Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation techniques in several plants

TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

2

ABSTRAK
ARIEF PAMBUDI. Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan TETTY CHAIDAMSARI.
Transformasi genetik adalah proses introduksi gen dari satu organisme ke organisme lain
yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Penggunaan
Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor transformasi memiliki keunggulan karena tidak
membutuhkan peralatan khusus serta efisiensi transformasi dan salinan tunggal dari gen yang
ditransformasi relatif tinggi. Penelitian ini merupakan penelitian transformasi komparatif pada

beberapa tanaman yang memiliki karakter berbeda, yaitu manggis sebagai tanaman apomiksis,
tembakau sebagai tanaman model, anggrek sebagai perwakilan dari kelas monokotil, dan kopi
sebagai perwakilan dari kelas dikotil. Transformasi dilakukan dengan metode yang sama dan
dilanjutkan dengan regenerasi pada media seleksi yang mengandung antibiotik. Konfirmasi sisipan
gen hasil transformasi dilakukan dengan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Hasil
konfirmasi dari sampel tanaman yang mampu tumbuh pada media seleksi menunjukkan hanya
tembakau yang positif tersisipi oleh gen yang ditransfomasi. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman
hasil transformasi yang mampu hidup di media seleksi belum merupakan jaminan tersisip oleh gen
yang diintroduksi sebelum dilakukan pengujian molekuler. Beberapa optimasi dalam sterilisasi,
teknik infeksi, peningkatan jumlah eksplan yang ditransformasi dan jumlah sampel yang diuji
perlu dilakukan untuk peningkatan efisiensi transformasi.
Kata kunci : Transformasi genetik, Agrobacterium tumefaciens, tanaman transgenik.

ABSTRACT
ARIEF PAMBUDI. Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation Techniques in Several
Plants. Supervised by MIFTAHUDIN and TETTY CHAIDAMSARI.
Genetic transformation is a process to introduce foreign gene from one organism to other
organisms. This process is a site directed mutagenesis that can improve a good character without
changing the existing characters. The use of Agrobacterium tumefaciens as a vector in genetic
transformation has several advantages compared to other transformation techniques. It is a simple

method, does not need special equipment, and produces high transformation efficiency in
transfering a single copy of insert gene. This research is a comparative genetic transformation
among several plants that have different characters. They are mangosteen as an apomixis plant,
tobacco as a model plant, orchid as a monocotyledon plant, and coffee as a dicotyledon plant. The
transformation were conducted in a same method and continued with regeneration step in
antibiotic selectable medium. Gene insert confirmation using Polimerase Chain Reaction (PCR)
technique showed that only tobacco the expected gene insert. The result suggested that the plant
ability to grow in selective medium was not guaranteed as a transgenic plant before being
confirmed using molecular assay approach. Some optimation in explants sterilization, infection
techniques, number of transformed explants and tested transformed samples are required to be
increases to achieve high transformation efficiency.
Keyword : Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, transgenic plant.

3

TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

4

Judul : Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens
Nama : Arief Pambudi
NIM : G34104067

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

(Dr. Ir. Miftahudin, M.Si)
NIP. 131 851 281

(Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si)
NIK. 110 400 241

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. drh. Hasim, DEA
NIP. 131 578 806

Tanggal lulus :

5

PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur atas limpahan rahmat, karunia, dan hidayah yang diberikan oleh
Allah SWT kepada penulis sehingga karya ilmiah yang berjudul Teknik Transformasi Genetik
beberapa Tanaman Menggunakan Agrobacterium tumefaciens dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si dan Dr. Tetty
Chaidamsari M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan dukungan, bantuan, pengarahan,
dan bimbingan kepada penulis selama pelaksanaan penelitian. Juga kepada Dr. Anja Meryandini
M.Si selaku dosen penguji yang banyak memberikan masukan dalam penulisan dan perbaikan
karya ilmiah ini.
Terima kasih juga kepada Mbak Herti, Mbak Nina, Mas Topan, Mbak Riana, Mbak Retno,
dan Bu Dewi atas bantuan teknisnya, Winda, Kusnandar, Syamsul, Ruth, teman-teman di lab
BMRG dan Fistum, David, Yanti, Amie, Icha, Resti, Arlyn, Andik, Puspita, Uci, keluarga besar
Lab BMRG, Lab Fistum, kontrakan Delapan, teman-teman Biologi angkatan 41, para praktikan,
dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu. Tidak lupa ucapan terima kasih kepada
Papa, Mama, Annis, Ipul, Han, dan seluruh keluarga yang selalu memberi dukungan, kasih sayang,
doa, dan dorongan semangat yang tiada henti untuk menjadikan penulis lebih baik.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

Arief Pambudi

6

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 14 April 1987 dari pasangan Bapak
Sumarmadji dan Ibu Susiana. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 1998
penulis lulus dari SDN Malabar 1 Bogor, tahun 2001 lulus dari SMPN 2 Lubuk Pakam, kemudian
melanjutkan ke SMAN 1 Medan. Tahun 2004 lulus dari SMAN 1 Medan dan di tahun yang sama
penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru
(SPMB).
Selama studi di IPB, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai Staf
Bioworld 2006/2007 dan ketua divisi Biosains tahun 2007/2008. Penulis pernah menjadi asisten
praktikum Biologi Dasar, Fisiologi Tumbuhan Dasar, Sistematika Tumbuhan Berpembuluh, dan
pengajar biologi bimbingan belajar dan tutorial mahasiswa Be Expert.
Penulis melakukan praktek lapang pada tahun 2007 di PT. Bridgestone Sumatra Rubber
Estate dengan judul Sistem Pengusahaan Tanaman Karet (Hevea brasiliensis). Penulis juga pernah
menjadi finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional XX di Lampung dengan tulisannya

yang berjudul Analisis kandungan senyawa golongan flavonoid Selaginella yang berpotensi
sebagai antioksidan.

