Optimization Sugarcane Explants Transformation of P5CS Gene using Agrobacterium tumefaciens

OPTIMASI TRANSFORMASI EKSPLAN TEBU
MENGGUNAKAN GEN P5CS MELALUI
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

DWI SUBIYARTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Optimasi Transformasi
Eksplan Tebu menggunakan Gen P5CS melalui Agrobacterium tumefaciens
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Tesis ini
merupakan bagian dari Proyek Penelitian Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan Indonesia (BPBPI), PT Riset Perkebunan Nasional (RPN) berkerja
sama
dengan

Pusat
Penelitian
dan
Pengembangan
Perkebunan
(PUSLITBANGBUN) DIPA APBN Tahun 2012 untuk publikasi nasional atas
nama Dr. Hayati Minarsih, MSc. dan tim. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.

Bogor, Agustus 2013
Dwi Subiyarti
G851110011

RINGKASAN
DWI SUBIYARTI. Optimasi Transformasi Eksplan Tebu menggunakan Gen
P5CS melalui Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh LAKSMI
AMBARSARI dan HAYATI MINARSIH.
Transformasi genetik merupakan salah satu upaya yang ditempuh untuk

merakit tebu (Saccharum officinarum L.) yang toleran terhadap cekaman
kekeringan. Gen P5CS berperan dalam biosintesis asam amino prolin yang
terakumulasi saat tanaman mengalami cekaman kekeringan. Tujuan penelitian ini
adalah untuk merakit tebu yang teleran terhadap kekeringan melalui optimasi
transformasi eksplan tebu menggunakan gen P5CS melalui variasi strain A.
tumefaciens, sumber eksplan dan varietas tebu.
Penelitian ini dilakukan melalui tahap sebagai berikut verifikasi gen P5CS
koleksi BPBPI (Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia),
transformasi A. tumefaciens (Wang 2006), transformasi eksplan tebu (Sain et al.
1994) dan regenerasi tebu transforman.
Gen P5CS koleksi telah diverifikasi melalui analisis PCR dan elektroforesis
gel agarosa menunjukkan adanya pita tunggal dengan ukuran 2.4 kb sama dengan
kontrol positif. Hal ini menyakinkan bahwa benar gen P5CS dan selanjutnya siap
digunakan untuk transformasi A. tumefaciens.
Gen P5CS koleksi BPBPI berada dalam plasmid pBI121 yang tersusun
dalam konstruk rekombinan pBI-P5CS ditransformasikan ke A. tumefaciens strain
GV3101, LBA4404 dan AGL1. Konstruk rekombinan pBI-P5CS asal tanaman
Vigna aconitifolia berhasil dengan baik ditransformasikan ke dalam sel A.
tumefaciens strain GV3101, LBA4404 dan AGL1 yang ditumbuhkan dengan
antibiotik yang sesuai. Strain GV3101 dan LBA4404 menggunakan antibiotik

kanamisin dan rifampisin, sedangkan strain AGL1 antibiotik yang ditambahkan
adalah kanamisin, rifampisin dan ampisilin masing-masing 50 ppm. Konfirmasi
keberhasilan transformasi dilakukan dengan pengamatan pertumbuhan koloni
transforman di media seleksi dan analisis PCR koloni menggunakan primer
spesifik P5CS utuh. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa A. tumefaciens
transforman tumbuh di media seleksi. Selain itu, hasil analisis PCR dan
elektroforesis gel agarosa menunjukkan adanya pita tunggal dengan ukuran 2.4 kb
sama dengan kontrol positif. Hal tersebut menunjukkan keberhasilan transformasi
A. tumefaciens dan selanjutnya siap digunakan untuk transformasi eksplan tebu.
Sumber eksplan tebu yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas tiga
jenis, yaitu kalus yang ditanam di media padat, kalus embriogenik dan embrio
somatik yang diperoleh melalui metode Temporary Immersion System (TIS) atau
Sistem Perendaman Sesaat (SPS) serta tebu dengan varietas Kidang Kencana, PS
881 dan PS 891. Ko-kultivasi dilakukan di media MS dengan penambahan
asetosiringon 100 ppm di ruang kultur selama dua hari. Seleksi tebu transforman
dilakukan di media MS dengan penambahan kanamisin 50 ppm dan sefotaksim
500 ppm. Eksplan yang tidak ditransformasi ditanam di media MS sebagai kontrol
positif sedangkan kontrol negatif ditanam di media seleksi.
Seleksi tebu transforman di media seleksi diamati dengan menghitung
persentase pertumbuhan pada minggu ke-16 dan minggu ke-32. Selain itu,

verifikasi tebu transforman dilakukan melalui uji histokimia GUS dan analisis

PCR untuk melihat keberhasilan dan kestabilan transformasi. Uji histokimia GUS
untuk menguji keberadaan konstruk gen P5CS menunjukkan hasil positif dengan
adanya pewarnaan biru. Demikian pula dengan analisis PCR menggunakan primer
spesifik P5CS dari daerah terkonservasi gen P5CS menunjukkan adanya
amplifikasi DNA yang berukuran sekitar 1.2 kb dan 700 bp untuk primer NPTII
sama dengan kontrol positif. Hasil pengujian menunjukkan kedua gen telah masuk
ke genom tebu.
Pertumbuhan tunas transforman sebagian masih mengalami albino dan
penurunan tingkat hijau daun. Oleh karena itu, pada media regenerasi MS
penambahan glukosa 1% dan putresin dengan variasi konsentrasi 0 ppm, 10 ppm
dan 30 ppm. Terlihat adanya peningkatan warna hijau tunas transforman setelah
tumbuh di media regenerasi selama 2 bulan dengan konsentrasi putresin yang
optimum adalah 30 ppm. Planlet transforman siap diaklimatisasi dan diuji lebih
lanjut kestabilan transformasi gen P5CS.
Serangkaian hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa transformasi eksplan
tebu menggunakan gen P5CS melalui A. tumefaciens telah berhasil dilakukan.
Strain A. tumefaciens yang paling optimum sebagai media transformasi gen P5CS
pada tebu adalah LBA4404. Sumber eksplan yang paling optimum adalah embrio

somatik hasil kultur SPS. Sedangkan, pertumbuhan tebu transforman varietas
Kidang Kencana terlihat paling baik dibandingkan dengan varietsaa PS 881 dan
PS 891.

Kata kunci: cekaman kekeringan, embrio somatik, kalus embriogenik, prolin

SUMMARY
DWI SUBIYARTI. Optimization Sugarcane Explants Transformation of P5CS
Gene using Agrobacterium tumefaciens. Supervised by LAKSMI AMBARSARI
and HAYATI MINARSIH.
Genetic transformation is one of the attempt in generating sugarcane
(Saccharum officinarum L.) that are tolerant to drought stress. P5CS gene has a
role in prolin biosynthesis, the amino acid that accumulating in water stress
condition. Transformation of a P5CS gene construct into plant cells in conjunction
with regeneration for transgenic plantlets should develop sugarcane tolerant to
drought stress. The aim of this research is to generate drought-tolerant sugarcane
through optimization transformation which includes the strain of Agrobacterium
tumefaciens, a good source of sugarcane eksplant and varieties.
This study was done through verification of IBRIEC (Indonesian
Biotechnology Research Institute for Estate Crops) P5CS gene collection A.

