PENDAHULUAN PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ANTIBODI MONOKLONAL ANTIGLIKOPROTEIN VIRUS RABIES.

SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI 2015 1178 | Kuta, 29-30 Oktober 2015 dan 2. Penentuan adanya virus rabies pada hewan terinfeksi sehingga tindakan yang perlu dilakukan dapat diputuskan dengan cepat. Glikoprotein G yang merupakan protein perlekatan atachment berfungsi menginisiasi infeksi dengan cara melekatkan virus pada permukaan sel target. Jika glikoprotein virus rabies ini melekat pada permukaan sel target umumnya sel syaraf, maka virus dapat menginfeksi sel tersebut Kuzmina et al, 2013, Mori dan Marimoto, 2014. Keberadaan antibodi yang mengikat protein G antibodi anti-glikoprotein virus rabies dapat mencegah virus untuk melekat pada permukaan sel target sehingga dapat mencegah infeksi mentralisasi virus. Karena itu, protein inilah yang mengandung antigen pemicu antibodi netralisasi virus yang dapat melindungi tubuh dari infeksi virus rabies. Banyak vaksin rabies yang dibuat hanya dengan hanya menggunakan protein G virus rabies. Diagnosis rabies berbasis glikoprotein dapat dilakukan untuk melacak virus pada hewn terinfeksi menggunakan antibodi monoklonal anti-glikoprotein virus rabies seperti ourescene antibody technique FAT. Penggunaan antibodi monoklonal anti- glikopeotein diharapkan dapat meningkatkan spesivisitas dan sensitivitas uji, serta memudahkan penyediaan reagen diagnostik. Selain itu, tersedianya antibodi monoklonal terhadap protein G virus rabies dapat dipakai untuk memurnikan protein dari jaringan atau sel terinfeksi yang nantinya dapat dipakai sebagai antigen untuk melacak antibodi rabies pada hewan pasca vaksinasi. Hal ini juga akan memudahkan pemantauan respons imun hewan pasca vaksinasi yang sangat bermanfaat dalam mengevaluasi keberhasilan vaksinasi. Dalam paper ini dipaparkan produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal rabies yang diharapkan nantinya dapat dipakai untuk mengembangkan metode diagnosis yang lebih akurat.

2. BAHAN DAN METODE

2.1. Pembuatan dan Pemurnian AbMO Anti-glikoprotein Virus Rabies

AbMo anti glikoprotein virus rabies dibuat dengan mengimunisasi mencit Balbc dengan vaksin rabies yang tersedia secara komersial dan virus rabies isolate Bali. Skema imunisasi dilakukan sesuai dengan prosedur yang dijabarkan oleh Astawa et al, 2012. Dalam hal ini, mencit diimunisasi 4 kali dengan interval waktu 10 hari. Satu minggu setelah imunisasi terakhir, mencit diimunisai setiap hari selama 3 hari secara berturut-turut. Mencit kemudian siap dipakai untuk pembuatan sel hibridoma. Hibridoma dibuat dengan cara memfusikan sel mieloma dengan limfosit asal limpa mencit yang telah kebal terhadap virus rabies. Sebanyak 10 8 sel limfosit asal mencit yang kebal menghasilkan antibodi terhadap virus rabies difusikan dengan 2 x 10 7 sel mieloma NS1 menggunakan polyethylene glycol PEG45 . Sel hasil fusi kemudian disuspensikan dengan medium selektif DMEM-HAT dulbecomodi ed essential medium-hypxanthine amainopterin thymine yang mengandung 10 6 sel per sumuran dalam sel- 96 sumuran pada suhu 37 o C. Media selektif membunuh sel mieloma, tetapi tidak membunuh sel hibridoma yang merupakan fusi sel myeloma dan limfosit. Tujuh hari setelah fusi, sel hibridoma dibiakan dalam media HTsampai muncul klon hibridoma yang menghasilkan antibodi terhadap antigen virus rabies. Skrining klon hibridoma yang menghasilkan AbMo terhadap glikoprotein virus rabies dilakukan dengan uji ELISA menggunakan virus rabies isolat Bali sebagai antigen. Hibridoma yang terbukti menghasilkan AbMo terhadap glikprotein kemudian diisolasi dan dipakai untuk menyiapkan AbMo dalam jumlah besar. AbMo stok ini dibuat dengan cara menumbuhkan hibridoma dalam media HT sampai terlihat tanda-tanda kematian sel. Cairan supernatannya kemudian ditampung, disimpan dalam -20 o C dan dipakai sebagai AbMo stok. Selain itu, AbMo stok juga dibuat dengan penyuntikan sel hibridoma pada mencit Balbc. Pertama, mencit jantan dewasa disuntik dengan dengan 0,5 ml pristane. Dua minggu setelah penyuntikan pristane, sebanyak 1 juta sel hibridoma penghasil antibodi disuntikkan ke dalam rongga abdomen mencit. Cairan ascites dipanen setelah perut mencit mengalami pembengkakan.

