Optimasi Produksi Dan Karakterisasi Enzim Microbial Transglutamminase (Mtgase) Dari Streptomyces Sp. Galur Tta 02 Sds 14

OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM
MICROBIAL TRANSGLUTAMINASE (MTGase) DARI
Streptomyces sp. GALUR TTA 02 SDS 14

HANA NURULLITA PRESTISIA
P051130161

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Optimasi Produksi dan
Karakterisasi Enzim Microbial Transglutaminase (MTGase) dari Streptomyces sp.
Galur TTA 02 SDS 14” adalah benar karya saya dan dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar

Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Maret 2016

Hana Nurullita Prestisia
NIM P051130161

RINGKASAN
HANA NURULLITA PRESTISIA. Optimasi Produksi dan Karakterisasi Enzim
Microbial Transglutamminase (MTGase) dari Streptomyces sp. Galur
TTA 02 SDS 14. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DEWI
SESWITA ZILDA.
Transglutaminase (TGase) adalah enzim yang mengkatalisis reaksi
perpindahan gugus asil antara residu glutamin (Gln) dan lisin (Lys) yang
membentuk ikatan silang (crosslinking) ε-(γ-glutamyl)lisin (Motoki dan Seguro
1998). Enzim transglutaminase bekerja secara intra- dan interseluler menghasilkan
ikatan silang antar protein. Transglutaminase mengkatalisis reaksi antara suatu
peptida terikat residu glutamin dan amina primer. Beberapa potensi aplikasi

transglutaminase antara lain untuk meningkatkan mutu protein pangan,
memperbaiki sifat edibel film, memperbaiki sifat pembuihan protein,
memperbaiki sifat gel, memperbaiki sifat adonan roti, dan peningkatan stabilitas
penyimpanan bahan pangan kering. Tujuan penelitian ini yaitu mengukur kondisi
optimum produksi MTGase yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. galur TTA 02
SDS 14 dan mendapatkan karakteristik enzim.
Penelitian ini dilakukan beberapa tahapan yaitu, optimasi produksi enzim
MTGase dan karakterisasi enzim MTGase (menentukan pH dan suhu optimum,
ketahanan enzim terhadap panas, serta pengaruh ion logam dan inhibitor terhadap
aktivitas enzim).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa Streptomyces sp. galur TTA 02
SDS 14 menghasilkan enzim transglutaminase secara optimum pada pH media 6
dan suhu 25 ºC. Pengujian enam jenis media yang berbeda untuk memproduksi
enzim transglutaminase diperoleh bahwa media yang digunakan oleh Bahrim et
al. dengan komposisi pepton 1,5%, MgSO4.7H2O 0,1%, KH2PO4 0,2%, Na2HPO4
0,5%, tepung kedelai 2%, tepung kentang 2% dan glukosa 1,5% menghasilkan
enzim dengan aktivitas tertinggi setelah fermentasi selama 4 hari (108 jam). Hasil
karakterisasi enzim diketahui bahwa enzim yang dihasilkan mempunyai pH
optimum 6,0 dan suhu optimum 45-50 ºC. Pengujian stabilitas enzim pada suhu
40 ºC, 45 ºC, dan 50 ºC selama 4 jam masih menunjukkan aktivitas di atas 50%.

Penambahan ion logam Na+, K+, Ca2+, Mg2+ meningkatkan aktivitas MTGase,
sebaliknya ion logam Li+, Cu+, Zn2+, Fe3+ menurunkan aktivitas MTGase.
Penambahan IAA (iodoacetamide) 1 mM dapat meningkatkan aktivitas enzim
MTGase sedangkan EDTA (ethylendiamine tetraacetic acid), PMSF (phenyl
methyl sulfonyl flouride), dan DPB (dibromoacetophenone) dapat menghambat
aktivitas MTGase.
Kata kunci: MTGase, Streptomyces sp., optimasi, karakterisasi

SUMMARY
HANA NURULLITA PRESTISIA. Optimization of Production and
Characterization of Microbial Transglutaminase (MTGase) from Streptomyces sp.
Strain TTA 02 SDS 14. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and
DEWI SESWITA ZILDA.
Transglutaminase (TGase) is an enzyme that catalyses an acyl transfer
reaction between bond glutaminyl (Gln) residue and lysin (Lys), and catalyses the
crosslinking through the formation of an ε-(γ-glutamyl) lysine bond.
Transglutaminase catalyses reaction between the carboxyamide group of peptidebound glutamine residues and a variety of primary amines. Preparations
containing TGase has potentially wide range of applications such as improve
amino acid for low protein, to produce edible film, foaming properties, and
gelation and manufacture bakery product. The aim of this study was to

determinate optimization of production and characterization of a microorganism
like Streptomyces sp. TTA 02 SDS 14 strain that product enzyme MTGase.
This research was conducted several stages such as optimize to produce
enzyme and characterization of MTGase (determined optimal pH and
temperature, thermal stability of enzyme, as well as the influence of metal ions
and inhibitors of the enzyme activity).
These research showed transglutaminase could produced by
Streptomyces sp. strain TTA 02 SDS 14 in medium optimum pH 6.0 and
temperature 25 ºC. Screening with six type of medium to produce
transglutaminase was obtained that the media used by Bahrim et al. with a
composition of peptone 1.5%, MgSO4.7H2O 0.1 %, KH2PO4 0.2 %, Na2HPO4
0.5 % , soybean flour 2 %, potato starch 2 %, and glucose 1.5 % could produce an
enzyme with the highest activity after fermentation for 4 days (108 hours). Results
of enzyme characterization known that the enzyme produced has optimum pH 6.0
and optimum temperature 45-50 ºC. Enzyme stable at temperature of 40 ºC, 45 ºC,
and 50 ºC with activity above 50 % for up to four hours of incubation time. The
partial purified MTGase’s activity was increased with Na+, K+, Ca2+, and Mg2+,
IAA (iodoacetamide) 1mM, but it was activated by the presence Li+, Cu+, Zn2+,
and Fe3+, EDTA (ethylendiamine tetraacetic acid), PMSF (phenyl methyl sulfonyl
flouride), IAA (iodoacetamide) 5mM, and DPB (dibromoacetophenone).

Key word: : MTGase, Streptomyces sp.,optimization, characterization

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM
MICROBIAL TRANSGLUTAMINASE (MTGase) DARI
Streptomyces sp. GALUR TTA 02 SDS 14

HANA NURULLITA PRESTISIA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Anja Meryandini, MS.