Tumefaciens transformation (Wang 2006), sugarcane explants transformation
(Sain 1994) and sugarcane transformant regeneration.
Verification of P5CS gene collection was PCR analysed by specific primers
P5CS full lenght. PCR and gel electrophoresis showed a single band agarose and
the same size of 2.4 kb with positive control. It is convinced that the P5CS gene
has been isolated and transformed into A. tumefaciens.
IBRIEC collection P5CS genes in plasmid pBI121 were arranged in a
recombinant construct of PBI-P5CS transformed into A. tumefaciens strain
GV3101, LBA4404 and AGL1. Recombinant constructs PBI- P5CS from Vigna
aconitifolia (V. aconitifolia) successfully transformed into cell A. tumefaciens
were grown with appropriate antibiotics. Strain GV3101 and LBA4404 used 50
ppm kanamycin and rifampicin respectively, while antibiotics were added in
AGL1 strain is 50 ppm kanamycin, rifampicin and ampicillin respectively. The
existence of P5CS gene in A. tumefaciens was tested by observing the growth of
transformed colonies in media selection and colony PCR analysis using specific
primers P5CS full lenght. The results showed that A. tumefaciens transformants
were grown in selection media. PCR and gel electrophoresis analysis showed a
single band agarose and same size of 2.4 kb with positive control. This showed
the success of the transformation A. tumefaciens and used to explants sugar cane
transformation.

Sugarcane explants used in this research was included calli grown in solid
medium, embryogenic calli and somatic embryos with MS medium derived from
Temporary Immersion System (TIS) culture with three varieties Kidang Kencana,
PS 881 and PS 891. Co-cultivation medium used solid MS medium with
acetosyringon in room temperature for two days. Transgenes selection was done
in solid MS with antibiotics 50 ppm kanamycin and 500 ppm cefotaxime.
Explants were not transformed cultured in MS media as positive control negative
control while planted in the media selection.
Observation of sugarcane transforman in selection media was calculated the
percentage growth in 16th weeks and 32th weeks. The existence of P5CS gene in
transgenic shoots was tested with GUS histochemical assay, PCR using conserved

regions of specific primers P5CS and NPTII. GUS histochemical test for the
presence of P5CS gene constructs showed positive results in the presence of blue
staining. DNA amplification showed that expected bent size at 1.2 kb and 700 bp
for primers NPTII. The results of this examination proved that both transgenes
were inserted in the sugarcane genomes.
The test results are stable sugarcane transformants through histochemical
GUS test and PCR analysis showed stable transformants sugarcane. Growth of
transformants on selection media indicated P5CS gene via A. tumefaciens

transformation has been successfully performed on sugarcane.
Regeneration of transformed sugarcane in the MS medium with the addition
of 1% glucose and putrescine with various concentration of 0 ppm, 10 ppm and 30
ppm. Green shoots transformant were increased after growth in regeneration
medium for 2 months with the optimum concentration of putrescine was 30 ppm.
Transformant plantlets ready tobe acclimatized and to be further tested stability
of P5CS gene.
It can be concluded that A. tumefaciens strain LBA4404 was the most
effective transformation media of P5CS gene on sugarcane. The regeneration of
Kidang Kencana transformants was better than the other two varieties, PS 881 and
PS 891. Whilst, the best performance of transformants based on the source of
explants was somatic embryo.
Keywords: drought stress, embryogenic calli, somatic embryos, proline

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

OPTIMASI TRANSFORMASI EKSPLAN TEBU
MENGGUNAKAN GEN P5CS MELALUI
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

DWI SUBIYARTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. I Made Artika, M. App Sc.

Judul Tesis : Optimasi Transformasi Eksplan Tebu menggunakan Gen P5CS
melalui Agrobacterium tumefaciens
Nama
: Dwi Subiyarti
NIM
: G851110011

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Laksmi Ambarsari, MS
Ketua

Dr Hayati Minarsih, MSc
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 26 Juli 2013

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya, sehingga karya ilmiah berjudul Optimasi Transformasi
Eksplan Tebu menggunakan Gen P5CS melalui Agrobacterium tumefaciens dapat
diselesaikan.
Penulis mengucapkan penghargaan dan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, MS. selaku ketua Komisi Pembimbing.
2. Ibu Dr. Hayati Minarsih, MSc. selaku anggota Komisi Pembimbing dan
Penanggung jawab penelitian di Laboratorium Biokimia dan Biologi
Molekuler BPBPI yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk ikut
serta dalam penelitian ini.
3. Triyono, MT. suamiku sayang yang telah memberikan kesempatan penulis
untuk terus belajar.
4. Bapak Dr. Priyono, ADS selaku Kepala BPBPI sekarang dan Bapak Dr. Ir. H.
Darmono Taniwiryono, MSc. selaku Kepala BPBPI sebelumnya atas izin
penelitian dan seluruh keluarga BPBPI yang membantu penelitian ini.
5. Bapak Soekarno Mismana Putra, SSi; Bapak Imron Riyadi, MSi; Ibu Niyyah
Fitranty, SSi; Ibu Marini, Amd dan Saudari Rizqi Emilia.
6. Mama, Papa, Mamak, Bapak, Kakak, Adik dan keponakan tersayang yang
senantiasa mendoakan dan memberi dukungan.
7. Teman-teman angkatan 2011 Biokimia S2 (Endri Purwanti, SSi; Djihan Ryn
Pratiwi, SSi; Edy Sukmara, SSi; Rahardian Pratama, SSi; Welly Anggraini
dan Septiani C. Palilingan, SSi) dan Mba Martha Sari, MSi atas dukungan,
kerja sama dan motivasinya.
8. Semua pihak yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak
langsung, sehingga penelitian ini dapat diselesaikan.
Semoga Allah subhanahu wa ta’ala memberi keberkahan dan karya ilmiah
ini dapat bermanfaat. Amiin.

Bogor, Agustus 2013
Dwi Subiyarti

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xvi

DAFTAR GAMBAR

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

xvi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
2
2

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Strategi Penelitian
Prosedur Penelitian

3
3
3
3
4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen P5CS
A. tumefaciens Transforman
Tebu Transforman
Hasil Verifikasi Tebu Transforman
Hasil Pengujian Kestabilan Tebu Transforman
Hasil Regenerasi Tebu Transforman

12
12
17
21
24
33
35

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

39
39
39

DAFTAR PUSTAKA

40

LAMPIRAN

41

RIWAYAT HIDUP

48

DAFTAR TABEL
Karakteristik strain A. tumefaciens
Pertumbuhan tebu transforman (16 minggu)
Pertumbuhan tebu transforman berdasarkan varietas tebu yang
digunakan (16 minggu)
Pertumbuhan tunas transforman (32 minggu)
Pertumbuhan tunas transforman berdasarkan varietas tebu yang
digunakan (32 minggu)
Tingkat hijau daun tunas transforman

