Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein
IDENTIFIKASI SPESIES POLEROVIRUS PADA TANAMAN
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
ii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA *
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Identifikasi Spesies
Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat
Protein” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya pada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Ina Rubiatul Hasanah
NIM A34100091
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
ABSTRAK
INA RUBIATUL HASANAH. Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman
Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA.
Selama survei di sentra produksi wortel di Jawa Barat, beberapa tanaman
ditemukan menunjukkan gejala mirip diinduksi virus. Tanaman yang sakit
menunjukkan gejala kemerahan dan kekuningan pada daun, tetapi tanaman tidak
tampak kerdil. Gejala ini mirip dengan penyakit yang telah dilaporkan terdapat di
negara-negara lain, yang disebut “carrot motley dwarf”, dimana gejala
kemerahan, kekuningan, dan pengerdilan sangat jelas. Penyakit ini dilaporkan
disebabkan oleh infeksi campuran dari dua virus yang berbeda, yaitu Carrot red
leaf virus (CtRLV), anggota dari genus Polerovirus dan Carrot mottle mimic virus
(CMoMV), anggota dari genus Umbravirus. Untuk mengetahui agen penyebab
penyakit daun merah di Indonesia, RNA total diekstraksi dari daun tanaman
wortel bergejala yang diperoleh dari pertanaman wortel di Cipanas, Cianjur, Jawa
Barat untuk digunakan dalam proses reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR). Deteksi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer
spesifik untuk CtRLV. Namun virus tersebut gagal dideteksi, kemudian
identifikasi lebih lanjut difokuskan pada virus lain dari spesies Polerovirus
dengan menggunakan sepasang primer CP-F (5'-AATTAAGGATCCAATACG
GGAGGGGTTAGGAGAAAT-3') dan CP-R (5'-AATTAACTGCAGTTTCGG
GTTGTGCAATTGCACAGTA-3'). RT-PCR berhasil mengamplifikasi pita DNA
berukuran sekitar 650 bp, sesuai dengan estimasi ukuran primer yang dirancang.
Produk RT-PCR kemudian disekuen dan 630 nukleotida berhasil dibaca. Analisis
BLAST menunjukkan bahwa virus yang menjadi penyebab penyakit daun merah
pada tanaman wortel di Jawa Barat adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV).
PeVYV adalah virus yang sudah ditemukan menginfeksi cabai di Bali. Hal ini
merupakan laporan pertama mengenai PeVYV yang menginfeksi tanaman wortel
di Indonesia.
Kata kunci: Pepper vein yellow virus, penyakit daun merah, reverse-transcription
polymerase chain reaction.
ABSTRACT
INA RUBIATUL HASANAH. Identification of Polerovirus Species in Carrot by
Analysing The Nucleotide Sequence of Coat Protein Gene. Supervised by GEDE
SUASTIKA.
During survey on central production of carrot in West Java, some plants
were found exhibiting virus-like induced symptoms. The diseased plants showed
reddening and yellowing of leaves, but the plants were unlikely to be stunting.
The symptom was resemble to the disease reported in other countries as „motley
dwarf‟, in which the reddening, yellowing, and stunting is accentuated. The
disease was reported to be caused by mixed infection of two different viruses that
were Carrot red leaf virus (CtRLV), member of genus Polerovirus and Carrot
mottle mimic virus (CMoMV), member of genus Umbravirus. To know the causal
agent of the disease present in Indonesia, total RNA extraced from the symptom
exhibiting carrot plants obtained from field in Cipanas, Cianjur, West Java was
subjected to reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using
primer pair specific to CtRLV. Unfortunately, the virus was failed to be detected
and therefore, further identification was focused on other virus. Using primer pair
of CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) and
CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟), that
were specific to Polerovirus. RT-PCR was successfully amplified a DNA band of
about 650 bp, the size which accordance with the designed primers. The RT-PCR
product was then sequenced and the 630 nucleotides were succesfully read. The
BLAST analysis of the nucleotide sequence revealed that the virus associated with
red leaf disease on carrot in West Java was associated with Pepper vein yellow
virus (PeVYV). PeVYV was a virus found previously infected chilli pepper in
Bali. This is the first report concerning PeVYV infected carrot in Indonesia.
Keywords: Pepper vein yellow virus, red leaf disease, reverse transcriptionpolymerase chain reaction.
IDENTIFIKASI SPESIES POLEROVIRUS PADA TANAMAN
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk melakukan
penelitian tugas akhir
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
: Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel
melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein
Nama Mahasiswa : Ina Rubiatul Hasanah
NIM
: A34100091
Judul Usulan
Disetujui oleh
Dr Ir Gede Suastika, MSc
Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi
Ketua Departemen
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke khadirat Allah SWT yang telah
memberikan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga dapat menyelesaikan skripsi
ini yang berjudul “Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui
Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein”. Penelitian dilakukan di
Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013
sampai Maret 2014.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua serta keluarga
yang selalu memberikan doa, dukungan serta motivasi kepada penulis. Terima
kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Ir Gede Suastika, MSc selaku dosen
pembimbing skripsi yang memberikan banyak saran, pengetahuan, dan dukungan,
Dr Ir Idham Sakti Harahap, MSi selaku dosen pembimbing akademik sekaligus
dosen penguji tamu yang telah memberikan banyak kritik dan saran terhadap
penulis. Terima kasih kepada Fitrianingrum Kurniawati, SP, MSi, Sari Nurulita,
SP, Pak Heru, Mansyur Tri Widodo, dan teman-teman Laboratorium Virologi
yang telah memberikan bimbingan dan membantu selama proses penelitian, serta
teman-teman Proteksi Tanaman angkatan 47 dan teman-teman KC yang telah
memberikan banyak dukungan dan motivasi selama perkuliahan hingga
penelitian.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang perlu diperbaiki dalam
skripsi ini, oleh karena itu penulis membutuhkan kritik dan saran yang bersifat
membangun untuk mencapai tujuan yang diinginkan. Semoga skripsi ini
bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Ina Rubiatul Hasanah
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan
Manfaat Penelitian
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Alat
Metode
Ekstraksi RNA Total
Sintesis Complementary (cDNA)
Amplifikasi DNA
Visualisasi Hasil RT-PCR
Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Virus yang Berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah pada Tanaman
Wortel
Spesies Polerovirus Penyebab Daun Merah pada Tanaman Wortel
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
vii
vii
vii
1
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
5
6
6
7
8
11
12
1
DAFTAR TABEL
1 Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali reaksi
2 Komposisi reaktan Polymerase chain reaction (PCR) untuk satu kali
reaksi
3 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada
tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus
yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel
4 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada
tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang
sudah dilaporkan di beberapa negara lain
4
4
8
9
DAFTAR GAMBAR
1 Gejala pada daun wortel (Daucus carota L) yang ditemukan di
lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun
semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi
kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan
2 Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala
penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman
cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
3 Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan
sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi
PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-ThailandCabai JX427541, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-JapanCabai AB594828, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-ChinaCabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-Cabai AF134484
digunakan sebagai outgroup.
6
7
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida isolat Pepper vein yellow virus
asal Jawa Barat dengan isolat Pepper vein yellow virus asal China,
Israel, Jepang, Taiwan, Thailand, dan India menggunakan program
ClustalW Bioedit V.7.0.5.
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wortel (Daucus carota L) merupakan salah satu tanaman sayuran dari
famili Umbelliferae yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Tanaman ini
berasal dari Asia Tengah yang beriklim sedang. Di Indonesia tanaman ini ditanam
di daerah dataran tinggi (ketinggian 1200-1500 m dpl), terutama di daerah dengan
kondisi yang sesuai bagi pertumbuhannya, yaitu suhu optimum sekitar 15 sampai
21oC, pH tanah netral, drainase baik, dan bahan organik yang cukup (BPPP 2012).
Jawa Barat merupakan salah satu sentra produksi wortel di Indonesia.
Produktivitas wortel daerah ini tercatat pada tahun 2011 hingga 2013 adalah
sekitar 17 ton/ha lebih tinggi dari rata-rata produksi secara nasional yang hanya
sekitar 15 ton/ha pada tahun yang sama (BPS 2013). Produktivitas tanaman wortel
sebesar ini tampaknya masih lebih rendah dari potensi produktivitas varietas yang
dibudidayakan yaitu sebesar 20-25 ton/ha (Rukmana 1995). Hal tersebut dapat
disebabkan oleh berbagai faktor, seperti kondisi lingkungan biotik dan abiotik
yang tidak sesuai. Faktor biotik yang dapat berpengaruh terhadap produksi wortel
adalah organisme pengganggu tumbuhan (OPT). Patogen merupakan salah satu
OPT yang sulit dikendalikan. Beberapa penyakit pada tanaman wortel di
Indonesia yang telah tercatat, antara lain bercak daun cercospora (Cercospora
carotae), embung tepung (Oidium sp.), dan busuk daun bakteri (Erwinia
carotovora pv. carotovora) (Semangun 1996).
Beberapa virus juga telah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di
berbagai negara, seperti Carrot latent virus (CtLV), Carrot mosaic virus (CtMV),
Carrot mottle mimic virus (CMoMV), Carrot mottle virus (CMoV), Carrot red
leaf virus (CtRLV), Carrot temperate virus (CtTV), Carrot thin leaf virus
(CTLV), dan Carrot yellow leaf virus (CYLV) (Fauquet et al. 2005).
