Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. dari ikan lele (Clarias sp.) serta Potensinya sebagai Probiotik

ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp. DARI IKAN LELE
(Clarias sp.) SERTA POTENSINYA SEBAGAI PROBIOTIK

HAMTINI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Seleksi
Bacillus sp. dari Ikan Lele (Clarias sp.) serta Potensinya sebagai Probiotik adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka
dibagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014
Hamtini
NIM G351120051

RINGKASAN
HAMTINI. Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. dari Ikan Lele (Clarias sp.) serta
Potensinya sebagai Probiotik. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan
WIDANARNI.
Budi daya ikan lele menghadapi berbagai macam permasalahan diantaranya
mengenai tingkat pertumbuhannya dan salah satu yang dapat dilakukan adalah
dengan meningkatkan kecernaan pakan yang diberikan. Pakan yang diberikan
pada ikan tidak semuanya dapat dicerna, ada yang dikeluarkan dalam bentuk feses
dan sisa metabolisme lainnya. Oleh karena itu, peningkatan kualitas pakan sangat
diperlukan agar pakan yang diberikan dapat lebih banyak terserap oleh ikan
sehingga dapat mengurangi penumpukan sisa metabolisme ikan di dasar kolam.
Aplikasi probiotik merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk
mengatasi permasalahan tersebut. Probiotik pada akuakultur selain dapat menekan
bakteri patogen di lingkungan akuakultur juga dapat menghasilkan sejumlah
metabolit dan enzim-enzim pencernaan untuk mempermudah penyerapan pakan

sehingga dapat meningkatkan laju pertumbuhan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menyeleksi Bacillus sp. dari
usus ikan lele serta menguji potensinya sebagai kandidat probiotik pada pakan
ikan. Isolasi usus ikan lele sebanyak 1 gram dilakukan dengan pemanasan sampel
usus yang telah dimasukkan di dalam tabung reaksi yang telah berisi larutan
garam fisiologis steril pada suhu 80 oC selama 10-15 menit. Isolasi menggunakan
media Triptone soy agar (TSA) yang ditambahkan 1% susu skim untuk aktivitas
proteolitik dan 1% pati untuk aktivitas amilolitik. Seleksi bakteri probiotik
meliputi uji patogenitas, uji kepekaan antibiotik dan total padatan tersuspensi.
Isolat yang memiliki kemampuan degradasi pakan terbesar selanjutnya akan
dibuat kurva pertumbuhan, aktivitas amilase dan protease serta proses
pencampuran Bacillus sp. pada pakan ikan. Isolat yang terseleksi sebagai kandidat
probiotik selanjutnya diidentifikasi gen 16S-rRNA.
Hasil isolasi yang berasal dari usus ikan lele diperoleh 16 isolat bakteri, 14
isolat bakteri hasil dari pewarnaan spora merupakan Bacillus sp. Hasil uji
patogenisitas secara in vitro menggunakan media agar-agar darah terdapat 7 isolat
bakteri memiliki aktivitas hemolisis gamma (PTB 1.1, PTB 1.2, PTB 1.4, PTB
1.7, STB 1.6, STB 1.1, dan STB 2.1). Isolat-isolat yang memiliki aktivitas gamma
hemolisis akan diseleksi lebih lanjut. Uji kepekaan menggunakan 3 jenis
antibiotik yaitu rifampisin, amoxicillin dan ciprofloxacin menunjukkan bahwa

dari 7 isolat yang diseleksi terdapat 3 isolat yang peka terhadap antibiotik yang
diuji (PTB 1.4, PTB 1.7 dan STB 1.6). Tiga isolat terpilih ini diuji kemampuannya
dalam mendegradasi pakan ikan. Isolat PTB 1.4 mampu mendegradasi pakan
dengan sisa pada kertas saring terkecil yaitu 0,0068 g. Isolat PTB 1.4 juga
memiliki indeks proteolitik dan amilolitik sebesar 0,60 dan 0,61. Hasil
pengukuran aktivitas enzim amilase isolat PTB 1.4 yang ditambahkan 1.2% pakan
tertinggi pada 120 jam pengamatan sebesar 0,399 U/mL dan aktivitas tertinggi
protease pada 72 jam pengamatan sebesar 0,065 U/mL. Jumlah inokulum awal
pada isolat bakteri PTB 1.4 adalah 108 CFU/mL, setelah digabungkan pada pakan
dan CMC kemudian diinkubasi jumlah inokulum akhir menjadi 106 CFU/mL.

Berdasarkan BLAST-N isolat PTB 1.4 memiliki nilai homologi sebesar
99% dan hasil pensejajaran 1011 bp menunjukkan isolat PTB 1.4 memiliki
kedekatan dengan Bacillus megaterium. Isolat PTB 1.4 sebagai isolat terbaik
karena tidak bersifat patogen, peka terhadap antibiotik yang diuji, memiliki
aktivitas enzim protease dan amilase serta kemampuan mendegradasi pakan
terbaik.
Kata Kunci: Bacillus sp., Clarias sp., pakan, probiotik

SUMMARY

HAMTINI. Isolation and Selection of Bacillus sp. from Catfish (Clarias sp.) as a
Potential Probiotic. Supervised by ANJA MERYANDINI and WIDANARNI.
Problem in aquaculture Clarias sp. is the growth rate and one of the ways to
solve this problem is the digestibility of feed. Feed for the fish can not digest it all,
there are issued in the form of feces and other metabolic wastes. Therefore,
improving the quality of feed is necessary that the feed can be absorbed by the
fish so it will not any longer buildup in the bottom of the pool. Application of
probiotic can be a promosing way to overcome this problem. Probiotics in
aquaculture in addition can suppress pathogenic bacteria in aquaculture
environments and produce a number of metabolites and digestive enzymes to
facilitate absorption so as to increase the growth rate.
The aims of this study were to isolate and select Bacillus sp. from the gut of
catfish (Clarias sp.) and know the potential probiotic candidates in the fish feed
production. Isolation 1 gram of catfish (Clarias sp.) gut carried out by heating the
sample that have been included in the gut in a test tube which contains a sterile
physiological saline solution at 80 °C for 10-15 minutes. Isolation using Triptone
soy agar (TSA) media which have been added with 1% skim milk for proteolytic
activity and 1% starch for amylolytic activity. Selection was conducted based on
pathogenicity test, antibiotic susceptibility test and total suspended solids. Isolate
that have ability to degrade feed would be made the growth curves, analysis

