dengan tujuan penelitian (Weising et al. 1995). Penggunaan marka DNA dapat
mencerminkan perubahan pada tingkat DNA, perbedaan jarak genetik antara
individu lebih akurat daripada penggunaan marka ciri morfologi, karena fenotipe
yang sama dapat dimunculkan oleh genotipe yang berbeda (Serret et al. 1997).
Penanda
molekular mempunyai
peranan
yang
sangat
luas
untuk
memperbaiki efisiensi program pemuliaan tanaman. Marka molekular dalam
pemuliaan digunakan dalam analisis pautan dan pemetaan genetik, identifikasi
genotipe, estimasi keragaman genetik dan kekerabatan inter dan antar spesies atau
6
varietas (Weising et al. 1996). Menurut Ribaut dan Hoisington (1998) keragaman
genetik yang dihasilkan dari data sidikjari (fingerprinting) dapat digunakan dalam
pengelompokan tumbuhan. Informasi yang diperoleh dapat digunakan untuk
mengidentifikasi tetua yang paling sesuai untuk disilangkan. Pengukuran jarak
genetik berdasarkan marka DNA diperlukan untuk memproduksi kultivar hibrida.
Penanda molekular juga dapat digunakan untuk menentukan lokasi gen yang tepat
pada kromosom. Kelebihan utama dari pemuliaan tanaman menggunakan penanda
molekular dibandingkan seleksi konvensional adalah seleksi dapat dilakukan pada
tanaman yang masih muda, tanpa menunggu pertumbuhan generatif (Sanjaya
2002).
Dasar penanda molekular adalah polimorfisme pada tingkat protein atau
DNA. Polimorfisme yang terdeteksi oleh AFLP dan RFLP mengungkapkan
variasi ukuran berdasarkan situs restriksi. Polimorfisme berdasarkan RAPD
mencerminkan variasi sekuen DNA pada situs perlekatan primer (Powell et al.
1996). RFLP telah digunakan untuk mengevaluasi keragaman genetik pada
tanaman, tetapi analisis dengan RFLP membutuhkan DNA dalam jumlah banyak
dan kemurnian DNA yang tinggi, selain itu RFLP pada beberapa spesies tanaman
kurang baik karena polimorfisme yang terdeteksi rendah (Powell et al. 1996).
Teknik RFLP sangat menyita waktu dan relatif mahal, sehingga beberapa peneliti
cenderung menggunakan RAPD dan AFLP untuk pemetaan genetik (Ben Chaim
et al. 2001).
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Marka AFLP merupakan jenis marka yang didasarkan pada amplifikasi
selektif potongan DNA hasil restriksi genomik total dengan enzim restriksi
endonuklease (Vos et al. 1995). Sebenarnya marka ini mirip marka RAPD, tetapi
primernya spesifik dan jumlah pitanya lebih banyak. Marka AFLP dikategorikan
sebagai marka kodominan, walaupun pada kenyataannya seringkali diperlakukan
sebagai marka dominan. Hal ini dikarenakan kesulitan membedakan intensitas
pita dominan homozigot dengan heterozigot (Setiawan et al. 2000).
Keunggulan teknik AFLP menurut Vos et al. (1995) antara lain tidak
memerlukan informasi sekuen dari genom dan perangkat (kit) oligonukleotida
7
yang sama ketika dilakukan analisis dan dapat diamplifikasikan pada semua
organisme termasuk tanaman, hasil amplifikasinya bersifat stabil, tingkat
pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi, memiliki efisiensi yang sangat
tinggi dalam pemetaan lokus karena sekali amplifikasi dapat meliputi beberapa
lokus, dapat digunakan untuk menganalisis sidik jari semua DNA dengan
mengabaikan kompleksitas dan asal usulnya, serta dapat bertindak sebagai
jembatan antara peta genetik dan peta fisik pada kromosom. Keterbatasan teknik
AFLP adalah cara aplikasinya relatif lebih rumit, sehingga memerlukan waktu
lebih lama dan keterampilan khusus, serta alat dan bahan yang sangat mahal.