Pada tanaman wortel penyakit yang disebut Carrot motley dwarf banyak
dilaporkan di beberapa negara seperti Australia, Eropa, Jepang, Israel, Amerika
Utara, Inggris, Belgia, dan di Afrika (Bunwaree et al. 2009). Penyakit ini
dilaporkan disebabkan oleh asosiasi antara CtRLV dari genus Polerovirus dan
CMoMVdari genus Umbravirus (Murant et al. 1985). Infeksi kedua virus ini
secara bersama-sama menyebabkan daun wortel menguning sampai kemerahan,
pertumbuhan tanaman terhambat hingga nampak kerdil, dan dapat menyebabkan
kehilangan hasil yang cukup signifikan (Bunwaree et al. 2009). Di Indonesia,
gejala penyakit seperti di atas sudah banyak ditemukan di beberapa daerah sentra
produksi wortel di Jawa Barat (pengamatan penulis), namun laporan mengenai
penyebabnya belum pernah ada. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk
mengidentifikasi virus yang menyebabkan gejala kuning kemerahan pada tanaman
wortel yang ditemukan di Jawa Barat.
Metode molekuler banyak digunakan untuk mengidentifikasi maupun
mendiagnosis penyakit yang disebabkan oleh virus. Salah satu metode tersebut
adalah polymerase chain reaction (PCR). Teknik ini dapat bekerja secara cepat,
spesifik, dan sensitif (Narayanasamy 2011). Teknik lain yaitu reverse
transcription (RT)-PCR digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus
yang memiliki komponen genetik RNA. Hasil amplifikasi DNA kemudian
disekuen untuk mengetahui urutan basa nukleotida virus tersebut.
2
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi spesies Polerovirus penyebab
penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat melalui RT-PCR dan
sekuen nukleotida.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel, sehingga dapat digunakan
sebagai dasar dalam menentukan rekomendasi pengendalian di lapangan.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Survei dan pengambilan sampel tanaman wortel yang bergejala dilakukan di
pertanaman wortel di daerah Cipanas-Cianjur, Lembang-Bandung Barat, dan
Cikajang-Garut. Identifikasi virus dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013 hingga Maret 2014.
Metode Penelitian
Ekstraksi RNA Total
Ekstraksi RNA total dilakukan dengan menggunakan RNeasy Plant Mini
Kits (Phille Korea Technology). Sebanyak 0.1 gram daun wortel bergejala digerus
dalam nitrogen cair dengan mortar dan pistil dengan penambahan nitrogen cair,
kemudian ditambahkan 500 µL Plant RNA Lysis Solution dan 5 µL (1%) βmerkaptoetanol. Sap dimasukkan ke dalam tabung effendorf (volume 1.5 ml) dan
diinkubasi pada suhu 56 oC selama 3 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan
14 000 rpm (20 000 x g) selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung effendorf baru dan ditambahkan 250 µL etanol 96%. Siapan dipindahkan
ke dalam kolom purifikasi dan disentifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12
000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 700 µL Wash
buffer 1 pada kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g)
selama 1 menit. Supernatan dibuang kembali lalu ditambahkan 500 µL Wash
buffer 2 pada kolom dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 11 000 rpm (12
000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang dan diulangi langkah sebelumnya,
lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya,
dipindahkan ke kolom purifikasi pada tabung effendorf baru, kemudian
tambahkan 50 µL Nuclease free water pada bagian tengah kolom purifikasi lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Hasil
ekstraksi RNA disimpan di dalam -80 oC sebelum digunakan.
Sintesis Complementary (c) DNA
Reaksi reverse transcription (RT) atau transkipsi balik merupakan proses
yang digunakan untuk merubah RNA menjadi DNA. Hasil dari proses RT berupa
DNA komplemen. Adapun komposisi yang digunakan dalam reaksi RT terdapat
pada Tabel 1. Proses RT merupakan salah satu tahapan PCR. Komponen genetik
berupa RNA harus ditranskripsi balik menjadi DNA komplemen (cDNA)
menggunakan enzim reverse transcriptase, kemudian cDNA diamplifikasi
menggunakan teknik PCR.
4
Tabel 1 Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali
reaksi (Thermo Scientific, US).
Komponen
Volume (µL)
ddH2O
3.70
Buffer RT
2.00
dNTPS
0.50
dTT
0.35
MMULV
0.35
RNAse inhibitor
0.35
Random hexamer
0.75
RNA
2.00
Total volume
10.00
Amplifikasi DNA
Reaksi PCR digunakan untuk memperbanyak pita cDNA yang telah
terbentuk dari proses RT. Adapun komposisi bahan yang digunakan dalam PCR
terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi reaktan polymerase chain reaction (PCR) untuk satu
kali reaksi (Thermo Scientific, US).
Komponen
Volume (µL)
Dream taq MM
12.50
Primer F
1.00
Primer R
1.00
ddH2O
8.50
cDNA
2.00
Total volume
25.00
Program PCR terdiri atas tahapan pradenaturasi pada suhu 94 oC selama 5
menit, 35 siklus untuk denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 94 oC
selama 30 detik, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 50 oC selama 1
menit untuk, dan elongasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72 oC selama 1
menit, tahap pascaelongasi pada72 oC selama 10 menit, dan penyimpanan pada
suhu 4 oC.
Visualisasi Hasil RT-PCR
Visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 1%.
Pembuatan gel dilakukan dengan 0.3 g agarose dicampur dengan 30 ml buffer
TBE 10% (Tris boric acid EDTA) dan dipanaskan dengan microwave selama 3
menit. Setelah itu, larutan agarose didinginkan hingga hangat kuku, kemudian
larutan tersebut dituangkan ke dalam cetakan dan didiamkan hingga padat. Setelah
gel terbentuk, DNA ladder 1 kb (Thermo Scientific, US) sebanyak 5 µL
dimasukkan ke dalam sumur gel dan 7 μL DNA hasil PCR ke dalam masingmasing sumur gel.
Gel agarose kemudian dimasukkan ke dalan mesin elektroforesis dan
dilakukan elektroforesis dengan voltase 100 V selama 30 menit. Hasil
elektroforesis kemudian direndam pada larutan ethidium bromide selama 15
5
menit, gel direndam di dalam air selama 5 menit, divisualisasi dengan UV
transiluminator, dan didokumentasikan.
Analisis Sekuensing Nukleotida dan Filogenetika
Analisis sekuen nukleotida dilakukan dengan pembuatan produk PCR
sampel yang positif mengandung virus sebanyak 50 μL. Sampel tersebut
kemudian dikirim ke PT Genetika Science Indonesia untuk dilakukan sekuen
nukleotida.
Hasil sekuen nukleotida kemudian digunakan untuk analisis kesejajaran
dengan sikuen nukleotida lain yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan
program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) (NCBI 2014). Data
sekuen nukleotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan analisis spesifisitas
nukleotida dilakukan dengan program multiple alignment, ClustalW dengan
software Bioedit V7.0.5. Analisis filogenetika dilakukan dengan menggunakan
program CLC sequence viewer 6.7.1 berdasarkan pendekatan Unweighted Pair
Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA).
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Survei telah dilakukan di beberapa lokasi pertanaman wortel di CipanasCianjur, Lembang-Bandung Barat, dan Cikajang-Garut. Beberapa tanaman wortel
di lahan petani ditemukan gejala yang memperlihatkan seperti terinfeksi virus.
Daun-daun tanaman wortel yang sakit berubah warna secara bertahap dari kuning
menjadi merah kemudian ungu. Daun-daun yang lebih tua berwarna kuning,
kemudian daun-daun yang lebih atas (muda) memperlihatkan perubahan warna
menjadi kemerahan, dan daun-daun yang lebih muda lagi menjadi ungu. Daundaun yang paling muda (pucuk) umumnya tetap berwarna hijau. Warna merah
keunguan pada tanaman sakit tampak sangat dominan, sehingga pada laporan ini
disebut „Penyakit daun merah‟.
A
B
C
Gambar 1 Gejala pada daun wortel (Daucus carota L) yang ditemukan di
lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun
semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi
kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan.
Gejala penyakit daun merah yang terjadi pada tanaman wortel di Jawa Barat
ini sangat mirip dengan deskripsi gejala penyakit Carrot motley dwarf (CMD)
yang telah dilaporkan di beberapa negara penghasil wortel dunia (Bunwaree et al.
2009). Menurut Murant et al. 1985, CMD dapat disebabkan oleh asosiasi dari
CtRLV dari genus Polerovirus dan CMoMV dari genus Umbravirus. Penyakit ini
dapat disebabkan oleh infeksi tunggal dari CtRLV maupun kombinasi dengan
CMoMV. CtRLV merupakan helper dari CMoMV dalam hal penularannya
melalui serangga vektor. Kedua virus ini persisten di dalam tubuh serangga
vektornya, yaitu kutu Cavariella aegopodii (Elnagar et al. 2008).
Walaupun karakteristik gejala penyakit daun merah dan CMD relatif mirip,
namun terdapat perbedaan yang signifikan dalam hal penghambatan pertumbuhan
tanaman. Pada CMD karakter dwarf (kerdil) menjadi hal yang dominan, namun
pada penyakit daun merah tidak terlihat perbedaan tinggi antara tanaman sakit dan
tanaman sehat (data tidak diperlihatkan). Banyak faktor yang mungkin
berhubungan dengan perbedaan gejala ini, seperti akibat reaksi varietas tanaman
wortel yang berbeda, isolat virus atau mungkin juga jenis virus yang berbeda, dan
kondisi lingkungan yang berbeda.