7

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................................... viii
PENDAHULUAN................................................................................................................................1
Latar Belakang.................................................................................................................................1
Tujuan ..............................................................................................................................................1
BAHAN DAN METODE ....................................................................................................................1
Waktu dan Tempat ..........................................................................................................................1
Bahan dan Alat ................................................................................................................................1
Metode .............................................................................................................................................2
Kultur bakteri A. tumefaciens.....................................................................................................2
Transformasi genetik dan regenerasi ........................................................................................2
Isolasi DNA Total .......................................................................................................................2

Uji kuantitatif dan kualitatif DNA..............................................................................................2
Uji Insersi dengan PCR..............................................................................................................2
HASIL ..................................................................................................................................................3
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................3
Manggis ......................................................................................................................................3
Tembakau....................................................................................................................................4
Anggrek.......................................................................................................................................4
Kopi.............................................................................................................................................4
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................4
PEMBAHASAN ..................................................................................................................................5
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................5
Manggis ......................................................................................................................................5
Tembakau....................................................................................................................................6
Anggrek.......................................................................................................................................6
Kopi.............................................................................................................................................6
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................7
SIMPULAN..........................................................................................................................................7
SARAN.................................................................................................................................................8
DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................................................................8
LAMPIRAN .........................................................................................................................................9

8

DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
3.
4.

Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi..........................................................................2
Hasil transformasi tembakau setelah 8 minggu..............................................................................4
Hasil transformasi anggrek .............................................................................................................4
Absorbansi dan konsentrasi DNA total hasil isolasi ......................................................................4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Sumber eksplan daun tanaman manggis yang diambil dari rumah kaca yang masih
berwarna merah (A), daun in-vitro (B), dan biji (C)....................................................................3
Pola pertunasan biji (A, B, C) dan pengkalusan daun manggis (D, E, F)
yang bukan berasal dari luka. .......................................................................................................3
Eksplan transformasi daun rumah kaca (A), kontrol transformasi rumah kaca (B), kontrol
negatif rumah kaca (C), transformasi daun in-vitro (D), kontrol transformasi in-vitro (E),
kontrol negatif in-vitro (F) ...........................................................................................................3
Persentase kalus manggis hasil transformasi daun asal rumah kaca............................................3

Persentase kalus manggis hasil transformasi daun in-vitro.........................................................3
Pola pertumbuhan tunas tembakau (tanda panah) berasal dari bekas luka..................................4
Planlet tembakau hasil transformasi dengan TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C).................4
Planlet kultur in-vitro anggrek hasil transformasi TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C) .......4
Planlet kopi hasil transformasi TcAG terlihat menguning (A), kontrol (B), kopi TcAP1 (C).....4
Elektroforesis 200 ng DNA hasil isolasi ......................................................................................5
Hasil PCR dengan primer TcAG ...................................................................................................5
Hasil PCR dengan primer TcAP1 .................................................................................................5
Konsep model ABC pada pembentukan organ bunga..................................................................6

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Pembuatan larutan MS (Murashige & Skoog) ............................................................................10
Pembuatan buffer SDS.................................................................................................................10
Komposisi media LB (Luria Bertani Broth)................................................................................10
Komposisi media ko-kultivasi .....................................................................................................10
Komposisi media eliminasi..........................................................................................................10
Komposisi media seleksi..............................................................................................................11
Komposisi MS vitamin ................................................................................................................11
Pembuatan larutan antibiotik .......................................................................................................11
Peta plasmid pBIN-AG dan pBIN-AP1.......................................................................................11
Bagan alur penelitian....................................................................................................................12

9

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pemuliaan tanaman telah dimulai sejak
dimulainya peradaban manusia. Secara
konvensional, pemuliaan dapat dilakukan
dengan berbagai cara seperti seleksi sifat
tertentu, persilangan, dan mutasi buatan.
Penemuan gen sebagai substansi penentu sifat,
diikuti dengan penemuan teknik isolasi gen,
transfer gen, dan pengekspresiannya pada sel
lain memberikan alternatif baru dalam
pemuliaan melalui bioteknologi (Suwanto
1998). Hal ini memungkinkan penyisipan gengen penting saja, sedangkan sifat lain yang
telah ada diharapkan tidak berubah.
Transformasi genetik yang merupakan
proses introduksi gen dari satu organisme ke
organisme lain adalah salah satu bentuk dari
bioteknologi. Proses transformasi genetik
dapat dilakukan secara langsung (particle
bombardment, penggunaan polietilen-glikol
(PEG), elektroporasi) maupun tidak langsung
menggunakan
bantuan
Agrobacterium
tumefaciens.
Setiap teknik transformasi memiliki
keunggulan dan kekurangan masing-masing.
Transformasi secara langsung memiliki
keunggulan karena cakupannya yang luas
pada berbagai spesies tanaman, namun gen
yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan
yang banyak sehingga peluang terjadinya
penyusunan kembali (re-arrangement) gen
lebih tinggi (Hansen & Chilton 1996).
Transformasi tidak langsung menggunakan A. tumefaciens memiliki keunggulan
karena tidak membutuhkan peralatan khusus,
dapat
dilakukan
dengan
peralatan
laboratorium yang sederhana dan sisipan gen
tunggal berpeluang lebih tinggi dibanding
transformasi langsung, sehingga stabilitas
ekspresi gen lebih tinggi (Hansen & Chilton
1996; Dai et al. 2001; Rahmawati 2006).
Namun transformasi tidak langsung memiliki
kekurangan yaitu sekuen yang ditransfer ke
genom target bersifat acak, ada kemungkinan
yang ditransfer bukan gen target (Wenck et al.
1997; Gelvin 2003).
Secara alami A. tumefaciens hanya dapat
menginfeksi tanaman dikotil, sehingga pada
awalnya transformasi menggunakan A.
tumefaciens hanya terbatas pada tanaman
dikotil. Perkembangan penelitian dasar
mengenai mekanisme infeksi A. tumefaciens
telah memberikan pemahaman baru sehingga
beberapa modifikasi metode transformasi

