SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI 2015
Kuta, 29-30 Oktober 2015 | 1179 Tris-HCl 0,0625 M. pH. 6,0, gliserol 10, bromophenolblue 0,001 dan dianalisis dengan SDS-PAGE
sodium dedocylsulphate- polyacrylamidegel electropjoresis. Protein virus rabies yang telah dipisahkan dalam gel kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa dipotong kecil-kecil
dan direaksikan dengan AbMo. Adanya ikatan antara AbMo dengan protein virus rabies divisualisasikan dengan penambahan anti-mouse IgG-alkaline phosphatase dan substrat BCIPNBT.
2.3. Pelacakan Antigen Virus pada Otak Anjing Terinfeksi
Pelacakan antigen virus pada otak anjing yang terinfeksi dilakukan dengan uji imunohistokimia dan uji imuno ouresen indirek. Untuk uji imunohistokimia, jaringan otak yang sebelumnya telah di ksasi
dengan formalin dan pemerosesan jaringan, dipotong setebal 4 mikron. Potongan jaringan tersebut kemudian dibuat di atas glas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine dan jaringan selanjutnya
diwarnai dengan teknik immunoperoxidase mengikuti teknik yang dijabarkan oleh Ohnishi et al 2005. Pertama potongan jaringan di atas glas obyek dideparaf nisai 2 kali dalam xylol dan dibersihkan 2 kali
dengan ettanol absolut. Potongan jaringan kemudian dicuci 3 kali dengan PBS dan dicelupkan kedalam buffer sitrat yang mengandung 0.05 Tween-20 pada suhu 90
o
C selama 20 menit untuk membuka kembali epitop yang tertutup akibat ksasi dengan formalin. Enzim peroksidase endogen kemudian diinaktifkan
dengan mencelupkan potongan jaringan ke dalam 3 H
2
O
2
dalam PBS for 20 menit pada suhu ruangan. Setelah jaringan diblok dengan susu skim 5 dalam PBS, AbMo antiglikoprotein virus rabies ditambahkan
ke atas potongan jaringan dan diinkubasikan selama 18 suhu 4
o
C dalam ruangan yang lembab. Setelah pencucian 3 kali dengan PBS. biotinylated goat anti-mouse IgG Biocare, USA. Streptavidin-horse radish
peroxidase Biocare, USA. Sel yang terinfeksi virus rabies kemudian divisualisasikan dengan penambahan substat diazinobenzidine DAB Biocare, USA.
Uji imuno ouresen indirek dilakukan dengan membuat preparat sentuh otak anjng terinfeksi pada objek gelas yang telah dilapisi dengan poly- L-lysin. Setelah di ksasi dengan aseton selama 15 menit,
sediaan jaringan sentuh kemudian dicuci dengan PBS, ditambahkan antibodi monoklonal anti-glikoprotein virus rabies, dan diikubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Jaringan di atas gelas objek kemudian dicuci
kembali seperti di atas dan digenangi kembali dengan antimouse IgG- ourescence Isotiocyanate FITC selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, jaringan ditutup dengan gliserol dan
coverglass.
Adanya sel terinfeksi virus rabies dilihat di bawah mikroskop ouresen.
3. HASIL
3.1. Sel Hibridoma Penghasil AbMo
Dari 3 kali percobaan fusi diperoleh 503 klon sel hibridoma yang terdiri atas 53 klon dari fusi-1, 225 klon dari fusi ke-2 dan 245 dari fusi ke-3. Skrining dengan uji ELISA menunjukkan bahwa 8 klon
sel hibroma yang menghasilkan antibodi monoklonal terhadap virus rabies yang terdiri atas, 1 klon sel hibridoma dari fusi pertama klon CH9, 5 klon hibridoma dari fusi ke-2 AE7, BB5, DB8, EE9 dan AG9,
dan 2 klon dari fusi ke 3 AF6, dan AC11 Tabel 1 .
Tabel 1. Jumlah Hibridoma Penghasil Antibodi Monoklonal Anti-virus Rabies dari Percobaan Fusi
Fusi Ke- Imunogen
Jumlah hibromas
ELISA Antigen rabies
Antigen jaringan normal
I Vaksin
53 1
II Vaksin
225 5
III vaksin
245 2
Jumlah 503
8
SEMINAR NASIONAL SAINS DAN TEKNOLOGI 2015
1180 | Kuta, 29-30 Oktober 2015
3.2. Karakteristik Antibodi Monoklonal
Tiga BB5, AF6 dan AE11 dari 8 antibodi monoklonal tersebut bereaksi dengan protein 66 kDa glikoprotein seperti yang terlihat pada hasil uji Western blotting Gambar 1. Penentuan isotipe
menunjukkan bahwa ke 8 AbMo berturut-turut mepunyai isotipe berikut yaitu, 5 AbMo mempunyai isotipe IgG1 AG9, EE9, AF6, BB5 dan AC11, dan 3 AbMo mempunyai Isotype IgG2a AE7, DB8 dan
CH 9 Tabel 2.
Gambar 1. Reaktivitas antibodi monoclonal terhadap protein virus rabies isolate Bali. Protein standar 1, AbMo CH9, AC7, AG9, DB8, EE9, BB5, AE11, AF6 2-9.
Tabel 2. Karakteristik Antibodi Monoklonal Anti-virus Rabies
AbMo Isotipe
Titer ELISA Protein reaktif
IHK FAT
CH9 IgG2a
2
5
---- ++
± AC7
IgG2a 2
6
--- ++
+ DB8
IgG2a 2
8
--- +++
++ EE9
IgG1 2
5
--- +
+ AG9
IgG1 2
5
--- +
+ BB5
IgM 2
6
66 KDa ++
++ AF6
IgG1 2
5
66 KDa ++
++ AC11
IgG1 2
4
66 Kda ++
++
Keteranagan : AbMo: antibodi monoklonal, ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay, IHK: imunohistokimia, FAT: ourescence antibody technique
3.3. Reaktivitas AbMo dengan Antigen Virus Rabies pada Sel Otak Terinfeksi
Semua AbMo yang diproduksi dalam penelitian ini dapat melacak virus rabies dalam jaringan otak anjing yang terinfeksi. Dengan uji imunohistokimia 3 AbMo BB5, AF6 dan AE11 yang mengenali
glikoprotein virus rabies dapat melacak antigen virus pada jaringan otak ajing terinfeksi dan telah di ksasi dengan formalin. Hasil potitif ditandai dengan adanya negri bodi pada sel neuron.. Sel yang terinfeksi
ditandai dengan adanya warna coklat kemerahan pada sitoplasma dari sel otak yang meliputi sekitar 10-20 sel otak. Virus rabies tidak terlacak pada jaringan otak anjing yang tidak terinfeksi Gambar 2.
Jika dibandingkan dengan 5 AbMo lainnya, ketiga AbMo antiglikoprotein bereaksi lebih spesi k ditandai dengan latar belakang yang lebih rendah.