activities protease and amilase and also combine Bacillus sp. with feed. Selected
isolate as candidate probiotic furthermore 16S-rRNA gene identified.
Result of isolation from gut catfish (Clarias sp.) obtained 16 isolates, 14
isolates of bacteria from staining spore are Bacillus sp. Result of in vitro
pathogenicity test using blood agar medium there were 7 isolates that have gamma
hemolytic activity (PTB 1.1, PTB 1.2, PTB 1.4, PTB 1.7, STB 1.6, STB 1.1 and
STB 2.1). Antibiotic susceptibility test showed that 3 isolates were sensitive to the
tested antibiotics (PTB 1.4, PTB 1.7 and STB 1.6). These three selected isolates
were tested for their ability to degrade fish feed. PTB 1.4 isolate was able to
degrade the feed with the smallest residue on the filter paper (0.0068 g). PTB 1.4
isolate also has proteolytic and amylolytic index of 0.61 and 0.60, respectively.
Amylase activity of PTB 1.4 isolate added with 1.2% feed reached the highest
peak in 120-hour of observation time (0.399 U/mL) and the highest protease
activity was in 72-hour of observation time (0,065 U/mL). Inoculum amount on
bacterial isolates PTB 1.4 is 108 CFU/mL, after combained with feed and CMC
then incubated, inoculum of amount 106 CFU/mL.
Based on 16S-rRNA gene sequences isolate PTB 1.4 was 99% homolog and
aligment result have 1011 bp showed PTB 1.4 distanly related with Bacillus
megaterium. Isolation and selection of probiotic candidate from catfish get PTB
1.4 as a best isolate, there are not pathogenic, sensitive to antibiotic test, has

protease and amilase activities. PTB 1.4 isolate has capability to degrade the feed.
Keywords: Bacillus sp., Clarias sp., feed, probiotic

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN SELEKSI Bacillus sp. DARI IKAN LELE
(Clarias sp.) SERTA POTENSINYA SEBAGAI PROBIOTIK

HAMTINI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi, MSi

Judul Tesis : Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. dari ikan lele (Clarias sp.) serta
Potensinya sebagai Probiotik
Nama
: Hamtini
NIM
: G 351120051
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr Anja Meryandini, MS
Ketua

Dr Ir Widanarni, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Anja Meryandini, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 18 Agustus 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan karunia-Nya kepada penulis, sehingga karya ilmiah ini
berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2013 sampai
Mei 2014 ini berjudul “Isolasi dan Seleksi Bacillus sp. dari Ikan Lele (Clarias sp.)
serta Potensinya sebagai Probiotik”. Penelitian ini bertempat di Laboratorium
Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB dan Laboratorium Mikrobiologi
Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Anja Meryandini, MS
dan Dr Ir Widanarni, MSi sebagai komisi pembimbing yang telah banyak
membantu dan memberikan bimbingan serta sarannya. Terima kasih penulis
ucapkan kepada Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) atas beasiswa tesis
yang telah diberikan kepada penulis. Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr
Dinamella Wahjuningrum, SSi, MSi yang telah menjadi penguji sidang dan
memberi saran dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih kepada
Ketua Program Studi Mikrobiologi Prof Dr Anja Meryandini, MS atas saran-saran
dan nasehatnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Ir
Suharsono, DEA sebagai Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB) IPB Yang telah memberikan fasilitas laboratorium, serta

ucapan terima kasih buat seluruh staf-staf dan teknisi PPSHB IPB yang telah
banyak memberikan bantuan.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua
tercinta Yamin (alm) dan Noriah, serta keluarga yang telah banyak memberikan
bantuan dan kata-kata semangat. Penulis sangat berterima kasih kepada Mbak Sri
Murtini dan keluarga atas segala bantuan dan kata-kata semangatnya buat penulis
serta ucapan terima kasih buat Bu Dewi, Teteh Pipit, Pak Pras, Pak Jaka, Pak
Hendar, Pak Yayat dan Mbak Lilis atas segala bantuan yang telah diberikan. Buat
teman-teman di laboratorium yaitu Hapsari Dewi, Anik, Ayun, Lia, Ika, Rahmi,
Novi, Debby, Bob, Yeni, Leni, Dedi, Wahyu, Ira, Fathin serta buat teman-teman
mikrobiologi 2012, Anja, Eja, Wulan, Dina, Vita, Ayun dan Rika terima kasih tak
terhingga atas segala bantuan yang telah kalian berikan. Penulis juga ingin
mengucapkan terima kasih kepada Tina, Tisrin, Windi, Siti, Rini, Ina dan Feni
atas bantuan dan semangat yang telah diberikan, buat Afi, Ayu, Indah, Janah,
Mona, Teh Ai, Delfi, Ika, Tiva dan Guntur terima kasih atas segala bantuan dan
doanya buat penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2014

Hamtini

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN

xii
xii
xii
1

Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp. sebagai Bakteri Probiotik
Mekanisme Kerja Bakteri Probiotik
Seleksi Bakteri Probiotik
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Isolasi Bacillus sp. dari Usus Ikan Lele
Seleksi Bacillus sp. sebagai Kandidat Probiotik
Identifikasi gen 16S-rRNA
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
5
8
8
8
13
18
18
18
19
23
29

DAFTAR TABEL
1 Isolat yang diperoleh dari usus ikan lele dengan masa inkubasi
24 jam pada suhu ruang
2 Sifat patogenisitas Bacillus sp. media agar-agar darah dengan
masa inkubasi 24 jam pada suhu ruang
3 Kepekaan Bacillus sp. terhadap 3 jenis antibiotik. Kriteria yang
diamati berdasarkan diamater zona hambat (mm) yang terbentuk
dengan masa inkubasi 24 jam pada suhu ruang
4 Penurunan total padatan tersuspensi (TPT) pakan yang ditambah
isolat-isolat Bacillus sp. Substrat 1.2% pakan ikan, diinkubasi
120 jam pada kecepatan 120 rpm suhu ruang
5 Hasil BLAST-N gen sekuen 16S-rRNA isolat PTB 1.4

8
9
9
10
13

DAFTAR GAMBAR
1 Zona bening yang terbentuk, 1% susu skim, 1% pati, inkubasi
24 jam pada suhu ruang
2 Aktivitas protease isolat PTB 1.4 pada 1.2% media pakan ikan,
di shaker 120 rpm selama 120 jam pada suhu ruang
3 Aktivitas amilase isolat PTB 1.4 pada 1.2% media pakan ikan,
di shaker 120 rpm selama 120 jam pada suhu ruang
4 Kurva nilai kerapatan optik (Optical Density), isolat PTB 1.4
Isolat ditumbuhkan pada media TSB, ph 7.2, dan di shaker
120 rpm pada suhu ruang selama 24 jam

11
11
12
12

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Prosedur uji aktivitas protease (Walter 1984)
Prosedur uji aktivitas amilase (Bernfeld 1959)
Komposisi reagen yang digunakan
Karakteristik morfologi isolat dari usus ikan lele
Hasil contig gen parsial 16S-rRNA
Hasil Blast sekuen basa nukleotida isolat PTB 1.4
Berdasarkan data bank gen koleksi NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)