dapat dilakukan untuk tanaman monokotil
(Slamet-Loedin 1994).
Penelitian ini merupakan penelitian
transformasi gen terhadap beberapa spesies
tanaman dengan karakteristik yang berbeda
dengan menggunakan sistem dan metode yang
sama. Hasil penelitian ini diharapkan mampu
memberikan informasi baru mengenai teknik
transformasi yang efektif menggunakan
A. tumefaciens pada berbagai jenis tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari
sistem yang tepat dalam melakukan introduksi
gen menggunakan A. tumefaciens strain
AGL0 pada beberapa spesies tanaman yang
memiliki karakter berbeda yaitu manggis
(tanaman apomiksis), tembakau (tanaman
model), anggrek (kelas monokotil), dan kopi
(kelas dikotil).

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2008 hingga November 2008 di
Laboratorium
Biologi
Molekuler
dan
Rekayasa Genetika (BMRG) Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia dan
Laboratorium
Fisiologi
dan
Biologi
Molekuler Tumbuhan Departemen Biologi,
FMIPA IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan antara lain
tanaman manggis, kultur in-vitro tembakau,
kultur in-vitro anggrek, kopi, dan tembakau
hasil transformasi. Bakteri untuk transformasi
merupakan koleksi Laboratorium BMRG,
yaitu A. tumefaciens strain AGL0 pembawa
konstruksi gen Agamous asal kakao (TcAG)
dan gen Apetala1 asal kakao (TcAP1). Kultur
in-vitro menggunakan media Murashige &
Skoog (MS) (Lampiran 1) dengan pemberian
antibiotik kanamisin dan cefotaksim. Isolasi
DNA menggunakan buffer SDS (Lampiran 2).
Uji insersi menggunakan Polimerase Chain
Reaction (PCR) kit RBC (Real Biotech Corp.,
Taiwan) dengan primer spesifik gen target
(Tabel 1).
Alat yang digunakan adalah laminar air
flow, skalpel, pinset, alat gelas, shaker
incubator, sentrifuse berpendingin, vortex,
tabung mikro, speed vac, spektrofotometer,

102

deep freezer, mesin PCR, pipet mikro,
perangkat elektroforesis, dan gel doc.
Tabel 1. Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi

Primer
TcAG-F396
TcAG-R
TcAP1-F2
TcAP1-R2

Sekuen
5’-CGCATTGCCTATGAAGGATC
5’-GGTGACCGTAGCACTTACTCCACCAGA
5’-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCA
5’-CTTCTCCCATGTAGTGCCTG

Metode
Kultur bakteri A. tumefaciens
Sebanyak 1 lup suspensi A. tumefaciens
dari gliserol stok diremajakan pada media
Luria Bertani Agar (LA) (Lampiran 3) +
antibiotik kanamisin 25 mg/L dan rifampisin
25 mg/L. Kemudian diinkubasi selama 18 jam
pada suhu maksimum 28 oC. Pengkayaan
kultur dilakukan dalam media Luria Bertani
Broth (LB) (Lampiran 3) + kanamisin 25
mg/L dan rifampisin 25 mg/L dalam shaker
incubator dengan kecepatan 150 rpm, suhu
maksimum 28 oC (kondisi gelap). Hasil
pengkayaan diresuspensi dengan media kokultivasi cair (Lampiran 4) dan diinkubasi
pada kondisi yang sama selama 2-3 jam.
Transformasi genetik dan regenerasi
Sumber eksplan manggis yang digunakan
dalam transformasi adalah daun manggis asal
rumah kaca, daun in-vitro dan biji. Daun asal
rumah kaca yang digunakan sebagai sumber
eksplan adalah tunas daun dengan lebar 3-3,5
cm yang masih berwarna kemerahan. Daun invitro yang digunakan sebagai sumber eksplan
berasal dari kultur in-vitro yang sudah
memunculkan sepasang daun dengan ukuran
lebar 1-1,5 cm berwarna hijau kemerahan.
Eksplan biji manggis didapatkan dengan
membersihkan biji dari arilusnya yang
berwarna putih, kemudian direndam dalam
larutan Dithane M45 0,8% yang diberi 500
mg/L PVP (polivinilpirolidon). Selanjutnya,
biji yang telah disterilisasi dipotong melintang
menjadi 3-4 potongan sebelum ditanam pada
media atau ditransformasi.
Transformasi pada eksplan daun manggis
asal rumah kaca diawali dengan sterilisasi
permukaan menggunakan alkohol 70% dan
klorox 1%. Potongan eksplan diinokulasi
dalam suspensi bakteri A. tumefaciens
pembawa gen insert dalam larutan MS cair +
acetosiringone 200 mg/L selama 15 menit
dalam shaker incubator 75 rpm (kondisi

