Peningkatan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase dengan site directed mutagenesis

PENINGKATAN TERMOSTABILITAS ENZIM ALKALIFILIK
XILANASE DENGAN SITE DIRECTED MUTAGENESIS

NADIA ADI PRATIWI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Peningkatan
Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase dengan Site Directed Mutagenesis
yang dilakukan di laboratorium Teknologi Bioindustri LAPTIAB-BPPT adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT).

Bogor, Mei 2013
Nadia AdiPratiwi
NIM G84080035

ABSTRAK
NADIA ADI PRATIWI. Peningkatan Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase
dengan Site Directed Mutagenesis. Dibimbing oleh POPI ASRI KURNIATIN dan
NIKNIK NURHAYATI.
Aplikasi xilanase di industri pulp dan kertas membutuhkan enzim yang
tahan terhadap kondisi pH dan suhu tinggi. Oleh karena itu, dibutuhkan xilanase
yang bersifat alkali-termostabil. Tujuan penelitian ini adalah memutasi gen
alkxynaq1cmu dengan metode Site Directed Mutagenesis (SDM) untuk
meningkatkan termostabilitas dari enzim alkalifilik xilanase. Plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan 5 pasang primer mutagenik, yaitu
Q53K, Q62L, E146V, T194I, dan S330I. Hasil restriksi, 2 dari 5 klon termutasi
(klon 2.2 dan M3) memiliki situs restriksi XbaI, menghasilkan 3 fragmen DNA.
Klon termutasi memiliki aktivitas xilanase yang bervariasi dari 22.7 U/ml hingga

49.3 U/ml. Hasil analisis urutan nukleotida (sequensing) dari 3 klon menunjukkan
2 klon (2.2 & 3.9) mengandung nukleotida single mutation dan satu klon (M3)
mengandung nukleotida double mutation. Klon 2.2 berhasil dimutasi dengan
primer Q62L mengubah asam amino glutamin menjadi lisin, klon 3.9 dapat
dimutasi dengan primer E146V mengubah asam amino asam glutamat menjadi
valin, dan klon M3 dapat dimutasi dengan primer E146V dan Q62L.
Kata kunci: double mutation, SDM, single mutation, termostabil, xilanase

ABSTRACT
NADIA ADI PRATIWI. Improving Thermostability Alkalifilik Xylanase Enzyme
by Site Directed Mutagenesis. Under the direction of POPI ASRI KURNIATIN
and NIKNIK NURHAYATI.
Application of xylanase in the pulp and paper industries required enzyme
that is resistant to alkaline and high temperatures conditions. A suitable enzyme
for that purpose is an alkalo-thermostable xylanase. The objective of this research
is mutated gene alkxynaq1cmu by Site Directed Mutagenesis (SDM) method to
increase thermostability of the xylanase. pGEMalkxynaq1cmu recombinant
plasmids were mutated separately using 5 pairs of mutagenic primers, namely
Q53K, Q62L, E146V, T194I, and S330I. Restriction result, 2 out of 5 mutated
clones (2.2 and M3) has a XbaI restriction site that produce 3 DNA fragments.

Mutan clones have xylanase activity that were varied from 22.7 U/ml to 49.3
U/ml. The results of sequencing from 3 clones showed 2 clones (2.2 & 3.9)
contain a single nucleotide mutation and one clone (M3) contains a double
nucleotides mutation. Clones 2.2 has successfully exchanged by Q62L primer that
changed the amino acid glutamine to lysine, 3.9 clone has successfully exchanged
by E146V primer, amino acid glutamic acid to valine, and M3 has successfully
exchanged by E146V and Q62L primers.
Keywords: double mutation, SDM, single mutation, thermostable, xylanase

PENINGKATAN TERMOSTABILITAS ENZIM ALKALIFILIK
XILANASE DENGAN SITE DIRECTED MUTAGENESIS

NADIA ADI PRATIWI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul Skripsi : Peningkatan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase dengan site
directed mutagenesis
Nama
: Nadia Adi Pratiwi
NIM
: G84080035

Disetujui oleh

Popi Asri Kurniatin, SSi.Apt.,MSi
Pembimbing I

Dr Niknik Nurhayati
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, M.App. Sc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2012 adalah biologi molekuler,
dengan judul Peningkatan Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase dengan
Site-Directed Mutagenesis.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Popi Asri Kurniatin, M.Si.Apt
dan Ibu Dr. Niknik Nurhayati selaku pembimbing yang telah banyak member
bimbingan, ilmu, saran, dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah dengan baik. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada keluarga
tercinta, bapak Daryono RW, ibu Galuh K, dan saudaraku Hana NP yang telah
memberikan perhatian, dukungan, dan motivasi. Selain itu, ucapan terima kasih
penulis sampaikan kepada staf, peneliti, dan teman-teman di laboratorium

bioindustri BPPT yang telah banyak membantu dan mengajarkan selama
menjalani penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada temanteman biokimia 45 yang telah banyak member perhatian dan motivasi.
Akhir kata, semoga Allah SWT membalas setiap kebaikan dengan
kebaikan yang jauh lebih besar kepada semua pihak yang telah membantu penulis
dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis menyadari karya ilmiah ini masih
jauh dari sempurna, namun penulis berharap semoga karya tulis ini dapat
memberikan manfaat bagi yang membutuhkan.

Bogor, Mei 2013

Nadia Adi Pratiwi

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Bahan

2

Alat

2

Metode Penelitian

3

HASIL

6

Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmuI

6

Mutasi Kedua Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmuI

7

Analisis Hasil Urutan nukleotida (sequencing)

9

Analisis Termostabilitas Enzim Xilanase

9

PEMBAHASAN

10

SIMPULAN DAN SARAN

12

Simpulan

12

Saran

13

DAFTAR PUSTAKA

13

LAMPIRAN

15

RIWAYAT HIDUP

26

DAFTAR GAMBAR

1 Hasil amplifikasi SDM PCR pGEMalkxynaq1cmu dengan primer Q53,
Q62L, E146V, T194I, & S330I
2 Analisis hasil restriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu
3 Hasil uji aktivitas enzim xilanase
4 Analisis hasil restriksi
5 Hasil uji aktivitas enzim xilanase dari mutasi kedua
6 Hasil uji termostabilitas enzim xilanase

6

7
7
8
8
9

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5
6
7
8

Strategi penelitian
Site-directed mutagenesis plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan 1
Site-directed mutagenesis plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan 2
Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon 2.2)
Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon 3.9)
Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon M3)
Alignment mutasi gen alkxynaq1cmu klon 2.2 & M3
Alignment mutasi gen alkxynaq1cmu klon 3.9 & M3