19
27
29
30
30
36

DAFTAR GAMBAR
Diagram penelitian
Skema jalur biosintesis prolin pada tanaman
Peta Restriksi Konstruk Plasmid pBI-P5CS
Pertumbuhan bakteri di media seleksi
Hasil database menggunakan BLASTN 2.1.3
Elektroforegram hasil PCR dengan primer spesifik start stop
Interaksi A. tumefaciens dengan sel tumbuhan
Pertumbuhan koloni hasil transformasi konstruk rekombinan pBIP5CS ke A. tumefaciens
Elektroforegram hasil transformasi pBI-P5CS ke A. tumefaciens
A. tumefaciens
Pertumbuhan kalus di media MS
Sumber eksplan yang siap ditransformasi
Hasil uji histokimia GUS
Reaksi pembentukan warna biru
Perbandingan pertumbuhan tebu
Tebu transforman di media ko-kultivasi
Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer spesifik P5CS CS tebu
transforman
Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer spesifik NPTII pada
tebu transforman
Hasil uji histokimia GUS tunas transforman
Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer spesifik P5CS CS tunas
transforman
Elektroforegram hasil PCR menggunakan primer spesifik NPTII
tunas transforman
Tunas transforman
Pertumbuhan tunas transforman di media dengan penambahan putresin
(8 minggu)
Planlet tebu di media cair

5
13
14
15
16
16
18
19
20
22
23
24
25
26
28
31
32
33
34
35
36
38
38

DAFTAR LAMPIRAN
Komposisi media MS untuk induksi kalus dan regenerasi planlet
Komposisi dan pembuatan media

46
47

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kebutuhan bibit tebu semakin meningkat seiring meningkatnya produksi gula
menuju swasembada gula tahun 2014. Sekitar 1.5-2 milyar bibit tebu per tahun
harus tersedia, sementara penggunaan varietas tebu unggul masih terbatas. Selain
itu, luas lahan perkebunan tebu semakin menurun dan saat ini bergeser ke lahanlahan marjinal. Pemanfaatan lahan marjinal memerlukan tanaman tebu yang
memiliki produktivitas tinggi dan toleran terhadap cekaman abiotik, khususnya
toleran kekeringan.
Varietas unggul tebu (Saccharum officinarum L.) memiliki ciri-ciri antara
lain produktivitas gula tinggi (nilai rendemen 13%), mudah dikepras dan toleran
terhadap cekaman biotik (tahan terhadap hama dan penyakit) maupun cekaman
abiotik (tahan kekeringan, genangan air, kadar garam tinggi, kadar nitrogen
rendah dan sebagainya) (Tim Penulis PS 1992).
Salah satu upaya yang ditempuh adalah melalui rekayasa genetik guna
merakit tebu yang toleran kekeringan. Upaya ini terbukti mampu menghasilkan
tanaman yang memiliki sifat-sifat unggul (Manuhara 2006). Keberhasilan
perakitan tanaman transgenik unggul dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain
(1) adanya sistem transformasi dan regenerasi yang mapan, (2) konstruk gen
pembawa sifat unggul yang berfungsi dan sesuai serta (3) varietas tanaman
anjuran baik atas dasar karakter agronomis maupun kemudahan teknis (Minarsih
2003). Selain itu, juga ditunjukkan dengan keberhasilan pertumbuhan tanaman
baru yang normal, fertil dan dapat mengekspresikan gen baru hasil insersi
(Manuhara 2006).
Beberapa hasil penelitian telah (Ananda 2004; Wulandari 2005; Nurkhasanah
2007; Susiyanti et al. 2007) dilaporkan bahwa transformasi tebu menggunakan
gen fitase telah berhasil dilakukan agar tahan di lahan dengan kadar fosfat rendah.
Selain itu, Eka et al. (1997) juga telah berhasil merakit tebu yang tahan terhadap
penggerek batang (Chillo auricillius), stem borer (pembuat lubang pada batang)
(Ali 2006), virus kuning daun (Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) (Gilbert et
al. 2009) dan jamur (Khamrit et al. 2012).
Perakitan tebu toleran kekeringan dapat diupayakan dengan melakukan
transformasi gen P5CS yang menyandi enzim ∆1-Pyrroline-5-carboxylate
synthetase (P5CS). Gen P5CS berperan dalam biosintesis prolin yaitu asam amino
yang berperan sebagai senyawa osmoprotektan yang diakumulasi saat tanaman
mengalami cekaman kekeringan atau cekaman osmotik (Bray 1997).
Transformasi gen P5CS ke tebu telah berhasil dilakukan tetapi masih
mengalami beberapa kendala antara lain terhambatnya pertumbuhan transforman,
terbentuknya planlet albino atau bulai, kimera, browning (pencoklatan pada
eksplan dan media) dan vigor yang lemah (Minarsih 2003). Untuk memperbaiki
tebu transgenik tersebut perlu dilakukan kembali transformasi gen P5CS, sehingga
dapat diperoleh tebu transgenik yang toleran terhadap cekaman kekeringan dan
vigor yang kuat. Penelitian ini penting dilakukan untuk mendapatkan metode
transformasi gen yang optimum melalui variasi strain Agrobacterium, sumber
eksplan dan varietas tebu yang baik sebagai target transformasi gen.

2

Perumusan Masalah
Transformasi eksplan tebu menggunakan gen P5CS melalui A. tumefaciens
telah berhasil diperoleh tebu transforman yang memiliki sifat toleran terhadap
kekeringan. Transformasi kalus embriogenik tebu varietas PS 851 dan PS 862 asal
media padat menggunakan gen P5CS melalui A. tumefaciens strain LBA4404
masih belum optimal karena menghadapi beberapa kendala seperti terhambatnya
pertumbuhan transforman, terbentuknya planlet albino atau bulai, kimera,
browning (pencoklatan pada eksplan dan media) dan vigor yang lemah. Oleh
sebab itu perlu dilakukan optimasi penggunaan strain A. tumefaciens, sumber
eksplan dan varietas tebu agar diperoleh tebu transgenik yang memiliki sifat
toleran terhadap kekeringan dengan pertumbuhan transforman yang cepat, warna
planlet hijau, tidak kimera dan vigor yang kuat.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk merakit tebu yang teloren terhadap
kekeringan melalui optimasi transformasi eksplan tebu menggunakan gen P5CS
melalui variasi strain A. tumefaciens, sumber eksplan dan varietas tebu.

Hipotesis Penelitian
Perakitan tebu toleran kekeringan dapat dilakukan melalui transformasi
eksplan tebu menggunakan strain A. tumefaciens yang efektif, sumber eksplan dan
varietas tebu yang optimum.

Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat membantu upaya rekayasa
genetik toleran kekeringan, sehingga dapat meningkatkan produksi tebu melalui
kulur jaringan.

3

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler
serta Laboratorium Biak Sel dan Mikropropagasi, Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan Indonesia (BPBPI) Jalan Taman Kencana No. 1 Bogor. Penelitian ini
dimulai dari bulan Maret 2012-Juni 2013.