23
24
26
27
28
28

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan lele (Clarias sp.) merupakan hasil produksi perikanan budi daya yang
sangat populer di Indonesia. Ikan lele memiliki kandungan gizi dan protein yang
tinggi sehingga banyak digunakan dalam industri makanan serta berbagai jenis
olahan dan fillet untuk diekspor ke luar negeri. Berdasarkan data dari Kementerian
Kelautan dan Perikanan (2010) produksi ikan lele menempati urutan ketiga
sebesar 273,554 ton di bawah ikan nila dan ikan mas. Upaya untuk peningkatan
laju pertumbuhan ikan lele masih terus ditingkatkan sehingga penggunaan pakan
akan lebih efektif dan efesien. Seperti kita ketahui bahwa sebagian besar budi
daya perikanan intensif telah mengalami berbagai hambatan karena masalah
penyakit, pertumbuhan yang lambat dan tingkat kelangsungan hidup ikan yang
rendah (Mohapatra et al. 2012).
Budi daya ikan lele masih menghadapi berbagai macam permasalahan
diantaranya mengenai tingkat pertumbuhannya yang masih rendah dan salah satu
yang dapat dilakukan adalah dengan meningkatkan kecernaan pakan yang
diberikan. Pakan yang diberikan hanya sebagian kecil yang dapat diserap oleh
ikan sedangkan sebagiannya lagi akan dikeluarkan sebagai hasil buangan berupa
feses dan sisa metabolisme lainnya. Menurut Antony dan Philip (2006) proporsi
pakan yang digunakan oleh hewan aquatik hanya dalam jumlah yang sedikit,
akibatnya sebagian besar pakan tersisa sebagai limbah di air yang diikuti
eutrofikasi dan pengayaan material organik yang tinggi pada dasar kolam. Oleh
karena itu, diperlukan upaya untuk efisiensi pakan pada budi daya ikan lele agar
selain dapat meningkatkan pertumbuhan ikan lele, juga dapat menekan biaya
pembelian pakan.
Aplikasi probiotik merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk
menangani permasalahan tersebut. Dalam peningkatan nilai nutrisi pakan, bakteri
probiotik memiliki mekanisme dalam menghasilkan beberapa enzim exogenous
untuk pencernaan pakan seperti amilase, protease, lipase dan selulase (Bairagi et
al. 2002; Aslamyah 2006; Wang et al. 2008). Enzim-enzim pencernaan yang
dihasilkan tersebut dapat membantu meningkatkan daya cerna ikan sehingga
penggunaan pakan akan lebih efisien.
Prinsip dasar kerja probiotik pada akuakultur salah satunya adalah
pemanfaatan kemampuan mikroorganisme dalam memecah atau menguraikan
rantai panjang karbohidrat, protein dan lemak yang menyusun pakan yang
diberikan (Feliatra et al. 2004). Spesies Bacillus banyak yang dapat menghasilkan
berbagai enzim ekstraseluler dan digunakan secara luas untuk menghasilkan
enzim bagi industri, seperti protease dan amilase (Fleming et al. 1995).
Keunggulan bakteri ini adalah sporanya dapat dibuat dalam bentuk kering
sehingga mudah ditambahkan ke dalam pakan buatan (Gatesoupe 1999).
Kajian mengenai potensi dan aplikasi penggunaan bakteri probiotik pada
budi daya akuakultur diantaranya dapat memberikan dampak positif bagi
pertumbuhan, kualitas air, dan efisiensi pakan. Murni (2004) menyatakan bahwa
penambahan bakteri probiotik Bacillus sp. ke dalam pakan menyebabkan adanya
peningkatan aktivitas enzim protease dan amilase sehingga kecernaan protein dan

2

karbohidrat meningkat. Sun et al. (2010) menyatakan bahwa pemberian Bacillus
pumilus dan Bacillus clausii dapat memperbaiki efisiensi pakan dan laju
pertumbuhan pada ikan kerapu Epinephelus coides. Tilapia yang diberi probiotik
Enterococcus faecum dengan konsentrasi 107 CFU/mL menunjukkan bobot akhir
dan penambahan bobot harian secara nyata lebih baik dibanding kontrol (Wang et
al. 2008).
Penambahan probiotik dalam pakan telah mampu meningkatkan kinerja
pertumbuhan ikan nila (Putra 2010). Isolat probiotik 1Ub, SKT-b dan Ua efektif
menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan secara signifikan dapat
meningkatkan kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva udang windu
(Widanarni et al. 2008). Probiotik dapat diberikan pada inang atau ditambahkan
ke lingkungan akuatik melalui beberapa cara pemberian (Moriarty 1998).
Perumusan Masalah
Pakan ikan yang diberikan tidak semuanya dapat dicerna oleh ikan karena
ada sebagian yang dikeluarkan dalam bentuk limbah berupa feses dan sisa
metabolisme. Selain banyaknya sisa pakan juga disebabkan kurangnya enzim
pencernaan yang ada pada ikan untuk mengurai karbohidrat, protein atau lemak
yang menyusun pakan. Oleh karena itu, diperlukan suatu cara untuk
meningkatkan efisiensi pakan yaitu dengan penggunaan bakteri probiotik.
Diketahuinya manfaat bakteri probiotik dalam saluran pencernaan ikan yang
mempunyai kemampuan enzimatis sehingga dapat membantu proses penyerapan
pakan. Spesies dari Bacillus sp. banyak digunakan sebagai probiotik pada
akuakultur dikarenakan terdapat berbagai macam keunggulan diantaranya
memiliki enzim amilase, protease dan lipase yang berperan sebagai enzim
pencernaan serta memiliki spora yang dapat dibuat dalam bentuk kering.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menyeleksi Bacillus sp.
dari usus ikan lele serta menguji potensinya sebagai kandidat probiotik pada
pakan ikan.
Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan informasi dan
pengembangan ilmu mikrobiologi khususnya tentang peranan bakteri sebagai
probiotik terutama yang berkaitan dengan nutrisi dan penambahan bakteri
probiotik dalam pakan sehingga mampu meningkatkan efisiensi pakan khususnya
pada ikan lele.

3

TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus sp. sebagai Bakteri Probiotik
Bakteri probiotik yang telah dilaporkan untuk budi daya perairan seperti
ikan, kerang maupun udang adalah bakteri fotosintetik, Lactobacillus dan Bacillus
(Zhou et al. 2009). Genus Bacillus termasuk bakteri Gram positif, berbentuk
batang lurus atau dapat sedikit bengkok, berukuran 0.3-2.2 μm x 1.2-7.0 μm,
aerobik atau dapat berupa fakultatif anaerobik, kebanyakan bersifat motil dan
memiliki endospora. Struktur endospora pada Bacillus membuatnya memiliki
eksistensi yang tinggi di alam karena spora tersebut tahan terhadap cekaman
lingkungan. Spora dari genus Bacillus memiliki keunggulan dibandingkan sel
vegetatif, karena stabil dalam jangka waktu yang lama serta dapat dijadikan
produk komersial yang berguna yaitu sebagai agen biologis (Hong et al. 2005).
Toldar (2009) menyatakan bahwa pembentukan spora ditemukan secara universal
pada genus, diperkirakan sebagai suatu strategi untuk bertahan pada lingkungan.
Mesalhy et al. (2008) melaporkan bakteri probiotik yang diisolasi dari
saluran pencernaan ikan nila adalah dari jenis B. firmis, B. pumilus dan
Citrobacter freundi. Banyak dari spesies Bacillus sp. yang dimanfaatkan sebagai
probiotik, hal ini dikarenakan keberadaan dari spesies yang melimpah di alam.
Definisi probiotik untuk akuakultur adalah sebagai mikroba hidup yang
menguntungkan bagi inang dengan memodifikasi hubungan komunitas mikroba
yang dapat berasosiasi dengan inang atau lingkungannya dalam meningkatkan
penggunaan pakan atau nilai nutrisi, memacu respon inang terhadap penyakit, atau
dengan meningkatkan kualitas perairan (Verschuere et al. 2000). Probiotik
mikroba memiliki peran penting bagi akuakultur, yaitu mengenai pengaruhnya
terhadap produktivitas, sumber nutrisi bagi hewan akuatik, kualitas air,
pengendalian penyakit dan perbaikan lingkungan (Verschuere et al. 2000).
Mekanisme Kerja Bakteri Probiotik
Mikroflora normal dalam saluran pencernaan memiliki peranan yang
penting dalam proses pencernaan hewan (Singh et al. 2010). Berbagai galur
bakteri dalam saluran pencernaan mempunyai kemampuan merubah substratsubstrat makanan menjadi metabolit potensial dengan menghasilkan enzim-enzim
pencernaan sehingga metabolit-metabolit potensial tersebut dapat dimanfaatkan
oleh inangnya (Lisal 2005).
Menurut Verschuere et al. (2000) beberapa kemungkinan model kerja
probiotik yaitu: (1) produksi senyawa penghambat, (2) menghasilkan exogenous
enzim, (3) kompetisi senyawa kimia atau ketersediaan energi, (4) kompetisi
tempat penempelan, (5) peningkatan respons imun. Pada dasarnya ada 3 model
kerja probiotik menurut Irianto (2003) yaitu (1) menekan populasi mikroba
melalui kompetisi dengan memproduksi senyawa-senyawa antimikroba atau
melalui kompetisi nutrisi dan tempat pelekatan di dinding intestinum, (2) merubah
metabolisme mikrobial dengan meningkatkan atau menurunkan aktivitas enzim,