Walaupun analisis AFLP relatif lebih mahal dibandingkan dengan analisis RAPD,
namun lokus yang diperoleh dalam tiap reaksi lebih banyak (Powell et al. 1996).
AFLP merupakan suatu teknik analisis DNA berbasis PCR (Polymerase
Chain Reaction). Sebelum amplifikasi PCR, DNA genom dipotong dengan dua
enzim restriksi. Prosedur tersebut melibatkan beberapa tahap yang dimulai dengan
memotong DNA genomik dengan sepasang enzim restriksi, satu enzim memotong
jarang/rare cutter (karena mempunyai situs pengenalan 6 pasang basa/pb) dan
satu enzim memotong sering/frequent cutter (mempunyai situs pengenalan 4 pb).
Selanjutnya adaptor oligonukleotida diligasikan untuk menghasilkan potongan
fragmen sebagai DNA cetakan dalam PCR (Van Eck et al. 1995). Sekuen adaptor
dan situs restriksi di dekatnya bertindak sebagai tempat perlekatan primer untuk
reaksi amplifikasi terhadap fragmen tersebut. Nukleotida selektif terletak pada
ujung 3' primer PCR, sehingga hanya dapat mengawali sintesis DNA dari satu
bagian situs restriksi tersebut (Gambar 2). Hanya fragmen restriksi yang
nukleotidanya mengapit situs restriksi yang cocok dengan nukleotida selektif
yang akan diamplifikasi (Vos et al. 1995).
Reaksi amplifikasi pada AFLP umumnya menggunakan dua primer. Desain
primer yang baik merupakan faktor yang sangat menentukan dalam amplifikasi
PCR. AFLP fingerprinting untuk genom yang kompleks pada umumnya
melibatkan reaksi amplifikasi sebanyak dua tahap yaitu reaksi preamplifikasi dan
reaksi amplifikasi. Preamplifikasi dilakukan dengan dua primer AFLP yang
memiliki satu nukleotida selektif, kemudian hasil reaksi diencerkan dan
digunakan sebagai cetakan untuk reaksi amplifikasi berikutnya (Vos et al. 1995).
8
Polimorfisme terdeteksi berupa ada atau tidaknya fragmen sehingga
merupakan marka dominan. Metode AFLP menghasilkan sejumlah besar fragmen
DNA, tanpa memerlukan pengetahuan tentang sekuen nukleotida. Setiap pasangan
primer selektif dapat memvisualisasikan sekitar 50-100 fragmen DNA hasil
restriksi pada sekuensing gel. Oleh karena setiap fragmen dianggap mewakili satu
karakter tertentu, maka sejumlah besar karakter dapat divisualisasikan untuk
setiap pasangan primer (Haris 2006).
Keberhasilan teknik AFLP juga dipengaruhi oleh keberhasilan teknik PCR.
Teknik PCR didasarkan pada prinsip amplifikasi sekuen DNA secara enzimatis
(in vitro). Amplifikasi sekuen DNA genom pada mesin PCR melibatkan
pengaturan suhu yang terjadi secara berulang. Reaksi terdiri dari denaturasi DNA
menjadi utas tunggal (suhu 94 ºC), penempelan primer (annealing) pada sekuen
DNA genom (suhu 56 ºC), dan pemanjangan primer (elongation) pada suhu 72 ºC.
Pengulangan siklus 25-50 kali akan meningkatkan jumlah fragmen DNA yang
diamplifikasi secara eksponensial (Weising et al. 1995).
Mse I adaptor
G
CAT
DNA genom
Enzim restriksi
(Mse I dan Eco R I)
dan DNA ligase
(1)
Restriksi dan ligasi
Pemotongan Mse I
Eco R I adaptor
AATTG
C
pemotongan Eco RI
Eco RI adaptor
Mse I adaptor
G
CAT
GTAA
CATT
(2)
AATTG
C
GAATTG
CTTAAC
Amplifikasi selektif
primer Mse I
CATTGTA
(3)
GTAACAT
CATTGTA
CGAGAATTG
GCTCTTAAC
CGAGAATTG
primer Eco R I
Gambar 2 Skema teknik AFLP (Mueller & Wolfenbarger 1999)
Pemotongan DNA genom dengan enzim restriksi (1), ligasi adaptor
(2), dan amplifikasi selektif (3).