Judul Tesis

Nama
NIM

: Optimasi Produksi dan Karakterisasi Enzim Microbial
Transglutaminase (MTGase) dari Steptomyces sp. Galur
TTA 02 SDS 14
: Hana Nurullita Prestisia

: P051130161

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Ketua

Dr Dewi Seswita Zilda, MSi
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Dekan SekolahPascasarjana

Prof Dr Ir Suharsono, DEA

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 5 Februari 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNYA sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian
yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2015 sampai September 2015 ini ialah
enzim transglutaminase, dengan judul Optimasi Produksi dan Karakterisasi Enzim
Microbial Transglutaminase (MTGase) dari Streptomyces sp. Galur TTA 02 SDS
14.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Dewi Seswita Zilda selaku anggota
komisi pembimbing yang telah membimbing dan memberikan saran serta kritikan
selama menyusun tesis ini. Selain itu penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada penguji luar komisi Prof Dr Anja Meryandini, MS yang telah memberikan
masukan pada saat ujian sidang tesis, serta kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA
selaku ketua Program Studi Bioteknologi IPB yang telah memberikan motivasi

kepada penulis. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Kustiariyah Tarman
SPi, MSi selaku dosen Teknologi Hasil Perairan, FPIK IPB yang selalu
memberikan motivasi kepada penulis selama menempuh pendidikan pascasarjana
di IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kementrian Kelautan dan
Perikanan (BBRP2B) yang telah membiayai penelitian ini serta DIKTI melalui
Beasiswa BPPDN 2013 selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Ekowati Chasanah, MSi
dan Ir Yusro Nuri Fawzya, MSi yang telah banyak memberikan bimbingan dan
arahan di Laboratorium. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Mbak Dewi
Rahmi, Pak Pujo, Pak Nursyid, Bu Umi, Mas Gintung, Mas Agus, Mbak Maya,
Mbak Hana, Yudi, Benget, Zul, Bang Sepri, Habib, Mbak Lia dan Ayu atas
bantuannnya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium. Rekan-rekan
Pascasarjana Bioteknologi 2013-2014 atas segala bantuan dan kerjasamanya.
Ucapan terima kasih tak terhingga untuk seluruh keluarga besar penulis terutama
suami tercinta Rizky Fachru Rozy dan ananda Muhammad Tara Luvian Akbar yang
tiada putus-putusnya atas dukungan baik material, moral maupun spiritual. Terima
kasih untuk seluruh pihak yang telah membantu penulis selama penulisan dan
penyusunan tesis yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Maret 2016

Hana Nurullita Prestisia

DAFTAR ISI
...................................................................................

xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................

xi

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................

xi

1 PENDAHULUAN ..................................................................................
Latar Belakang .....................................................................................

Tujuan ..................................................................................................
Manfaat Penelitian ................................................................................

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA..........................................................................
Enzim Transglutaminase.......................................................................
Streptomyces sp. ...................................................................................
Media Pertumbuhan Mikrob .................................................................
Karakterisasi Biokmia Enzim ...............................................................
Ultrafiltrasi ............................................................................................
Teknik Pemisahan dengan Membran Ultrafiltrasi ................................

3
3
5
5
7
9
10

3 METODE ................................................................................................
Bahan ....................................................................................................
Waktu dan Tempat ................................................................................
Tahapan Penelitian ................................................................................
Optimasi Produksi Enzim MTGase ......................................................
Karakterisasi enzim ...............................................................................

11
11
11
11
12
14

4 HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................
Hasil ....................................................................................................
Pembahasan ..........................................................................................

16
16
23

5 SIMPULAN DAN SARAN ....................................................................
Simpulan ...............................................................................................
Saran ....................................................................................................

28
28
28

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

29

LAMPIRAN ................................................................................................

33

RIWAYAT HIDUP .....................................................................................

35

DAFTAR TABEL

DAFTAR TABEL

1
2
3

Sifat biokimia dari lima jenis mammalian transglutaminase ...............
Kebutuhan nutrien bagi mikroba dan bentuk yang dimanfaatkan ........
Komposisi media produksi enzim ........................................................

4
6
12

DAFTAR GAMBAR

1 Transglutaminase mengkatalisis reaksi ................................................
2 Kisaran ukuran pori membran ..............................................................
3 Prinsip proses pemisahan dengan membran ultrafiltasi .......................
4 Diagram alur penelitian ........................................................................
5 Isolat Streptomyces sp. galur TTA 02 SDS 14 .....................................
6 Optimasi kondisi produksi enzim MTGase Streptomyces sp. galur
TTA 02 SDS 14 . ..................................................................................
7 Optimasi media produksi enzim MTGase Streptomyces sp. galur
TTA 02 SDS 14 ...................................................................................
8 Optimasi waktu produksi enzim MTGase Streptomyces sp. galur
TTA 02 SDS 14 ...................................................................................
9 Pengaruh pH terhadap aktivitas MTGase ............................................
10 Pengaruh suhu terhadap aktivitas MTGase . ........................................
11 Pengaruh ketahanan panas terhadap aktivitas MTGase . .....................
12 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas MTGase .................................
13 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas MTGase . ..................................

3
9
10
11
16
17
18
20
21
21
22
22
23

DAFTAR LAMPIRAN

1 Pembuatan kurva standar L-asam glutamat γ-monohidroksamat .........
2 Hasil uji aktivitas enzim MTGase Streptomyces sp. galur
TTA 02 SDS 14 . ..................................................................................