gelap). Lalu eksplan dikeringkan dengan tisu
steril dan ditanam pada media ko-kultivasi
padat (Lampiran 4) yang diberi kertas saring
selama 2 hari. Transformasi pada tembakau
menggunakan sumber eksplan daun in-vitro.
Prosedur transformasi pada eksplan tembakau,
kopi, dan anggrek sama dengan prosedur
transformasi pada daun manggis.
Eksplan hasil ko-kultivasi kemudian dicuci
dengan media eliminasi (Lampiran 5) hingga
jernih. Eksplan yang telah dikeringkan
kemudian dikultur pada media seleksi
(Lampiran 6) pada suhu 26 oC kondisi gelap.
Sub-kultur ke media baru dilakukan setiap 4-6
minggu sekali dan persentase planlet berkalus
diamati tiga minggu sekali selama masa
percobaan.
Isolasi DNA Total
Isolasi DNA total dilakukan dengan
menggunakan buffer SDS (Lampiran 2)
menggunakan 100 mg sampel jaringan daun.
Uji kuantitatif dan kualitatif DNA
DNA total hasil isolasi kemudian diuji
kuantitatif untuk mengetahui konsentrasinya
dengan mengukur perbandingan serapan pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Konsentrasi DNA yang tinggi digambarkan
dengan nilai serapan tinggi pada panjang
gelombang 260 nm. Kemurnian DNA
dibanding dengan makromolekul lain dapat
dilihat dari perbandingan serapan antara
260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0
(Sambrook et al. 1989). Menghitung
konsentrasi
DNA
dilakukan
dengan
persamaan :
Kons (ng/µl) = A260nm x k x fp
A260nm : Serapan pada 260 nm
k
: Konstanta konsentrasi (50 untuk DNA)
fp
: Faktor pengenceran

Uji kualitatif DNA dilakukan dengan
teknik elektroforesis gel agarose 1% pada
tegangan 65V, 40 menit menggunakan 0.5x
buffer TBE.
Uji Insersi dengan PCR
Uji insersi dilakukan untuk mengetahui
integrasi gen insert pada genom tanaman
sampel. PCR dilakukan dengan total volum
sebesar 15 µl yang terdiri atas 100 ng DNA
template, 1X buffer PCR (+ MgCl2), 0.1 µM
dNTPs, 0.2 µM masing-masing primer
forward dan reverse, 1.5 unit taq polimerase,

TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

2

ABSTRAK
ARIEF PAMBUDI. Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan TETTY CHAIDAMSARI.
Transformasi genetik adalah proses introduksi gen dari satu organisme ke organisme lain
yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Penggunaan
Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor transformasi memiliki keunggulan karena tidak
membutuhkan peralatan khusus serta efisiensi transformasi dan salinan tunggal dari gen yang
ditransformasi relatif tinggi. Penelitian ini merupakan penelitian transformasi komparatif pada
beberapa tanaman yang memiliki karakter berbeda, yaitu manggis sebagai tanaman apomiksis,
tembakau sebagai tanaman model, anggrek sebagai perwakilan dari kelas monokotil, dan kopi
sebagai perwakilan dari kelas dikotil. Transformasi dilakukan dengan metode yang sama dan
dilanjutkan dengan regenerasi pada media seleksi yang mengandung antibiotik. Konfirmasi sisipan
gen hasil transformasi dilakukan dengan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Hasil
konfirmasi dari sampel tanaman yang mampu tumbuh pada media seleksi menunjukkan hanya
tembakau yang positif tersisipi oleh gen yang ditransfomasi. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman
hasil transformasi yang mampu hidup di media seleksi belum merupakan jaminan tersisip oleh gen
yang diintroduksi sebelum dilakukan pengujian molekuler. Beberapa optimasi dalam sterilisasi,
teknik infeksi, peningkatan jumlah eksplan yang ditransformasi dan jumlah sampel yang diuji
perlu dilakukan untuk peningkatan efisiensi transformasi.
Kata kunci : Transformasi genetik, Agrobacterium tumefaciens, tanaman transgenik.

ABSTRACT
ARIEF PAMBUDI. Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation Techniques in Several
Plants. Supervised by MIFTAHUDIN and TETTY CHAIDAMSARI.
Genetic transformation is a process to introduce foreign gene from one organism to other
organisms. This process is a site directed mutagenesis that can improve a good character without
changing the existing characters. The use of Agrobacterium tumefaciens as a vector in genetic
transformation has several advantages compared to other transformation techniques. It is a simple
method, does not need special equipment, and produces high transformation efficiency in
transfering a single copy of insert gene. This research is a comparative genetic transformation
among several plants that have different characters. They are mangosteen as an apomixis plant,
tobacco as a model plant, orchid as a monocotyledon plant, and coffee as a dicotyledon plant. The
transformation were conducted in a same method and continued with regeneration step in
antibiotic selectable medium. Gene insert confirmation using Polimerase Chain Reaction (PCR)
technique showed that only tobacco the expected gene insert. The result suggested that the plant
ability to grow in selective medium was not guaranteed as a transgenic plant before being
confirmed using molecular assay approach. Some optimation in explants sterilization, infection
techniques, number of transformed explants and tested transformed samples are required to be
increases to achieve high transformation efficiency.
Keyword : Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, transgenic plant.