BAHAN DAN METODE
Metode
Identifikasi keragaman genetik jarak pagar dilakukan menggunakan karakter
bunga dan DNA dengan teknik AFLP. Penelitian dilakukan mengikuti bagan alir
yang tertera pada Gambar 3.
Penyiapan bahan tanaman
Identifikasi keragaman genetik
Karakter bunga :
Jumlah bunga jantan
Jumlah bunga betina
Daun dari tanaman berumur 2
bulan diambil untuk analisis
DNA dengan teknik AFLP
Teknik AFLP:
Isolasi DNA
Restriksi DNA dan
ligasi adaptor
Amplifikasi fragmen
hasil restriksi
Analisis data karakter bunga dan
AFLP :
Analisis similaritas
Analisis Komponen Utama
Keragaman genetik jarak pagar
Gambar 3
Bagan alir penelitian identifikasi keragaman genetik jarak pagar
(Jatropha curcas L.) berdasarkan karakter bunga dan DNA
menggunakan teknik AFLP.
10
Penyiapan Bahan Tanaman
Bahan tanaman berupa 10 aksesi jarak pagar yang meliputi aksesi Madiun,
Dompu, Bengkulu, Lampung, Bangka, Ponorogo, Kediri, Jember, Subang dan
Sukabumi (Lampiran 1). Biji jarak pagar dikecambahkan dengan cara meletakkan
biji pada bak plastik yang telah dilapisi dengan kertas tissu basah. Selanjutnya biji
ditutup kembali dengan kertas tissu basah dan dibiarkan pada suhu ruang selama
dua minggu. Setelah dua minggu kecambah dipindahkan ke polibag ukuran 5x15
cm (0.5 kg) yang berisi tanah latosol dan pupuk kandang dengan perbandingan
1:1, kemudian tanaman diletakkan di rumah kaca. Setelah satu bulan tanaman
dipindahkan ke polibag berukuran 25x50 cm (10 kg) yang berisi tanah dan pupuk
kandang dengan perbandingan 1:1.
Pengamatan Karakter Bunga
Pengamatan karakter bunga dimulai pada saat tanaman mulai berbunga yaitu
4 bulan setelah tanam (BST). Karakter bunga yang diamati adalah rasio bunga
jantan dan betina. Penghitungan rasio bunga jantan dan betina berdasarkan pada
jumlah infloresen yang muncul selama bulan Mei sampai Oktober 2007.
Pembuatan Sayatan Melintang Bunga
Bunga difiksasi di dalam larutan FAA [5 bagian formalin, 5 bagian asam
asetat glasial, 90 bagian alkohol 70% (v/v)]. Sampel yang telah difiksasi selama
24 jam di dalam larutan FAA, didehidrasi dengan larutan seri n-Butanol III–VII
masing-masing selama 1 jam (Nakamura 1995). Parafin diinfiltrasikan secara
bertahap, dengan cara menambahkan parafin ke dalam n-Butanol p.a. dengan
perbandingan 1:1 dan disimpan di dalam oven pada suhu ruang selama 12 jam.
Kemudian disimpan lagi di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama 24 jam.
Parafin yang bercampur dengan dehidran diganti dengan parafin murni dan
disimpan di dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama tiga hari. Sampel kemudian
ditanam di dalam parafin. Blok sampel diiris dengan ketebalan 10
m
menggunakan mikrotom putar (Yamato RV-240). Pita parafin yang diperoleh
direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan larutan albumin-gliserin
dan dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 40 ºC selama 3 sampai 5 jam.