15
16
17
18
20
22
24
25

1

PENDAHULUAN
Teknologi industri pulp dan kertas terus mengalami perkembangan terutama
teknologi yang berwawasan lingkungan.Usaha yang saat ini dilakukan adalah
mengurangi limbah yang dihasilkan. Pemakaian bahan kimia dalam industri pulp
dan kertas tidak dapat dihindari, mengingat kelangsungan proses yang harus
terjaga dengan baik. Proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas saat ini
telah dikembangkan. Perkembangan bioteknologi ini ditunjukkan dengan
penggunaan enzim dalam prosesnya. Enzim dapat digunakan pada beberapa
proses pembuatan pulp dan kertas, seperti pada pemasakan, reduksi pitch, dan
pemutihan (Haroen dan Artiningsih 2004). Pemakaian enzim memiliki banyak
keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan bahan kimia, dan
meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. Namun, apabila dibandingkan dengan
proses kimia atau mekanis, aplikasi penggunaan enzim pada industri pulp dan
kertas masih menghadapi beberapa kendala, yakni ketersediaan enzim yang masih
diimpor, penanganan dan penyimpanan enzim, dan lamanya waktu yang
digunakan untuk membuat pulp dan kertas. Hal ini mengakibatkan aplikasi enzim
dalam industri jarang digunakan.
Penggunaan enzim atau bahan kimia dalam teknologi pulp dan kertas,
sebagian besar diaplikasikan pada proses pemutihan. Hal ini disebabkan pada
pemutihan dibutuhkan zat yang dapat menghidrolisis lignin sehingga
menghasilkan pulp yang memiliki derajat putih yang tinggi. Pemutihan pulp tidak
hanya menghasilkan pulp yang lebih putih, tetapi juga membuat lebih stabil
sehingga tidak menguning selama penyimpanan. Pemutihan harus menggunakan
bahan kimia yang bersifat reaktif untuk melarutkan sisa lignin agar diperoleh
derajat putih yang tinggi. Bahan kimia yang digunakan dalam pemutihan adalah
klor. Klor merupakan zat bersifat oksidator yang dapat mendegradasi dan
menghilangkan lignin dari gugus kromoform. Apabila dalam pemutihan
menggunakan klor, maka dari unit ini akan dihasilkan limbah cair yang
mengandung chlorinated organic compounds yang dilaporkan sangat berbahaya
terhadap lingkungan (Batubara 2006).
Penggunaan bahan kimia yang kurang efektif dan tidak ramah lingkungan,
membuat industri pulp dan kertas mencari alternatif lain yang dapat membantu
pembuatan kertas menjadi lebih efektif dan ramah lingkungan. Salah satunya
adalah menggunakan enzim xilanase. Enzim ini dilaporkan dapat membantu
pembuatan kertas yang lebih efektif serta ramah lingkungan. Sebagian besar
industri pulp dan kertas di negara maju telah menggunakan enzim dalam
pembuatan kertas, akan tetapi di Indonesia penggunaan enzim belum sepenuhnya
diterapkan di industri pulp dan kertas. Enzim ini terutama digunakan pada
pemutihan, karena pada proses ini dapat dihasilkan pulp yang memiliki derajat
putih yang tinggi dan stabil. Mekanisme enzim xilanase dalam proses pemutihan
terjadi melalui proses hidrolisis hemiselulosa. Proses hidrolisis ini dapat memecah
komponen hemiselulosa seperti asam metilglukoronat menjadi satuan-satuan asam
kromofor yang masih terikat pada rantai xilan. Xilanase juga dapat melarutkan
lignin dengan cara menghidrolisis xilan yang merupakan penyusun utama
hemiselulosa, serta membuka struktur pulp selulosa sehingga struktur lignin
terbuka dan lebih mudah larut (Polizeli et al. 2005). Kertas yang dihasilkan

2
2
menggunakan xilanase memiliki kualitas kecerahan yang lebih tinggi, lebih lentur,
dan permukaannya lebih halus (Rifaat et al. 2005).
Xilanase yang digunakan dalam industri pulp dan kertas, sebagian besar
prosesnya menggunakan xilanase yang bersifat termostabil dan tahan di pH basa
(alkali). Xilanase bersifat alkali bermanfaat karena dapat membantu mendegradasi
lignin melalui hidrolisis glukosa yang masih bersatu dengan pulp. Xilanase
termostabil bermanfaat karena dapat menurunkan beban pada enzim dan dapat
mengurangi kontaminasi dari mikroorganisme. Jumlah xilanase termostabil saat
ini masih terbatas, oleh karena itu perbaikan suhu pada xilanase untuk mencapai
suhu yang termostabil dilakukan menggunakan metode mutasi dengan pendekatan
rasional berdasarkan struktur tiga dimensi. Pendekatan ini kurang efektif
digunakan, oleh karena itu perbaikan suhu yang baik dilakukan adalah dengan
mutasi dengan pendekatan yang diarahkan (site-directed) (Zhang et al. 2010).
Penggunaan enzim dalam pembuatan pulp dan kertas merupakan alternatif
yang baik. Namun, enzim yang dihasilkan saat ini belum memiliki ketahanan yang
stabil pada suhu yang tinggi. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu metode untuk
meningkatkan termostabilitas enzim xilanase. Penelitian ini bertujuan memutasi
gen alkxyxaq1cmu dengan site-directed mutagenesis (SDM) untuk meningkatkan
termostabilitas dari enzim alkalifilik xilanase. Adapun hipotesis penelitian ini
adalah mutasi gen alkxynaq1cmu dengan metode site-directed mutagenesis dapat
meningkatkan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase. Penelitian ini diharapkan
dapat menghasilkan gen alkxynaq1cmu yang termutasi sehingga menghasilkan
enzim alkalifilik xilanase yang bersifat termostabil.

BAHAN DAN METODE
Alat
Peralatan yang digunakan adalah mikropipet, alat-alat gelas, jarum ose,
elektroforesis (Mupid-exu), Mini Spin (Eppendorf), thermal cycler PCR
(Eppendorf), sentrifus dingin (Sorvale Fresco), konsentrator (Eppendorf),
dokumentasi gel kodak, thermomixer(Eppendorf), shaker incubator (Kuhner),
water purification system (Millipore), electrophoresis documentation and analysis
system (EDAS 290 KODAK), laminar air flow class II BSC (ESCO), freezer 85°C (NUAIRE),microwave, autoklaf (IWAKI), alat pengaduk (vortex mixer),
spektrofotometer UV-Fis (Hitachi U-2001), pH meter digital (WTW series
inolab), neraca analitik (Radwag), dan inkubator (Memert).

Bahan
Bahan-bahan media yang digunakan yaitu media Luria bertani (LB), super
optimal broth (SOB), dan super optimal broth with catabolite repression (SOC).
Bahan yang digunakan untuk SDM yaitu dNTPs, Pfu DNA polymerase, 10x bufer
Pfu, enzim restriksi EcoRI, DpnI, dan XbaI, dan Escherichia coli DH5α. Adapun
bahan kimia yang digunakan yaitu isopropil β-D-1-thiogalaktopiranosit (IPTG), 5-

3

bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galaktopiranosil (X-Gal), ampisilin, bufer
natrium sitrat pH 6, bufer natrium phosphat pH 7 dan 8, bufer TrisCl pH 8 dan 9,
bufer glisin + NaOH pH 10, xilan Beechwood, plasmid klon 3
(pGEMalkxynaq1cmu), asam dinitro salisilat (DNS), ddH2O, etanol 70%, kit
untuk ekstraksi (Fermentas).