3

TEKNIK TRANSFORMASI GENETIK BEBERAPA TANAMAN
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens

ARIEF PAMBUDI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

4

Judul : Teknik Transformasi Genetik beberapa Tanaman Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens
Nama : Arief Pambudi
NIM : G34104067

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

(Dr. Ir. Miftahudin, M.Si)
NIP. 131 851 281

(Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si)
NIK. 110 400 241

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. drh. Hasim, DEA
NIP. 131 578 806

Tanggal lulus :

5

PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur atas limpahan rahmat, karunia, dan hidayah yang diberikan oleh
Allah SWT kepada penulis sehingga karya ilmiah yang berjudul Teknik Transformasi Genetik
beberapa Tanaman Menggunakan Agrobacterium tumefaciens dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si dan Dr. Tetty
Chaidamsari M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan dukungan, bantuan, pengarahan,
dan bimbingan kepada penulis selama pelaksanaan penelitian. Juga kepada Dr. Anja Meryandini
M.Si selaku dosen penguji yang banyak memberikan masukan dalam penulisan dan perbaikan
karya ilmiah ini.
Terima kasih juga kepada Mbak Herti, Mbak Nina, Mas Topan, Mbak Riana, Mbak Retno,
dan Bu Dewi atas bantuan teknisnya, Winda, Kusnandar, Syamsul, Ruth, teman-teman di lab
BMRG dan Fistum, David, Yanti, Amie, Icha, Resti, Arlyn, Andik, Puspita, Uci, keluarga besar
Lab BMRG, Lab Fistum, kontrakan Delapan, teman-teman Biologi angkatan 41, para praktikan,
dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu. Tidak lupa ucapan terima kasih kepada
Papa, Mama, Annis, Ipul, Han, dan seluruh keluarga yang selalu memberi dukungan, kasih sayang,
doa, dan dorongan semangat yang tiada henti untuk menjadikan penulis lebih baik.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

Arief Pambudi

6

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 14 April 1987 dari pasangan Bapak
Sumarmadji dan Ibu Susiana. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 1998
penulis lulus dari SDN Malabar 1 Bogor, tahun 2001 lulus dari SMPN 2 Lubuk Pakam, kemudian
melanjutkan ke SMAN 1 Medan. Tahun 2004 lulus dari SMAN 1 Medan dan di tahun yang sama
penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru
(SPMB).
Selama studi di IPB, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai Staf
Bioworld 2006/2007 dan ketua divisi Biosains tahun 2007/2008. Penulis pernah menjadi asisten
praktikum Biologi Dasar, Fisiologi Tumbuhan Dasar, Sistematika Tumbuhan Berpembuluh, dan
pengajar biologi bimbingan belajar dan tutorial mahasiswa Be Expert.
Penulis melakukan praktek lapang pada tahun 2007 di PT. Bridgestone Sumatra Rubber
Estate dengan judul Sistem Pengusahaan Tanaman Karet (Hevea brasiliensis). Penulis juga pernah
menjadi finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional XX di Lampung dengan tulisannya
yang berjudul Analisis kandungan senyawa golongan flavonoid Selaginella yang berpotensi
sebagai antioksidan.

7

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................................................... viii
PENDAHULUAN................................................................................................................................1
Latar Belakang.................................................................................................................................1
Tujuan ..............................................................................................................................................1
BAHAN DAN METODE ....................................................................................................................1
Waktu dan Tempat ..........................................................................................................................1
Bahan dan Alat ................................................................................................................................1
Metode .............................................................................................................................................2
Kultur bakteri A. tumefaciens.....................................................................................................2
Transformasi genetik dan regenerasi ........................................................................................2
Isolasi DNA Total .......................................................................................................................2
Uji kuantitatif dan kualitatif DNA..............................................................................................2
Uji Insersi dengan PCR..............................................................................................................2
HASIL ..................................................................................................................................................3
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................3
Manggis ......................................................................................................................................3
Tembakau....................................................................................................................................4
Anggrek.......................................................................................................................................4
Kopi.............................................................................................................................................4
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................4
PEMBAHASAN ..................................................................................................................................5
Transformasi dan regenerasi ...........................................................................................................5
Manggis ......................................................................................................................................5
Tembakau....................................................................................................................................6
Anggrek.......................................................................................................................................6
Kopi.............................................................................................................................................6
Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR........................................................................................7
SIMPULAN..........................................................................................................................................7
SARAN.................................................................................................................................................8
DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................................................................8
LAMPIRAN .........................................................................................................................................9

8

DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
3.
4.

Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi..........................................................................2
Hasil transformasi tembakau setelah 8 minggu..............................................................................4
Hasil transformasi anggrek .............................................................................................................4
Absorbansi dan konsentrasi DNA total hasil isolasi ......................................................................4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Sumber eksplan daun tanaman manggis yang diambil dari rumah kaca yang masih
berwarna merah (A), daun in-vitro (B), dan biji (C)....................................................................3
Pola pertunasan biji (A, B, C) dan pengkalusan daun manggis (D, E, F)
yang bukan berasal dari luka. .......................................................................................................3
Eksplan transformasi daun rumah kaca (A), kontrol transformasi rumah kaca (B), kontrol
negatif rumah kaca (C), transformasi daun in-vitro (D), kontrol transformasi in-vitro (E),
kontrol negatif in-vitro (F) ...........................................................................................................3
Persentase kalus manggis hasil transformasi daun asal rumah kaca............................................3
Persentase kalus manggis hasil transformasi daun in-vitro.........................................................3
Pola pertumbuhan tunas tembakau (tanda panah) berasal dari bekas luka..................................4
Planlet tembakau hasil transformasi dengan TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C).................4
Planlet kultur in-vitro anggrek hasil transformasi TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C) .......4
Planlet kopi hasil transformasi TcAG terlihat menguning (A), kontrol (B), kopi TcAP1 (C).....4
Elektroforesis 200 ng DNA hasil isolasi ......................................................................................5
Hasil PCR dengan primer TcAG ...................................................................................................5
Hasil PCR dengan primer TcAP1 .................................................................................................5
Konsep model ABC pada pembentukan organ bunga..................................................................6

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Pembuatan larutan MS (Murashige & Skoog) ............................................................................10
Pembuatan buffer SDS.................................................................................................................10
Komposisi media LB (Luria Bertani Broth)................................................................................10
Komposisi media ko-kultivasi .....................................................................................................10
Komposisi media eliminasi..........................................................................................................10
Komposisi media seleksi..............................................................................................................11
Komposisi MS vitamin ................................................................................................................11
Pembuatan larutan antibiotik .......................................................................................................11
Peta plasmid pBIN-AG dan pBIN-AP1.......................................................................................11
Bagan alur penelitian....................................................................................................................12

9

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pemuliaan tanaman telah dimulai sejak
dimulainya peradaban manusia. Secara
konvensional, pemuliaan dapat dilakukan
dengan berbagai cara seperti seleksi sifat
tertentu, persilangan, dan mutasi buatan.
Penemuan gen sebagai substansi penentu sifat,
diikuti dengan penemuan teknik isolasi gen,
transfer gen, dan pengekspresiannya pada sel
lain memberikan alternatif baru dalam
pemuliaan melalui bioteknologi (Suwanto
1998). Hal ini memungkinkan penyisipan gengen penting saja, sedangkan sifat lain yang
telah ada diharapkan tidak berubah.
Transformasi genetik yang merupakan
proses introduksi gen dari satu organisme ke
organisme lain adalah salah satu bentuk dari
bioteknologi. Proses transformasi genetik
dapat dilakukan secara langsung (particle
bombardment, penggunaan polietilen-glikol
(PEG), elektroporasi) maupun tidak langsung
menggunakan
bantuan
Agrobacterium
tumefaciens.
Setiap teknik transformasi memiliki
keunggulan dan kekurangan masing-masing.
Transformasi secara langsung memiliki
keunggulan karena cakupannya yang luas
pada berbagai spesies tanaman, namun gen
yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan
yang banyak sehingga peluang terjadinya
penyusunan kembali (re-arrangement) gen
lebih tinggi (Hansen & Chilton 1996).
Transformasi tidak langsung menggunakan A. tumefaciens memiliki keunggulan
karena tidak membutuhkan peralatan khusus,
dapat
dilakukan
dengan
peralatan
laboratorium yang sederhana dan sisipan gen
tunggal berpeluang lebih tinggi dibanding
transformasi langsung, sehingga stabilitas
ekspresi gen lebih tinggi (Hansen & Chilton
1996; Dai et al. 2001; Rahmawati 2006).
Namun transformasi tidak langsung memiliki
kekurangan yaitu sekuen yang ditransfer ke
genom target bersifat acak, ada kemungkinan
yang ditransfer bukan gen target (Wenck et al.
1997; Gelvin 2003).
Secara alami A. tumefaciens hanya dapat
menginfeksi tanaman dikotil, sehingga pada
awalnya transformasi menggunakan A.
tumefaciens hanya terbatas pada tanaman
dikotil. Perkembangan penelitian dasar
mengenai mekanisme infeksi A. tumefaciens
telah memberikan pemahaman baru sehingga
beberapa modifikasi metode transformasi

dapat dilakukan untuk tanaman monokotil
(Slamet-Loedin 1994).
Penelitian ini merupakan penelitian
transformasi gen terhadap beberapa spesies
tanaman dengan karakteristik yang berbeda
dengan menggunakan sistem dan metode yang
sama. Hasil penelitian ini diharapkan mampu
memberikan informasi baru mengenai teknik
transformasi yang efektif menggunakan
A. tumefaciens pada berbagai jenis tanaman.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari
sistem yang tepat dalam melakukan introduksi
gen menggunakan A. tumefaciens strain
AGL0 pada beberapa spesies tanaman yang
memiliki karakter berbeda yaitu manggis
(tanaman apomiksis), tembakau (tanaman
model), anggrek (kelas monokotil), dan kopi
(kelas dikotil).