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah alat gelas, ose, bunsen, autoklaf, rak kultur, pipet
mikro, mikrotips, neraca analitik Sartorius® ED4252-CW, Allegra 64R
Centrifuge-Beckman Coulter, tabung sentrifus, mikrosentrifus Eppendorf 5415R,
tabung Eppendorf, shaker incubator ES20-Biosan, laminar air flow ESCO, pH
meter (Docu pHmeter Sartorius®), magnetic stirrer, seperangkat alat PCR
TPersonal BIOMETRA®, seperangkat elektroforesis TOYLAB, botol kultur steril,
vortex mixer CORNING LSE®, water bath, Speed Vacum DNA, lemari pendingin,
mikrofilter, sarung tangan, plastik, karet, pinset, pisau dan seperangkat
spektrofotometer Thermo Scientific Multiskan GO.
Bahan yang digunakan adalah media MS (Murashige dan Skoog 1962) untuk
induksi kalus dan media regenerasi yang komposisinya terdapat pada Lampiran 2,
media LB (Luria-Bertani) (Lampiran 2), aluminium foil, serbuk agarosa, buffer
TBE (Tris Borat EDTA), kit isolasi plasmid (GenJETTM plasmid miniprep kit,
Fermentas life sciences), kit bahan campuran PCR (Fermentas life sciences),
primer spesifik P5CS dari sekuen CDS gen P5CS V. aconitifolia (start 5’-CGG
GGG TTC ATG AAG GAC G-γ’ dan stop 5’-GAA TCG TTA AAC ATT GTG
GAC C-γ’), primer spesifik P5CS dari daerah terkonservasi sekuen CDS gen
P5CS V. aconitifolia (CS forward 5’-TAC TGA GAC TGT GAA GTC GC-γ’ dan
CS reverse 5’-ATG GCA TTG CAG GCT GCC G-γ’), primer spesifik NPTII
(Neomycin Phosphotransferase II), akuades, Gel red, loading dye, nitrogen cair,
tusuk gigi, masker, alkohol, antibiotik rifampisin, kanamisin, ampisilin,
sefotaksim, asetosiringon, putresin, glukosa dan pereaksi untuk GUS assay (Uji
histokimia GUS/ -glukoronidase).
Kalus dari media padat, kalus embriogenik dan embrio somatik tebu varietas
PS 881, PS 891 dan Kidang Kencana (KK). Strain A. tumefaciens strain
LBA4404, GV3103 dan AGL1 (dari Dr. Sony Suhandono, Sekolah Ilmu dan
Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung) serta konstruk rekombinan pBIP5CS Vigna aconitifolia (V. aconitifolia) dari Dr. Desh Pal S. Verma, Ohio State
University, USA.

Strategi Penelitian
Strategi penelitian melalui tahapan sebagai berikut, yaitu: (1) penyiapan
konstruk rekombinan pBI-P5CS yang meliputi pertumbuhan koleksi di media

4
seleksi, perbanyakkan plasmid, isolasi konstruk rekombinan pBI-P5CS dan
elektroforesis gel agarosa (2) transformasi konstruk rekombinan pBI-P5CS ke A.
tumefaciens yang meliputi pertumbuhan A. tumefaciens starin GV3101, LBA4404
dan AGL1 koleksi di media seleksi, peremajaan dan perbanyakkan, pembuatan sel
kompeten dan transformasi konstruk rekombinan pBI-P5CS sel kompeten A.
tumefaciens, (3) pengujian Agrobacterium transforman yang meliputi
pertumbuhan di media seleksi, analisis PCR koloni dan elektroforesis gel agarosa,
(4) transformasi gen ke eksplan meliputi penyiapan pucuk tebu, subkultur kalus di
media padat, subkultur kalus melalui metode SPS dan transformasi gen melalui A.
tumefaciens ke eksplan tebu serta (5) pengujian tebu transforman meliputi
perhitungan persentase pertumbuhan tunas transforman di media seleksi, uji GUS,
isolasi DNA, analisis PCR, regenerasi tebu transforman dan kestabilan
transformasi gen (Gambar 1).

Prosedur Penelitian

Kultur jaringan tanaman tebu
Penanaman pucuk tebu untuk penyiapan kalus (Minarsih 2003)
Pucuk tebu varietas varietas KK, PS 881 dan PS 891 disiapkan dengan
memisahkan pucuk yang masih muda (daun menggulung) yaitu sekitar 20 cm
pada jaringan meristem. Pucuk tebu direndam dalam alkohol dan disterilisasi
dengan memanaskannya di atas pembakar spiritus beberapa saat. Setelah itu,
bagian kulit terluar pucuk tebu dikupas, direndam kembali dalam alkohol,
dipanaskan dan diulangi sebanyak 2 kali hingga mendapat pucuk yang lunak.
Sekitar 0.2-0.5 cm dari pangkal tunas, batang pucuk muda dipotong-potong
menjadi 12 bagian kecil. Kemudian, potongan pucuk ditanam di media MS dan
diinkubasi di ruang kultur tanpa cahaya selama 4 minggu. Penanaman pucuk tebu
dilakukan dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow. Pembuatan media MS
dengan komposisi bahan yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 1.

Penyiapan kalus embriogenik dan embrio somatik (Mordocco et al. 2009)
Kalus embriogenik dan embrio somatik varietas KK, PS 881 dan PS 891
disiapkan di Laboratorium Biak Sel dan Mikropropagasi BPBPI, Ciomas melalui
metode Temporary Immersion System (TIS) atau Sistem Perendaman Sesaat
(SPS). Kalus yang berasal dari pucuk tebu ketiga varietas disubkultur sebanyak 24 kali. Kemudian, sebanyak 0.5 gram kalus dimasukkan dalam bejana SPS RITA®
dan dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow. Bejana SPS RITA®
kemudian dihubungkan dengan pompa dan automatic timer (Autonic). Program
Autonic diatur secara otomatis dengan lama perendaman selama tiga menit setiap
24 jam hingga terbentuk kalus embriogenik (6 minggu) dan embrio somatik (8
minggu).

5
Konstruk
rekombinan
pBI-P5CS

Sel kompeten
Agrobacterium

Agrobacterium
transforman

Eksplan tebu

Tebu Transforman

Elektroforesis
gel agaros

Pembuatan sel
kompeten

Pertumbuhan di
media seleksi

Kalus, kalus
embriogenik dan
embrio somatik

Pertumbuhan di
media seleksi

Isolasi plasmid

Peremajaan dan
perbanyakkan
Agrobacterium

Analisis PCR
koloni

Subkultur kalus
di SPS

Uji GUS

Elektroforesis
gel agaros

Subkultur kalus
di media padat

Isolasi DNA

Penanaman
pucuk tebu
varietas KK, PS
881 dan PS 891

Analisis PCR

Perbanyakkan
plasmid

Peremajaan
Agrobacterium
strain GV3101,
LBA4404 dan
AGL1

Pertumbuhan di
media seleksi

Regenerasi tebu
transforman

Kestabilan
transformasi gen

Gambar 1 Diagram penelitian
5

6
Transformasi genetik
Peremajaan A. tumefaciens
A. tumefaciens strain GV3103, LBA4404 dan AGL1 ditanam kembali dalam
media YEP (Yeast Extract Peptone) padat yang baru (Lampiran 2). Media seleksi
YEP dengan penambahan antibiotik rifampisin 50 ppm digunakan untuk A.
tumefaciens strain GV3101 dan LBA4404. Sedangkan untuk strain AGL1
antibiotik yang ditambahkan ke dalam media YEP adalah rifampisin 50 ppm dan
ampisilin 50 ppm. Penyiapan media dan penanaman A. tumefaciens dilakukan
secara aseptis dalam laminar air flow. A. tumefaciens di media baru kemudian
diinkubasi tanpa cahaya selama 2 hari untuk strain GV3103 dan LBA4404 serta 3
hari untuk strain AGL1 pada suhu 28 oC. Pembuatan media dan peremajaan A.
tumefaciens dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow.