11
Sampel diwarnai dengan safranin 2% (b/v) di dalam air dan fastgreen 0.5% (b/v)
di dalam alkohol 95% (v/v).
Analisis AFLP
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB (Cetil
Trimetil Amonium Bromida) menurut Doyle dan Doyle (1987) yang dimodifikasi
yaitu dengan penambahan PVP (Polyvinyl Pyrrolidon). Sebanyak 0.5 g daun jarak
pagar ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dalam lumpang porselin
sampai menjadi serbuk. Selanjutnya serbuk daun dimasukkan ke dalam tabung
ependorf yang berisi 600 µl campuran bufer ekstrak [CTAB 2% (b/v), EDTA
(Ethylene Diamine Tetra Acetic) 0.02 M, Tris-HCl 1 M pH 8, NaCl 1.4 M dan
PVP 1% (b/v)] serta 2 l β-merkaptoetanol. Ekstrak diinkubasi pada suhu 65 ºC
selama 1 jam. Pemurnian dilakukan di dalam campuran larutan kloroform dan
isoamil alkohol (CIAA) dengan perbandingan 24:1 sebanyak 1 kali volume
ekstrak. Campuran larutan digoyang merata dengan cara dibolak-balikkan secara
perlahan. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm (Jouan BR4i) pada
suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil kemudian ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 0.7 kali volume, serta dibolak balik secara perlahan.
Ekstrak diinkubasikan di freezer selama 2 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 10 000 rpm dengan suhu 4 ºC selama 20 menit. Supernatan yang
diperoleh dibuang dan endapan dibilas dengan 500
l alkohol 70% (v/v).
Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm
dengan suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v) dibuang dan endapan
dikeringkan dengan vakum sampai kering. Pelet yang diperoleh disuspensikan
dengan 50 l ddH2O. Ekstrak ditambah dengan 1 kali volume campuran larutan
PCI (fenol:kloroform:isoamilalkohol) dengan perbandingan 25:24:1, selanjutnya
digerakkan bolak-balik. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm
pada suhu 20 ºC selama 20 menit. Supernatan diambil, kemudian ditambah
dengan 0.1 kali volume sodium asetat 3 M pH 5.2 dan alkohol absolut sebanyak 2
kali volume. Ekstrak kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ºC. Larutan
disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ºC.
Supernatan dibuang, selanjutnya endapan yang diperoleh dibilas dengan 500 µl
12
alkohol 70% (v/v). Pembilasan dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan
kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4 ºC selama 5 menit. Alkohol 70% (v/v)
dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan vakum sampai kering. Endapan
disuspensikan dengan 50 l ddH2O. Selanjutnya ditambahkan 0.1 kali RNAse (10
mg/ml), diinkubasi pada suhu 37 ºC selama semalam. Ekstrak yang diperoleh
disimpan sebagai stok pada suhu -20 ºC.
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi RNA dalam larutan.
Jumlah RNA yang banyak akan mempengaruhi hasil absorbansi yang diamati
pada panjang gelombang 260 nm dengan menggunakan spektrofotometer.
Kemurnian DNA ditentukan berdasarkan tingkat kontaminasi protein dalam
larutan dengan membandingkan nilai OD260 dengan OD280. Molekul DNA
dikatakan murni apabila rasio keduanya berada antara 1.8 sampai 2.0. Jika nilai
rasio lebih kecil dari 1.8 maka di dalam larutan tersebut masih terkontaminasi
protein atau fenol dalam larutan, dan nilai rasio yang lebih besar dari 2
menunjukkan adanya akumulasi RNA yang tercampur DNA. Hal ini
mengharuskan dilakukan pemurnian kembali menggunakan RNAse. Kemurnian
DNA yang tinggi akan menghasilkan cetakan yang baik pada proses PCR. Prinsip
kerja spektrofotometer adalah iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh
nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida
secara maksimal dicapai pada panjang gelombang 260 nm, dan penyerapan
maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Kepadatan optik
(optical density) yang disebut OD260 sama dengan 1, maka konsentrasinya se