Metode Penelitian
Penelitian ini diawali dengan site directed mutagenesis (SDM) pertama pada
plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu yang telah diperoleh dari penelitian
sebelumnya. Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan
primer. Mutasi ini dilakukan menggunakan lima pasang primer. Setelah dimutasi,
untuk mengetahui ekspresi dari plasmid rekombinan, maka dilakukan uji aktivitas
pada enzim xilanase yang dihasilkan oleh plasmid rekombinan.Plasmid
rekombinan yang termutasi dari SDM pertama, kemudian dimutasi kembali (SDM
PCR 2). Plasmid rekombinan yang termutasi, kemudian di analisis urutan
nukleotida (sequencing) untuk memastikan terjadinya mutasi pada salah satu basa
yang diinginkan.
Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu 1
Site-Directed Mutagenesis (Zheng et al. 2004). Plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan metode SDM PCR. Komposisi
bahan yang digunakan yaitu 10x Pfu bufer 2.5 µl, 10 mM dNTP mix 0.75 µl, 3U/
µl Pfu DNA Polymerase (invitrogen) 0.5 µl, 1 µl primer forward, 1 µl primer
revers, 1-2.5 ng plasmid pGEMalkxynaq1cmu 3 µl, dan ddH2O 25 µl dimasukkan
dalam tabung mikro PCR. Mutasi dilakukan dengan program denaturasi (hot
start) 95°C selama 2 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik, annealing (sesuai
dengan masing-masing time melting primer) selama 30 detik, dan elongasi 72°C
selama 10 menit. Suhu annealing masing-masing primer berbeda yakni Q53K =
64.6 °C, Q62L = 64.7°C, E146V = 68.9°C, T194I = 64.6°C, dan S330I = 58.5°C.
Proses mutasi berlangsung selama 20 siklus, setelah itu elongasi terakhir pada
suhu 72°C selama 5 menit.Produk PCR kemudian direstriksi dengan enzim
restriksi DpnI.
Digesti Produk PCR dengan Enzim Restriksi DpnI (Zheng et al. 2004).
Produk hasil mutasi dengan PCR, kemudian direstriksi dengan enzim DpnI.
Sebanyak 17 µl produk PCR, 1 µl enzim restriksi DpnI 20 U/ µl, dan 2 µl bufer 4.
Setelah itu, diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam, kemudian diinkubasi
pada suhu 65°C selama 10 menit.
Pembuatan Sel Kompeten (Inoue et al. 1990). Hasil potongan produk PCR
dengan enzim restriksi DpnI, selanjutnya ditransformasi. Sebelum dilakukan
transformasi, E.coli DH5α harus dipersiapkan menjadi sel kompeten agar
memiliki efisiensi yang tinggi dalam menerima DNA dari luar pada proses
transformasi. Kultur E.coli DH5α dari stok di gores pada media LB agar,
kemudian diinkubasi ± 16 jam pada suhu 37°C. Koloni tunggal DH5α dari cawan
diinokulasi ke media SOB 50 ml lalu diinkubasi pada 150 rpm, 30°C hingga nilai
OD600 = 0.4-0.8. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam es hingga dingin dan
disentrifugasi pada 1006 g selama 15 menit dengan suhu 4°C. Supernatan dibuang

4

4

secara aseptis, sedangkan pelet diresuspensi dengan menambahkan TB bufer
dingin sebanyak 16.5 ml, kemudian diinkubasi di es selama 10 menit. Setelah itu,
disentrifugasi pada 1006 g selama 15 menit dengan suhu 4°C. Supernatan dibuang
secara aseptis dan pelet diresuspensi dengan menambahkan TB bufer dingin
sebanyak 4 ml, kemudian diinkubasi di es selama 10 menit. Setelah itu,
ditambahkan dimetil sulfoksida (DMSO) 0.3 ml lalu diinkubasi dalam es selama
10 menit. Hasil inkubasi dipindahkan ke dalam tabung mikro masing-masing 0.2
ml, kemudian simpan pada suhu -80°C.
Transformasi Hasil Digesti dengan DpnI ke E.coli DH5α (Zheng et al.
2004). Sel kompeten yang telah dibekukan lebih kurang 1 jam, dicairkan dalam
es. Sebanyak 8 µl hasil digesti dimasukkan ke dalam sel kompeten, kemudian
diinkubasi dalam es selama 30 menit. Inkubasi pada suhu 42°C selama 1 menit
dan diinkubasi kembali dalam es selama 2 menit.Setelah itu ditambahkan medium
SOC sebanyak 800 µl dan inkubasi dalam shaker inkubator pada 150 rpm dengan
suhu 37°C selama 1 jam. Setelah satu jam, sel disentrifugasi pada 4025 g selama 5
menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang sebanyak 800 µl, dan sisanya
diresuspensi dengan pelet dan disebar merata pada medium LB agar yang
mengandung antibiotik ampisilin 100 µg/ml, kemudian diinkubasi semalaman
pada suhu 37°C. Koloni yang diduga positif (koloni putih) diambil dan dikultur
dalam medium LB-ampisilin cair untuk selanjutnya diekstrak plasmidnya dan uji
aktivitas xilanase.
Isolasi Enzim Xilanase dari Sel E.coli DH5α (Huang et al. 2006). Koloni
tunggal E.coli DH5α rekombinan yang ditumbuhkan lebih kurang 18 jam
(overnight) dalam media LB-ampisilin 5 ml sebagai starter, diinokulasikan ke
dalam 50 ml media LB-ampisilin dan ditumbuhkan selama lebih kurang 18 jam
(overnight) pada suhu 37°, 150 rpm. Kultur tersebut disentrifugasi selama 15
menit pada 4025 g 4°C. Bagian supernatan dibuang dan pada bagian pelet
ditambahkan bufer natrium phosphat 20mM, pH 7 yang mengandung merkapto 1
mM sebanyak 5 ml. Pelet diresuspensi dengan vortex, kemudian disonikasi
dengan sonikator selama 5 menit 20 detik (on-off). Sonikasi dilakukan dalam
keadaan dingin dan hasil sonikasi disentrifugasi pada 4025 g 4°C, selama 10
menit. Supernatan diambil dan dilakukan uji aktivitas.
Uji Aktivitas Xilanase secara Kuantitatif (Bailey 1992). Sebanyak 400 µl
bufer natrium phosphat 50 mM pH 7 dimasukkan ke dalam masing-masing tabung
mikro, kemudian masukkan 50 µl substrat beech wood xylan 10%. Setelah itu,
diinkubasi pada suhu 50°C selama 1 menit. Masing-masing tabung mikro
dimasukkan 50 µl enzim kasar, kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama 5
menit. Setelah itu, dimasukkan 750 µl asam dinitro salisilat (DNS), kemudian
disentrifugasi pada 4025 g selama 5 menit. Setelah itu, dipanaskan pada suhu
100°C selama 5 menit dan didinginkan. Sampel diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 540 nm. Blanko dibuat dengan mencampurkan 400 µl buffer
Tris-Cl 50 mM pH 8 dengan 50µl substrat beech wood xylan 10%, kemudian
dipanaskan pada suhu 50°C selama 1 menit. Setelah itu, diinkubasi pada suhu
50°C selama 5 menit, kemudian ditambahkan dengan 750 µl DNS dan 50 µl
enzim kasar. Setelah itu, disentrifugasi pada 4025 g selama 5 menit dan
dipanaskan pada suhu 100°C selama 5 menit dan didinginkan pada suhu ruang.
Nilai absorbansi blanko diukur pada panjang gelombang 540 nm.