Pembuatan Sel Kompeten (Wang 2006)
Pembuatan sel kompeten menggunakan metode pembekuan (Thaw Method).
Sebanyak 100 µL A. tumefaciens strain GV3101, LBA4404 dan AGL1
dimasukkan ke dalam 100 mL media YEP cair (Lampiran 2) dengan antibiotik
rifampisin 50 ppm untuk strain GV3101 dan LBA4404. Sedangkan strain AGL1
antibiotik yang ditambahkan adalah rifampisin 50 ppm dan ampisilin 50 ppm.
Campuran diinkubasi pada suhu 28 oC tanpa cahaya dan dikocok pada kecepatan
120 rpm hingga memperoleh nilai OD600 0.55-0.65 (OD600, optical density pada
panjang gelombang 600 nm). Lalu, suspensi biakan disentrifugasi selama 10
menit pada kecepatan 10000 rpm dan suhu 4 oC. Setelah itu, supernatan dibuang
dan pelet disuspensikan ke dalam 5 mL larutan CaCl2 20 mM dingin. Campuran
disentrifugasi kembali selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm dan suhu 4 oC.
Selanjutnya, supernatan dibuang dan pelet disuspensikan dalam 1 mL larutan
CaCl2 20 mM dingin. Campuran kemudian dibagi ke dalam tabung Eppendorf
masing-masing 100 μL dalam kondisi dingin dan dimasukkan ke dalam nitrogen
cair yang selanjutnya disimpan pada suhu -70 oC untuk digunakan sekali pakai.
Pembuatan sel kompeten dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow.

Transformasi Agrobacterium (Wang 2006)
Sebanyak 1 μL plasmid (pBI-P5CS) dan 5 μL sel kompeten A. tumefaciens
dimasukkan ke dalam 2 mL media YEP (tanpa antibiotik). Campuran dimasukkan
ke dalam nitrogen cair selama 5 menit dan selanjutnya dipindahkan pada suhu 37
o
C selama 5-10 menit. Selanjutnya, campuran dimasukkan ke dalam media YEP 2
mL dan diinkubasi selama 2-4 jam pada suhu 28 oC serta dihomogenkan. Setelah
itu, campuran disentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 10000 rpm dan suhu 4
o
C. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan media YEP cair sebanyak 0.1-2 mL
dengan penambahan antibiotik rifampisin 50 ppm. Sebanyak 100-γ00 μL hasil
resuspensi dipindahkan ke media seleksi LB padat (Lampiran 2) yang
ditambahkan antibiotik rifampisin 50 ppm dan kanamisin 50 ppm untuk A.
tumefaciens strain LBA4404 dan GV3101. Sedangkan penambahan antibiotik
rifampisin 50 ppm, ampisilin 50 ppm dan kanamisin 50 ppm ke media seleksi LB
padat untuk strain AGL1. A. tumefaciens yang telah ditransformasi kemudian

7
diinkubasi tanpa cahaya pada suhu 28 oC selama 2 hari untuk strain GV3103 dan
LBA4404 serta 3 hari untuk strain AGL1. Transformasi konstruk rekombinan
pBI-P5CS ke A. tumefaciens dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow.

Transformasi eksplan tebu (Sain et al. 1994)
Gen P5CS dalam konstruk rekombinan pBI-P5CS ditransformasi ke eksplan
kalus asal media padat, kalus embriogenik dan embrio somatik yang berasal dari
kultur SPS melalui perantara A. tumefaciens. A. tumefaciens transforman
diremajakan terlebih dahulu dalam 5 mL media LB cair dengan penambahan
antibiotik rifampisin 50 ppm dan kanamisin 50 ppm untuk A. tumefaciens strain
LBA4404 dan GV3101. Sedangkan penambahan antibiotik rifampisin 50 ppm,
ampisilin 50 ppm dan kanamisin 50 ppm ke media LB cair untuk strain AGL1. A.
tumefaciens yang telah ditransformasi kemudian diinkubasi dan dikocok pada
suhu 28 oC tanpa cahaya selama 2 hari untuk strain GV3103 dan LBA4404 serta 3
hari untuk strain AGL1.
A. tumefaciens segar sebanyak 1 mL kemudian diremajakan kembali ke
media LB baru sebanyak 10 mL dengan antibiotik yang sesuai. Campuran
diinkubasi pada suhu 28 oC tanpa cahaya dan dikocok pada kecepatan 120 rpm
hingga memperoleh nilai OD600 = 0.55-0.65. Selanjutnya, suspensi biakan
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. Pelet yang dihasilkan
dilarutkan dengan larutan MS cair dan ditambah asetosiringon 100 ppm.
Larutan kemudian digunakan untuk inokulasi eksplan selama 15 menit tanpa
cahaya. Lalu, eksplan diserapkeringkan dengan kertas tisu steril. Segera setelah
itu, eksplan diko-kultivasi pada media MS padat dengan asetosiringon 100 ppm
dan diinkubasi selama 2 hari di ruang kultur tanpa cahaya. Jika A. tumefaciens
tumbuh signifikan, maka eksplan dicuci dengan media MS cair atau akuades steril
hingga bersih. Apabila pertumbuhan A. tumefaciens tidak nyata, maka eksplan
dapat langsung dipindahkan ke MS padat yang mengandung sefotaksim 500 ppm
dan diinkubasi di ruang kultur tanpa cahaya selama 7 hari.
Eksplan kemudian disubkultur ke media seleksi dengan penambahan
kanamisin 50 ppm dan sefotaksim 500 ppm selama 4 minggu di ruang kultur
gelap. Selanjutnya, eksplan disubkultur dan diinkubasi di ruang terang pada media
yang sama untuk inisiasi tunas. Eksplan yang tidak ditransformasi ditanam di
media MS sebagai kontrol positif sedangkan kontrol negatif ditanam di media
seleksi. Proses penambahan antibiotik, penyiapan eksplan dan subkultur dilakukan
secara aseptis dalam laminar air flow.
Media kultur untuk kalus tebu adalah MS padat ditambahkan suplemen 100
mL/L air kelapa muda, 30 g/L sukrosa dengan 3.0 mg/L 2,4 D 0.2 mg/L. Tunas
diinduksi pada media yang sama tetapi berbeda kandungan hormonnya, yaitu 2
mg/L IAA dan BAP 0.2 mL/L (Lampiran 1). Subkultur ke media baru dilakukan
setiap 4 minggu hingga terbentuk planlet (tanaman hasil kultur jaringan). Pada
fase induksi akar, planlet dipindahkan ke dalam media MS cair hingga siap
diaklimatisasi.