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2008 hingga November 2008 di
Laboratorium
Biologi
Molekuler
dan
Rekayasa Genetika (BMRG) Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia dan
Laboratorium
Fisiologi
dan
Biologi
Molekuler Tumbuhan Departemen Biologi,
FMIPA IPB.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan antara lain
tanaman manggis, kultur in-vitro tembakau,
kultur in-vitro anggrek, kopi, dan tembakau
hasil transformasi. Bakteri untuk transformasi
merupakan koleksi Laboratorium BMRG,
yaitu A. tumefaciens strain AGL0 pembawa
konstruksi gen Agamous asal kakao (TcAG)
dan gen Apetala1 asal kakao (TcAP1). Kultur
in-vitro menggunakan media Murashige &
Skoog (MS) (Lampiran 1) dengan pemberian
antibiotik kanamisin dan cefotaksim. Isolasi
DNA menggunakan buffer SDS (Lampiran 2).
Uji insersi menggunakan Polimerase Chain
Reaction (PCR) kit RBC (Real Biotech Corp.,
Taiwan) dengan primer spesifik gen target
(Tabel 1).
Alat yang digunakan adalah laminar air
flow, skalpel, pinset, alat gelas, shaker
incubator, sentrifuse berpendingin, vortex,
tabung mikro, speed vac, spektrofotometer,

102

deep freezer, mesin PCR, pipet mikro,
perangkat elektroforesis, dan gel doc.
Tabel 1. Primer spesifik yang digunakan dalam uji insersi

Primer
TcAG-F396
TcAG-R
TcAP1-F2
TcAP1-R2

Sekuen
5’-CGCATTGCCTATGAAGGATC
5’-GGTGACCGTAGCACTTACTCCACCAGA
5’-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCA
5’-CTTCTCCCATGTAGTGCCTG

Metode
Kultur bakteri A. tumefaciens
Sebanyak 1 lup suspensi A. tumefaciens
dari gliserol stok diremajakan pada media
Luria Bertani Agar (LA) (Lampiran 3) +
antibiotik kanamisin 25 mg/L dan rifampisin
25 mg/L. Kemudian diinkubasi selama 18 jam
pada suhu maksimum 28 oC. Pengkayaan
kultur dilakukan dalam media Luria Bertani
Broth (LB) (Lampiran 3) + kanamisin 25
mg/L dan rifampisin 25 mg/L dalam shaker
incubator dengan kecepatan 150 rpm, suhu
maksimum 28 oC (kondisi gelap). Hasil
pengkayaan diresuspensi dengan media kokultivasi cair (Lampiran 4) dan diinkubasi
pada kondisi yang sama selama 2-3 jam.
Transformasi genetik dan regenerasi
Sumber eksplan manggis yang digunakan
dalam transformasi adalah daun manggis asal
rumah kaca, daun in-vitro dan biji. Daun asal
rumah kaca yang digunakan sebagai sumber
eksplan adalah tunas daun dengan lebar 3-3,5
cm yang masih berwarna kemerahan. Daun invitro yang digunakan sebagai sumber eksplan
berasal dari kultur in-vitro yang sudah
memunculkan sepasang daun dengan ukuran
lebar 1-1,5 cm berwarna hijau kemerahan.
Eksplan biji manggis didapatkan dengan
membersihkan biji dari arilusnya yang
berwarna putih, kemudian direndam dalam
larutan Dithane M45 0,8% yang diberi 500
mg/L PVP (polivinilpirolidon). Selanjutnya,
biji yang telah disterilisasi dipotong melintang
menjadi 3-4 potongan sebelum ditanam pada
media atau ditransformasi.
Transformasi pada eksplan daun manggis
asal rumah kaca diawali dengan sterilisasi
permukaan menggunakan alkohol 70% dan
klorox 1%. Potongan eksplan diinokulasi
dalam suspensi bakteri A. tumefaciens
pembawa gen insert dalam larutan MS cair +
acetosiringone 200 mg/L selama 15 menit
dalam shaker incubator 75 rpm (kondisi

gelap). Lalu eksplan dikeringkan dengan tisu
steril dan ditanam pada media ko-kultivasi
padat (Lampiran 4) yang diberi kertas saring
selama 2 hari. Transformasi pada tembakau
menggunakan sumber eksplan daun in-vitro.
Prosedur transformasi pada eksplan tembakau,
kopi, dan anggrek sama dengan prosedur
transformasi pada daun manggis.
Eksplan hasil ko-kultivasi kemudian dicuci
dengan media eliminasi (Lampiran 5) hingga
jernih. Eksplan yang telah dikeringkan
kemudian dikultur pada media seleksi
(Lampiran 6) pada suhu 26 oC kondisi gelap.
Sub-kultur ke media baru dilakukan setiap 4-6
minggu sekali dan persentase planlet berkalus
diamati tiga minggu sekali selama masa
percobaan.
Isolasi DNA Total
Isolasi DNA total dilakukan dengan
menggunakan buffer SDS (Lampiran 2)
menggunakan 100 mg sampel jaringan daun.
Uji kuantitatif dan kualitatif DNA
DNA total hasil isolasi kemudian diuji
kuantitatif untuk mengetahui konsentrasinya
dengan mengukur perbandingan serapan pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Konsentrasi DNA yang tinggi digambarkan
dengan nilai serapan tinggi pada panjang
gelombang 260 nm. Kemurnian DNA
dibanding dengan makromolekul lain dapat
dilihat dari perbandingan serapan antara
260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0
(Sambrook et al. 1989). Menghitung
konsentrasi
DNA
dilakukan
dengan
persamaan :
Kons (ng/µl) = A260nm x k x fp
A260nm : Serapan pada 260 nm
k
: Konstanta konsentrasi (50 untuk DNA)
fp
: Faktor pengenceran