5

Restriksi Mutan Plasmid Rekombinan pGEMakxynaq1cmu (New
England Biolabs 2005). Plasmid yang telah diekstrak, selanjutnya dipotong
dengan enzim restriksi. Sebanyak 3 µl plasmid alkxynaq1cmu rekombinan, 0.1 µl
enzim restriksi EcoRI, 0.5 µl 10x bufer EcoRI, dan ddH2O dimasukkan dalam
tabung mikro kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah 30
menit, plasmid yang telah terpotong oleh enzim EcoRI, dipotong kembali
menggunakan enzim restriksi XbaI. Sebanyak 0.1 µl enzim restriksi XbaI, 0.7 µl
10x bufer 2 NEB, dan 1.2 µl ddH2O dimasukkan dalam tabung mikro kemudian
inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah 30 menit, plasmid yang telah
terpotong dilihat menggunakan elektroforesis gel agarose.
Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu 2 (Zheng et al. 2004)
Plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan yang telah dimutasi, kemudian
dimutasi kembali menggunakan metode SDM PCR. Komposisi bahan yang
digunakan yaitu 10x Pfu bufer 2.5 µl, 10 mM dNTP mix 0.75 µl, 3U/µl Pfu DNA
Polymerase (invitrogen) 0.5 µl, 1 µl primer forward, 1 µl primer revers, 1-2.5 ng
plasmid pGEMalkxynaq1cmu 3 µl, dan ddH2O 25 µl dimasukkan dalam tabung
mikro PCR. Mutasi dilakukan menggunakan program denaturasi (hot start) 95°C
selama 2 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik, annealing (sesuai dengan
masing-masing time melting primer) selama 30 detik, dan elongasi 72°C selama
10 menit. Suhu annealing setiap primer berbeda yakni Q53K = 64.6 °C, Q62L =
64.7°C, E146V = 68.9°C, T194I = 64.6°C, dan S330I = 58.5°C. Proses mutasi
berlangsung selama 20 siklus, elongasi terakhir pada suhu 72°C selama 5 menit.
Produk PCR direstriksi dengan enzim restriksi DpnI dan ditransformasi ke dalam
sel kompeten E.coli DH5α. Koloni putih yang tumbuh, kemudian diekstraksi dan
diisolasi untuk uji aktivitas enzim xilanase. Plasmid rekombinan yang telah
diekstraksi, kemudian di restriksi dengan enzim restriksi EcoRI dan XbaI.
Analisis Urutan Nukleotida (sequencing)
Plasmid yang membawa gen alkxynaq1cmu yangtermutasi, kemudian
dianalisis urutan nukleotidanya untuk mengetahui basa yang terdapat pada gen
tersebut telah termutasi. Sebelum itu, plasmid yang akan dianalisis urutan
nukleotida harus dipurifikasi. Sebanyak 30 µl polietilen glikol (PEG) 20% 2.5 M
NaCl ditambahkan dalam larutan plasmid, kemudian dikocok secara perlahan dan
diinkubasi dalam es selama satu jam, kemudian disentrifugasi pada 18894 g 4°C
selama 5 menit. Bagian supernatan dibuang dan bagian pelet dikeringkan
menggunakan konsentrator.Pelet yang telah kering dilarutkan dalam 20 µl Tris-Cl
10 mM pH 8. Plasmid yang telah dipurifikasi, kemudian dilakukan analisis urutan
nukleotida (sequencing) melalui Genetika Science. Analisis data urutan nukelotida
dilakukan menggunakan software BLAST, Bioedit, dan Genetic.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji aktivitas xilanaseberupa absorban, nilai ini
dimasukkan ke dalam kurva standar xilosa. Nilai yang diperoleh dimasukkan
dalam rumus aktivitas xilanase (Bailey et al. 1992):
Aktivitas enzim (U/ml) = konsentrasi enzim × 1000 × faktor pengenceran
Bobot molekul xilosa × Volume enzim × waktu reaksi

6

6

Hasil analisis urutan nukleotida dari Genetica Science, dianalisis kembali
menggunakan software BLAST, Bioedit, dan Genetic. Analisis menggunakan
software tersebut dapat menunjukkan urutan nukleotida yang termutasi.

HASIL
Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu
Site Directed Mutagenesis
Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu yang diperoleh dari penelitian
sebelumnya, kemudian dimutasi. Mutasi dilakukan menggunakan lima pasang
primer mutagenik yang dibantu dengan PCR. Hasil amplifikasi menunjukkan
plasmid rekombinan yang termutasi memiliki ukuran 4300 pb (Gambar 1).
1

2

3

4

5

M

10000 pb
5000 pb

4000 pb
1000 pb
500 pb

Gambar 1 Hasil amplifikasi SDM PCR pGEMalkxynaq1cmu dengan primer
Q53K (1), Q62L (2), E146V (3), T194I (4), & S330I (5)
Seleksi Mutan Plasmid Rekombinan
Plasmid rekombinan yang termutasi diseleksi untuk kemudian dimutasi
kembali. Pemilihan plasmid rekombinan diawali dari hasil ekstraksi plasmid.
Hasil ekstraksi plasmid ditunjukkan dengan adanya pita pada gel agarose pada
posisi 4300 pb (Gambar 2). Setelah itu, plasmid rekombinan diseleksi
menggunakan enzim restriksi XbaI. Hasil restriksi menunjukkan terdapat satu
klon (2.2) yang dapat terpotong oleh enzim tersebut pada posisi 300 pb (Gambar
3).
10000 bp

M

1.1 2.2 3.9

4.2

5.2

5000 bp
4000 bp
1000 bp
500 bp

Gambar 2 Hasil ekstraksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu, marker (M),
plasmid rekombinan mutasi 1 dengan primer Q53K (1.1), Q62L (2.2),
E146V (3.9), T194I (4.2), & S330I (5.2)

7

WT2.22 33.9 4.2 5.2 1.1 M
20000 pb
3000 pb
1500 pb

1000 pb
300 pb

Gambar 3 Analisis hasill rrestriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1c
1cmu
mutasi 1 de
dengan enzim restriksi E.coRI dan XbaI,
Xb
pGEMalkxynaq1
q1cmu (WT), klon termutasi dengan primer Q53K
Q5
(1.1), Q62L (2.2)
.2), E146V (3.9), T194I (4.2), & S330I (5.2)

Aktivitas xilanase (U/ml)

Analisis Ekspresi Plasmid
d Re
Rekombinan Termutasi
Klon termutasi (1.1,, 2.
2.2, 3.9, 4.2, dan 5.2) diuji ekspresi proteinnya yaitu
ya
dengan pengujian aktivitas en
enzim xilanase. Pengujian aktivitas ini dilakukan pada
pa
suhu 50°C dan pH 7. Nilai
ai aktivitas masing-masing klon berbeda (Gambar
ar 4),
klon yang memiliki nilai akti
ktivitas terbesar adalah klon 3.9 (mutasi dengan prim
rimer
E146V) yakni sebesar 49.2
.2963 U/ml dan klon yang memiliki nilai aktivi
tivitas
terkecil adalah klon 5.2 (mut
utasi dengan primer S330I) memiliki aktivitas sebe
besar
22.7218 U/ml.
49.2963

50
40
30

32.4236

32.283

27.2212
12

22.7218

20
10
0
1.1

2.2

3.9

4.2

5.1

klon

Gambar 4 Hasil uji akti
ktivitas enzim xilanase pada suhu 50°C dan pH 7

Mutasi Kedua Pla
Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu
Site Directed Mutagenesiss
Klon 3.9 yang mem
emiliki nilai aktivitas tertinggi, dimutasi kemb
mbali
menggunakan primer Q62L.
2L. Klon 3.9 yang telah dimutasi, diberi nama kklon
mutan (M). Klon ini dia
dianalisis menggunakan enzim restriksi XbaI dan
d
menghasilkan pita pada posis
sisi 300 pb (Gambar 5).