8
Pengujian molekuler
Uji koleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah plasmid koleksi berada
dalam Escherichia coli (E. coli) atau sudah dalam A. tumefaciens. Koleksi
konstruk rekombinan pBI-P5CS sebanyak 10 μL ditambahkan dalam media LB
sebanyak 25 mL dalam botol kecil yang sudah disterilisasi.
Seleksi antibiotik koleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS disiapkan dalam
dua botol kecil. Botol pertama berisi media LB sebanyak 25 mL ditambah
antibiotik rifampisin 50 ppm dan kanamisin 50 ppm kemudian dikocok pada
kecepatan 250 rpm dan suhu 28 oC selama 2 hari. Apabila tumbuh (kuning keruh)
maka dapat dipastikan bahwa konstruk rekombinan pBI-P5CS sudah berada
dalam A. tumefaciens. Sedangkan botol kecil yang kedua berisi media LB
sebanyak 25 mL ditambah antibiotik kanamisin 50 ppm dan diinkubasi pada suhu
37 oC hingga 18 jam sambil dikocok pada kecepatan 250 rpm. Apabila tumbuh,
maka dapat disimpulkan bahwa konstruk rekombinan pBI-P5CS masih berada
dalam E. coli yang selanjutnya harus diisolasi untuk mendapatkan pBI-P5CS.

Isolasi konstruk rekombinan pBI-P5CS
Isolasi konstruk rekombinan pBI-P5CS dalam E. coli dilakukan untuk
mendapatkan konstruk rekombinan pBI-P5CS yang akan ditransformasi ke A.
tumefaciens. Isolasi ini dilakukan dengan menggunakan GeneJETTM Plasmid
miniprep kit (Fermantas life science kit).
Sebanyak 4 mL kultur bakteri koleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan
ditambahkan Resuspesion buffer sebanyak β50 μL. Larutan kemudian
dihomogenkan dengan vortex hingga larut. Setelah itu, campuran ditambah
larutan Lysis buffer sebanyak β50 μL dan dihomogenkan dengan cara dibolakbalik 4-6 kali. Lalu, campuran ditambah larutan Neutralization buffer sebanyak
γ50 μL dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik 4-6 kali. Kemudian,
campuran disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 25 oC selama 5
menit.
Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh ditambah larutan Wash solution
sebanyak 700 μL dalam tabung berfilter. Setelah itu, tabung berfilter
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Lalu, supernatan
dibuang dan ditambah larutan Wash solution sebanyak 700 μL. Campuran
selanjutnya disentrifugasi kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit.
Supernatan dibuang dan tabung berfilter diganti dengan Eppendorf steril 1.5
mL. Kemudian, filtrat ditambah larutan Ellution buffer sebanyak γ0 μL,
didiamkan selama 2 menit pada suhu kamar dan selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Tabung berfilter dibuang dan akhirnya
diperoleh plasmid sekitar γ0 μL. Cairan konstruk rekombinan pBI-P5CS yang
diperoleh disimpan pada suhu -20 oC.

9
Isolasi DNA tebu transforman (Orozco-Castillo et al. 1994)
Isolasi DNA tebu transforman dilakukan sebelum DNA dianalisis PCR.
Sebanyak 0.1 gram tebu transforman yang sudah diseleksi dimasukkan ke dalam
tabung Eppendorf 2 mL. Kemudian, tebu transforman ditambah nitrogen cair dan
ditumbuk hingga halus. Selanjutnya, serbuk tebu transforman ditambah larutan
buffer ekstraksi sebanyak 1 mL yang telah dipanaskan dan ditambahkan larutan merkaptoetanol 1% sebanyak 10 μL. Campuran kemudian dihomogenkan dengan
cara dibolak-balik hingga homogen dan dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65
o
C.
Larutan ekstrak buffer kemudian dibiarkan hingga dingin di suhu kamar.
Setelah itu, larutan ditambah campuran kloroform:isoamilalkohol (24:1) (larutan
KI) sebanyak 1 mL dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik. Setelah itu,
campuran disentrifugasi pada kecepatan 11000 rpm dan suhu 25 oC selama 10
menit. Lapisan bagian atas dipipet ke tabung Eppendorf yang baru dan diekstrak
kembali dengan larutan KI sebanyak volume cairan yang diperoleh. Kemudian
campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 11000 rpm dan suhu 25 oC
selama 10 menit.
Cairan bagian atas dipipet ke tabung Eppendorf yang baru dan ditambahkan
larutan isopropanol sebanyak 1 kali volume cairan yang diperoleh. Setelah itu,
campuran dikocok perlahan hingga homogen dan disimpan dalam lemari
pendingin pada suhu 4 oC selama 30 menit. Setelah itu, campuran disentrifugasi
pada kecepatan 11000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet DNA
dikeringkan dengan cara membalikkan tabung Eppendorf.
Pelet DNA dilarutkan dalam 100 μL larutan buffer TE (Tris-EDTA).
Kemudian, larutan ditambah 10 μL larutan CH3COONa 3 M pH 5.2 dan etanol
absolut sebanyak 250 μL. Setelah itu, campuran dihomogenkan dan disimpan
dalam lemari pendingin (-20 oC) selama 30 menit. Selanjutnya, campuran
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang
dan pelet DNA dicuci dengan larutan etanol 70% sebanyak 50-100 μL dan
dikeringkan dengan Speed Vacum DNA.
Pelet yang sudah kering dilarutkan dalam 100 μL buffer TE atau ddH2O,
ditambahkan RNase sebanyak β5 μL/ mL dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama
30 menit. DNA tebu transforman yang telah diperoleh selanjutnya dianalisis PCR.
Kualitas DNA lebih lanjut dapat diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1% dan
konsentrasinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230,
260 dan 280 nm.

Verifikasi konstruk rekombinan pBI-P5CS (Minarsih 2003)
Verifikasi konstruk rekombinan pBI-P5CS dilakukan untuk menyakinkan
hasil isolasi menggunakan PCR (Polimerase Chain Reactions). Reaksi PCR
menghasilkan DNA konstruk rekombinan pBI-P5CS yang telah diperbanyak.
Keberadaan plasmid yang diinginkan dapat dilihat dengan elektroforesis gel
agarosa. Reagen yang digunakan berasal dari Fermentas life science. Sebanyak 5
μL larutan buffer dNTP 1 μL, primer spesifik P5CS start dan stop masing-masing
sebanyak 2 μL, Taq polymerase sebanyak 0.6 μL, 1 μL DNA plasmid hasil isolasi
yang telah diencerkan 10 kali dan ditambah ddH2O (molecular water) hingga
volume β5 μL. Reaksi dijalankan pada mesin PCR sebanyak 35 siklus.

10
Program PCR diatur sebagai berikut: pre denaturasi 94 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 30 menit, penempelan (annealing) 58 oC selama 30 detik,
tahap penyempurnaan reaksi (perpanjangan rantai DNA) 72 oC selama 4 menit
dan stabilisasi reaksi pada suhu 10 oC. Hasil PCR dianalisis menggunakan metode
elektroforesis untuk mengetahui ukuran plasmid.
Verifikasi gen NPTII dan gen P5CS (primer spesifik P5CS CS) tebu
transforman dilakukan dengan program yang sama dengan primer spesifik P5CS
start dan stop. Suhu annealing untuk primer NPTII adalah 55 oC (Minarsih 2003).
Sedangkan, program PCR koloni ditambahkan tahap lisis sebelum pre denaturasi.
Pengaturan program lisis sebagai berikut suhu 96 oC selama 5 menit, 50 oC selama
1 menit 30 detik, 96 oC selama 1 menit 30 detik, 45 oC selama 1 menit 30 detik,
96 oC selama 1 menit dan 40 oC selama 1 menit.
Kontrol positif menggunakan template DNA rekombinan pBI-P5CS.
Sedangkan kontrol negatif menggunakan molecular water sebagai template.
Keduanya disiapkan dan direaksikan bersama setiap melakukan analisis PCR.