4

(3) menstimulasi imunitas melalui peningkatan kadar antibodi atau aktivitas
makrofag.
Seleksi Bakteri Probiotik
Menurut Faturrahman (2012) sebelum melakukan seleksi mikroba probiotik,
pemahaman tentang mekanisme kerja probiotik sangat penting karena merupakan
dasar untuk menentukan kriteria seleksi yang diinginkan. Prosedur seleksi dan
pengembangan probiotik bagi akuakultur terdiri atas enam tahapan, yaitu (1)
pengumpulan informasi dari literatur serta di lapangan, manajemen produksi dan
pengendalian penyakit, (2) isolasi kandidat probiotik potensial dari pool atau
sumber terbaiknya (inang, pakan alami maupun dari lingkungan budi daya), (3)
seleksi dan evaluasi kemampuan calon probiotik potensial, (4) penilaian
patogenisitas probiotik potensial, (5) pengujian skala laboratorium termasuk
melihat pengaruh kandidat probiotik secara in vivo terhadap variabel imunologi,
sintasan dan keragaan inang, dan (6) analisis ekonomi (Gomez-Gill et al. 2000).
Manfaat probiotik pada budi daya meliputi peningkatan kualitas air,
peningkatan nutrisi inang melalui produksi enzim pencernaan tambahan,
kelangsungan hidup yang lebih besar bagi hewan akuakultur, serta meningkatkan
respon imun (Verschuere et al. 2000). Ada beberapa cara pemberian probiotik
pada inang diantaranya adalah melalui pemberian pakan hidup (Gomez-Gill et al.
2000), penambahan pada media budi daya (Moriarty 1998), dan penambahan pada
pakan buatan (Rengpipat et al. 2000).

METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan
Biomedis, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan
Laboratorium Mikrobiologi, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan
penelitian dimulai pada bulan Juli 2013 hingga Mei 2014.
Isolasi Bacillus sp. dari Usus Ikan Lele
Usus ikan lele sebanyak 1 gram disuspensikan secara terpisah ke dalam 9
mL larutan garam fisiologis 0.85% steril dan dihomogenkan. Tabung reaksi yang
telah berisi sampel diencerkan secara serial pada pengenceran 10 -1 hingga 10-3
serta diberi renjatan panas pada suhu 80 oC selama 10-15 menit. Perlakuan ini
diharapkan hanya akan menyisakan endospora. Larutan sampel sebanyak 0,1 mL
di sebar pada media TSA (Triptone Soy Agar) yang telah ditambahkan susu skim
untuk mengetahui aktivitas proteolitik dan pati terlarut untuk aktivitas amilolitik.
Inokulum yang dikulturkan dengan metoda cawan sebar pada media TSA adalah

5

pengenceran 10-1 hingga 10-3. Petri yang telah berisi sampel kemudian diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ruang. Isolat yang tumbuh akan diindentifikasi secara
morfologi dan dimurnikan sehingga didapatkan koloni tunggal.
Seleksi Bacillus sp. sebagai Kandidat Probiotik
Uji patogenisitas
Isolat bakteri diuji patogenitasnya dengan digoreskan pada media agar-agar
darah. Biakan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Isolat dengan aktivitas
gamma hemolisis atau tidak terbentuknya zona bening di sekitar koloni akan
diambil untuk diuji lanjut.
Uji kepekaan antibiotik
Isolat diuji kepekaannya terhadap 3 jenis antibiotik yaitu amoxicillin 20
μg/mL, rifampisin 5 μg/mL, dan ciprofloxacin 5 μg/mL. Kepekaan antibiotik
dihitung berdasarkan ukuran zona hambat yang terbentuk menggunakan metode
sumur. Kultur bakteri masing-masing ditanam pada medium TSA dengan cara
dituang secara merata pada petri. Pada cawan yang telah dituangkan bakteri dibuat
sumur untuk dimasukkan antibiotik dengan menggunakan corckborer, diinkubasi
pada suhu ruang selama 24 jam kemudian diukur zona hambatnya. Resistensi
antibiotik dihitung berdasarkan ukuran zona hambatan yang terbentuk
menggunakan metode sumur. Interpretasi zona hambatan untuk resistensi,
intermediet dan rentan ditentukan berdasarkan CLSI (2007). Isolat yang memiliki
profil resistensi terhadap salah satu dari ke - 3 antibiotik dieliminasi sebagai
kandidat probiotik.
Total Padatan Tersuspensi (TPT)
Pakan ikan 1.2% dalam 100 mL akuades sebagai substrat disterilisasi pada
suhu 121 oC 15 menit. Substrat diinokulasi dengan 10 mL kultur bakteri dengan
jumlah sel 108 CFU/mL, kemudian diletakkan di shaker dengan kecepatan 120
rpm di suhu ruang selama 120 jam. Analisis TPT untuk isolat terpilih dilakukan
inkubasi selama 120 jam. Kontrol dibuat tanpa penambahan bakteri pada media
kultur. Kertas saring terlebih dahulu dipanaskan di oven pada suhu 105 oC selama
2 jam untuk pengeringan kemudian ditimbang. Sebanyak 10 mL kultur disaring
dengan kertas saring GFC (47 mm Ø Whatman) dalam wadah penyaring yang
dihubungkan dengan Erlenmeyer bercorong. Corong Erlenmeyer dihubungkan
dengan pompa vakum berkekuatan 10 inHg (Milipore, USA). Setelah disaring,
filtrat pada kertas saring dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam
atau sampai mencapai berat konstan. Nilai TPT dihitung dengan menggunakan
persamaan sebagai berikut:

6

Pengujian Aktivitas Proteolitik dan Amilolitik
Pengujian ini bertujuan untuk mengukur besarnya kemampuan dari
aktivitas proteolitik dan amilolitik pada masing-masing isolat yang diuji melalui
uji hidrolisis susu skim dan pati. Hidrolisis proteolitik ditandai dengan adanya
zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan pada media TSA ditambah 1%
susu skim sedangkan hidrolisis amilolitik ditandai dengan zona bening pada
media TSA ditambah 1% pati. Indeks proteolitik dan amilolitik diukur dengan
menggunakan rumus menurut Lim dan Rahim (1987).