8

8

M1 M2 M3 M4 M5 M

20000 pb
3000 pb
1500 pb
1000 pb
400 pb
300 pb

Gambar 5 Analisis hasil restriksi
si dengan enzim restriksi E.coRI dan XbaI pada
plasmid rekombinan pG
pGEMalkxynaq1cmu mutasi 2, marker (M), dan
sampel mutan 2 dengan
an primer Q62L (M1-M5)
Analisis Ekspresi Plasmid Rekomb
ombinan Termutasi
Klon yang asam aminonyaa ttelah termutasi di dua lokasi (mutasi ganda),
kemudian dilakukan analisis eksp
kspresi protein. Analisis ini dilakukan dengan
pemgujian aktivitas enzim. Pengu
gujian aktivitas juga dilakukan pada suhu 50°C
itas pada klon mutasi ganda, menghasilkan nilai
dan pH 7. Hasil pengujian aktivita
ing-masing klon, yaitu klon mutan urutan 1 (klon
aktivitas yang berbeda pada masing
U/ml, mutan urutan 2 (klon M2) sebesar 7.5365
M1) memiliki aktivitas 3.7401 U/m
memiliki aktivitas sebesar 32.4236 U/ml, mutan
U/ml, mutan urutan 3 (klon M3)) m
ivitas 8.2395 U/ml, dan mutan urutan 5 (klon M5)
urutan 4 (klon M4) memiliki aktivit
3656 U/ml (Gambar 6). Hasil tersebut juga
memiliki aktivitas sebesar 0.365
nilai aktivitas xilanase tertinggi.
menunjukkan klon M3 memiliki nil
32.4236

Aktivitas xilanase (U/ml)

35
30
25
20
15

5

8.2395

77.5365

10
3.7401

0.3656

0
M1

M2

M3
klon

M4

M5

zim xilanase dari mutasi kedua pada suhu 50°C
Gambar 6 Hasil uji aktivitas enzim
dan pH 7

9

Analisis Has
asil Urutan Nukleotida (Sequencing)
Plasmid rekombinan ya
yang dianalisis urutan nukleotida adalah plasmid klon
k
2.2, 3.9, dan M3. Berdasark
arkan hasil analisis urutan nukleotida, klon 2.2 yang
ya
dimutasi dengan primer Q62
Q62L mengalami mutasi pada urutan asam aminoo 62
in dengan kodon CAA termutasi menjadi asam ami
mino
yaitu asam amino glutamin
A. Klon 3.9 yang dimutasi dengan primer E14
E146V
leusin dengan kodon CTA.
utan asam amino 146 yaitu asam amino asam glutam
tamat
mengalami mutasi pada uruta
tasi menjadi valin dengan kodon GTG. Klon M3 pa
pada
dengan kodon GAG termutas
kan primer E146V dan mengalami mutasi pada uru
rutan
mutasi pertama menggunakan
m amino asam glutamat dengan kodon GAG termut
utasi
asam amino 146 yaitu asam
on GTG, kemudian klon ini dimutasi kembali deng
engan
menjadi valin dengan kodon
bah asam amino 62 yaitu asam amino glutamin deng
engan
primer Q62L yakni menguba
jadi asam amino leusin dengan kodon CTA (Lampi
piran
kodon CAA termutasi menjad
7 dan 8).

isis Termostabilitas Enzim Xilanase
Analisis
alisis urutan nukleotida (sequencing) dan sudah terbu
rbukti
Klon yang telah dianalis
ukan analisis termostabilitas.Hal ini dilakukan unt
untuk
termutasi, kemudian dilakuk
o
n oleh
mengetahui kestabilan klon yyang termutasi dan nilai aktivitas yang dihasilkan
isi suhu dan pH yang berbeda. Klon yang dianali
alisis
masing-masing pada kondisi
miliki
termostabilitas adalah klon 22.2, 3.9, dan M3.Klon 2.2 (mutasi tunggal) memil
miliki
nilai aktivitas tertinggi padaa ssuhu 50°C pH 7, klon 3.9 (mutasi tunggal) memil
anda)
nilai aktivitas tertinggi padaa ssuhu 50°C pH 7, sedangkan klon M3 (mutasi gan
pada suhu 75°C pH 10 (Gambar 7).
memiliki aktivitas tertinggii pa
49.30

Aktivitas xilanase U/ml

50.00

45.18
38.30

38.27

40.00
32.42

32.42

30.00

25.03
20.444

19.80
14.56
14.18

20.00
10.00

6.57

0.00
2.2

3.9
Klon

Series1
50° C pH 7

Series2

60
60°C pH 10

Series3

M3

Series4

70°C pH 10 75°C pH 10

ostabilitas pada klon mutasi tunggal (2.2 & 3.9)) dan
d
Gambar 7 Hasil uji termost
M3)
mutasi ganda (M3

10

10

PEMBAHASAN
Mutasi ini dilakukan menggunakan primer yang mengandung satu
nukleotida missed match pada titik-titik yang telah ditentukan. Masing-masing
missed match tersebut dapat mengubah satu asam amino menjadi asam amino
lain. Letak penggantian asam amino ditentukan berdasarkan posisi dari α-heliks.
Hal ini disebabkan protein termofilik menunjukkan peningkatan hidrofobisitas di
daerah α-heliks. Peningkatan hidrofobisitas juga ditemukan dalam residu, dengan
demikian peningkatan hidrofobisitas dengan cara subtitusi asam amino menjadi
kekuatan pendorong utama dalam mencapai termostabilitas (Joo et al. 2011; Xu et
al. 2009; Wang et al. 2010).
Mutasi ini dilakukan menggunakan lima primer, primer yang pertama yaitu
Q53K (forward) 5’-GCCTTTTGCATGGAAAGTTGCTTCTCT-3’ dan Q53K
(revers)
5’-AGAGAAGCAACTTTCCATGCAAAAGGC-3’.
Primer
ini
memutasi gen alkxynaq1cmu pada urutan asam amino 53 yaitu glutamin yang
diubah menjadi lisin. Glutamin termasuk asam amino yang bersifat polar. Asam
amino tersebut diubah menjadi lisin yang bersifat polar. Primer kedua adalah
Q62L (forward) 5’-CTTTCTGAGCGATATCTAGAGCAGTTTGATATT-3’ dan
Q62L (revers) 5’-AATATCAAACTGCTCTAGATATCGCTCAGAAAG-3’.
Primer ini mengubah asam amino glutamin menjadi leusin pada urutan asam
amino 62. Primer ketiga yaitu E146V (forward) 5’-GCCAAGAGAAGGTGTGT
GGAACTGGAAAG-3’ dan E146V (revers) 5’-CTTTCCAGTTCCACACACCT
TCTCTTGGC-3’, primer ini mengubah asam amino pada urutan 146 yakni asam
glutamat yang bersifat polar menjadi valin yang bersifat non-polar. Primer
keempat yang digunakan adalah T194I (forward) 5’-GATGGTGGATGAAATAG
ACCCAGATAAAC-3’ dan T194I (revers) 5’-GTTTATCTGGGTCTATTTCAT
CCACCATC-3’, primer ini mengubah asam amino pada urutan 194 yakni treonin
yang bersifat polar menjadi isoleusin yang bersifat non-polar. Primer kelima yaitu
S330I (forward) 5’-GAAAAGTTTACGATTTTAGGATTAGAC-3’ dan S330I
(revers) 5’-GTCTAATCCTAAAATCGTAAACTTTTC-3’, primer ini mengubah
asam amino serin yang bersifat polar menjadi isoleusin yang bersifat non-polar
(Genetika Science).
Amplifikasi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu menggunakan
pasangan primer mutagenik, menghasilkan DNA dengan ukuran yang sesuai
dengan harapan yaitu sekitar 4300 pb. Ukuran plasmid sebelum dimutasi dan
sesudah dimutasi sama, yakni 4300 pb. Hal ini disebabkan mutasi yang dilakukan
adalah subtitusi.
Plasmid rekombinan yang telah termutasi, kemudian diekstraksi dan
menunjukkan ukuran plasmid pada 4300 pb. Plasmid rekombinan yang telah
diperoleh dari hasil ekstraksi, kemudian dipotong dengan enzim restriksi untuk
mengidentifikasi keberadaan situs restriksi yang timbul akibat mutasi. Situs
restriksi yang muncul akibat mutasi, hanya terdapat pada plasmid yang dimutasi
dengan primer Q62L. Primer ini menghasilkan situs enzim restriksi XbaI pada
plasmid yang dimutasi. Analisis enzim restriksi dilakukan menggunakan dua
enzim restriksi yaitu EcoRI dan XbaI. Enzim EcoRI digunakan untuk memotong
gen alkxynaq1cmu berukuran sekitar 1300 pb yang disisipkan ke dalam plasmid
pGEM-T yang berukuran 3000 pb. Sementara itu, enzim XbaI digunakan untuk