33
34

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan salah satu produk industri yang memiliki nilai
ekonomis cukup tinggi di pasar dunia saat ini. Penggunaan enzim di Indonesia
semakin meningkat dari tahun ke tahun. Hal ini sejalan dengan semakin
berkembangnya industri pangan dan nonpangan yang memanfaatkan enzim
sebagai katalisator berbagai reaksi kimia. Beberapa pengamatan yang telah
dilakukan membuktikan bahwa penggunaan enzim di Indonesia setiap tahunnya
mengalami peningkatan hingga 9,1% per tahun. Berbagai industri tersebut
menggunakan enzim dalam jumlah yang sangat besar. Pada tahun 2014, besarnya
impor enzim ekstrak kasar di Indonesia mencapai 2.500 ton dengan harga
Rp 187,5 milyar (BPPT 2014). Enzim memiliki sifat-sifat spesifik yang sangat
menguntungkan yaitu, efisien, selektif, mengalami reaksi tanpa efek samping, dan
ramah lingkungan (Muffarikha et al. 2014).
Produk enzim yang memiliki prospek baik untuk dikembangkan adalah
protease, amilase, xilanase dan transglutaminase karena dipandang cukup luas
penggunaannya dalam berbagai industri. Transglutaminase merupakan salah satu
enzim yang digunakan dalam industri pangan untuk modifikasi protein. Enzim
transglutaminase telah diproduksi secara komersial dari hati marmut dengan harga
tinggi sekitar US$ 80/unit (Bahrim et al. 2010).
Transglutaminase (TGase) adalah enzim yang mengkatalisis reaksi
perpindahan gugus asil antara residu glutamin (Gln) dan lisin (Lys) yang
membentuk
ikatan
silang
(crosslinking)
ε-(γ-glutamyl)lisin
(Motoki dan Seguro 1998). Enzim transglutaminase bekerja secara intra- dan
interseluler menghasilkan ikatan silang antar protein. Transglutaminase
mengkatalisis reaksi antara suatu peptida terikat residu glutamin dan amina primer
(Mayashopha et al. 2015).
Transglutaminase pada awalnya dikenal sebagai Faktor XIIIa di bidang
kedokteran, yang berperan pada proses penggumpalan darah. Transglutaminase
dapat ditemukan pada berbagai organ, jaringan, cairan tubuh hewan (darat
maupun air), dan tanaman. Enzim ini terlibat pada berbagai fungsi biologis mulai
dari penggumpalan darah sampai diferensiasi sel. Transglutaminase juga dapat
ditemukan pula pada beberapa mikroorganisme (Srianta 2000).
Transglutaminase yang berasal dari hewan mempunyai harga sangat tinggi
yang menjadi kendala untuk aplikasi lebih luas. Sejak awal 1990-an setelah
ditemukannya Streptomyces mobaraensis, sudah banyak dilaporkan
mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim transglutaminase dan proses
optimasi produksinya juga sudah banyak dilakukan. Bahayanya adalah
meningkatnya aplikasi enzim ini pada industri makanan. Pada industri perikanan
MTGase telah digunakan untuk meningkatkan sifat mekanik surimi yang
dihasilkan dari berbagai jenis ikan (Zilda 2014). Beberapa potensi aplikasi
transglutaminase lainnya ialah untuk meningkatkan mutu protein pangan,
memperbaiki sifat edibel film, memperbaiki sifat pembuihan protein,
memperbaiki sifat gel, memperbaiki sifat adonan roti, dan peningkatan stabilitas
penyimpanan bahan pangan kering (Srianta 2000).

2

Mikrob merupakan sumber enzim yang paling banyak digunakan dari pada
hewan dan tumbuhan, karena mikrob memiliki pertumbuhan yang cepat dan dapat
tumbuh pada berbagai jenis substrat (Muffarikha et al. 2014). Penghasil TGase
dari kelompok Actinomycetes banyak ditemukan dari genus Streptoverticillium
atau Streptomyces. Produk transglutaminase asal mikrob sering disebut dengan
microbial transglutaminase (MTGase) (Ando et al. 1989).
Microbial transglutaminase (MTGase) dapat dihasilkan secara
ekstraseluler dan intraseluler. Transglutaminase ekstraseluler dihasilkan dari
mikrob jenis Sacharomyces cerrevisiae, Streptoverticillium ladakanum,
Streptoverticillium mobaraensis, Streptoverticillium sp., Streptoverticillium
lydicus, dan Aspergillus sp. Transglutaminase intraseluler ditemukan pada
Bacillus subtilis dan Physarium olycephalum (Haard dan Simpson 2000).
Pada penelitian ini telah dilakukan penelitian pendahuluan yaitu penapisan
isolat lokal Streptomyces sp. untuk menghasilkan enzim transglutaminase. Hasil
penelitian pendahuluan tersebut menunjukkan bahwa dari 108 isolat lokal
Streptomyces sp. yang diisolasi dari tanah di Bima, Nusa Tenggara Barat,
Indonesia menghasilkan 10 isolat yang berpotensi menghasikan enzim
transglutaminase. Salah satu isolat lokal yang memiliki aktivitas enzim
transglutaminase ekstraseluler yaitu isolat Streptomyces sp. galur SDS-LU.
Paparan ini jelas menunjukkan bahwa Streptoyces sp. isolat lokal memiliki
potensi tinggi untuk dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menghasilkan enzim
transglutaminase beserta karakterisasinya.

Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengukur kondisi optimum produksi
MTGase yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. galur TTA 02 SDS 14 (meliputi
pH media dan suhu inkubasi) dan mendapatkan karakteristik enzim MTGase,
meliputi stabilitas panas, pH, suhu, ion logam, dan pengujian inhibitor).

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai mikrob
yang menghasilkan enzim microbial transglutaminase (MTGase) dan kondisi
optimum produksi enzim transglutaminase yang dihasilkannya.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Enzim Transglutaminase
Transglutaminase termasuk ke dalam kelompok enzim transferase dan
mempunyai nama sistematis, yaitu protein glutamin γ-glutamyltransferase
(EC 2.3.2.13). Transglutaminase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi
perpindahan gugus asil antara kelompok γ-carboxyamide residu glutamin pada
protein, peptida dan berbagai amina primer (Gambar 1). Apabila kelompok
ε-amino residu lisin aktif sebagai aseptor asil, maka akan menghasilkan proses
polimerisasi dan interaksi silang inter- atau intra-molekul protein melalui
pembentukan ikatan ε-(γ-glutamyl) lisin. Pada proses ini terjadi pertukaran
amonia dari kelompok ε-amino residu lisin ke kelompok carboxyamide residu
glutamin pada molekul protein. Apabila amin primer tidak ada, maka air dapat
berperan sebagai aseptor asil dan menghasilkan proses deamidasi kelompok
γ-carboxyamide
glutamin
untuk
membentuk
asam
glutamat
(Haard dan Simpson 2000).

Gambar 1 Transglutaminase mengkatalisis reaksi: a) Reaksi umum transfer asil
dengan TGase b) reaksi ikatan antara asam amino glutamin dan lisin
dengan TGase c) deamidasi dengan amin primer dari air pada reaksi
dikatalis TGase (Marapana dan Jiang 2004)
Istilah
“transglutaminase”
pertama
kali
diperkenalkan
oleh
Clarke et al. (1959) yang menjelaskan aktivitas transamidasi pada hati marmut.
Saat ini transglutaminase sudah ditemukan pada tumbuhan, invertebrata, amfibi,
burung, ikan, dan mikroorganisme. Enzim dari berbagai sumber tersebut
mengkatalis perubahan post-translational protein dengan membentuk ikatan
isopeptida melalui interaksi silang protein atau penggabungan amina (Folk 1980).
Transglutaminase yang terdapat pada hewan merupakan enzim yang tergantung
pada nutrisi kalsium (Ca2+), sedangkan transglutaminase yang terdapat pada
bakteri aktinomiset tidak tergantung pada nutrisi kalsium. Transglutaminase bebas