Elektroforesis
Sampel DNA dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa untuk konfirmasi
ukuran pBI-P5CS dan DNA tebu transforman setelah dianalisis PCR. Gel agarosa
konsentrasi 1% dimasukkan dalam bejana elektroforesis dan sebanyak β μL
sampel dimasukkan dalam sumur. Kemudian, gel agarosa dielektroforesis dengan
tegangan 75 volt. Hasil elektroforesis diamati dan difoto di atas UV
transluminator, sehingga dapat dilihat ukuran dari plasmid pBI-P5CS dalam
satuan bp (base pair/ pasang basa) dibandingkan dengan marka 1 kb Plus DNA
Ladder dari Invitrogen.

Uji histokimia GUS (Jefferson 1987)
Pengujian GUS dilakukan pada eksplan yang telah ditransformasi. Reagen
yang digunakan adalah larutan X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -Dglucuronic acid) 1 mM; K3Fe(CN)6 0.1 mM; K4Fe(CN)6 0.1 mM; triton 3% dan
fosfat buffer (NaH2PO4/NaHPO4) 50 mM dengan pH 7.0. Tebu transforman
diinkubasi dalam larutan reagen selama 24 jam pada suhu 37 oC tanpa cahaya.
Setelah itu, tebu transforman dicuci dengan alkohol dan diamati warna biru yang
terbentuk.

Regenerasi tebu transforman
Regenerasi tebu transforman dilakukan setelah tumbuh di media seleksi
selama 24 minggu (6 bulan). Media regenerasi yang digunakan adalah media MS
dengan penambahan glukosa 1% dan putresin masing-masing dengan variasi
konsentrasi 0 ppm, 10 ppm dan 30 ppm. Pengamatan perubahan tingkat warna
hijau daun tunas transforman dilakukan setelah 8 minggu (2 bulan).

11
Verifikasi kestabilan tebu transforman
Verifikasi kestabilan tebu transforman diuji setelah terbentuk planlet
transforman berumur 32 minggu (8 bulan) setelah transformasi. Uji histokimia
GUS dan analisis PCR dilakukan pada tunas yang terbentuk dari tebu transforman
yang telah diuji pada 16 minggu (4 bulan) setelah transformasi. Uji histokimia
GUS dilakukan dengan metode Jefferson (1987), sedangkan analisis PCR
menggunakan primer spesifik P5CS CS dan NPTII.

12

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gen P5CS
Tebu termasuk dalam famili Poaceae, genus Saccharum dan spesies
Saccharum officinarum L. (Benson 1957) yang dapat tumbuh di daerah tropis dan
subtropis (James 2004). Kebutuhan tebu sebagai bahan baku utama pembuatan
gula meningkat, untuk memenuhi program pemerintah yaitu swasembada gula
tahun 2014. Oleh karena itu, perlu penyediaan bibit tebu yang cukup. Salah satu
kendala yang dihadapi adalah adanya perubahan musim dan lahan yang terbatas.
Berbagai upaya telah dilakukan untuk merakit tebu yang cocok ditanam di lahan
marjinal mulai metode konvensional hingga modern.
Kekeringan adalah faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan,
perkembangan, ketahanan dan produktivitas tanaman. Kekeringan tidak hanya
permasalahan utama di lahan marjinal tetapi juga di lahan optimum pada kondisi
iklim di lahan kering. Respon tanaman terhadap toleran kekeringan bervariasi.
Secara molekuler diantaranya adalah dengan mengakumulasi senyawa
osmoprotektan (Bray 1997). Prolin merupakan asam amino yang berperan sebagai
senyawa osmoprotektan.
Sintesis prolin pada tanaman tingkat tinggi dapat melalui dua jalur yaitu jalur
glutamat (Glu) dan jalur ornitin (Orn) (Gambar 2) (Delauney dan Verma 1993).
Saat tanaman mengalami cekaman, prolin diproduksi secara langsung melalui
jalur Glu. Sedangkan saat kondisi normal, tanaman menggunakan ornitin sebagai
prekursor melalui jalur Orn untuk menghasilkan prolin (Aprile et al. 2009).
Jalur Glu dimulai dengan konversi asam glutamat menjadi glutamat- semialdehid (GSA) yang dikatalisis oleh enzim ∆1-pyrroline-5-carboxylate
synthetase (P5CS). Selanjutnya, GSA diubah menjadi ∆1-pyrroline-5-carboxylate
(P5C) secara spontan. Akhirnya L-prolin terbentuk dari P5C yang dikatalisis oleh
enzim ∆1-pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR). Sintesis prolin melalui jalur
Glu dapat meningkat pada kondisi tanaman mengalami cekaman kekeringan
(Delauney dan Verma 1993).
Sintesis prolin melalui jalur Orn dimulai dengan konversi L-ornitin menjadi
α-keto-δ-amonivelarat yang dikatalisis oleh enzim ornitin-α-aminotransferase dan
secara spontan diubah menjadi ∆1- pyrroline-2-carboxylate (P2C). Akhirnya Lprolin terbentuk dari P2C yang dikatalisis oleh enzim ∆1-pyrroline-2-carboxylate
reductase (P2CR). Selain itu, L-ornitin juga dapat diubah menjadi GSA yang
dikatalisis oleh enzim ornitin-δ-aminotransferase (OAT) dan selanjutnya dibentuk
prolin melalui jalur Glu.
Gen P5CS merupakan gen yang menyandi enzim P5CS. Enzim P5CS
dianggap sebagai enzim pengatur utama dalam sintesis prolin dan meningkatkan
pengaturan produksi prolin pada saat tanaman mengalami cekaman (Aprile et al.
2009). Selain itu, gen P5CS merupakan penyandi enzim yang menjadi faktor
pembatas dalam biosintesis prolin pada tanaman tingkat tinggi (Hu et al. 1992).
Prolin berfungsi sebagai pelindung enzim sitoplasmik dan pelindung stuktur
seluler sebagai saat tanaman mengalami cekaman kekeringan (Gibon et al. 2000).
Rodrigues et al. (2009) menganalisis profil ekspresi gen kondisi kekeringan pada
tebu toleran kekeringan. Metode yang dilakukan menggunakan microarray

13
membrane yang terdiri atas 3575 klon cDNA dari pustaka daun tebu dan hasilnya
dikonfirmasi menggunakan analisis Real Time PCR. Hasil penelitian
menunjukkan terdapat 165 gen yang terekspresi saat stress air, tetapi hanya 94%
yang diatur saat stress dan baru 49 gen yang sudah diketahui identitasnya salah
satunya adalah gen P5CS.