11

memotong gen alkxynaq1cmu pada posisi nukleotida 300 pb yang merupakan
hasil mutasi oleh primer Q62L. Hasil analisis restriksi pada Gambar 3
menunjukkan hanya satu klon, yakni klon 2.2 yang memiliki 3 fragmen DNA
berukuran 3000, 1000, dan 300 pb, sementara klon lainnya hanya terdiri dari dua
fragmen. Hasil tersebut menunjukkan bahwa klon 2.2 yang dimutasi dengan
primer Q62L memiliki situs enzim restriksi XbaI, sedangkan keempat primer lain
tidak memiliki situs enzim restriksi XbaI sehingga hanya dihasilkan 2 fragmen.
Hal ini disebabkan keempat primer tidak memiliki situs enzim restriksi XbaI.
Koloni putih yang tumbuh pada media LB-ampisilin tidak hanya diekstraksi
plasmidnya, tetapi juga diuji ekspresi proteinnya melalui pengujian aktivitas
enzim xilanase. Pengujian aktivitas ini dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Hal
ini dikarenakan enzim xilanase yang dapat bekerja pada suhu yang tinggi dan pH
alkali. Besarnya aktivitas enzim xilanase pada masing-masing klon berbeda. Nilai
aktivitas tertinggi dari klon mutasi tunggal, digunakan untuk memilih klon yang
akan dimutasi kembali. Klon yang dipilih untuk dimutasi kembali adalah klon 3.9,
dengan nilai aktivitas 49.2963 U/ml.
Klon 3.9 yang telah termutasi, dimutasi kembali menggunakan primer
Q62L. Primer ini mengubah asam amino pada urutan 62 yaitu glutamin menjadi
leusin (Sadeghi et al. 2006). Produk PCR yang berupa plasmid rekombinan
(mutan 2), direstriksi dengan enzim restriksi EcoRI dan XbaI, kemudian
dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarose. Hasil tersebut menunjukkan
terdapat dua pita, pita pertama pada posisi 300 pb merupakan insert (mutan 2) dan
posisi 1000 pb merupakan gen alkxynaq1cmu. Hal ini menunjukkan bahwa
plasmid rekombinan mutasi ganda(klon M1, M2, M3, M4, dan M5) memiliki situs
enzim restriksi XbaI.
Analisis ekspresi pada klon mutasi ganda, dilakukan dengan uji aktivitas.
Pengujian aktivitas ini dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Hasil pengujian
aktivitas pada klon mutasi ganda, menghasilkan nilai aktivitas yang berbeda pada
masing-masing klon. Berdasarkan hasil tersebut, dapat terlihat bahwa klon M3
memiliki nilai aktivitas paling tinggi dari pada klon lainnya. Faktor penyebab
perbedaan aktivitas pada klon ini, belum diketahui dan diperoleh secara jelas
dalam penelitian ini. Klon M3 yang memiliki nilai aktivitas paling tinggi, juga
dipilih untuk selanjutnya dianaliasis urutan nukleotida (sequencing).
Hasil
restriksi
menunjukkan
bahwa
plasmid
rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu yang dimutasi dengan satu pasang primer dan dua pasang
primer menunjukkan hasil yang positif. Hal ini tidak cukup membuktikan bahwa
gen alkxynaq1cmu telah termutasi. Oleh karena itu dilakukan analisis urutan
nukleotida (sequencing) untuk mengetahui mutasi yang mengubah satu asam
amino menjadi asam amino lain. Plasmid rekombinan yang dianalisis urutan
nukleotida adalah plasmid klon 2.2, 3.9, dan M3. Hal ini dikarenakan klon 2.2
merupakan klon yang dimutasi dengan primer 2 (Q62L) dan primer ini digunakan
pula untuk mutasi kedua pada klon M3.Klon 3.9 merupakan templat yang
digunakan untuk mutasi kedua, sedangkan pada klon M3 dilakukan sekuensing
untuk melihat terjadi atau tidaknya mutasi kedua oleh primer Q62L. Berdasarkan
hasil sekuensing, klon 2.2 yang dimutasi dengan primer Q62L mengalami mutasi
pada urutan asam amino 62 yaitu asam amino glutamin dengan kodon CAA
termutasi menjadi asam amino leusin dengan kodon CTA. Klon 3.9 yang dimutasi
dengan primer E146V mengalami mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam

12

12

amino asam glutamat dengan kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon
GTG. Klon M3 pada mutasi pertama menggunakan primer E146V dan mengalami
mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam amino asam glutamat dengan
kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon GTG, kemudian klon ini
dimutasi kembali dengan primer Q62L yakni mengubah asam amino 62 yaitu
asam amino glutamin dengan kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusin
dengan kodon CTA (Lampiran 7 dan 8). Hasil analisis urutan nukleotida ini
menunjukkan bahwa gen alkxynaq1cmu dapat termutasi sesuai dengan primer
yang telah didesain dengan metode site-directed mutagenesis.
Klon 2.2, 3.9, dan M3 yang telah terbukti termutasi, dianalisis kembali
dengan pengujian termostabilitas. Pengujian ini dilakukan pada suhu yang lebih
tinggi dari suhu pengujian aktivitas sebelumnya.Hal ini dilakukan untuk
mengetahui kemampuan kerja enzim xilanase pada suhu dan pH tinggi. Hasilnya
menunjukkan bahwa klon 2.2 (mutasi tunggal) memiliki aktivitas tertinggi pada
suhu 50°C pH 7, sedangkan pada suhu 60°C, 70°C, dan 75°C pH 10 memiliki
nilai aktivitas yang rendah. Hal ini juga terjadi pada klon 3.9 yang memiliki
aktivitas tertinggi pada 50°C pH 7, sedangkan pada kondisi yang lebih tinggi nilai
aktivitasnya rendah. Klon M3 (mutasi ganda) berbeda dengan klon sebelumnya,
klon ini memiliki nilai aktivitas tertinggi pada 75°C pH 10 dan pada suhu dan pH
yang rendah klon ini memiliki nilai aktivitas yang rendah. Besar kecilnya nilai
aktivitas dipengaruhi oleh penggantian asam amino yang terjadi pada mutasi (Liu
et al. 2002; Nath et al. 2001). Ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi
elektrostatik merupakan faktor struktural yang dapat meningkatkan termostabilitas
(Vieira and Degreve 2009; Kim et al. 2010). Interaksi hidrofobik terjadi pada
asam amino yang bersifat non-polar, karena asam amino ini memiliki residu
(Mamo et al. 2009; Liu et al. 2012). Residu-residu ini yang akan saling
berinteraksi antar molekul hidrofobik sehingga dapat meningkatkan
termostabilitas enzim (Kim et al. 2012; Joo et al. 2010). Selain itu, letak asam
amino yang dapat meningkatkan termostabilitas terletak pada α-heliks protein,
karena pada posisi tersebut terdapat sisi katalitik enzim xilanase (Fenel et al.
2006; Balaa et al. 2009; Xu et al. 2009). Semakin banyak asam amino yang
termutasi pada posisi yang tersebut, maka semakin bersifat termostabil (Fenel et
al. 2006; Sriprang et al. 2006). Selain itu, faktor internal jembatan sulfida yang
terbentuk karena adanya mutasi, dilaporkan dapat meningkatkan termostabilitas
enzim (Jeong et al. 2007). Klon yang termutasi pada penelitian ini belum
seluruhnya dapat meningkatkan termostabilitas, akan tetapi aktivitas xilanase
terbukti dapat ditingkatkan pada klon yang termutasi ganda.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen alkxynaq1cmu telah berhasil termutasi menggunakan metode sitedirected mutagenesis PCR. Proses mutasi yang dilakukan menggunakan primer
yang mengandung satu nukleotida missed match pada salah satu asam aminonya,
telah berhasil mengganti asam amino yang bersifat polar menjadi nonpolar. Klon