Uji kualitatif DNA dilakukan dengan
teknik elektroforesis gel agarose 1% pada
tegangan 65V, 40 menit menggunakan 0.5x
buffer TBE.
Uji Insersi dengan PCR
Uji insersi dilakukan untuk mengetahui
integrasi gen insert pada genom tanaman
sampel. PCR dilakukan dengan total volum
sebesar 15 µl yang terdiri atas 100 ng DNA
template, 1X buffer PCR (+ MgCl2), 0.1 µM
dNTPs, 0.2 µM masing-masing primer
forward dan reverse, 1.5 unit taq polimerase,

3
11

dan ddH2O hingga mencapai volume 15 µl.
Program termal yang digunakan sesuai dengan
Chaidamsari et al. (2006b) antara lain 95 oC
selama 5 menit (pra-denaturasi), 95 oC 30
detik (denaturasi), 50 oC 30 detik (penempelan), 70 oC 1.5 menit (pemanjangan), yang
diulang 35 siklus dan diakhiri dengan
pemanasan 70 oC 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis dengan gel agarose 1% pada
tegangan 75 V selama 40 menit menggunakan
0.5x buffer TBE kemudian divisualisasi
dengan pewarna etidium bromida diatas UV
transluminator.

A

B

C

D

E

F

Gambar 2 Pola pertunasan biji (A, B, C) dan pengkalusan
daun manggis (D, E, F) yang bukan berasal
dari luka.

HASIL
A

B

C

D

E

F

Transformasi dan regenerasi
Manggis
Sumber eksplan tanaman manggis yang
digunakan dalam kultur in-vitro dan
transformasi dapat dilihat pada Gambar 1.

A
Gambar 1

B

Gambar 3 Eksplan transformasi daun rumah kaca (A),
kontrol transformasi rumah kaca (B), kontrol
negatif rumah kaca (C), transformasi daun invitro (D), kontrol transformasi in-vitro (E),
kontrol
negatif
in-vitro
(F).
Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 5 mm.

C

Sumber eksplan daun tanaman manggis yang
diambil dari rumah kaca yang masih
berwarna merah (A), daun in-vitro (B), biji
(C).

Kontaminasi kultur in-vitro baik dari
sumber eksplan daun maupun biji sangat
tinggi (74,19% untuk transformasi daun yang
diambil dari rumah kaca, 13,79% untuk
transformasi yang berasal dari daun in-vitro,
dan 72,62% untuk kultur biji). Hal ini salah
satunya disebabkan permukaan eksplan yang
tidak halus, kandungan polifenolik serta
mucilage (karbohidrat kompleks) yang tinggi
pada manggis sehingga sterilisasi permukaan
kurang maksimal. Optimasi sterilisasi perlu
dilakukan
untuk
menurunkan
tingkat
kontaminasi dengan cara pengocokan
menggunakan shaker lalu diikuti screening
eksplan asal rumah kaca sebelum dilakukan
transformasi.
Pola pertunasan dan pengkalusan pada
manggis tidak berasal dari bekas luka
(Gambar 2). Hasil transformasi daun manggis
asal rumah kaca dan in-vitro yang
ditransformasi menggunakan gen TcAP1
dapat dilihat pada Gambar 3-5.

Gambar 4 Persentase kalus manggis hasil transformasi
daun asal rumah kaca.

Gambar 5 Persentase kalus manggis hasil transformasi
daun in-vitro.

4
12

Eksplan manggis yang diamati belum
mengalami regenerasi membentuk tunas.
Pertumbuhannya masih sampai tahap kalus
sehingga eksplan belum bisa diambil untuk
pengujian molekuler.

Tabel 3. Hasil transformasi anggrek

,,,

Tembakau
Tingkat
keberhasilan
transformasi
tembakau dan kultur tembakau hasil
transformasi dengan gen TcAG dan TcAP1
berturut-turut dapat dilihat pada Tabel 2 dan
Gambar 6-7.
Gambar 8 Planlet kultur in-vitro anggrek hasil
transformasi TcAG (A), kontrol (B), dan
TcAP1 (C).

Tabel 2. Hasil transformasi tembakau setelah 8 minggu

Kopi
Kultur kopi hasil transformasi dua jenis
gen pengatur pembungaan asal tanaman
kakao, TcAG dan TcAP1 dapat dilihat pada
Gambar 9.

Gambar 6

Pola pertumbuhan tunas tembakau (tanda
panah), berasal dari bekas luka. Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 2 cm.

B
Gambar 9 Planlet kopi hasil transformasi TcAG terlihat
menguning (A), kontrol (B), kopi TcAP1
(C).

A
Gambar 7

C

B

Planlet tembakau hasil transformasi dengan
TcAG (A), kontrol (B), dan TcAP1 (C). Garis
menunjukkan ukuran sepanjang 2 cm.

Anggrek
Tingkat keberhasilan transformasi anggrek
dan kultur anggrek hasil transformasi dengan
gen TcAG dan TcAP1 berturut-turut dapat
dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 8.

Isolasi DNA dan uji insersi dengan PCR
Absorbansi dan konsentrasi DNA hasil
isolasi disajikan pada Tabel 4. Elektroforesis
200 ng DNA hasil isolasi berdasarkan hasil
spektrofotometri menunjukkan pita dengan
intensitas ketebalan yang berbeda (Gambar
10)