ornitin-αaminotransferase

α-keto-δ-aminovelarat

L-ornitin

spontan

∆1 -pirolin-2-karboksilat
(P2C)

ornitin-δaminotransferase

P2C
reduktase

spontan

Asam L-glutamat

L-prolin

Gambar 2 Skema jalur biosintesis prolin pada tanaman
(Delauney dan Verma 1993)
Ket:
P2C
P2CR
P5C
P5CR
P5CS
GSA

= ∆1-pyrroline-2-carboxylate (∆1-pirolin-2-karboksilat)
= ∆1-pyrroline-2-carboxylate reductase (∆1-pirolin-2-karboksilat redutase)
= ∆1-pyrroline-5-carboxylate (∆1-pirolin-5-karboksilat)
= ∆1-pyrroline-5-carboxylate reductase (∆1-pirolin-5-karboksilat reduktase)
= ∆1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (∆1-pirolin-5-karbosilat sintetase)
= glutamate- -semialdehide (glutamat- -semialdehid)

Penelitian tembakau dan tebu transgenik yang diintroduksi gen P5CS dengan
perlakuan kondisi toleran kekeringan menunjukkan konsentrasi prolin meningkat
dan lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol (non-transgenik) (Minarsih
2003). Selain itu, transformasi kalus kelapa sawit menggunakan gen P5CS telah
berhasil mendapatkan kalus transforman yang memiliki sifat toleran terhadap
kekeringan (Usmani 2011).
Transformasi eksplan tebu menggunakan gen P5CS telah berhasil dilakukan
secara biologis melalui A. tumefaciens dan secara fisik dengan particle
bombardment. Hasil penelitian menunjukkan penggunaan Agrobacterium terbukti
lebih efektif dan efisien dalam transfer konstruk transgen P5CS ke dalam kalus
tebu daripada metode particle bombrdment. Tebu transforman yang dihasilkan
mengalami pertumbuhan yang lebih lambat dibandingkan dengan kontrol positif,
regenerasi planlet tebu transgenik bulai dan memiliki vigor yang lemah (Minarsih
2003).
Gen P5CS koleksi BPBPI berada dalam plasmid pBI (Gambar 3) (Kishor et
al. 1995). Plasmid pBI berfungsi sebagai vektor yang membawa gen P5CS yang
akan ditransformasikan ke tebu. Plasmid pBI-P5CS diperoleh dari cDNA P5CS
tanaman V. aconitifolia yang ditempatkan antara promoter (35S-P) CaMV 35s dan

14
daerah NOS-γ’. Hasil konstruksi dimasukkan ke dalam EcoRl pada vektor bagian
pBI121. Vektor tersebut juga mengandung NPTII dan uidA (GUS) daerah
penyandi yang digunakan untuk seleksi tanaman transgenik pada antibiotik
kanamisin. Peta restriksi konstruk rekombinan menunjukkan daerah label cDNA
P5CS yang ditandai dengan marka oleh ATG pada nukleotida yang ke-37 dan
TAA ke-2185 serta daerah lainnya (Kavi Kishor et al. 1995).

NPT II

GUS

Gambar 3 Peta Restriksi Konstruk Rekombinan pBI-P5CS (Kishor et al. 1995)

Plasmid pBI121 telah banyak digunakan untuk transformasi tanaman. Ukuran
lengkap sekuen plasmid pBI121 adalah 14758 bp dengan daerah T-DNA 6193 bp
yang mengandung batas kanan (right border, RB) gen NPTII sebagai penanda
seleksi dan gen GUS sebagai gen reporter di batas kiri (left border, LB) (Chen et
al. 2003).
Tahap awal penelitian ini adalah menguji keberadaan koleksi pBI-P5CS
BPBPI. Konstruk rekombinan pBI-P5CS koleksi diuji untuk mengetahui
keberadaan plasmidnya di E. coli atau A. tumefaciens. Pengujian keberadaan
plasmid dilakukan pada dua botol kultur dengan media LB sebagai media
pertumbuhan. Penambahan antibiotik rifampisin bertujuan untuk menyeleksi
pertumbuhan A. tumefaciens. Sedangkan antibiotik kanamisin merupakan
penyeleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS, yaitu pengujian keberadaan gen
NPTII (Kishor et al. 1995).
Botol pertama, media LB cair ditambahkan antibiotik rifampisin 50 ppm dan
kanamisin 50 ppm kemudian dikocok pada kecepatan 250 rpm dan suhu 28 oC
selama 2 hari tanpa cahaya. Media tersebut merupakan media seleksi untuk
pertumbuhan A. tumefaciens (Venkatachalam et al. 2000; Minarsih 2003; Heikal
et al. 2008). Sedangkan botol kedua, media LB cair ditambah antibiotik kanamisin
50 ppm dan diinkubasi pada suhu 37 oC hingga 18 jam sambil dikocok pada
kecepatan 250 rpm. Botol kedua merupakan media seleksi untuk pertumbuhan E.
coli (Chandrasekharaiah et al. 2004).
Pengamatan hari pertama belum menunjukkan perubahan warna campuran
pada kedua botol kultur. Suspensi biakan masih berwarna coklat tua. Hasil
inkubasi hari kedua juga tidak menunjukkan adanya perubahan warna campuran
pada botol pertama. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tidak tumbuh. Sedangkan
botol kedua terjadi perubahan warna campuran menjadi kuning keruh yang

15
menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Hasil inkubasi mengindikasikan
bahwa koleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS berada dalam E. coli (Gambar 4).

a

b

Gambar 4 Pertumbuhan bakteri di media seleksi
a. Suspensi biakan A. tumefaciens dan b. Suspensi biakan
E. coli

Konstruk rekombinan pBI-P5CS dalam E. coli kemudian diisolasi untuk
mendapatkan konstruk rekombinan pBI-P5CS yang akan ditransformasi ke A.
tumefaciens. Isolasi konstruk rekombinan pBI-P5CS dilakukan dengan
menggunakan GeneJETTM Plasmid miniprep kit (Fermantas life science kit).
Proses isolasi diawali dengan peremajaan koleksi konstruk rekombinan pBI-P5CS
dalam bakteri yang bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang masih muda dan
segar.
Pengujian kebenaran konstruk rekombinan pBI-P5CS hasil isolasi dianalisis
menggunakan PCR dengan primer spesifik P5CS dan elektroforesis gel agarosa
yang dibandingkan dengan kontrol positif. Program PCR yang digunakan telah
dioptimasi untuk mendapatkan suhu annealing yang optimum yaitu 58 oC. Primer
spesifik P5CS yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer yang dirancang
untuk mengidentifikasi adanya gen P5CS menggunakan BLASTN 2.1.3 atas dasar
daerah terkonservasi dan cDNA utuh gen P5CS V. aconitivolia (Gambar 5)
(Minarsih 2003).
Hasil analisis BLASTN 2.1.3 menunjukkan perbandingan homologi P5CS V.
aconitifolia dengan spesies lainnya. Gen P5CS telah dimiliki tanaman secara
alami, termasuk juga tebu. Transformasi eksplan tebu menggunakan gen P5CS
akan meningkatkan ketahanan tebu ketika mengalami cekaman kekeringan. Selain
itu, pada proses pengk