13

yang telah termutasi yaitu klon 2.2 dengan pengubahan asam amino glutamin
menjadi leusin dan memiliki aktivitas tertinggi 32.42 U/ml pada 50°C pH 7, klon
3.9 dengan pengubahan asam amino asam glutamat menjadi valin dengan nilai
aktivitas tertinggi 49.30 U/ml pada 50°C pH 7, dan klon M3 dengan pengubahan
dua asam amino yaitu glutamin menjadi leusin dan asam glutamat menjadi valin,
memiliki nilai aktivitas tertinggi 45.18 U/ml pada 75°C pH 10 .
Saran
Saran dari penulis adalah perlu dilakukan karakterisasi enzim xilanase dari
gen alkxynaq1cmu yang telah termutasi untuk melihat sifat termostabilitas.
Bentuk karakterisasi yang dapat dilakukan adalah dengan analisis profil pH dan
suhu, serta termostabilitas dari enzim xilanase mutan.

DAFTAR PUSTAKA
Bailey MJ, Biely P, Poutanen K. 1992. Interlaboratory testing of methods for
assay of xylanase activity. J Biotechnol. 23:257-270.
Balaa BA, Brijs K, Gebruers K, Vandenhaute J, Wouters J, Housen I. 2009.
Xylanase XYL1p from Soytalidium acidophilum: site directed mutagenesis and
acidophilic adaptation. Bioresource Technology. 100: 6465-6471.
Batubara R. 2006. Teknologi bleaching ramah lingkungan [tesis]. Medan:
Program Pascasarjana, Universitas Sumatera Utara.
Fenel F, Zitting AJ, Kantelinen A. 2006. Increased alkali stability in Trichoderma
reesei endo-1,4-β xylanase II by site directed mutagenesis. Journal of
Biotechnology. 121: 102-107.
Haroen WK, Artiningsih T. 2004. Penggunaan enzim polyporaceae pada
pemutihan pulp kraft Acacia mangium. Prosiding Seminar MIPA IV, ITB.
Bandung. hlm 347-351.
Huang J, Wang G, Xiao L. 2006. Cloning, sequencing, and expression of the
xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli.
Bioresource Technology. 97: 802-808.
Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990.High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene. 96: 23-28.
Jeong MY, Kim S, Yun CW, Choi YJ, Cho S. 2007.Engineering a de novo
internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from
Bacillus stearothermophilus No 236. Journal of Biotechnology. 127: 300-309.
Joo JC, Pohkrel S, Pack SP, Yoo YJ. 2010. Thermostabilization of Bacillus
circulans xylanase via computational design of a flexible surface cavity.
Journal of Biotechnology. 146: 31-39.
Joo JC, Pack SP, Kim YH, Yoo YJ. 2011. Thermostabilization of Bacillus
circulans xylanase: Computational optimization of unstable residues based on
thermal fluctuation analysis. Journal of Biotechnology. 151:56-65.
Kim DY, Han MK, Oh HW, Bae KS, Jeong TS, Kim SU, Shin DH, Kim IH, Rhee
YH, Son KH, Park HY. 2010. Novel intraselular GH10 xylanase from
Cohnella laeviribasi HY-21: Biocatalytic properties and alterations of substrate

14

14

specifities by site directed mutagenesis of Trp residues. Bioresource
Technology. 101: 8814-8821.
Kim T, Joo JC, Yoo YJ. 2012. Hydrophobic interaction network analysis for
thermostabilization of mesophilic xylanase. Journal of Biotechnology. 161: 4959.
Liu L, Zeng L, Wang S, Cheng J, Li X, Song A, Wu K, Chen H. 2012. Activity
and thermostability increasw of xylanase following transplantation with
modules sub-divided from hyper-thermophilic CBM9 1-2. Process
Biochemistry. 47: 853-857.
Liu X, Qu Y, You F, Liu Y. 2002.Studies on the key amino acid residues
responsible for the alkali-tolerance of the xylanase by site directed mutagenesis
or random. Journal of Molecular Catalysis Enzymatic. 18: 307-313.
Mamo G, Thunnissen M, Kaul RH, Mattiasson B. 2009. An alkaline active
xylanase: Insights into mechanisms of high pH catalytic adaptation. Biochimie.
91: 1187-1196.
Nath D, Rao M. 2001. pH dependent conformational and structural changes of
xylanase from an alkalophilic thermophilic Bacillus sp (NCIM 59). Enzyme
and Microbial Technology. 28: 397-403.
New England Biolabs. 2005. Catalog and Technical Reference. Jakarta: Gene
Craft Labs.
Polizeli M, RizzattiACS, Monti R, FterenziH, Jorge JA, Amorim DS. 2005.
Xylanases from fungi properties and industrial applications. Journal Applied
Microbiol Biotechnol. 67: 577-591.
Rifaat HM, Nagieb ZA, Ahmed YM. 2005. Productions of xylanases by
Streptomyces sp and theirbleacing effect on rice straw pulp. Environ. 4: 151160.
Sadeghi M, Manesh HN, Zarabi M, Ranjbar B. 2006. Effective factors in
thermostability of thermophilic protein. Biophysical Chemistry. 119: 256-270.
Sriprang R, Asano K, Gobsuk J, Tanapongpipat S, Champreda V, Eurwilaichitr L.
2006. Improvement of thermostability of fungal xylanase by using site directed
mutagenesis. Journal of Biotechnology. 126: 454-462.
Wang C, Chan H, Lin H, Shyu Y. Production, purification, and characterization of
a novel halostable xylanase from Bacillus sp NTU-06. Ann Appl Biol. 156:
187-197.
Xu W, Yan M, Xu L, Ding L, Ouyang P. 2009. Engineering the activity of
thermophilic xylose isomerase by site directed mutation at subunit interface.
Enzyme and Microbial Technology. 44: 77-83.
Zhang ZG, Yi ZL, Pei XQ, Wu ZL. 2010. Improving the thermostability of
Geobacillus stearothermophilius xylanase XT6 by directed evolution and sitedirected mutagenesis. Bioresource Technology. 101:9272-9278.
ZhengL, Baumann U, Reymond JL. 2004. An efficient one-step site-directed and
site-saturation mutagenesis protocol. Nucl Acids Res. 32: 115.