IP/IA : Indeks aktivitas proteolitik /amilolitik
X1
: Rata-rata diameter zona bening
X2
: Rata-rata diameter koloni
Produksi Protease dan Amilase Ekstraseluler
Isolat yang memiliki indeks proteolitik dan amilolitik terbesar serta
penurunan total padatan tersuspensi tertinggi dikarakterisasi lanjut. Isolat terpilih
diukur aktivitas enzim protease dan amilasenya. Satu ose koloni tunggal bakteri
diinokulasikan pada 20 mL media TSB (Triptone soy Broth). Sebanyak 10 mL
kultur bakteri (108 CFU/mL) diinokulasikan pada 100 mL kultur pakan 1.2%.
Kultur diinkubasi pada waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm. Setiap
selang waktu 24 jam selama 120 jam diambil sampel kultur untuk pengujian
aktivitas protease dan amilase. Enzim diperoleh dengan cara mensentrifugasi
kultur pada kecepatan 5000x g selama 30 menit.
Pengukuran aktivitas protease
Aktivitas protease diukur berdasarkan metode Walter (1984) (Lampiran 1).
Setiap tabung dimasukkan substrat berupa 0.5 mL kasein 1%, kemudian 0.5 mL
0.01 M bufer fosfat pH 7.5. Untuk sampel ditambahkan 0.1 mL ekstrak kasar
enzim protease, blanko diisi dengan 0.1 mL aquades, sedangkan standar diisi
dengan 0.1 mL tirosin 0.37 mmol L-1. Campuran dikocok sampai homogen lalu
diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Reaksi enzim dihentikan dengan
penambahan 1 mL asam trikloro asetat (TCA) 10%. Untuk standar enzim
ditambahkan setelah pemberian TCA. Campuran diinkubasi 10 menit pada lemari
pendingin, kemudian disentrifus dengan kecepatan 8600x g selama 10 menit.
Endapan dibuang sedangkan supernatan ditambahkan 2.5 mL Na2CO3 (0.4 M) dan

7

0.5 mL pereaksi Folin Cicalteau (1:2) dan dikocok kuat. Setelah didiamkan 20
menit setiap perlakuan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm.
Satu unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
menghasilkan 1 μmol tirosin per menit pada kondisi pengukuran.
Pengukuran aktivitas amilase
Aktivitas amilase diukur menurut metode Bernfeld (1955) (Lampiran 2).
Campuran 1 mL enzim dalam substrat berupa 1 mL 1% pati terlarut yang
dilarutkan dalam bufer fosfat 0.05 M, pH 7.5 diinkubasi pada suhu ruang selama
10 menit kemudian ditambahkan 2 mL reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS)
untuk mendeteksi gula pereduksi. Kontrol dibuat dengan menggunakan komposisi
yang sama tetapi enzim ditambahkan setelah pemberian DNS (Lampiran 3).
Sampel dan kontrol dididihkan selama 5 menit untuk menghentikan reaksi, lalu
didinginkan selama 15 menit dalam air. Gula pereduksi yang dihasilkan diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Aktivitas enzim
didapatkan dengan mengukur konsentrasi maltosa reaksi dengan persamaan
regresi linear dari kurva standar maltosa. Satu unit aktivitas amilase didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang reaksinya menghasilkan produk setara dengan 1 μmol
maltosa per menit pada kondisi pengukuran.
Kurva Pertumbuhan
Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri kandidat probiotik bertujuan untuk
mengetahui fase-fase pertumbuhan bakteri dan penentuan waktu dalam
pemanenan sel bakteri. Koloni tunggal bakteri diinokulasikan ke dalam 20 mL
medium cair TSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Sebanyak 10 mL
kultur segar diinokulasikan ke dalam medium TSB steril 90 mL, di shaker 120
rpm selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri diamati setiap 2 jam dengan mengukur
nilai kerapatan optik pada panjang gelombang 620 nm dan dicawankan pada
beberapa titik pengamatan (Hadioetomo 1993).
Pencampuran Bacillus sp. pada Pakan Ikan
Bakteri diinokulasi dalam media cair TSB dan di shaker selama 8 jam (hasil
pengamatan kurva pertumbuhan). Kultur bakteri kemudian disentrifugasi dan
hasil endapan diambil (108 CFU/mL) lalu ditambahkan pada 50 gram pakan dan 1
gram CMC (Carboxy-Methyl-Cellulose) kemudian dicampurkan dan diinkubasi
pada suhu 60 oC selama 10 menit dan dicawankan. Ketahanan bakteri diperoleh
dari hasil perbandingan jumlah sel bakteri sebelum dan setelah inkubasi.

8

Identifikasi 16S-rRNA
Amplifikasi gen penyandi 16S-rRNA menggunakan primer 63f (5’CAG
GCC TAA CACATG CAA GTC-3’) dan primer 1387r (5’-GGG GGG WGT
GTA CAA CGC-3’) Marchesi et al. (1998). Komposisi master mix PCR setiap
tabung terdiri atas 25 µl GoTaq (Promega), 4 µl primer 63f, 4 µl primer 1387r, 17
µl ddH2O dan DNA cetakan (template) diambil dengan tusuk gigi secara langsung
dari isolat Bacillus. Kondisi PCR sebagai berikut: pradenaturasi 95 oC selama 5
menit, denaturasi 95 oC selama 1 menit, annealing primer 55 oC selama 1 menit,
elongasi 72 oC selama 1 menit, dan post PCR pada suhu 72 oC selama 5 menit dan
di running sebanyak 30 siklus. Penghentian reaksi dilakukan dengan penurunan
suhu ke 4 oC. Produk PCR dijalankan pada elektroforesis gel agarose 1% dengan
bufer TAE 1X pada 80 volt selama 45 menit. Selanjutnya, diletakkan di atas
paparan sinar UV transluminator untuk divisualisasikan dan dilihat ada tidaknya
pita DNA bakteri hasil isolasi.
Penentuan urutan gen (sekuensing) dilakukan dengan mengirimkan DNA
hasil amplifikasi ke perusahaan penyedia jasa sekuensing. Analisis data kasar
hasil sekuensing menggunakan Mega 5 software. Hasil alignment sekuen DNA
disejajarkan dengan data base di Gene Bank menggunakan program BLAST-N
online software (www.ncbi.nlm.nih.gov).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Bacillus sp. dari Usus Ikan Lele
Hasil isolasi yang berasal dari usus ikan lele diperolah 16 isolat. Sebanyak 8
isolat diperoleh dari media TSA ditambah 1% pati, dan 8 isolat tumbuh pada
media TSA ditambah 1% susu skim yang diinkubasi pada suhu ruang selama 24
jam (Tabel 1). Berdasarkan bentuk morfologi dari 16 isolat terlihat memiliki
karakter morfologi koloni dan sel yang relatif seragam. Warna koloni berkisar
antara putih, krem dan kuning sedangkan tepian koloni ada yang tak beraturan,
bergerigi dan licin (Lampiran 4).
Tabel 1 Isolat yang diperoleh dari usus ikan lele dengan masa inkubasi 24 jam
pada suhu ruang
Media