4

kalsium telah ditemukan pada bakteri jenis aktinomiset termasuk Streptomyces
cinnamoneus dan Streptomyces mobaraense (Yokoyama et al. 2004)
Transglutaminase tersebar secara luas pada organisme eukariot dan
prokariot. Akan tetapi karakteristik transglutaminase yang paling banyak
dilakukan, yaitu berasal dari mamalia. Berdasarkan sumbernya, enzim
transglutaminase dibagi ke dalam dua golongan, yaitu:
a). Mammalian Transglutaminase
Aktivitas transglutaminase ditemukan dan tersebar secara luas dalam
plasma, jaringan, dan cairan ekstraseluler dari beberapa mamalia.
Transglutaminase yang mengubah protein seluruhnya ada dalam tubuh. Enzim
transglutaminase tersebut dapat digolongkan ke dalam lima golongan, yaitu faktor
XIII (plasma dan plasenta), transglutaminase jaringan, keratinosit, epidermis, dan
prostat (Dvorcakova et al. 2002; Esposito dan Caputo 2004). Perbedaan dari
kelima jenis transglutaminase mamalia terletak pada berat molekul, struktur
subunit dan aktivitas protease, tetapi semuanya memiliki ketergantungan yang
sama pada kalsium (Tabel 1).
Tabel 1 Sifat biokimia dari lima jenis transglutaminase mamalia
TGase
Faktor XIII
- Plasma
- Plasenta
Jaringan
Keratinosit
Epidermis
Prostat

Bobot molekul
(KDa)

Struktur subunit

Aktivitas
protease

Ketergantungan
pada kalsium

360
166
80
90
77
150

a2b2
a2
monomer
monomer
monomer
homodinerik

ada
ada
tidak
tidak
ada
tidak

ada
ada
ada
ada
ada
ada

Sumber : Dvorcakova et al. (2002); Esposito dan Caputo (2004)

b). Varietas Transglutaminase lainnya
Enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan ε-(γ-glutamyl) lisin
ditemukan pada berbagai organisme. Aktivitas transglutaminase yang ditemukan
pada ikan (Worratao dan Yongsawatdigul 2005), tiram (Kumazawa et al. 1997),
kepiting sepatu kuda (Tachypleus tridentatus) (Tokunaga et al. 1993) serta yeast
Candida albicans (Ruizherrer et al. 1995).
Transglutaminase ekstraseluler dihasilkan dari mikrob jenis Sacharomyces
cerrevisiae,
Streptoverticillum
sp.,
Streptoverticillium
ladakanum,
Streptoverticillium mobaraensis, Streptomyces lydicus, dan Aspergillus sp.
Transglutaminase intraseluler ditemukan pada Bacillus subtilis dan sporula
Physarium polychephalum. Enzim ini dihasilkan dari fermentasi aerob
(Haard dan Simpson 2000).
Transglutaminase ekstraseluler dipengaruhi oleh katabolit yang terdapat
pada medium fermentasi dalam proses biosintesis. Adanya glukosa dan gula-gula
sederhana akan menghambat sintesis enzim. Transglutaminase ekstraseluler juga
dipengaruhi oleh sifat mikrob penghasil. Bakteri Gram-positif cenderung

5

membebaskan sebagian besar enzim degradatifnya ke dalam medium. Enzim ini
berada secara berdekatan sehingga produk hasil degradasinya mudah diangkut ke
dalam sel oleh mekanisme transport pada dinding sel. Pada keadaan ini resiko
kehilangan produk nutrien atau makanan karena faktor difusi ke media fermentasi
dapat dikurangi (Ryszka et al. 2009).
Kebutuhan media fermentasi untuk media fermentasi mikrob penghasil
MTGase cukup tinggi mencapai 30% dari total biaya produksi. Alternatif
penggunaan media dari sumber nonekonomis untuk produksi MTGase terus
diteliti dan dikembangkan. Aktivitas transglutaminase yang dihasilkan oleh
seluruh organisme tersebut tergantung pada Ca2+, kecuali bakteri dan tumbuhan
(Portilla-Rivera et al. 2009).
Streptomyces sp.
Streptomyces memiliki ukuran besar dengan diameter antara 0,5-1,0 m.
Ciri pemersatu ialah pleomorfisme sel-selnya dan kecenderungan membentuk
filamen (hifa) bercabang. Pada beberapa spesies, hifa-hifa itu bersatu membentuk
miselium. Streptomyces bersifat aerobik, yaitu tumbuh pada kondisi lingkungan
yang banyak oksigen atau konsentrasi karbondioksida sedikit. Bakteri ini juga
bersifat kemoorganotrof dan mesopilik. Streptomyces mampu tumbuh optimum
pada temperatur 25 ˚C dan pH 6,5-8,0. Bakteri ini kebanyakan hidup saprofit pada
tanah, bakteri ini juga dapat ditemukan pada tumbuhan yang membusuk.
Streptomyces sp. dapat memproduksi senyawa volatil yaitu geosmin yang
memiliki
bau khas pada
tanah. Reproduksi
bakteri
yang
termasuk
Streptoverticillium terjadi dari salah satu miselium aerial atau dari germinasi
spora. Spora tersebut memiliki permukaan yang halus sampai sedikit kasar
(Madigan et al. 2012).
Setiap cabang vertisil memiliki puncak cabang (umbel) yang terdiri atas
dua atau beberapa rantai spora yang berbentuk bola dan spiral. Beberapa spesies
menghasilkan pigmen yang dapat larut, substrat berwarna dan aerial mycelium.
Bakteri ini resisten pada lysozyme dan neomycin serta mampu menghasilkan
komponen yang menunjukkan aktivitas seperti antifungi, antibakteri, antiprotozoa
dan antitumor serta sensitif terhadap agen antibakteri dan actinophage.
Streptomyces termasuk ke dalam kelompok bakteri Gram-positif.
Dinding
selnya
mengandung
L-diaminopimelic
acid
(L-DAP).
Kandungan utama sel bakteri ini adalah saturated, iso- dan anteiso-fatty acid, MK9 (H6) dan MK-9 (H8) menaquinone serta phospholipid (diphosphatidylglycerol,
phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol dan phosphatidylinositol
mannoside) (Holt et al. 1994).
Media Pertumbuhan Mikrob
Media merupakan suatu substansi yang terdiri atas campuran zat-zat
makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan
jasad renik. Media pertumbuhan dapat berupa media padat, cair, dan semi padat.
Media pertumbuhan mikrob dapat berupa media sintetik maupun media alami.
Media sintetik pada setiap komponennya merupakan senyawa yang relatif murni
serta konsentrasi komponen dalam media dan strukturnya dapat diketahui dengan