15

Lampiran 1 Strategi Penelitian
Analisis enzim
restriksi
Site-directed
Mutagenesis PCR 1
plasmid rekombinan
Uji aktivitas

pGEMalkxynaq1cmu

Analisis enzim
restriksi
Site-directed
Mutagenesis PCR 1
plasmid rekombinan

Uji aktivitas

pGEMalkxynaq1cmu

Sekuensing

Uji aktivitas

16

16

Lampiran 2 Site-Directed Mutagenesis Plasmid pGEMalkxynaq1cmu
Rekombinan 1

•
•
•
•
•

SDM-PCR single mutasi plasmid

Primer Q53K
Primer Q62L
Primer E146V
Primer T194I
Primer S330I

pGEMalkxynaq1cmu dengan PfuDNA Polimerase

Digesti produk PCR dengan enzim
restriksi DpnI

Transformasi konstruk pGEMTalkxynaq1cmu ke dalam E. coli DH5α
kompeten

Seleksi koloni putih biru pada media

Seleksi koloni berzona bening pada

agar LB Ampisilin + IPTG dan X-

media agar LB Ampisilin + xylan

Gal

Kultivasi klon positif dalam media
cair LB + Ampisilin pada T= 37ºC,
150 rpm

Assay aktivitas xilanase rekombinan
dengan metode Bailey
Ekstraksi plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu (Minipreps)

Analisis enzim restriksi mutan plasmid
pGEMakxynaq1cmu rekombinan.

•
•
•

Mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu

•

rekombinan terverifikasi

•

Mutan 1.1
Mutan 2.2
Mutan 3.9
Mutan 4.2
Mutan 5.2

17

Lampiran 3 Site-Directed Mutagenesis Plasmid pGEMalkxynaq1cmu
Rekombinan 2
SDM-PCR double mutasi plasmid

•

Primer Q62L

pGEMalkxynaq1cmu dengan Pfu-

Mutan 3.9

•

DNA Polimerase

Digesti produk PCR dengan enzim
restriksi DpnI

Transformasi konstruk pGEMTalkxynaq1cmu ke dalam E. coli DH5α
kompeten

Seleksi koloni putih biru pada media

Seleksi koloni berzona bening pada

agar LB Ampisilin + IPTG dan X-

media agar LB Ampisilin + xylan

Gal

Kultivasi klon positif dalam media
cair LB + Ampisilin pada T= 37ºC,
150 rpm

Assay aktivitas xilanase rekombinan
dengan metode Bailey

Ekstraksi plasmid rekombinan
pGEMalkxynaq1cmu (Minipreps)

Analisa enzim restriksi mutan plasmid
pGEMakxynaq1cmu rekombinan.

•
•
•
•

Mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu
rekombinan terverifikasi

•

Mutan M1
Mutan M2
Mutan M3
Mutan M4
Mutan M5

18

18

Lampiran 4 Alignment Gen alkxynaq1cmu mutasi tunggal (klon 2.2) dengan
program BLAST
>
gb|AF534180.1|
gene,
complete cds
Length=1470

Bacillus halodurans endo-1,4-beta-xylanohydrolase (xyn10A)

Subject start position
Score = 1332 bits (721), Expect = 0.0
Identities = 883/953 (93%), Gaps = 44/953 (5%)
Strand=Plus/Plus
Query

367

Sbjct

449

Query

427

Sbjct

509

Query

487

Sbjct

569

Query

547

Sbjct

629

Query

607

Sbjct

689

Query

667

Sbjct

749

Query

727

Sbjct

809

Query

787

Sbjct

869

Query

847

Sbjct

929

Query

907

Sbjct

989

Query

967

Sbjct

1048

Query

1027

Sbjct

1106

Query

1087

Sbjct

1163

Query

1147

Sbjct

1215

TTTCTGAGCGATATCTAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAG
||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTTCTGAGCGATATCAAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAG

426

AAGGGAGACAAGCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAGGGAGACAAGCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAA

486

TGAAGCCTGAATCACCCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAA
||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGAAGCCTGAATCACTCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAA
TTGTGGAGTTTGCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTGTGGAGTTTGCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACA
GCCAAGTACCAGAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCAAGTACCAGAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAG
ACCCAGATAAACGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACCCAGATAAACGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTA
AAACGGTTGTTGAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAACGGTTGTTGAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTA
TTGACGATGGCGGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTGACGATGGCGGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACA

508

568
546
628
606
688
666
748
726
808
786
868
846
928

TTAAGGTAGCTTTCGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTA
||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTAAGGTAGCTTTTGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTA

906

ATGATTACAACACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGGTGAAAGAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
ATGATTACAACACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGG-TGAAAGAC

966

TTATTAAAGCAAGGGATTGCCAATTGGACGGGGTAGGACATCAGTCCCATATCCAATTCG
|||||| ||||||| | ||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||| |||
TTATTAGAGCAAGG-AGTGCCAATTG-ACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCG
GCTGGCCTTCCATTGAAAATACAAGAACTTCCTTTTGAAAAGTTTACCAAGTTTAGGGAT
||||||||||||||||| |||||||| |||| ||||||||||||||| | ||||||| ||
GCTGGCCTTCCATTGAAGATACAAGAGCTTC-TTTTGAAAAGTTTACGA-GTTTAGG-AT
TAGCCAATCCAGGTAACTGGAGCTAAGACATGAATTCTCTATTGGGCTGGGCCACCGGAC
||| ||||| || |||||| ||||| ||||||| | |||||| || |||| |||||| ||
TAGACAATCAAG-TAACTG-AGCTA-GACATGAGT-CTCTAT-GG-CTGG-CCACCG-AC
AGGGGGCATAACCCCGTCATATGGACGACCTTTCCAACCAAAAATTCCCTTTCAGGCCCA
||||| |||| | | |||||||| ||||| || ||| | | || | || || || |||||
AGGGG-CATA-CAC-GTCATATG-ACGACATT-CCAGC-AGAACT-CC-TT-CAAGCCCA

988

1047
1026
1105
1086
1162
1146
1214
1206
1265

19

Lampiran 4 (lanjutan)
Query

1207

Sbjct

1266

Query

1267

Sbjct

1315

AGGCAAGACCGGTTACGATTCAGCtttttttGAAGTTATACAGAAAAAATAAGCCTGGCT
|||| ||||| ||||||| ||||||||
|| ||||||| ||| || || || || ||
-GGCA-GACCG-TTACGAT-CAGCTTTTC--GA-GTTATAC-GAAGAATTA-GC-TG-CT
GGAATATAAACCAAGTGAAACTTTTTCGGGGGGAAATTGCCTGAATAACCATA
| | ||| | | | ||| |||||| | |||| || |||| ||| ||||||||
G-A-TATTAGC-A-GTGTAACTTTCT-GGGG--AA-TTGC-TGA-TAACCATA

1319
1357

1266
1314

20

20

Lampiran 5 Alignment Gen alkxyn aq1cmu mutasi tunggal (klon 3.9) dengan