7
Virus yang berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah
pada Tanaman Wortel
Berdasarkan simptomatologi, penyakit daun merah pada tanaman wortel
yang ditemukan di Jawa Barat diduga sama dengan CMD yang telah dilaporkan
terjadi di beberapa negara penghasil wortel dunia. Pada penelitian ini, deteksi
virus difokuskan pada deteksi CtRLV dan CMoMV yang telah diketahui
berasosiasi dengan penyakit CMD.
Deteksi virus telah dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan primer
spesifik untuk CtRLV (Morton et al. 2003) dan CMoMV (Bunwaree et al. 2009).
RT-PCR telah dilakukan beberapa kali terhadap RNA total yang diekstraksi dari
contoh tanaman wortel sakit yang berbeda. Pita DNA tidak teramplifikasi (data
tidak ditampilkan). Banyak faktor yang dapat menyebabkan RT-PCR gagal
menghasilkan pita DNA yang diharapkan, salah satunya adalah tidak adanya RNA
virus target dalam RNA total yang digunakan sebagai template. Hal ini berarti
bahwa CtRLV dan CMoMV tidak ditemukan pada tanaman wortel sampel. Hasil
ini mengindikasikan bahwa CtRLV maupun CMoMV mungkin bukan merupakan
penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat.
Spesies Polerovirus yang pernah dilaporkan sudah terdapat di Indonesia
adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV) yang ditemukan menginfeksi tanaman
cabai di daerah Bali (Suastika et al. 2012). Primer yang didesain untuk
mengamplifikasi gen coat protein (CP) secara utuh telah tersedia di Laboratorium
Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Primer tersebut adalah
CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) dan
CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟) yang
mempunyai prediksi produk PCR sebesar ±650 pb. RT-PCR yang telah dilakukan
menggunakan primer ini mengamplifikasi DNA berukuran sesuai dengan prediksi
dan sama dengan hasil amplifikasi PeVYV isolat cabai yang digunakan sebagai
kontrol positif (Gambar 2). Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa
kemungkinan spesies virus yang berasosiasi dengan penyakit klorosis pada
tanaman cabai di Bali sama dengan spesies virus yang bersosiasi dengan penyakit
daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat. Isolat virus ini untuk selanjutnya
disebut PeVYV-WJC.
M
75
2
P
K-
I
±
±650 pb
Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala
penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman
cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
8
Spesies Polerovirus Penyebab Penyakit Daun Merah
pada Tanaman Wortel
Produk RT-PCR dari sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah
berhasil disekuen di PT Genetika Science, Indonesia. Hasil sekuen nukleotida
tersebut (lampiran) terdiri dari pita DNA berukuran sekitar 630 pb sesuai dengan
estimasi ukuran pita DNA hasil RT-PCR. Analisis tingkat homologi sekuen
nukleotida merupakan cara yang sahih digunakan untuk mengidentifikasi spesies
virus (Barton 1998). Pada analisis tersebut sekuen nukleotida PeVYV-WJC
dibandingkan dengan sekuen nukleotida padanannya dari spesies virus yang telah
dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel, yaitu CtRLV (Huang et al. 2005),
CMoV (Menzel et al. 2008), CMoMV (Gibbs et al. 1996), CTLV (Xu et al.
2012), CYLV (Menzel et al. 2009), danPeVYV dari genus Polerovirus yang
menginfeksi tanaman cabai (Murakami et al. 2005).
.
Tabel 3 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman
wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus yang sudah
dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.
No Aksesi
AB594828
NC_006265
NC_011515
NC_001726
JX156435
NC_013007
Spesies virus
Homologi (%)
PeVYV
CtRLV
CMoV
CMoMV
CTLV
CYLV
97.4
59.4
33.3
29.6
37.5
42.0
Hasil perbandingan (Tabel 3) menunjukkan bahwa virus yang berasosiasi
dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat memiliki tingkat
kesamaan sekuen nukleotida yang sangat rendah, yaitu kurang dari 60% dengan
CtRLV, virus yang semula diduga sebagai penyebab penyakit daun merah.
Spesies virus lain yang telah dilaporkan dapat menginfeksi wortel di luar negeri,
seperti CMoV, CMoMV, CTLV, dan CYLV masing-masing hanya memiliki
homologi kurang dari 50%. Hal tersebut mengindikasikan bahwa virus penyebab
penyakit daun merah pada wortel di Jawa Barat bukan salah satu spesies virus
yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di belahan lain dunia.
Hasil yang tidak terduga dari penelitian ini adalah bahwa virus yang diteliti ini
merupakan salah satu isolat PeVYV yang hanya dilaporkan dapat menginfeksi
tanaman cabai karena memiliki tingkat homologi yang sangat tinggi, yaitu 97.4%
(Tabel 3).
PeVYV merupakan virus famili Luteoviridae dan genus Polerovirus. Virus
dari famili ini memiliki genom berupa RNA (ssRNA) dan partikel berbentuk
isometrik (Agrios 2005). Virus ini tidak dapat ditularkan secara mekanis melalui
sap tanaman, tetapi ditularkan dan disebarkan melalui vektor. Vektor dari virus ini
merupakan kutudaun dan virus ini persisten di dalam tubuh serangga (Walkey
1991).
9
Tabel 4 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman
wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang sudah
dilaporkan oleh beberapa negara lain.
No
1
2
3
4
5
6
7
Homologi (%)
1
2
3
4
5
PeVYV-WJC-JawaBarat-Wortel ID 91.6 92.5 97.4 97.2
PeVYV-China-Cabai
ID
90.9 93.1 93.7
PeVYV-Israel-Cabai
ID
94.2 94.2
PeVYV-Japan-Cabai
ID
99.4
PeVYV-Taiwan-Cabai
ID
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Nama Isolat
6
97.0
93.7
94.2
98.1
98.3
ID
7
96.4
93.1
93.8
97.9
98.1
99.4
ID
Hasil analisis dengan program BLAST dan BioEdit v 7.05 memastikan
bahwa PeVYV-WJC mempunyai tingkat homologi sekuen nukleotida pada daerah
CP lebih dari 90% dengan semua PeVYV isolat cabai (Capsicum spp.) yang
dilaporkan di Jepang, Israel, Taiwan, Thailand, dan China, serta PeVYV pada
tanaman ranti (Solanum nigrum) di India (Knierim et al. 2012) (Tabel 4).
Gambar 3 Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan
sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi
PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-ThailandCabai JX427541, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-JapanCabai AB594828, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-ChinaCabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-Cabai AF134484 digunakan
sebagai outgroup.
Analisis pohon filogenetika menunjukkan bahwa PeVYV-WJC isolat wortel
asal Jawa Barat memiliki kekerabatan yang dekat dengan isolat PeVYV asal
India, Thailand, Taiwan, dan Jepang yang berada dalam satu kelompok yang
sama. Hasil analisis filogenetika ini mengindikasikan bahwa PeVYV-WJC
mungkin merupakan hasil adaptasi virus yang berasal dari negara-negara tersebut
yang terbawa melalui bahan tanaman cabai ke Indonesia. Dugaan ini didukung
oleh fakta bahwa di Indonesia, tepatnya di daerah Bali, baru-baru ini sudah
ditemukan PeVYV pada tanaman cabai (Suastika et al. 2012). Kutudaun yang
10
berperan sebagai serangga vektor PeVYV adalah Aphis gossypii (Murakami et al.
2005). Serangga ini merupakan hama tanaman cabai, namun dapat ditemukan juga
pada tanaman wortel (Blackman et al. 1941). Hal tersebut memungkinkan A.
gossypii menjadi vektor untuk menularkan virus ini dari tanaman cabai ke
tanaman wortel.
11
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil sekuen nukleotida dapat disimpulkan bahwa spesies
Polerovirus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel
adalah Pepper vein yellow virus. Virus ini memiliki kekerabatan paling dekat
dengan PeVYV isolat cabai.
Saran
Perlu dilakukan survei dan pemetaan penyakit daun merah yang disebabkan
oleh PeVYV di seluruh pertanaman wortel di Indonesia agar dapat diketahui
kejadian penyakit dan akibat dari infeksi virus ini terhadap penurunan produksi
wortel.
12
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5thed. New York (US): Academic Press.
Barton GJ. 1998. Protein sequence alignment techniques. Acta Cryst. D54:1139-1146.
Blackman RL, Fastop VF. 1941. Aphids on The World’s Crop. 2nd ed. London (GB):
The Natural History Museum.
[BPPP] Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 2012. Teknologi
Budidaya Sayuran. Jakarta (ID): Pusat Perpustakaan dan Penyebaran
Teknologi Pertanian, Kementrian Pertanian.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2013. Luas panen, produksi, dan produktivitas
wortel, 2011-2012 [Internet]. [diunduh 2014 Maret 11]. Tersedia pada:
http://www.bps.go.id/tab_sub/view.php?kat=3&tabel=1&daftar=1&id_suby
ek=55¬ab=65.
Bunwaree AG, Menzel W, Winter S, Vally V, Seewoogoolam R, Madhu SPB.
2009. First report of Carrot red leaf virus and Carrot mottle virus, causal
agents of Carrot motley dwarf, in carrot in Mauritius. J APS Net.
93(11):1218. doi: http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-93-11-1218B.
Elnagar S, Murant AF. 1978. Relations of carrot red leaf and carrot mottle virus
with thei aphid vector, Caveriella aegopodii. Ann Appl Biol. 89(2):237-244.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. 2005. Virus Taxonomy
Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San
Diego (US): Virology Division International Union of Microbiological
Societies.