Jumlah isolat

TSA + Pati 1%

8

TSA + Susu skim 1%

8

Isolat
PTB 1.1, PTB 1.2, PTB 1.3, PTB
1.4, PTB 1.5, PTB 1.6, PTB 1.7,
PTB 2.0
STB 1.1, STB 1.5, STB 1.6, STB
2.1, STB 2.2, STB 2.3, STB 2.4,
STB 2.5

9

Pewarnaan spora dilakukan untuk memastikan bahwa isolat yang ada
merupakan Bacillus sp. Hasil dari pewarnaan spora terdapat 14 isolat yang
merupakan Bacillus sp. (Tabel 1) kecuali STB 2.4 dan STB 2.5.
Bacillus sp. sebagai Kandidat Probiotik
Patogenisitas Bacillus sp. secara in vitro
Hasil uji patogenisitas dengan inokulasi isolat pada media agar-agar darah
menunjukkan bahwa dari 14 isolat yang diuji terdapat 2 isolat yang memiliki
aktivitas beta hemolisis, 5 isolat alfa hemolisis dan 7 isolat dengan aktivitas
gamma hemolisis (Tabel 2).
Tabel 2 Sifat patogenisitas Bacillus sp. pada media agar-agar darah dengan masa
inkubasi 24 jam pada suhu ruang
Hemolisis

Jumlah isolat

Beta ( )
Alfa (α)
Gamma ( )

2
5
7

Isolat
PTB 1.3, PTB 2.0
PTB 1.5, PTB 1.6, STB 1.5, STB 2.2, STB 2.3
PTB 1.1, PTB 1.2, PTB 1.4, PTB 1.7, STB 1.1,
STB 1.6, STB 2.1

Kepekaan Bacillus sp. terhadap antibiotik
Pada penelitian ini telah dilakukan uji kepekaaan terhadap 3 jenis antibiotik
menggunakan metode sumur. Uji kepekaan isolat dilakukan terhadap beberapa
antibiotik yaitu rifampisin, amoxicillin dan ciprofloxacin. Hasil uji kepekaan
terhadap 3 jenis antibiotik tersebut disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Kepekaan Bacillus sp. terhadap 3 jenis antibiotik. Kriteria yang diamati
berdasarkan diameter zona hambat (mm) yang terbentuk dengan masa
inkubasi 24 jam pada suhu ruang
Kode
Isolat
STB 1.1
STB 1.6
STB 2.1
PTB 1.1
PTB 1.2
PTB 1.4
PTB 1.7

Rifampisin
Ø
Status
15
R
25
S
23
S
27
S
30
S
29
S
25
S

Jenis Antibiotik*
Amoxicillin
Ø
Status
10
R
30
S
0
R
20
I
20
I
37
S
31
S

Ciprofloxacin
Ø
Status
35
S
33
S
40
S
27
S
40
S
32
S
40
S

Isolat
terpilih
√
√
√

*
Standar resistensi rifampisin 5μg/mLμ ≤16 mm resisten, 17-19 mm intermediet, ≥20 peka; amoxicillin
20μg/mLμ ≤13 mm resisten, 14-16 mm intermediet, ≥17 peka; ciprofloxacin 5μg/mLμ ≤15 mm resisten, 16-20
mm intermediet, ≥21 peka; Øμ diameter zona hambat. S = Peka, I = Intermediet dan R = resisten (CLSI 2007).

10

Resisten rifampisin dan amoxicillin ditunjukkan oleh isolat STB 1.1, STB
2.1, sedangkan intermediet amoxicillin ditunjukkan oleh isolat PTB 1.1, dan PTB
1.2 (Tabel 3). Isolat yang masih sensitif terhadap antibiotik yang diuji adalah STB
1.6, PTB 1.4 dan PTB 1.7.
Total Padatan Tersuspensi (TPT)
Pengukuran TPT didasarkan pada berat partikel pakan yang tersuspensi
dalam air. Pakan ikan yang digunakan sebagai media terdiri atas campuran
protein, karbohidrat, lemak, vitamin dan mineral. Hasil uji total TPT pada pakan
yang ditambahkan isolat-isolat Bacillus sp. dengan melihat kadar penurunannya
pada kertas saring disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Penurunan total padatan tersuspensi (TPT), pakan yang ditambah isolatisolat Bacillus sp. Substrat 1.2% pakan ikan, diinkubasi 120 jam pada
kecepatan 120 rpm suhu ruang
Isolat
PTB 1.4
PTB 1.7
STB 1.6
Kontrol *

Ks + filtrat (g)
0,1179
0,1215
0,1215
0,1288

Ks (g)
0,1111
0,1110
0,1127
0,1125

Volum (mL)
10
10
10
10

TPT (g)
0,0068
0,0105
0,0088
0,0163

*

Tidak ada penambahan kultur bakteri; Ks: kertas saring

Isolat PTB 1.4 memiliki kemampuan mendegradasi pakan terbesar dengan
sisa pakan pada kertas saring terkecil yaitu 0,0068 g. Isolat PTB 1.7 dan STB 1.6
memiliki kemampuan mendegradasi pakan dengan sisa pakan pada kertas saring
sebesar 0,0105 g dan 0,0088 g, dengan nilai pada kertas saring lebih besar
dibanding isolat PTB 1.4, sehingga isolat PTB 1.4 menjadi isolat terpilih untuk
dilihat aktivitas proteolitik dan amilolitiknya. Kontrol tanpa penambahan kultur
bakteri memiliki kemampuan degradasi lebih kecil dengan sisa pada kertas saring
terbesar yaitu 0,0163 g.
Aktivitas Proteolitik dan Amilolitik
Isolat PTB 1.4 memiliki aktivitas proteolitik dan amilolitik dengan ditandai
adanya zona bening di sekitar koloni (Gambar 1). Pembentukan zona bening di
sekitar koloni pada media agar-agar yang ditambahkan dengan 1% susu skim dan
1% pati menunjukkan isolat PTB 1.4 mampu menghidrolisis sumber karbon yang
digunakan yaitu susu skim dan pati. Indeks proteolitik (IP) untuk isolat terpilih
adalah 0.60 dan indeks amilolitik (IA) adalah 0,61.