2.2. Penentuan Protein Virus Rabies yang Bereaksi dengan AbMo

Protein khas virus rabies yang bereaksi dengan AbMo ditentukan dengan metode Western blotting. Pertama, protein virus rabies diencerkan dalam sample reducing buffer SDS 2,3 , mercaptoethanol 5, SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI 2015 Kuta, 29-30 Oktober 2015 | 1179 Tris-HCl 0,0625 M. pH. 6,0, gliserol 10, bromophenolblue 0,001 dan dianalisis dengan SDS-PAGE sodium dedocylsulphate- polyacrylamidegel electropjoresis. Protein virus rabies yang telah dipisahkan dalam gel kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa dipotong kecil-kecil dan direaksikan dengan AbMo. Adanya ikatan antara AbMo dengan protein virus rabies divisualisasikan dengan penambahan anti-mouse IgG-alkaline phosphatase dan substrat BCIPNBT.

2.3. Pelacakan Antigen Virus pada Otak Anjing Terinfeksi

Pelacakan antigen virus pada otak anjing yang terinfeksi dilakukan dengan uji imunohistokimia dan uji imuno ouresen indirek. Untuk uji imunohistokimia, jaringan otak yang sebelumnya telah di ksasi dengan formalin dan pemerosesan jaringan, dipotong setebal 4 mikron. Potongan jaringan tersebut kemudian dibuat di atas glas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine dan jaringan selanjutnya diwarnai dengan teknik immunoperoxidase mengikuti teknik yang dijabarkan oleh Ohnishi et al 2005. Pertama potongan jaringan di atas glas obyek dideparaf nisai 2 kali dalam xylol dan dibersihkan 2 kali dengan ettanol absolut. Potongan jaringan kemudian dicuci 3 kali dengan PBS dan dicelupkan kedalam buffer sitrat yang mengandung 0.05 Tween-20 pada suhu 90 o C selama 20 menit untuk membuka kembali epitop yang tertutup akibat ksasi dengan formalin. Enzim peroksidase endogen kemudian diinaktifkan dengan mencelupkan potongan jaringan ke dalam 3 H 2 O 2 dalam PBS for 20 menit pada suhu ruangan. Setelah jaringan diblok dengan susu skim 5 dalam PBS, AbMo antiglikoprotein virus rabies ditambahkan ke atas potongan jaringan dan diinkubasikan selama 18 suhu 4 o C dalam ruangan yang lembab. Setelah pencucian 3 kali dengan PBS. biotinylated goat anti-mouse IgG Biocare, USA. Streptavidin-horse radish peroxidase Biocare, USA. Sel yang terinfeksi virus rabies kemudian divisualisasikan dengan penambahan substat diazinobenzidine DAB Biocare, USA. Uji imuno ouresen indirek dilakukan dengan membuat preparat sentuh otak anjng terinfeksi pada objek gelas yang telah dilapisi dengan poly- L-lysin. Setelah di ksasi dengan aseton selama 15 menit, sediaan jaringan sentuh kemudian dicuci dengan PBS, ditambahkan antibodi monoklonal anti-glikoprotein virus rabies, dan diikubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Jaringan di atas gelas objek kemudian dicuci kembali seperti di atas dan digenangi kembali dengan antimouse IgG- ourescence Isotiocyanate FITC selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, jaringan ditutup dengan gliserol dan coverglass. Adanya sel terinfeksi virus rabies dilihat di bawah mikroskop ouresen.

3. HASIL

3.1. Sel Hibridoma Penghasil AbMo

Dari 3 kali percobaan fusi diperoleh 503 klon sel hibridoma yang terdiri atas 53 klon dari fusi-1, 225 klon dari fusi ke-2 dan 245 dari fusi ke-3. Skrining dengan uji ELISA menunjukkan bahwa 8 klon sel hibroma yang menghasilkan antibodi monoklonal terhadap virus rabies yang terdiri atas, 1 klon sel hibridoma dari fusi pertama klon CH9, 5 klon hibridoma dari fusi ke-2 AE7, BB5, DB8, EE9 dan AG9, dan 2 klon dari fusi ke 3 AF6, dan AC11 Tabel 1 . Tabel 1. Jumlah Hibridoma Penghasil Antibodi Monoklonal Anti-virus Rabies dari Percobaan Fusi Fusi Ke- Imunogen Jumlah hibromas ELISA Antigen rabies Antigen jaringan normal I Vaksin 53 1 II Vaksin 225 5 III vaksin 245 2 Jumlah 503 8