Gibbs MJ, Cooper JI, Waterhouse PM. 1996. The genome organization and
affinities of an Australian isolate of carrot mottle umbravirus. J Virol. 224
(1):310-313.
Huang LF, Naylor M, Pallet DW, Reeves J, Cooper JI, Wang H. 2005. The
complete genome sequence, organization and affinities of Carrot red leaf
virus. Arch Virol. 150:1845-1855. doi: 10.1007/s00705-005-0537-6.
Knierim D, Tsai WS, Kenyon L. 2012. Analysis of sequences from field samples
reveals the presence of the recently described Pepper vein yellows virus
(genus Polerovirus) in six additional countries. Arch Virol. 158(6):137-41.
doi: 10.007/s00705-012-1598-y.
Menzel W, Mais E, Vetten HJ. 2008. Complete nucleoide sequence of a carrot
isolate of Carrot mottle virus from Germany. Arch Virol. 153(11):21632165.
Menzel W, Goetz R, Lesemann DE, Vetten HJ. 2009. Molecular characterization
of a Closterovirus from carrot and its identification as a German isolate
of Carrot yellow leaf virus. Arch Virol. 154(8):1343-1347.
Morton A, Spence NJ, Boonham N, Barbara DJ. 2003. Carrot red leaf assosiated
RNA in carrots in the United Kingdom. Plant Pathology. 52(1):795.
Murakami R, Nakshima N, Hinomoto N, Kawano S, Toyosato T. 2011. The
genome sequence of Pepper vein yellow virus (family Luteoviridae, genus
Polerovirus). Arch Virol. 156(5):921-923. doi: 10.007/s00705-011-0956-5.
Murant AF, Waterhouse PM, Raschke JH, Robinson D.J. 1985. Carrot red leaf
and Carrot mottle virus: Observations on the composition of the particles in
single and mixed infection. J Gen Virol. 66(7):1575-1579.
13
Narayanasamy P. 2011. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease
Diagnosis. Edisi ke-3. New York (US): Springer.
Rukmana R. 1995. Bertanam Wortel. Yogyakarta (ID): Kanisius.
Semangun H. 1996. Penyakit-Penyakit Tanaman Hortikultura. Yogyakarta (ID):
Gadjah Mada University Press.
Suastika G, Hartono S, Nyana IDN, Natsuaki T. 2012. Laporan Pertama tentang
Infeksi Polerovirus pada Tanaman Cabai di Daerah Bali, Indonesia.J
FitopatolIndones. 8(5):151-154.
Xu D, Liu HY, Li F, Tian T, Li R. 2012. Biological and molecular
characterization of Carrot thin leaf virus. [Internet]. [diunduh 24 April
2014]. Tersedia pada: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/465159049.
Walkey DGA. 1991. Applied Plant Virology. London (GB): Chapman and Hall.
14
LAMPIRAN
15
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5
15
25
35
ATTAAGGATC CAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGC GGAGCTAGGA GAAACAACAA
GATCGTTAAT GAATACGGAA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAACAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA
*
*
*******
** * ***** **** ** **
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
45
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
**********
....|....|
55
GGATCACGTA
GGATCACGAA
GGATCACGCG
GGATCACGTA
GGATCACGTA
GGATCACGTA
GGATCACGTA
********
....|....|
65
ACACCCGCCG
GCACCCGCCG
GCACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
*********
....|....|
75
TCGTAGACGC
TCGCAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
*** ******
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
85
CCACGACAGG
CCAAGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGA
*** *****
....|....|
95
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
**********
....|....|
105
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
**********
....|....|
115
GCACCCCCTG
GCACCCTCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
ACACCCCCTG
***** ***
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
125
GGCGCACACG
GGACAGCACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
**
****
....|....|
135
GCGAGGAAAT
GCGTGGAGGT
GCGGGGAAAT
GCGAGGAAAT
GCGAGGAAAT
GCGCGGAAAT
GCGCGGAAAT
*** *** *
....|....|
145
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
**********
....|....|
155
GAAATGGAGG
GAAGTGGAGG
GAAGTGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
*** ******
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
165
CCGGAACCGA
CCGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
* ********
....|....|
175
AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAG
A--------AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAG
AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAA
*
....|....|
185
ATAGAGTTGG
ATGGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATGGAGTTGG
ATGGAGTTGG
** *******
....|....|
195
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
**********
16
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
205
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
**********
....|....|
215
AAACTTTCGT
AGACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCGT
AAACTTTCGT
* ****** *
....|....|
225
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
**********
....|....|
235
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
245
AGGATAGTTC
AGGATGGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
***** ****
....|....|
255
CTCAGGAGCT
CTCAGGAGCT
CTCAGGAACT
CTCAGGATCT
CTCAGGATCT
CTCAGGAGCT
CTCAGGATCT
******* **
....|....|
265
GTCACCTTCG
ATCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
*********
....|....|
275
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
285
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
**********
....|....|
295
ATCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
*********
....|....|
305
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
**********
....|....|
315
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
325
TACCATGAAT
TACCATGAGT
TACCATGAGT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
******** *
....|....|
335
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAAATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
**** *****
....|....|
345
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTTAAT
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
****** **
....|....|
355
ATACGCTTCG
ATACGCTTCA
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
*********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
365
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGCGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
**** *****
....|....|
375
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
TTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
*********
....|....|
385
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAAGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
***** ****
....|....|
395
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
**********
17
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-Chin-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
405
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
**********
....|....|
415
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
**********
....|....|
425
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
**********
....|....|
435
TCTCCAATCC
CCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
*********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
445
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGCA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGCA
ACCCTGCGCA
******** *
....|....|
455
AATTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
* ********
....|....|
465
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
**********
....|....|
475
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCTA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
******** *
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-Chin-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
485
CTTTTCGGGC
CGTTCCGGGC
CCTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
* ** *****
....|....|
495
TTCGCAGATT
TGCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
* ********
....|....|
505
AACGGGGTAG
AATGGGGTAG
AATGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
** *******
....|....|
515
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCACGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
******* **
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
525
TACATCCGAA
TACAGCTGAA
TACATCTGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
**** * ***
....|....|
535
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTCA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
******** *
18
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purwakarta pada tanggal 06 September 1992, anak
sulung dari pasangan Bapak Yayat Hidayat dan Ibu Eli Setia Nurul Hilal. Penulis
telah menempuh pendidikan di TK Sejahtera pada tahun 1998, SD Negeri 2
Wanayasa pada tahun 2004, SMP Negeri 1 Wanayasa pada tahun 2007, dan SMA
Negeri 1 Purwakarta pada tahun 2010, pada tahun yang sama penulis diterima di
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Ujian talenta mandiri IPB (UTMI).
Selama menjadi mahasiswa IPB, pada tahun 2011 penulis menjadi anggota
dari Leadership and enterpreneurship school IPB angkatan V dan pada tahun
2012 menjadi anggota dari staf Fundrising LES angkatan VI. Pada tahun 2012
dan 2013 penulis menjadi anggota kepengurusan dari Himpunan mahasiswa
Proteksi Tanaman (Himasita) IPB. Penulis juga mengikuti kepanitiaan di beberapa
kegiatan IPB, Fakultas Pertanian, dan Departemen Proteksi Tanaman. Penulis
pernah menjadi juara 2 lomba lari maraton pada ajang lomba SERI-A 2012. Pada
semester ganjil tahun ajaran 2013-2014 penulis menjadi asisten praktikum mata
kuliah Hama dan Penyakit Tanaman Pangan dan Hortikultura dan pada semester
genap tahun ajaran 2014 penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Hama
Gudang dan Pemukiman, Ilmu Penyakit Tumbuhan Dasar, dan Dasar-dasar
Proteksi Tanaman.
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
ii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA *
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Identifikasi Spesies
Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat
Protein” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya pada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Ina Rubiatul Hasanah
NIM A34100091
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
ABSTRAK
INA RUBIATUL HASANAH. Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman
Wortel melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein. Dibimbing oleh
GEDE SUASTIKA.
Selama survei di sentra produksi wortel di Jawa Barat, beberapa tanaman
ditemukan menunjukkan gejala mirip diinduksi virus. Tanaman yang sakit
menunjukkan gejala kemerahan dan kekuningan pada daun, tetapi tanaman tidak
tampak kerdil. Gejala ini mirip dengan penyakit yang telah dilaporkan terdapat di
negara-negara lain, yang disebut “carrot motley dwarf”, dimana gejala
kemerahan, kekuningan, dan pengerdilan sangat jelas. Penyakit ini dilaporkan
disebabkan oleh infeksi campuran dari dua virus yang berbeda, yaitu Carrot red
leaf virus (CtRLV), anggota dari genus Polerovirus dan Carrot mottle mimic virus
(CMoMV), anggota dari genus Umbravirus. Untuk mengetahui agen penyebab
penyakit daun merah di Indonesia, RNA total diekstraksi dari daun tanaman
wortel bergejala yang diperoleh dari pertanaman wortel di Cipanas, Cianjur, Jawa
Barat untuk digunakan dalam proses reverse transcription-polymerase chain
reaction (RT-PCR). Deteksi dilakukan dengan menggunakan pasangan primer
spesifik untuk CtRLV. Namun virus tersebut gagal dideteksi, kemudian
identifikasi lebih lanjut difokuskan pada virus lain dari spesies Polerovirus
dengan menggunakan sepasang primer CP-F (5'-AATTAAGGATCCAATACG
GGAGGGGTTAGGAGAAAT-3') dan CP-R (5'-AATTAACTGCAGTTTCGG
GTTGTGCAATTGCACAGTA-3'). RT-PCR berhasil mengamplifikasi pita DNA
berukuran sekitar 650 bp, sesuai dengan estimasi ukuran primer yang dirancang.