6

pasti. Media sintetik mempunyai keuntungan, antara lain setiap komponen dapat
diubah, disamping kesalahan atau kelainan yang mungkin terjadi selama
fermentasi akibat komposisi media dapat dicegah.
Mikrob memerlukan nutrien dengan komposisi tertentu untuk tumbuh dan
membelah diri. Komposisi nutrien untuk pertumbuhan mikrob tergantung dari
jenis mikrob. Sejumlah mineral dan unsur hara terdapat di dalam tubuh mikrob
untuk menjalankan fungsi khusus, misanya K, Na, Ca, Mg, Fe, Co, Cu, Zn, dan
Mo. Kandungan kimiawi ini mempengaruhi kebutuhan nutrien untuk menunjang
penggandaan sel dan pertumbuhannya (Madigan et al. 2012).
Gula sederhana, yaitu glukosa, merupakan sumber karbon yang mudah
dicerna dan digunakan mikrob sebagai sumber energi. Penggunaan glukosa dalam
media harus dibatasi, karena selain pertimbangan ekonomis juga untuk
menghindari efek represi produksi enzim (Suhartono 1989). Bakteri akan
melakukan hidrolisis secara perlahan pada media yang mengandung senyawa
karbon dan sumber nitrogen untuk mencegah proses yang menyebabkan fase lag
menjadi berkepanjangan sehingga mempengaruhi sifat pertumbuhan dan
pembentukan produk yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim
(Bierbaum et al. 1994). Pemilihan sumber nutrien untuk menumbuhkan mikrob
yang diinginkan dalam memproduksi enzim tergantung jenis mikrob dan
kebutuhannya, ketersediaan di lingkungan industri fermentasi dan faktor biaya.
Zat nutrien utama bagi pertumbuhan mikrob adalah sumber karbon, nitrogen dan
mineral terutama fosfat (Tabel 2).
Tabel 2 Kebutuhan utama zat nutrien bagi mikrob dan bentuk yang dimanfaatkan
Zat Nutrien
Sumber karbon
1. Glukosa/sukrosa

Bentuk yang dimanfaatkan

2. Lemak

Minyak, lemak tumbuhan, lemak hewan, golongan
hidrokarbon

Sumber nitrogen
1. N-Anorganik
2. N-Organik
Sumber mineral

Glukosa/sukrosa murni
Glukosa/sukrosa sebagai hasil penguraian maltosa, pati
dan selulosa

Garam nitrat, amonium
Teung kedelai, pepton, ekstrak khamir, cairan jagung,
limbah
Garam-garam anorganik

Sumber: Suhartono (1989)

Sumber nitrogen yang biasa digunakan seperti garam ammonium , urea,
ekstrak khamir dan pepton. Ekstrak khamir mengandung asam amino, peptida,
vitamin, dan karbohidrat. Komposisi penggunaan ekstrak khamir yang tepat
sangat diperlukan dalam proses kultivasi. Penggunaan ekstrak khamir yang
berlebihan akan menyebabkan timbulnya buih pada media kultivasi, timbulnya
buih tersebut disebabkan terjadinya kontak antara ekstrak khamir dan udara
karena adanya pengadukan. Ekstrak khamir dan pepton merupakan sumber asam

7

amino atau nitrogen dan vitamin B untuk pertumbuhannya, yaitu vitamin B1
(thiamin), B2 (riboflavin), B6 (piridoksin), dan B12 (kobalamin). Vitamin B
digunakan dalam pembentukan koenzim yang akan berikatan dengan enzim
dengan ikatan yang tidak begitu kuat (Suhartono 1989).
Kebutuhan nutrisi mikrob terlihat dalam unsur-unsur yang tersusun dalam
selnya. Susunan kimia sel mikrob relatif tetap, baik unsur kimia maupun senyawa
yang terkandung di dalam sel. Komponen utama yang menyusun sel bakteri
adalah C, H, O, P, dan S yang jumlahnya 95% dari berat kering sel, sedangkan
sisanya tersususn dari unsur-unsur lain (Madigan et al. 2012).
Karakterisasi Biokimia Enzim
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor tertentu yang
menentukan efektivitas kerja suatu enzim. Apabila faktor pendukung tersebut
berada pada kondisi yang optimum, maka kerja enzim juga akan optimal. Hasil
karakterisasi enzim walaupun masih bersifat ekstrak kasar, namun dapat
menggambarkan karakter enzim di dalamnya. Kondisi lingkungan harus
menunjang kondisi yang dibutuhkan enzim untuk dapat berfungsi sebagai katalis
reaksi.
Suhu
Reaksi enzim umumnya terdiri atas beberapa tahapan reaksi dan respon
terhadap suhu dari masing-masing tahap berbeda. Setiap enzim memiliki aktivitas
pada suhu tertentu. Aktivitas enzim akan meningkat dengan peningkatan suhu,
akan tetapi setelah suhu optimum tercapai maka yang terjadi adalah sebaliknya,
yaitu akan menurun dengan peningkatan suhu. Hal ini disebabkan telah
terdenaturasinya protein enzim (Lehninger 2008).
Enzim merupakan suatu protein, kenaikan suhu dapat menyebabkan
terjadinya denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim
akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim makin menjadi
berkurang dan kecepatan reaksinya juga akan menurun. Kenaikan suhu akan
meningkatkan laju reaksi enzim sampai mencapai suhu optimumnya. Terjadinya
peningkatan kecepatan reaksi enzim tersebut karena bertambahnya energi kinetik
yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan rotasi enzim dan substrat, sehingga
memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi (Suhartono 1989). Peningkatan
suhu diatas suhu optimum akan menyebabkan peningkatan energi termal molekul
yang membentuk struktur protein enzim, sehingga akan menyebabkan rusaknya
interaksi nonkovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan interaksi
elektrostatik) yang menjaga struktur tiga dimensi enzim secara bersama-sama. Hal
ini akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan
struktur lipatan enzim membuka pada bagian permukaannya sehingga sisi aktif
enzim berubah dan sebagai akibatnya akan terjadi penurunan aktifitas enzim
(Hames dan Hoper 2005). Pada suhu tinggi substrat juga dapat mengalami
perubahan konformasi sehingga gugus reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami
hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim (Suhartono 1989).