11

a

b

Gambar 1 Zona bening yang terbentuk, a. 1% susu skim, b 1% pati, inkubasi 24
jam pada suhu ruang

Aktivitas Protease (IU/ml)

Kemampuan bakteri dalam mendegradasi substrat dapat diukur melalui
aktivitas enzim yang dihasilkan dengan diproduksi pada media cair. Aktivitas
enzim protease untuk isolat PTB 1.4 dilakukan pada kultur cair pakan ikan 1.2%.
Pada penelitian ini pembuatan kurva aktivitas enzim protease dilakukan selama
120 jam dengan pengamatan setiap 24 jam. Aktivitas protease pada jam ke 24
setelah inkubasi 0,0566 U/mL, pada jam ke 48 sebesar 0,0587 U/mL, dan aktivitas
tertinggi protease tercapai pada 72 jam pengamatan yaitu sebesar 0,0659 U/mL
(Gambar 2). Aktivitas protease mengalami penurunan pada 96 jam dan 120 jam
pengamatan.
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
24

48

72

96

120

Waktu (Jam)

Gambar 2 Aktivitas protease isolat PTB 1.4 pada 1.2% media pakan ikan, di
shaker 120 rpm selama 120 jam pada suhu ruang.
Pengukuran aktivitas enzim amilase untuk isolat PTB 1.4 dilakukan pada
kultur cair pakan ikan 1.2%. Aktivitas amilase dimulai dari jam ke 24 setelah
inkubasi dengan aktivitas sebesar 0,081 U/mL, dan pada 48 jam pengamatan
sebesar 0,145 U/mL. Aktivitas tertinggi amilase tercapai pada 120 jam
pengamatan yaitu sebesar 0,399 U/mL (Gambar 3). Aktivitas amilase mengalami
peningkatan pada 96 jam hingga 120 jam pengamatan.

Aktivitas Amilase (IU/mL)

12

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
24

48

72

96

120

Waktu (Jam)

Gambar 3 Aktivitas amilase isolat PTB 1.4 pada 1.2% media pakan ikan, di
shaker 120 rpm selama 120 jam pada suhu ruang

Kurva Pertumbuhan Isolat PTB 1.4

Optical Density ((λ= 620
nm)

Pengamatan fase pertumbuhan bakteri dilakukan dengan mengamati
perubahan populasi dan nilai kerapatan optik (Optical Density = OD). Selama 24
jam pengamatan isolat PTB 1.4 menunjukkan pola pertumbuhan yang diawali
oleh fase lag diikuti fase eksponensial dan fase statis. Fase lag atau fase
pertumbuhan awal terjadi antara 0 dan 2 jam. Fase eksponensial terjadi pada jam
ke 2 hingga jam ke 8 (Gambar 4).

2,5
2
1,5
1
0,5
0
2

4

6

8

10

12

24

Periode Pengamatan (Jam)

Gambar 4 Kurva kerapatan optik (Optical Density), isolat PTB 1.4. Isolat
ditumbuhkan pada media TSB, pH 7.2, dan di shaker 120 rpm pada
suhu ruang selama 24 jam

13

Ketahanan Bacillus sp. dalam Pakan Ikan
Pencampuran isolat PTB 1.4 dengan pakan ikan dimaksudkan sebagai
media pembawa probiotik bagi ikan. Pemilihan bakteri berspora dengan tujuan
agar pembuatan pelet dengan proses pemanasan tidak menyebabkan bakteri mati.
Jumlah inokulum awal adalah 108 CFU/mL, setelah digabungkan pada pakan dan
CMC kemudian diinkubasi selama 10 menit jumlah inokulum akhir menjadi 106
CFU/mL.
Identifikasi gen 16S-rRNA
Berdasarkan BLAST-N (Lampiran 5), isolat PTB 1.4 memiliki nilai
homologi sebesar 99% dan hasil pensejajaran 1011 bp menunjukkan isolat PTB
1.4 memiliki kedekatan dengan Bacillus megaterium (Tabel 5 dan Lampiran 6).
Tabel 5 Hasil BLAST-N gen sekuen 16S-rRNA isolat PTB 1.4
Nama Spesies
Bacillus sp. WP-XY01-5
Bacillus megaterium galur RD30
Bacillus megaterium galur S-3
Bacillus megaterium galur RC55
Bacillus megaterium galur RB132
Bacillus megaterium galur LA141
Bacillus megaterium galur RA138
Bacillus megaterium galur BMN1
Bacillus megaterium galur RLS12
Bacillus megaterium galur RHO3

Homologi
99
99
99
99
99
99
99
99
99
99

Nomor Assesi
KF052591.1
KJ534462.1
KJ572280.1
KJ534461.1
KJ534460.1
KJ534459.1
KJ534458.1
KJ461522.1
KF957737.1
KF957730.1

Pembahasan
Suatu probiotik yang baik seharusnya diisolasi dari hewan inang, habitat
atau pakannya sehingga dapat beradaptasi dengan lingkungan maupun saluran
pencernaannya. Menurut Verschuere et al. (2000) probiotik merupakan agen
mikroba hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inangnya
dengan berbagai macam interaksi, salah satunya adalah menjamin perbaikan
dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya. Pada penelitian ini
isolat yang didapatkan diharapkan adalah spesies dari Bacillus sp. Hasil isolasi
dari usus ikan lele didapatkan 14 isolat merupakan Bacillus sp. Penapisan Bacillus
dilakukan dengan cara memanaskan sampel usus ikan lele, metode ini sudah
menjadi cara yang umum dilakukan untuk menyeleksi Bacillus dari sampel alam,
karena bakteri ini merupakan bakteri penghasil endospora. Hong et al. (2005)
menyatakan bahwa spora dari genus Bacillus memiliki keunggulan dibandingkan
sel vegetatif, karena stabil dalam jangka waktu yang lama serta dapat dijadikan
produk komersil yang berguna.