Produk RT-PCR kemudian disekuen dan 630 nukleotida berhasil dibaca. Analisis
BLAST menunjukkan bahwa virus yang menjadi penyebab penyakit daun merah
pada tanaman wortel di Jawa Barat adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV).
PeVYV adalah virus yang sudah ditemukan menginfeksi cabai di Bali. Hal ini
merupakan laporan pertama mengenai PeVYV yang menginfeksi tanaman wortel
di Indonesia.
Kata kunci: Pepper vein yellow virus, penyakit daun merah, reverse-transcription
polymerase chain reaction.
ABSTRACT
INA RUBIATUL HASANAH. Identification of Polerovirus Species in Carrot by
Analysing The Nucleotide Sequence of Coat Protein Gene. Supervised by GEDE
SUASTIKA.
During survey on central production of carrot in West Java, some plants
were found exhibiting virus-like induced symptoms. The diseased plants showed
reddening and yellowing of leaves, but the plants were unlikely to be stunting.
The symptom was resemble to the disease reported in other countries as „motley
dwarf‟, in which the reddening, yellowing, and stunting is accentuated. The
disease was reported to be caused by mixed infection of two different viruses that
were Carrot red leaf virus (CtRLV), member of genus Polerovirus and Carrot
mottle mimic virus (CMoMV), member of genus Umbravirus. To know the causal
agent of the disease present in Indonesia, total RNA extraced from the symptom
exhibiting carrot plants obtained from field in Cipanas, Cianjur, West Java was
subjected to reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using
primer pair specific to CtRLV. Unfortunately, the virus was failed to be detected
and therefore, further identification was focused on other virus. Using primer pair
of CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) and
CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟), that
were specific to Polerovirus. RT-PCR was successfully amplified a DNA band of
about 650 bp, the size which accordance with the designed primers. The RT-PCR
product was then sequenced and the 630 nucleotides were succesfully read. The
BLAST analysis of the nucleotide sequence revealed that the virus associated with
red leaf disease on carrot in West Java was associated with Pepper vein yellow
virus (PeVYV). PeVYV was a virus found previously infected chilli pepper in
Bali. This is the first report concerning PeVYV infected carrot in Indonesia.
Keywords: Pepper vein yellow virus, red leaf disease, reverse transcriptionpolymerase chain reaction.
IDENTIFIKASI SPESIES POLEROVIRUS PADA TANAMAN
WORTEL MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA
GEN COAT PROTEIN
INA RUBIATUL HASANAH
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk melakukan
penelitian tugas akhir
pada
Departemen Proteksi Tanaman
DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
: Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel
melalui Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein
Nama Mahasiswa : Ina Rubiatul Hasanah
NIM
: A34100091
Judul Usulan
Disetujui oleh
Dr Ir Gede Suastika, MSc
Dosen Pembimbing
Diketahui oleh
Dr Ir Abdjad Asih Nawangsih, MSi
Ketua Departemen
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke khadirat Allah SWT yang telah
memberikan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga dapat menyelesaikan skripsi
ini yang berjudul “Identifikasi Spesies Polerovirus pada Tanaman Wortel melalui
Analisis Sekuen Nukleotida Gen Coat Protein”. Penelitian dilakukan di
Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013
sampai Maret 2014.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua serta keluarga
yang selalu memberikan doa, dukungan serta motivasi kepada penulis. Terima
kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Ir Gede Suastika, MSc selaku dosen
pembimbing skripsi yang memberikan banyak saran, pengetahuan, dan dukungan,
Dr Ir Idham Sakti Harahap, MSi selaku dosen pembimbing akademik sekaligus
dosen penguji tamu yang telah memberikan banyak kritik dan saran terhadap
penulis. Terima kasih kepada Fitrianingrum Kurniawati, SP, MSi, Sari Nurulita,
SP, Pak Heru, Mansyur Tri Widodo, dan teman-teman Laboratorium Virologi
yang telah memberikan bimbingan dan membantu selama proses penelitian, serta
teman-teman Proteksi Tanaman angkatan 47 dan teman-teman KC yang telah
memberikan banyak dukungan dan motivasi selama perkuliahan hingga
penelitian.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang perlu diperbaiki dalam
skripsi ini, oleh karena itu penulis membutuhkan kritik dan saran yang bersifat
membangun untuk mencapai tujuan yang diinginkan. Semoga skripsi ini
bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Ina Rubiatul Hasanah
vii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan
Manfaat Penelitian
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Alat
Metode
Ekstraksi RNA Total
Sintesis Complementary (cDNA)
Amplifikasi DNA
Visualisasi Hasil RT-PCR
Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Virus yang Berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah pada Tanaman
Wortel
Spesies Polerovirus Penyebab Daun Merah pada Tanaman Wortel
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
vii
vii
vii
1
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
5
6
6
7
8
11
12
1
DAFTAR TABEL
1 Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali reaksi
2 Komposisi reaktan Polymerase chain reaction (PCR) untuk satu kali
reaksi
3 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada
tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus
yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel
4 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada
tanaman wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang
sudah dilaporkan di beberapa negara lain
4
4
8
9
DAFTAR GAMBAR
1 Gejala pada daun wortel (Daucus carota L) yang ditemukan di
lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun
semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi
kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan
2 Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala
penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman
cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
3 Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan
sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi
PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-ThailandCabai JX427541, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-JapanCabai AB594828, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-ChinaCabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-Cabai AF134484
digunakan sebagai outgroup.
6
7
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida isolat Pepper vein yellow virus
asal Jawa Barat dengan isolat Pepper vein yellow virus asal China,
Israel, Jepang, Taiwan, Thailand, dan India menggunakan program
ClustalW Bioedit V.7.0.5.
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wortel (Daucus carota L) merupakan salah satu tanaman sayuran dari
famili Umbelliferae yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Tanaman ini
berasal dari Asia Tengah yang beriklim sedang. Di Indonesia tanaman ini ditanam
di daerah dataran tinggi (ketinggian 1200-1500 m dpl), terutama di daerah dengan
kondisi yang sesuai bagi pertumbuhannya, yaitu suhu optimum sekitar 15 sampai
21oC, pH tanah netral, drainase baik, dan bahan organik yang cukup (BPPP 2012).
Jawa Barat merupakan salah satu sentra produksi wortel di Indonesia.
Produktivitas wortel daerah ini tercatat pada tahun 2011 hingga 2013 adalah
sekitar 17 ton/ha lebih tinggi dari rata-rata produksi secara nasional yang hanya
sekitar 15 ton/ha pada tahun yang sama (BPS 2013). Produktivitas tanaman wortel
sebesar ini tampaknya masih lebih rendah dari potensi produktivitas varietas yang
dibudidayakan yaitu sebesar 20-25 ton/ha (Rukmana 1995). Hal tersebut dapat
disebabkan oleh berbagai faktor, seperti kondisi lingkungan biotik dan abiotik
yang tidak sesuai. Faktor biotik yang dapat berpengaruh terhadap produksi wortel
adalah organisme pengganggu tumbuhan (OPT). Patogen merupakan salah satu
OPT yang sulit dikendalikan. Beberapa penyakit pada tanaman wortel di
Indonesia yang telah tercatat, antara lain bercak daun cercospora (Cercospora
carotae), embung tepung (Oidium sp.), dan busuk daun bakteri (Erwinia
carotovora pv. carotovora) (Semangun 1996).
Beberapa virus juga telah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di
berbagai negara, seperti Carrot latent virus (CtLV), Carrot mosaic virus (CtMV),
Carrot mottle mimic virus (CMoMV), Carrot mottle virus (CMoV), Carrot red
leaf virus (CtRLV), Carrot temperate virus (CtTV), Carrot thin leaf virus
(CTLV), dan Carrot yellow leaf virus (CYLV) (Fauquet et al. 2005).
Pada tanaman wortel penyakit yang disebut Carrot motley dwarf banyak
dilaporkan di beberapa negara seperti Australia, Eropa, Jepang, Israel, Amerika
Utara, Inggris, Belgia, dan di Afrika (Bunwaree et al. 2009). Penyakit ini
dilaporkan disebabkan oleh asosiasi antara CtRLV dari genus Polerovirus dan
CMoMVdari genus Umbravirus (Murant et al. 1985). Infeksi kedua virus ini
secara bersama-sama menyebabkan daun wortel menguning sampai kemerahan,
pertumbuhan tanaman terhambat hingga nampak kerdil, dan dapat menyebabkan
kehilangan hasil yang cukup signifikan (Bunwaree et al. 2009). Di Indonesia,
gejala penyakit seperti di atas sudah banyak ditemukan di beberapa daerah sentra
produksi wortel di Jawa Barat (pengamatan penulis), namun laporan mengenai
penyebabnya belum pernah ada. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk
mengidentifikasi virus yang menyebabkan gejala kuning kemerahan pada tanaman
wortel yang ditemukan di Jawa Barat.
Metode molekuler banyak digunakan untuk mengidentifikasi maupun
mendiagnosis penyakit yang disebabkan oleh virus. Salah satu metode tersebut
adalah polymerase chain reaction (PCR). Teknik ini dapat bekerja secara cepat,
spesifik, dan sensitif (Narayanasamy 2011). Teknik lain yaitu reverse
transcription (RT)-PCR digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus
yang memiliki komponen genetik RNA. Hasil amplifikasi DNA kemudian
disekuen untuk mengetahui urutan basa nukleotida virus tersebut.
