Pembuatan dan Pemurnian AbMO Anti-glikoprotein Virus Rabies

SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI 2015 Kuta, 29-30 Oktober 2015 | 1179 Tris-HCl 0,0625 M. pH. 6,0, gliserol 10, bromophenolblue 0,001 dan dianalisis dengan SDS-PAGE sodium dedocylsulphate- polyacrylamidegel electropjoresis. Protein virus rabies yang telah dipisahkan dalam gel kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa dipotong kecil-kecil dan direaksikan dengan AbMo. Adanya ikatan antara AbMo dengan protein virus rabies divisualisasikan dengan penambahan anti-mouse IgG-alkaline phosphatase dan substrat BCIPNBT.

2.3. Pelacakan Antigen Virus pada Otak Anjing Terinfeksi

Pelacakan antigen virus pada otak anjing yang terinfeksi dilakukan dengan uji imunohistokimia dan uji imuno ouresen indirek. Untuk uji imunohistokimia, jaringan otak yang sebelumnya telah di ksasi dengan formalin dan pemerosesan jaringan, dipotong setebal 4 mikron. Potongan jaringan tersebut kemudian dibuat di atas glas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine dan jaringan selanjutnya diwarnai dengan teknik immunoperoxidase mengikuti teknik yang dijabarkan oleh Ohnishi et al 2005. Pertama potongan jaringan di atas glas obyek dideparaf nisai 2 kali dalam xylol dan dibersihkan 2 kali dengan ettanol absolut. Potongan jaringan kemudian dicuci 3 kali dengan PBS dan dicelupkan kedalam buffer sitrat yang mengandung 0.05 Tween-20 pada suhu 90 o C selama 20 menit untuk membuka kembali epitop yang tertutup akibat ksasi dengan formalin. Enzim peroksidase endogen kemudian diinaktifkan dengan mencelupkan potongan jaringan ke dalam 3 H 2 O 2 dalam PBS for 20 menit pada suhu ruangan. Setelah jaringan diblok dengan susu skim 5 dalam PBS, AbMo antiglikoprotein virus rabies ditambahkan ke atas potongan jaringan dan diinkubasikan selama 18 suhu 4 o C dalam ruangan yang lembab. Setelah pencucian 3 kali dengan PBS. biotinylated goat anti-mouse IgG Biocare, USA. Streptavidin-horse radish peroxidase Biocare, USA. Sel yang terinfeksi virus rabies kemudian divisualisasikan dengan penambahan substat diazinobenzidine DAB Biocare, USA. Uji imuno ouresen indirek dilakukan dengan membuat preparat sentuh otak anjng terinfeksi pada objek gelas yang telah dilapisi dengan poly- L-lysin. Setelah di ksasi dengan aseton selama 15 menit, sediaan jaringan sentuh kemudian dicuci dengan PBS, ditambahkan antibodi monoklonal anti-glikoprotein virus rabies, dan diikubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Jaringan di atas gelas objek kemudian dicuci kembali seperti di atas dan digenangi kembali dengan antimouse IgG- ourescence Isotiocyanate FITC selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, jaringan ditutup dengan gliserol dan coverglass. Adanya sel terinfeksi virus rabies dilihat di bawah mikroskop ouresen.

3. HASIL

3.1. Sel Hibridoma Penghasil AbMo

Dari 3 kali percobaan fusi diperoleh 503 klon sel hibridoma yang terdiri atas 53 klon dari fusi-1, 225 klon dari fusi ke-2 dan 245 dari fusi ke-3. Skrining dengan uji ELISA menunjukkan bahwa 8 klon sel hibroma yang menghasilkan antibodi monoklonal terhadap virus rabies yang terdiri atas, 1 klon sel hibridoma dari fusi pertama klon CH9, 5 klon hibridoma dari fusi ke-2 AE7, BB5, DB8, EE9 dan AG9, dan 2 klon dari fusi ke 3 AF6, dan AC11 Tabel 1 . Tabel 1. Jumlah Hibridoma Penghasil Antibodi Monoklonal Anti-virus Rabies dari Percobaan Fusi Fusi Ke- Imunogen Jumlah hibromas ELISA Antigen rabies Antigen jaringan normal I Vaksin 53 1 II Vaksin 225 5 III vaksin 245 2 Jumlah 503 8