8

pH
Enzim memiliki pH optimum dimana enzim mempunyai aktivitas
maksimal. Enzin dengan pH rendah atau pH tinggi dapat pula menyebabkan
terjadinya proses denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas
enzim (Hames dan Hoper 2005). Nilai pH optimum tidak perlu sama dengan pH
lingkungan normalnya, dengan pH yang mungkin sedikit berada di atas atau di
bawah pH optimum. Aktivitas katalitik enzim di dalam sel mungkin diatur
sebagian oleh perubahan pada pH medium lingkungan (Lehninger 2008).
Pada umumnya, enzim bersifat ampolitik, yang berarti enzim mempunyai
konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya terutama pada gugus
residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya. Diperkirakan perubahan
keaktifan enzim ini adalah akibat perubahan pH lingkungan. Perubahan pH
lingkungan ini terjadi karena adanya perubahan ionisasi pada gugus ionik enzim
pada sisi aktifnya atau sisi lain yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi
aktif. Gugus ionik berperan dalam menjaga konformasi sisi aktif dalam
meningkatkan substrat menjadi produk. Perubahan ionisasi juga dapat dialami
oleh substrat atau kompleks enzim-substrat, yang juga berperan terhadap aktivitas
enzim (Lehninger 2008).
Ion logam
Banyak enzim yang memerlukan tambahan komponen kimia bagi
aktivitasnya. Komponen ini disebut dengan kofaktor. Kofaktor bisa berupa
molekul anorganik, seperti ion Fe2+, Mn2+, Zn2+, atau mungkin juga suatu molekul
organik kompleks yang disebut koenzim, seperti thiamin pirofosfat, FAD, serta
koenzim A. Beberapa enzim membutuhkan baik koenzim maupun satu atau lebih
ion logam bagi aktivitasnya. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam
lainnya hanya terikat secara lemah atau dalam waktu sementara
(Hames dan Hoper 2005). Akan tetapi pada enzim lain senyawa ini terikat secara
kuat dan permanen, dalam hal ini disebut gugus protetik. Enzim yang strukturnya
sempurna dan aktif mengkatalisis bersama-sama dengan koenzim atau gugus
logamnya disebut haloenzim. Koenzim dan ion logam bersifat stabil selama
pemanasan, sedangkan bagian protein enzim disebut apoenzim akan terdenaturasi
oleh pemanasan (Lehninger 2008).
Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim.
Logam biasanya berperan sebagai pengatur aktivitas enzim (Lehninger 2008). Ion
logam dapat mengaktifkan enzim melalui berbagai kemungkinan seperti:
(a) menjaga bagain internal enzim, (b) menghubungkan enzim dengan substrat,
(c) mengubah konstanta keseimbangan reaksi enzim, (d) merubah tegangan
permukaan protein enzim, (e) menghilangkan inhibitor, (f) menggantikan ion
logam yang tidak efektif pada sisi aktif enzim maupun substrat, dan (g) merubah
konformasi enzim menjadi konformasi yang lebih aktif (Belitz et al. 2009.).
Lebih dari 25% jenis enzim mengandung ion logam yang terikat atau
memerlukan ion logam bagi aktivitasnya. Metaloenzim mengandung ion logam
fungsional dalam jumlah pasti, yang dipertahankan selama proses pemurnian.
Enzim yang diaktifkan oleh logam memperlihatkan ikatan yang lebih lemah
dengan logam, dengan demikian memerlukan logam tambahan. Oleh karena itu,
perbedaan metaloenzim dengan enzim yang diaktifkan oleh logam terletak pada
afinitas suatu enzim tertentu terhadap ion logamnya (Lehninger 2008).

9

Senyawa inhibitor
Inhibitor merupakan senyawa yang cenderung menurunkan kecepatan
reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Inhibitor dapat bereaksi dengan substrat,
kofaktor atau dengan enzim langsung. Microbial transglutaminase tidak
dipengaruhi ion logam Ca2+, sehingga adanya senyawa pengkelat logam, seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) tidak menghambat aktivitasnya
(Lin et al. 2008). Sebaliknya, transglutaminase yang dipengaruhi ion logam Ca2+
dapat dihambat oleh EDTA, misalnya tilapia transglutaminase. Aktivitas
microbial transglutaminase dapat dihambat kuat oleh (p-Chloromercuribenzoate)
PCMB serta sedikit dihambat oleh (N-ethylmaleimide) NEM dan (Phenyl methyl
sulfonyl fluoride) PMSF (Worratao dan Yongsawatdigul 2005).
Ultrafiltrasi
Berdasarkan ukuran pori, membran dapat dibagi menjadi empat macam,
yaitu membran mikrofiltrasi, ultrafiltrasi (UF), nanofiltrasi, dan reverse osmosis
(RO) (Gambar 2). Membran UF adalah membran yang berada di antara membran
mikrofiltrasi dan nanofiltrasi. Ukuran pori membran berkisar antara 5 nm sampai
dengan 0,1 m (Gutman 1λ87). Membran UF digunakan untuk memisahkan
makromolekul dan koloid dari larutannya. Membran UF dan mikrofiltrasi
merupakan membran porous dimana rejeksi zat terlarut sangat dipengaruhi oleh
ukuran dan berat zat terlarut relatif terhadap ukuran pori membran. Membran UF
memiliki struktur yang asimetris dengan lapisan atas yang lebih dense (ukuran
pori lebih kecil dan porositas permukaan lebih rendah) sehingga tahanan
hidrodinamiknya akan lebih besar (Mulder 1996).
Bobot

Gambar 2 Kisaran ukuran pori membran (Gutman 1987)
Fraksinasi protein dengan cepat menjadi lebih selektif melalui kemajuan
rancangan membran dan modul. Teknik separasi dengan membran membutuhkan
biaya yang lebih rendah dan dapat digunakan dalam skala besar untuk produksi
secara komersial. Teknik membran memiliki kekurangan, antara lain selektivitas
membran dan fouling yang disebabkan absorpsi protein selama proses filtrasi yang
dapat menjadi penghalang pada aplikasi UF selanjutnya (Larive et al. 1999). Oleh
karena itu dibutuhkan pretreatment yang sesuai sebelum proses UF. Pretreatment
diperlukan untuk menghilangkan padatan tersuspensi dari ekstrak umpan dan

10

menyediakan permeat yang bersih sebagai umpan untuk mendapatkan komponen
yang diinginkan dengan proses UF sehingga dapat mereduksi fouling
(Li et al. 2008).

Teknik Pemisahan dengan Membran Ultrafiltrasi
Proses pemisahan dengan membran telah berkembang dan digunakan di
dalam berbagai bidang, diantaranya ialah pada proses produksi air minum. Hal
utama yang membedakan proses pemisahan membran dengan proses pemisahan
konvensional lainnya ialah digunakannya suatu membran sebagai media
pemisahan. Membran dalam bentuk padatan maupun cairan dapat memisahkan
suatu permukaan antarmuka antara dua fasa. Membran ini berfungsi sebagai
lapisan permselektif yang mengatur laju perpindahan suatu komponen dari
campurannya. Membran tersebut dapat bersifat netral atau memiliki muatan
listrik, dapat berpori (porous) atau tidak berpori (non-porous) (Gambar 3) .
Modul Membran
Umpan

Retentat

Permeat
Gambar 3 Prinsip proses pemisahan dengan membran
Aliran umpan (feed) dimasukkan ke dalam modul membran. Pada modul
ini, aliran umpan dipisahkan menjadi dua aliran, yaitu aliran permeat dan aliran
retetntat. Aliran permeat adalah aliran komponen yang dapat melewati membran,
sedangkan aliran retentat adalah aliran komponen yang tidak dapat melewati
membran. Proses pemisahan dengan membran terjadi akibat adanya gaya dorong
(driving dorce) yang memungkinkan terjadinya perpindahan masa dari satu fasa
ke fasa yang lain melalui membran. Gaya dorong tersebut dapat berupa gradien
atau perbedaan konsentrasi, tekanan, potensial elektrik, atau temperatur
(Mulder 1996).