2
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi spesies Polerovirus penyebab
penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat melalui RT-PCR dan
sekuen nukleotida.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel, sehingga dapat digunakan
sebagai dasar dalam menentukan rekomendasi pengendalian di lapangan.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Survei dan pengambilan sampel tanaman wortel yang bergejala dilakukan di
pertanaman wortel di daerah Cipanas-Cianjur, Lembang-Bandung Barat, dan
Cikajang-Garut. Identifikasi virus dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini berlangsung mulai bulan September 2013 hingga Maret 2014.
Metode Penelitian
Ekstraksi RNA Total
Ekstraksi RNA total dilakukan dengan menggunakan RNeasy Plant Mini
Kits (Phille Korea Technology). Sebanyak 0.1 gram daun wortel bergejala digerus
dalam nitrogen cair dengan mortar dan pistil dengan penambahan nitrogen cair,
kemudian ditambahkan 500 µL Plant RNA Lysis Solution dan 5 µL (1%) βmerkaptoetanol. Sap dimasukkan ke dalam tabung effendorf (volume 1.5 ml) dan
diinkubasi pada suhu 56 oC selama 3 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan
14 000 rpm (20 000 x g) selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung effendorf baru dan ditambahkan 250 µL etanol 96%. Siapan dipindahkan
ke dalam kolom purifikasi dan disentifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12
000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 700 µL Wash
buffer 1 pada kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g)
selama 1 menit. Supernatan dibuang kembali lalu ditambahkan 500 µL Wash
buffer 2 pada kolom dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 11 000 rpm (12
000 x g) selama 1 menit. Supernatan dibuang dan diulangi langkah sebelumnya,
lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14 000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya,
dipindahkan ke kolom purifikasi pada tabung effendorf baru, kemudian
tambahkan 50 µL Nuclease free water pada bagian tengah kolom purifikasi lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm (12 000 x g) selama 1 menit. Hasil
ekstraksi RNA disimpan di dalam -80 oC sebelum digunakan.
Sintesis Complementary (c) DNA
Reaksi reverse transcription (RT) atau transkipsi balik merupakan proses
yang digunakan untuk merubah RNA menjadi DNA. Hasil dari proses RT berupa
DNA komplemen. Adapun komposisi yang digunakan dalam reaksi RT terdapat
pada Tabel 1. Proses RT merupakan salah satu tahapan PCR. Komponen genetik
berupa RNA harus ditranskripsi balik menjadi DNA komplemen (cDNA)
menggunakan enzim reverse transcriptase, kemudian cDNA diamplifikasi
menggunakan teknik PCR.
4
Tabel 1 Komposisi reaktan Reverse Transcription (RT) untuk satu kali
reaksi (Thermo Scientific, US).
Komponen
Volume (µL)
ddH2O
3.70
Buffer RT
2.00
dNTPS
0.50
dTT
0.35
MMULV
0.35
RNAse inhibitor
0.35
Random hexamer
0.75
RNA
2.00
Total volume
10.00
Amplifikasi DNA
Reaksi PCR digunakan untuk memperbanyak pita cDNA yang telah
terbentuk dari proses RT. Adapun komposisi bahan yang digunakan dalam PCR
terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi reaktan polymerase chain reaction (PCR) untuk satu
kali reaksi (Thermo Scientific, US).
Komponen
Volume (µL)
Dream taq MM
12.50
Primer F
1.00
Primer R
1.00
ddH2O
8.50
cDNA
2.00
Total volume
25.00
Program PCR terdiri atas tahapan pradenaturasi pada suhu 94 oC selama 5
menit, 35 siklus untuk denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 94 oC
selama 30 detik, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 50 oC selama 1
menit untuk, dan elongasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72 oC selama 1
menit, tahap pascaelongasi pada72 oC selama 10 menit, dan penyimpanan pada
suhu 4 oC.
Visualisasi Hasil RT-PCR
Visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 1%.
Pembuatan gel dilakukan dengan 0.3 g agarose dicampur dengan 30 ml buffer
TBE 10% (Tris boric acid EDTA) dan dipanaskan dengan microwave selama 3
menit. Setelah itu, larutan agarose didinginkan hingga hangat kuku, kemudian
larutan tersebut dituangkan ke dalam cetakan dan didiamkan hingga padat. Setelah
gel terbentuk, DNA ladder 1 kb (Thermo Scientific, US) sebanyak 5 µL
dimasukkan ke dalam sumur gel dan 7 μL DNA hasil PCR ke dalam masingmasing sumur gel.
Gel agarose kemudian dimasukkan ke dalan mesin elektroforesis dan
dilakukan elektroforesis dengan voltase 100 V selama 30 menit. Hasil
elektroforesis kemudian direndam pada larutan ethidium bromide selama 15
5
menit, gel direndam di dalam air selama 5 menit, divisualisasi dengan UV
transiluminator, dan didokumentasikan.
Analisis Sekuensing Nukleotida dan Filogenetika
Analisis sekuen nukleotida dilakukan dengan pembuatan produk PCR
sampel yang positif mengandung virus sebanyak 50 μL. Sampel tersebut
kemudian dikirim ke PT Genetika Science Indonesia untuk dilakukan sekuen
nukleotida.
Hasil sekuen nukleotida kemudian digunakan untuk analisis kesejajaran
dengan sikuen nukleotida lain yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan
program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) (NCBI 2014). Data
sekuen nukleotida yang terpilih kemudian dimodifikasi dan analisis spesifisitas
nukleotida dilakukan dengan program multiple alignment, ClustalW dengan
software Bioedit V7.0.5. Analisis filogenetika dilakukan dengan menggunakan
program CLC sequence viewer 6.7.1 berdasarkan pendekatan Unweighted Pair
Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA).
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit Daun Merah pada Tanaman Wortel
Survei telah dilakukan di beberapa lokasi pertanaman wortel di CipanasCianjur, Lembang-Bandung Barat, dan Cikajang-Garut. Beberapa tanaman wortel
di lahan petani ditemukan gejala yang memperlihatkan seperti terinfeksi virus.
Daun-daun tanaman wortel yang sakit berubah warna secara bertahap dari kuning
menjadi merah kemudian ungu. Daun-daun yang lebih tua berwarna kuning,
kemudian daun-daun yang lebih atas (muda) memperlihatkan perubahan warna
menjadi kemerahan, dan daun-daun yang lebih muda lagi menjadi ungu. Daundaun yang paling muda (pucuk) umumnya tetap berwarna hijau. Warna merah
keunguan pada tanaman sakit tampak sangat dominan, sehingga pada laporan ini
disebut „Penyakit daun merah‟.
A
B
C
Gambar 1 Gejala pada daun wortel (Daucus carota L) yang ditemukan di
lapangan (A) gejala penyakit daun merah pada wortel (B) daun-daun
semula berwarna kuning, daun-daun atas berubah warna menjadi
kemerahan (C) daun-daun yang lebih muda menjadi keunguan.
Gejala penyakit daun merah yang terjadi pada tanaman wortel di Jawa Barat
ini sangat mirip dengan deskripsi gejala penyakit Carrot motley dwarf (CMD)
yang telah dilaporkan di beberapa negara penghasil wortel dunia (Bunwaree et al.
2009). Menurut Murant et al. 1985, CMD dapat disebabkan oleh asosiasi dari
CtRLV dari genus Polerovirus dan CMoMV dari genus Umbravirus. Penyakit ini
dapat disebabkan oleh infeksi tunggal dari CtRLV maupun kombinasi dengan
CMoMV. CtRLV merupakan helper dari CMoMV dalam hal penularannya
melalui serangga vektor. Kedua virus ini persisten di dalam tubuh serangga
vektornya, yaitu kutu Cavariella aegopodii (Elnagar et al. 2008).
Walaupun karakteristik gejala penyakit daun merah dan CMD relatif mirip,
namun terdapat perbedaan yang signifikan dalam hal penghambatan pertumbuhan
tanaman. Pada CMD karakter dwarf (kerdil) menjadi hal yang dominan, namun
pada penyakit daun merah tidak terlihat perbedaan tinggi antara tanaman sakit dan
tanaman sehat (data tidak diperlihatkan). Banyak faktor yang mungkin
berhubungan dengan perbedaan gejala ini, seperti akibat reaksi varietas tanaman
wortel yang berbeda, isolat virus atau mungkin juga jenis virus yang berbeda, dan
kondisi lingkungan yang berbeda.
7
Virus yang berasosiasi dengan Penyakit Daun Merah
pada Tanaman Wortel
Berdasarkan simptomatologi, penyakit daun merah pada tanaman wortel
yang ditemukan di Jawa Barat diduga sama dengan CMD yang telah dilaporkan
terjadi di beberapa negara penghasil wortel dunia. Pada penelitian ini, deteksi
virus difokuskan pada deteksi CtRLV dan CMoMV yang telah diketahui
berasosiasi dengan penyakit CMD.
Deteksi virus telah dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan primer
spesifik untuk CtRLV (Morton et al. 2003) dan CMoMV (Bunwaree et al. 2009).
RT-PCR telah dilakukan beberapa kali terhadap RNA total yang diekstraksi dari
contoh tanaman wortel sakit yang berbeda. Pita DNA tidak teramplifikasi (data
tidak ditampilkan). Banyak faktor yang dapat menyebabkan RT-PCR gagal
menghasilkan pita DNA yang diharapkan, salah satunya adalah tidak adanya RNA
virus target dalam RNA total yang digunakan sebagai template. Hal ini berarti
bahwa CtRLV dan CMoMV tidak ditemukan pada tanaman wortel sampel. Hasil
ini mengindikasikan bahwa CtRLV maupun CMoMV mungkin bukan merupakan
penyebab penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat.
Spesies Polerovirus yang pernah dilaporkan sudah terdapat di Indonesia
adalah Pepper vein yellow virus (PeVYV) yang ditemukan menginfeksi tanaman
cabai di daerah Bali (Suastika et al. 2012). Primer yang didesain untuk
mengamplifikasi gen coat protein (CP) secara utuh telah tersedia di Laboratorium
Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Primer tersebut adalah
CP-F (5‟-AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTAGGAGAAAT-3‟) dan
CP-R (5‟-AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGTGCAATTGCACAGTA-3‟) yang
mempunyai prediksi produk PCR sebesar ±650 pb. RT-PCR yang telah dilakukan
menggunakan primer ini mengamplifikasi DNA berukuran sesuai dengan prediksi
dan sama dengan hasil amplifikasi PeVYV isolat cabai yang digunakan sebagai
kontrol positif (Gambar 2). Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa
kemungkinan spesies virus yang berasosiasi dengan penyakit klorosis pada
tanaman cabai di Bali sama dengan spesies virus yang bersosiasi dengan penyakit
daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat. Isolat virus ini untuk selanjutnya
disebut PeVYV-WJC.
M
75
2
P
K-
I
±
±650 pb
Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA virus dari sampel tanaman wortel bergejala
penyakit daun merah. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder
(Promega, US), (K-) kontrol negatif, (P) isolat PeVYV tanaman
cabai, (I) isolat PeVYV-WJC tanaman wortel.
8
Spesies Polerovirus Penyebab Penyakit Daun Merah
pada Tanaman Wortel
Produk RT-PCR dari sampel tanaman wortel bergejala penyakit daun merah
berhasil disekuen di PT Genetika Science, Indonesia. Hasil sekuen nukleotida
tersebut (lampiran) terdiri dari pita DNA berukuran sekitar 630 pb sesuai dengan
estimasi ukuran pita DNA hasil RT-PCR. Analisis tingkat homologi sekuen
nukleotida merupakan cara yang sahih digunakan untuk mengidentifikasi spesies
virus (Barton 1998). Pada analisis tersebut sekuen nukleotida PeVYV-WJC
dibandingkan dengan sekuen nukleotida padanannya dari spesies virus yang telah
dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel, yaitu CtRLV (Huang et al. 2005),
CMoV (Menzel et al. 2008), CMoMV (Gibbs et al. 1996), CTLV (Xu et al.
2012), CYLV (Menzel et al. 2009), danPeVYV dari genus Polerovirus yang
menginfeksi tanaman cabai (Murakami et al. 2005).
.
Tabel 3 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman
wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan virus-virus yang sudah
dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel.
No Aksesi
AB594828
NC_006265
NC_011515
NC_001726
JX156435
NC_013007
Spesies virus
Homologi (%)
PeVYV
CtRLV
CMoV
CMoMV
CTLV
CYLV
97.4
59.4
33.3
29.6
37.5
42.0
Hasil perbandingan (Tabel 3) menunjukkan bahwa virus yang berasosiasi
dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel di Jawa Barat memiliki tingkat
kesamaan sekuen nukleotida yang sangat rendah, yaitu kurang dari 60% dengan
CtRLV, virus yang semula diduga sebagai penyebab penyakit daun merah.
Spesies virus lain yang telah dilaporkan dapat menginfeksi wortel di luar negeri,
seperti CMoV, CMoMV, CTLV, dan CYLV masing-masing hanya memiliki
homologi kurang dari 50%. Hal tersebut mengindikasikan bahwa virus penyebab
penyakit daun merah pada wortel di Jawa Barat bukan salah satu spesies virus
yang sudah dilaporkan dapat menginfeksi tanaman wortel di belahan lain dunia.
Hasil yang tidak terduga dari penelitian ini adalah bahwa virus yang diteliti ini
merupakan salah satu isolat PeVYV yang hanya dilaporkan dapat menginfeksi
tanaman cabai karena memiliki tingkat homologi yang sangat tinggi, yaitu 97.4%
(Tabel 3).
PeVYV merupakan virus famili Luteoviridae dan genus Polerovirus. Virus
dari famili ini memiliki genom berupa RNA (ssRNA) dan partikel berbentuk
isometrik (Agrios 2005). Virus ini tidak dapat ditularkan secara mekanis melalui
sap tanaman, tetapi ditularkan dan disebarkan melalui vektor. Vektor dari virus ini
merupakan kutudaun dan virus ini persisten di dalam tubuh serangga (Walkey
1991).
9
Tabel 4 Homologi sekuen nukleotida virus penyebab daun merah pada tanaman
wortel di Jawa Barat (PeVYV-WJC) dengan PeVYV yang sudah
dilaporkan oleh beberapa negara lain.
No
1
2
3
4
5
6
7
Homologi (%)
1
2
3
4
5
PeVYV-WJC-JawaBarat-Wortel ID 91.6 92.5 97.4 97.2
PeVYV-China-Cabai
ID
90.9 93.1 93.7
PeVYV-Israel-Cabai
ID
94.2 94.2
PeVYV-Japan-Cabai
ID
99.4
PeVYV-Taiwan-Cabai
ID
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Nama Isolat
6
97.0
93.7
94.2
98.1
98.3
ID
7
96.4
93.1
93.8
97.9
98.1
99.4
ID
Hasil analisis dengan program BLAST dan BioEdit v 7.05 memastikan
bahwa PeVYV-WJC mempunyai tingkat homologi sekuen nukleotida pada daerah
CP lebih dari 90% dengan semua PeVYV isolat cabai (Capsicum spp.) yang
dilaporkan di Jepang, Israel, Taiwan, Thailand, dan China, serta PeVYV pada
tanaman ranti (Solanum nigrum) di India (Knierim et al. 2012) (Tabel 4).
Gambar 3 Pohon filogenetika isolat-isolat Pepper vein yellow virus berdasarkan
sekuen nukleotida gen coat protein menggunakan program CLC
sequence viewer v 6.7.1 dengan pendekatan UPGMA. No aksesi
PeVYV isolat ranti asal India adalah JX427531, PeVYV-ThailandCabai JX427541, PeVYV-Taiwan-Cabai JX427542, PeVYV-JapanCabai AB594828, PeVYV-Israel-Cabai HM439608, PeVYV-ChinaCabai AJ575129, dan PepLCV-Thailand-Cabai AF134484 digunakan
sebagai outgroup.
Analisis pohon filogenetika menunjukkan bahwa PeVYV-WJC isolat wortel
asal Jawa Barat memiliki kekerabatan yang dekat dengan isolat PeVYV asal
India, Thailand, Taiwan, dan Jepang yang berada dalam satu kelompok yang
sama. Hasil analisis filogenetika ini mengindikasikan bahwa PeVYV-WJC
mungkin merupakan hasil adaptasi virus yang berasal dari negara-negara tersebut
yang terbawa melalui bahan tanaman cabai ke Indonesia. Dugaan ini didukung
oleh fakta bahwa di Indonesia, tepatnya di daerah Bali, baru-baru ini sudah
ditemukan PeVYV pada tanaman cabai (Suastika et al. 2012). Kutudaun yang
10
berperan sebagai serangga vektor PeVYV adalah Aphis gossypii (Murakami et al.
2005). Serangga ini merupakan hama tanaman cabai, namun dapat ditemukan juga
pada tanaman wortel (Blackman et al. 1941). Hal tersebut memungkinkan A.
gossypii menjadi vektor untuk menularkan virus ini dari tanaman cabai ke
tanaman wortel.
11
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil sekuen nukleotida dapat disimpulkan bahwa spesies
Polerovirus yang berasosiasi dengan penyakit daun merah pada tanaman wortel
adalah Pepper vein yellow virus. Virus ini memiliki kekerabatan paling dekat
dengan PeVYV isolat cabai.
Saran
Perlu dilakukan survei dan pemetaan penyakit daun merah yang disebabkan
oleh PeVYV di seluruh pertanaman wortel di Indonesia agar dapat diketahui
kejadian penyakit dan akibat dari infeksi virus ini terhadap penurunan produksi
wortel.
12
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5thed. New York (US): Academic Press.
Barton GJ. 1998. Protein sequence alignment techniques. Acta Cryst. D54:1139-1146.
Blackman RL, Fastop VF. 1941. Aphids on The World’s Crop. 2nd ed. London (GB):
The Natural History Museum.
[BPPP] Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 2012. Teknologi
Budidaya Sayuran. Jakarta (ID): Pusat Perpustakaan dan Penyebaran
Teknologi Pertanian, Kementrian Pertanian.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2013. Luas panen, produksi, dan produktivitas
wortel, 2011-2012 [Internet]. [diunduh 2014 Maret 11]. Tersedia pada:
http://www.bps.go.id/tab_sub/view.php?kat=3&tabel=1&daftar=1&id_suby
ek=55¬ab=65.
Bunwaree AG, Menzel W, Winter S, Vally V, Seewoogoolam R, Madhu SPB.
2009. First report of Carrot red leaf virus and Carrot mottle virus, causal
agents of Carrot motley dwarf, in carrot in Mauritius. J APS Net.
93(11):1218. doi: http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-93-11-1218B.
Elnagar S, Murant AF. 1978. Relations of carrot red leaf and carrot mottle virus
with thei aphid vector, Caveriella aegopodii. Ann Appl Biol. 89(2):237-244.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. 2005. Virus Taxonomy
Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San
Diego (US): Virology Division International Union of Microbiological
Societies.