11

3 METODE
Bahan
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini yaitu isolat
Streptomyces sp. TTA 02 SDS 14 yang diperoleh dari koleksi Puslit Bioteknologi
LIPI. Isolat ini berasal dari Bima, Nusa Tenggara Barat dan diisolasi dari tanah.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2015 sampai bulan
September 2015 dan bertempat di Laboratorium Bioteknologi, Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan
Perikanan (BBP4BKP), Kementrian Kelautan dan Perikanan.
Tahapan Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan, yaitu optimasi produksi enzim
MTGase dan karakterisasi enzim (Gambar 4). Tahapan optimasi produksi enzim
yaitu, optimasi kondisi produksi, optimasi media produksi dan optimasi waktu
produksi enzim. Karakterisasi enzim meliputi pengujian pH optimum, suhu
optimum, ketahanan panas terhadap enzim, pengaruh ion logam, dan pengaruh
inhibitor.
Streptomyces sp.
Optimasi Produksi MTGase
Tellez-Luiz et al. 2004
Bahrim et al. 2010

Tellez-Luiz et al. 2004
Macedo et al. 2007
Aidaroos et al. 2011
Zhu et al. 1996

pH media

a

Optimasi kondisi produksi
b

Suhu inkubasi

Optimasi media produksi
Optimasi waktu produksi
Produksi Enzim
Karakterisasi
Enzim

Penentuan
pH optimum

Penentuan
suhu optimum

Penentuan
stabilitas panas

Gambar 4 Diagram alur penelitian

Pengaruh
ion logam

Pengaruh
inhibitor

12

Optimasi Produksi Enzim MTGase
Penyegaran Isolat Streptomyces sp. Galur SDS 14/LU
Stok kultur dari liofilisasi dilakukan penyegaran dalam media
International Streptomyces Project (ISP-2). Media terdiri atas ekstrak khamir
0,4%, ekstrak malt 1%, dan glukosa 0,4% selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 ˚C
dengan kecepatan agitasi 125 rpm selama 5 hari. Selanjutnya penyegaran kultur
Streptomyces dilakukan pada media ISP agar-agar. Media tersebut dibuat dari
media penyegaran ISP-2 dan ditambahkan agar-agar sebanyak 2% (b/v), isolat
Streptomyces disebar pada media agar-agar selanjutnya diinkubasi pada suhu
30 ˚C selama 5 hari. Penyegaran dilakukan berulang-ulang sebelum digunakan.
Optimasi Kondisi Produksi Enzim MTGase
Optimasi kondisi produksi enzim MTGase dilakukan untuk mendapatkan
suhu dan pH optimum dalam memproduksi enzim oleh Streptomyces sp. Kegiatan
dilakukan dengan cara memvariasikan pH media (6-8) dan suhu inkubasi
(25 ˚C, 30 ˚C, 35 ˚C). Inkubasi dilakukan pada inkubator bergoyang dengan
kecepatan agitasi 125 rpm selama 5 hari. Optimasi media dilakukan dengan
menggunakan media Tellez-luiz et al. 2004.
Optimasi Media Produksi enzim MTGase
Optimasi media produksi dilakukan untuk mendapatkan media produksi
terbaik dari beberapa literatur, sehingga didapatkan media produksi yang
menghasilkan aktivitas enzim yang tinggi. Komposisi media produksi disajikan
pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi media produksi enzim
Komposisi
Media
Pepton
Gliserol
Ekstrak khamir
Na. Kaseinat
MgSO4 · 7H2O
K2HPO4
KH2PO4
Na2HPO4
Tepung kedelai
Tepung jangung
Pati terlarut
NH4 Sulfat
CaCl2
Glukosa

Mediuma
A (%)
1,05
5,05
0,25
2
0,05
0
0,2
0,5
0
0
0
0
0
0

Mediumb
B (%)
1,5
0
0
0
0,1
0
0,2
0,5
2
2
0
0
0
1,5

Mediumc
C (%)
1,05
3,12
0,25
3,84
0,05
0
0,2
0,5
0
0
0
0
0
0

Mediumd
D (%)
1
0
0,2
0
0,2
0
0,4
0
2,5
2
2
0
0
0,2

Mediume
E (%)
2
0
0,5
0
0,2
0,2
0,2
0
0
0
2
2
0,1
0

Mediumf
F (%)
2
0
0,2
0
0,2
0,2
0
2,5
0
0
0
0
0
0,2

Keterangan: a: Tellez-Luiz et al. 2004a; b: Modifikasi Bahrim et al. 2010; c: Tellez-Luiz et al.
2004b, d: Macedo et al. 2007, e: Aidaroos et al. 2011, f: Zhu et al. 1996.

13

Pembuatan starter menggunakan media cair dengan berbagai komposisi
media produksi yang berbeda. Sebanyak 10% starter dimasukkan secara aseptik
pada masing-masing media produksi berisi 50 ml menggunakan erlenmeyer
200 ml. Starter ditumbuhkan pada kondisi produksi optimum dan diinkubasi pada
inkubator bergoyang dengan kecepatan agitasi 125 rpm selama 5 hari. Setiap hari
dilakukan pengambilan sampel kultur setiap 24 jam sebanyak 1,5 ml. Kultur
sampel disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 g pada suhu 4 ˚C selama 15 menit
untuk memperoleh ekstrak kasar enzim. Ekstrak kasar enzim lalu diukur
aktivitasnya.
Optimasi Waktu Produksi Enzim MTGase
Optimasi waktu produksi dilakukan untuk mengetahui waktu optimum
dalam memproduksi enzim dengan aktivitas yang tinggi. Optimasi waktu produksi
ini dimulai dengan menyegarkan isolat Streptomyces sp. pada media yang
mengandung agar-agar selanjutnya diinkubasi pada suhu 25 ˚C selama 5 hari
kemudian sebanyak 0,05 g (b/b) isolat Streptomyces sp. dipindahkan pada media
starter cair lalu diinkubasi pada suhu 25 ˚C selama 3 hari. Sebanyak 10% (v/v)
starter dimasukkan secara aseptik ke dalam media hasil optimasi produksi
(Tabel 1) berisi 15 ml dalam beberapa erlenmeyer 50 ml. Kultur bakteri
diinkubasi dengan kecepatan agitasi 125 rpm dan suhu suhu 25 ˚C selama 6 hari.
Pengamatan dilakukan setiap 12 jam dengan mengambil sampel sebanyak 2 ml
dan menyentrifugasinya dengan kecepatan 8000 g pada suhu 4 ˚C selama 15
menit. Parameter yang diukur pada kegiatan ini yaitu biomassa mikrob dan
aktivitas enzim.
Tujuan pengukuran biomassa yaitu untuk mengetahui waktu yang tepat
untuk mengetahui pola pertumbuhan dari Streptomyces sp. galur SDS 14/LU.
Pengukuran biomassa dilakukan dengan mengukur bobot biomassa sel kering
menggunakan timbangan digital. Endapan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi
dikeringkan dalam oven (105 ˚C) selama 24 jam kemudian ditimbang bobotnya.
Biomassa sel tersebut selanjutnya diplotkan untuk memperoleh kurva
pertumbuhan. Penentuan biomassa ditentukan berdasarkan bentuk kurva yang
dihasilkan. Persamaan dicantumkan untuk memperoleh biomassa bakteri:
Biomassa = (bobot biomassa bakteri+bobot tabung mikro) – bobot tabung mikro
Produksi Enzim MTGase
Produksi enzim MTGase dilakukan dengan menyegarkan isolat
Streptomyces sp. pada media yang mengandung agar-agar selanjutnya diinkubasi
pada suhu 30 ˚C selama 5 hari kemudian sebanyak satu ose isolat
Streptomyces sp. dipindahkan pada media starter cair lalu diinkubasi pada pada
inkubator bergoyang dengan kecepatan agitasi 125 rpm pada suhu 30 ˚C selama 4
hari.
Sebanyak 10% starter kultur bakteri dimasukkan secara aseptik ke dalam
media produksi sebanyak 1000 ml. Kultur bakteri Streptomyces sp. SDS 14/LU
ditumbuhkan pada media optimum sampai tercapai produksi MTGase tertinggi