Gibbs MJ, Cooper JI, Waterhouse PM. 1996. The genome organization and
affinities of an Australian isolate of carrot mottle umbravirus. J Virol. 224
(1):310-313.
Huang LF, Naylor M, Pallet DW, Reeves J, Cooper JI, Wang H. 2005. The
complete genome sequence, organization and affinities of Carrot red leaf
virus. Arch Virol. 150:1845-1855. doi: 10.1007/s00705-005-0537-6.
Knierim D, Tsai WS, Kenyon L. 2012. Analysis of sequences from field samples
reveals the presence of the recently described Pepper vein yellows virus
(genus Polerovirus) in six additional countries. Arch Virol. 158(6):137-41.
doi: 10.007/s00705-012-1598-y.
Menzel W, Mais E, Vetten HJ. 2008. Complete nucleoide sequence of a carrot
isolate of Carrot mottle virus from Germany. Arch Virol. 153(11):21632165.
Menzel W, Goetz R, Lesemann DE, Vetten HJ. 2009. Molecular characterization
of a Closterovirus from carrot and its identification as a German isolate
of Carrot yellow leaf virus. Arch Virol. 154(8):1343-1347.
Morton A, Spence NJ, Boonham N, Barbara DJ. 2003. Carrot red leaf assosiated
RNA in carrots in the United Kingdom. Plant Pathology. 52(1):795.
Murakami R, Nakshima N, Hinomoto N, Kawano S, Toyosato T. 2011. The
genome sequence of Pepper vein yellow virus (family Luteoviridae, genus
Polerovirus). Arch Virol. 156(5):921-923. doi: 10.007/s00705-011-0956-5.
Murant AF, Waterhouse PM, Raschke JH, Robinson D.J. 1985. Carrot red leaf
and Carrot mottle virus: Observations on the composition of the particles in
single and mixed infection. J Gen Virol. 66(7):1575-1579.
13
Narayanasamy P. 2011. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease
Diagnosis. Edisi ke-3. New York (US): Springer.
Rukmana R. 1995. Bertanam Wortel. Yogyakarta (ID): Kanisius.
Semangun H. 1996. Penyakit-Penyakit Tanaman Hortikultura. Yogyakarta (ID):
Gadjah Mada University Press.
Suastika G, Hartono S, Nyana IDN, Natsuaki T. 2012. Laporan Pertama tentang
Infeksi Polerovirus pada Tanaman Cabai di Daerah Bali, Indonesia.J
FitopatolIndones. 8(5):151-154.
Xu D, Liu HY, Li F, Tian T, Li R. 2012. Biological and molecular
characterization of Carrot thin leaf virus. [Internet]. [diunduh 24 April
2014]. Tersedia pada: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/465159049.
Walkey DGA. 1991. Applied Plant Virology. London (GB): Chapman and Hall.
14
LAMPIRAN
15
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5
15
25
35
ATTAAGGATC CAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGC GGAGCTAGGA GAAACAACAA
GATCGTTAAT GAATACGGAA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAATAATAA
AATCGTTAAT GAATACGGGA GGGGTTAGGA GAAACAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA
GATCGTTAAT GAATACGGGA GGAGTTAGGA GAAACAATAA
*
*
*******
** * ***** **** ** **
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
45
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
TGGAAATGGT
**********
....|....|
55
GGATCACGTA
GGATCACGAA
GGATCACGCG
GGATCACGTA
GGATCACGTA
GGATCACGTA
GGATCACGTA
********
....|....|
65
ACACCCGCCG
GCACCCGCCG
GCACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
ACACCCGCCG
*********
....|....|
75
TCGTAGACGC
TCGCAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
TCGTAGACGC
*** ******
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
85
CCACGACAGG
CCAAGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGG
CCACGACAGA
*** *****
....|....|
95
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
TTCGCCCTGT
**********
....|....|
105
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
CGTTGTGGTC
**********
....|....|
115
GCACCCCCTG
GCACCCTCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
GCACCCCCTG
ACACCCCCTG
***** ***
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
125
GGCGCACACG
GGACAGCACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
GGCGCACACG
**
****
....|....|
135
GCGAGGAAAT
GCGTGGAGGT
GCGGGGAAAT
GCGAGGAAAT
GCGAGGAAAT
GCGCGGAAAT
GCGCGGAAAT
*** *** *
....|....|
145
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
CGAAGACGAC
**********
....|....|
155
GAAATGGAGG
GAAGTGGAGG
GAAGTGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
GAAATGGAGG
*** ******
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
165
CCGGAACCGA
CCGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
CAGGAACCGA
* ********
....|....|
175
AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAG
A--------AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAG
AGAAGCCGAA
AGAAGCCGAA
*
....|....|
185
ATAGAGTTGG
ATGGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATAGAGTTGG
ATGGAGTTGG
ATGGAGTTGG
** *******
....|....|
195
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
AGGAAGGTCG
**********
16
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
205
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
AGCAACAGCG
**********
....|....|
215
AAACTTTCGT
AGACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCAT
AAACTTTCGT
AAACTTTCGT
* ****** *
....|....|
225
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
CTTCAACAAG
**********
....|....|
235
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
GACTCAATCA
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
245
AGGATAGTTC
AGGATGGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
AGGATAGTTC
***** ****
....|....|
255
CTCAGGAGCT
CTCAGGAGCT
CTCAGGAACT
CTCAGGATCT
CTCAGGATCT
CTCAGGAGCT
CTCAGGATCT
******* **
....|....|
265
GTCACCTTCG
ATCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
GTCACCTTCG
*********
....|....|
275
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
GGCCGTCTCT
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
285
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
ATCAGAGAGC
**********
....|....|
295
ATCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
GTCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
ATCGCGCTTT
*********
....|....|
305
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
CAGGTGGAGT
**********
....|....|
315
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
TCTCAAAGCC
**********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
325
TACCATGAAT
TACCATGAGT
TACCATGAGT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
TACCATGAAT
******** *
....|....|
335
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAAATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
ATAAGATCAC
**** *****
....|....|
345
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTTAAT
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
AATGGTCAAC
****** **
....|....|
355
ATACGCTTCG
ATACGCTTCA
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
ATACGCTTCG
*********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
365
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGCGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
TCAGTGAATC
**** *****
....|....|
375
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
TTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
CTCTTCCACA
*********
....|....|
385
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAAGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
GCGGAGGGCT
***** ****
....|....|
395
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
CCATCGCTTA
**********
17
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-Chin-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
405
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
CGAGCTGGAC
**********
....|....|
415
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
CCCCACTGCA
**********
....|....|
425
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
AGCTTACTAG
**********
....|....|
435
TCTCCAATCC
CCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
TCTCCAATCC
*********
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
445
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGCA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGTA
ACCCTGCGCA
ACCCTGCGCA
******** *
....|....|
455
AATTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
AGTTCCCCGT
* ********
....|....|
465
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
CACCAAAGGC
**********
....|....|
475
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCTA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
GGGCAAGCGA
******** *
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-Chin-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
485
CTTTTCGGGC
CGTTCCGGGC
CCTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
CTTTTCGGGC
* ** *****
....|....|
495
TTCGCAGATT
TGCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
TTCGCAGATT
* ********
....|....|
505
AACGGGGTAG
AATGGGGTAG
AATGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
AACGGGGTAG
** *******
....|....|
515
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCACGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
AGTGGCATGA
******* **
PeVYV-WJC-Wortel
PeVYV-China-Cabai
PeVYV-Israel-Cabai
PeVYV-Japan-Cabai
PeVYV-Taiwan-Cabai
PeVYV-Thailand-Cabai
PeVYV-India-Ranti
Clustal Co
....|....|
525
TACATCCGAA
TACAGCTGAA
TACATCTGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
TACATCCGAA
**** * ***
....|....|
535
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTCA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
GATCAATTTA
******** *
18
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purwakarta pada tanggal 06 September 1992, anak
sulung dari pasangan Bapak Yayat Hidayat dan Ibu Eli Setia Nurul Hilal. Penulis
telah menempuh pendidikan di TK Sejahtera pada tahun 1998, SD Negeri 2
Wanayasa pada tahun 2004, SMP Negeri 1 Wanayasa pada tahun 2007, dan SMA
Negeri 1 Purwakarta pada tahun 2010, pada tahun yang sama penulis diterima di
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Ujian talenta mandiri IPB (UTMI).
Selama menjadi mahasiswa IPB, pada tahun 2011 penulis menjadi anggota
dari Leadership and enterpreneurship school IPB angkatan V dan pada tahun
2012 menjadi anggota dari staf Fundrising LES angkatan VI. Pada tahun 2012
dan 2013 penulis menjadi anggota kepengurusan dari Himpunan mahasiswa
Proteksi Tanaman (Himasita) IPB. Penulis juga mengikuti kepanitiaan di beberapa
kegiatan IPB, Fakultas Pertanian, dan Departemen Proteksi Tanaman. Penulis
pernah menjadi juara 2 lomba lari maraton pada ajang lomba SERI-A 2012. Pada
semester ganjil tahun ajaran 2013-2014 penulis menjadi asisten praktikum mata
kuliah Hama dan Penyakit Tanaman Pangan dan Hortikultura dan pada semester
genap tahun ajaran 2014 penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Hama
Gudang dan Pemukiman, Ilmu Penyakit Tumbuhan Dasar, dan Dasar-dasar
Proteksi Tanaman.