14

dari hasil pengukuran produksi enzim. Kultur sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 8.000 g pada suhu 4 ˚C selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh
merupakan enzim ekstrak kasar yang akan dipekatkan dengan ultrafiltrasi. Enzim
ekstrak kasar dilakukan filtrasi menggunakan alat ultrafiltrasi Watson Marlow 323
dengan ukuran filter membran 10.000 MWCO dengan luas permukaan filter
110 cm2.
Uji Aktivitas MTGase
Aktivitas MTGase diukur berdasarkan pembentukan hidroksimat dari
N-carbobenzoxyl-L-glutaminilglycine (CBZ) (Ho et al. 2000). Sebanyak 100 µl
sampel supernatan direaksikan dengan substrat (25 µl 0,1 M Glutation, 25 µl 2,0
M Hydroxylamine dan 75 µl 0,1 M N-carbobenzoxyl-L-glutaminilglycine/CBZ)
dan 200 µl 0,1 M bufer Tris asetat pH 6, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C
selama 1 jam dan dihentikan dengan penambahan 425 µL FeCl3 5% (15% TCA
yang mengandung 5% FeCl3). Selanjutnya hasil reaksi diinkubasi kembali pada
suhu 37 ˚C selama 30 menit. Lalu supernatan diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
525 nm. Kurva standar dibuat
dengan menggunakan L-glutamic acid-γ-monohydroxamic acid sebagai standar
(Lampiran 1). Satu unit aktivitas MTGase didefinisikan sebagai jumlah
pembentukan 1 µmol hikdroksamat dalam waktu 1 menit pada suhu 37 ˚C.

Karakterisasi Enzim
Penentuan pH Optimum terhadap Aktivitas Enzim
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan menambahkan 100 µL
ekstrak enzim ultrafiltrasi yang direaksikan dengan 125 µL substrat dan 200 µL
bufer dengan berbagai variasi pH (pH 4-9). Bufer yang digunakan dalam
penentuan pH optimum ialah 200 mM bufer sitrat (pH 4-6), 200 mM bufer fosfat
(pH 6-8), dan 200 mM bufer Tris-HCl (pH 8-9) (El-Hofi et al. 2014). Aktivitas
enzim transglutaminase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.
Penentuan Suhu Optimum terhadap Aktivitas Enzim
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan mereaksikan
100 µL ekstrak enzim ultrafiltrasi dengan 125 µL substrat dan 200 µL bufer pada
pH optimum. Enzim yang telah dicampurkan dengan substrat dan bufer kemudian
diinkubasi pada tingkatan suhu 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 dan 70 ˚C
selama 1 jam waktu inkubasi (El-Hofi et al. 2014). Aktivitas enzim
transglutaminase diukur sesuai dengan prosedur pengujian sebelumnya.
Penentuan Ketahanan Enzim terhadap Panas
Ketahanan aktivitas terhadap panas dilakukan dengan menginkubasi enzim
transglutaminase selama 15, 30, 45, 60, 90, 120, dan 240 menit pada beberapa
variasi suhu yaitu 40, 45, dan 50 ˚C. Kestabilan enzim dilihat dari besarnya

15

persentase penurunan aktivitas relatif dari aktivitas relatif tertinggi (100%) yaitu
pada suhu dan pH optimumnya di kondisi pengujian sebelumnya
(El-Hofi et al. 2014). Aktivitas enzim transglutaminase diukur sesuai dengan
prosedur pengujian sebelumnya.
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Enzim
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim transglutaminase diketahui
dengan menggunakan 1 mM ion logam. Aktivitas diukur pada kondisi optimum
enzim, dan dibandingkan dengan kontrol, yaitu enzim tanpa penambahan ion
logam. Ion logam yang diujikan meliputi kation: Na+, K+, Li+, Cu+, Ca2+, Mg2+,
Zn2+, dan Fe3+ dalam bentuk larutan garam klorida (Lin et al. 2008). Setiap kation
disiapkan 1000 mL dengan konsentrasi 500 mM sebagai larutan stok.
Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim
Pengaruh penambahan inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase
diukur dengan mereaksikan enzim dengan dua konsentrasi inhibitor, yaitu 1 mM
dan 5 mM. Inhibitor yang digunakan yaitu EDTA (ethylenediamine tetraacetic
acid) dan PMSF (phenyl methyl sulfonyl flouride), IAA (iodoacetamide) dan DPB
(dibromoacetophenone) (Suzuki et al. 2000). Kontrol yang digiunakan yaitu
enzim yang tidak ditambahkan inhibitor.

16

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Peremajaan Isolat Streptomyces sp. Galur TTA 02 SDS 14
Isolat TTA 02 SDS 14 yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari
koleksi Puslit Bioteknologi LIPI, isolat ini berasal dari Bima, Nusa Tenggara
Barat yang diisolasi dari tanah (Gambar 5). Isolat TTA 02 SDS 14 yang tumbuh
pada media International Streptomyces Project (ISP-2) merupakan bakteri
Streptomyces sp. yang mampu menghasilkan enzim transglutaminase setelah
dilakukan penapisan dan pengujian enzim. Karakter isolat TTA 02 SDS