14

Bacillus sp. merupakan bakteri Gram positif, pembentuk spora yang secara
normal terdapat di udara, air, tanah, sedimen dan diperkirakan dapat masuk
saluran pencernaan melalui asosiasi dengan makanan (Moriarty 1999; Farzanfar
2006). Bakteri ini banyak digunakan dalam aplikasi probiotik, khususnya pada
akuakultur karena bakteri ini banyak ditemukan di alam dan spesiesnya dapat
menghasilkan enzim ekstraseluler serta memiliki spora. Toldar (2009)
menyatakan bahwa bakteri ini tersebar luas di alam dan dikenal dengan sporanya
yang tahan terhadap senyawa kimia dan agen fisik. Beberapa spesies Bacillus
yang dilaporkan untuk probiotik pada sistem akuakultur, diantaranya adalah
Bacillus coagulans SC8168 (Zhou et al. 2009), Bacillus spp. (Ziaei-Nejad et al.
2006), dan Bacillus S11 (Rengpipat et al. 2000). Selanjutnya biakan yang telah
murni diseleksi berdasarkan sejumlah kriteria diantaranya uji patogenisitas secara
in vitro menggunakan agar-agar darah kemudian kepekaan isolat terhadap
antibiotik uji dan kemampuan isolat untuk mendegradasi pakan dengan uji total
padatan tersuspensi serta uji aktivitas enzim protease dan amilase yang dihasilkan.
Pada uji patogenisitas menggunakan agar-agar darah didapatkan 7 isolat
yang memiliki aktivitas gamma hemolisis yang ditandai dengan tidak ada
perubahan warna dalam media. Media yang digunakan adalah media agar-agar
darah yang merupakan media diferensial, media ini digunakan untuk membedakan
bakteri berdasarkan kemampuan melisiskan sel darah merah. Bakteri yang mampu
melisiskan sel darah merah bersifat lebih virulen dibandingkan yang tidak mampu
melisiskan sel darah merah. Kemampuan bakteri untuk melisiskan sel darah
merah ditentukan oleh substansi berupa protein ekstraseluler yang disebut
hemolisin. Ada 3 tipe hemolisis yaitu, beta, gamma dan alfa hemolisis. Beta
hemolisis disebut sebagai lisis lengkap sel darah merah dan hemoglobin, sehingga
media yang ada koloninya menjadi bening. Pada gamma hemolisis tidak terjadi
hemolisis, ditandai dengan tidak ada perubahan warna dalam media sedangkan
alfa hemolisis disebut sebagai lisis sebagian dari sel darah merah dan hemoglobin
(Suryanto et al. 2007).
Faktor-faktor lingkungan mikro, seperti faktor adhesi dan kompetisi
terhadap bakteri komensal lainnya, perolehan nutrisi, dan pH di dalam saluran
gastrointestinal berpengaruh terhadap produksi enterotoksin. Duc et al. (2004)
menyatakan bahwa bakteri tidak selalu memproduksi enterotoksin. Selain melalui
uji hemolisis pada media agar-agar darah untuk sifat patogenitas dapat juga
dilakukan secara molekuler dengan PCR. Das et al. (2009) melakukan deteksi
cepat terhadap gen yang mencirikan Bacillus cereus enterotoksigenik (hbla)
melalui teknik PCR. Namun dalam penelitian ini uji patogenitasnya hanya
menggunakan media agar-agar darah sehingga hanya isolat dengan aktivitas
gamma hemolisis akan diseleksi lebih lanjut dan isolat yang memiliki aktivitas
alfa dan beta hemolisis akan dieliminasi dari seleksi karena dikhawatirkan akan
dapat bersifat patogen.
Selain itu, salah satu kriteria untuk seleksi bakteri probiotik adalah kepekaan
terhadap salah satu atau lebih antibiotik yang umum digunakan pada manusia dan
hewan akuatik. Gou et al. (2009) mengatakan bahwa penggunaan antibiotik dalam
jangka tertentu dapat menyebabkan timbulnya masalah resisten bakteri patogen
terhadap antibiotik tersebut pada ikan dan mencemari lingkungan yang pada
akhirnya dapat mematikan organisme bukan sasaran. Pada penelitian ini telah
dilakukan uji kepekaaan terhadap 3 jenis antibiotik menggunakan metode sumur.

15

Uji kepekaan isolat dilakukan terhadap beberapa antibiotik. Rifampisin
merupakan inhibitor RNA polimerase melalui pengikatan kuat pada subunit- dan
memblok masuknya nukleotida pertama yang dibutuhkan untuk aktivasi
polimerase sehingga menghambat laju transkripsi, sedangkan antibiotik
amoxicillin dan ciprofloxacin merupakan antibiotik yang mekanisme kerjanya
merusak sintesis peptidoglikan.
Bakteri resisten antibiotik bila digunakan akan dapat meningkatkan potensi
ancaman melalui transfer gen resistensi kepada patogen manusia lewat saluran
gastrointestinal atau lingkungan. Brashear et al. (2003) menyatakan dari 55 isolat
kandidat probiotik yang diuji kerentanannya terhadap 6 jenis antibiotik hanya 19
isolat yang masih bersifat rentan. Faturrahman (2012) melaporkan bahwa dari 14
isolat kandidat probiotik yang diuji sensitifitasnya terhadap 4 jenis antibiotik
(tetrasiklin, rifampisin, ampisilin dan vankomisin) hanya diperoleh 7 isolat yang
bersifat sensitif. Resistensi pada bakteri disebabkan oleh beberapa faktor
diantaranya adanya gen resistensi pada kromosom atau plasmid dan dapat juga
karena terjadinya transfer materi genetik. Isolat-isolat yang sensitif terhadap
antibiotik yang diuji kemudian diseleksi lanjut dengan melihat kemampuan isolat
mendegradasi pakan ikan melalui uji total padatan tersuspensi.
Pada pengukuran total padatan tersuspensi yang diamati ialah berat partikel
pakan yang tersuspensi dalam air. Pakan ikan yang digunakan sebagai media
terdiri atas campuran protein, karbohidrat, lemak, vitamin dan mineral. Pakan ikan
yang berkualitas selain dapat dihasilkan dari sumber bahan pakan, dapat juga
dengan penambahan enzim pencernaan. Semakin tinggi nutrien pakan yang
tercerna, semakin besar pula kemungkinan nutrien tersebut dimanfaatkan oleh
ikan untuk pertumbuhannya dan menurunkan porsi nutrien yang akan terbuang ke
lingkungan, sehingga secara tidak langsung dapat menekan laju penurunan mutu
lingkungan. Peranan probiotik dalam meningkatkan kecernaan pakan dan
pemanfaatan bagi pertumbuhan ikan telah banyak diteliti. Rengpipat et al. (1998)
melaporkan bahwa keberadaan probiotik dalam saluran pencernaan dapat
meningkatkan penyerapan pakan serta menekan jumlah patogen dalam saluran
pencernaan.
Seperti diketahui bahwa enzim ekstraseluler yang disekresikan oleh bakteri
untuk mendegradasi pakan ditujukan untuk memenuhi kebutuhan karbon atau
energi bagi bakteri itu sendiri, akan tetapi karena ketersediaan nutrien lebih
banyak dibandingkan dengan kebutuhan bakteri menyebabkan ketersediaan
nutrien untuk inang tidak terganggu (Faturrahman 2012). Peranan enzim-enzim
pencernaan sangat penting, karena dapat berperan dalam menghidrolisis senyawasenyawa kompleks menjadi lebih sederhana dan mudah diserap. Kemampuan
isolat dalam mendegradasi pakan didukung oleh kemampuan isolat dalam
menghasilkan enzim-enzim ekstraseluler yang digunakan untuk memecah
senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana. Sonenschein et al. (1993)
menyatakan bahwa enzim ekstraseluler Bacillus sangat efisien dalam memecah
berbagai senyawa karbohidrat, lipid dan protein rantai panjang menjadi unit-unit
rantai pendek atau senyawa yang lebih sederhana. Isolat PTB 1.4 yang memiliki
kemampuan degradasi tertinggi dilakukan uji proteolitik dan amilolitik serta
dilihat aktivitas amilase dan proteasenya.
Menurut Cordeiro et al. (2002); Aygan et al. (2008) penapisan awal isolat
penghasil enzim potensial dilakukan dengan produksi enzim secara kualitatif

16

berdasarkan luas daerah zona bening yang dihasilkan dari isolat pada media padat
yang terdapat substrat. Lim dan Rahim (1987); Wang et al. (2007) menyeleksi
isolat penghasil enzim potensial berdasarkan indeks aktivitas tertinggi.
Kemampuan isolat PTB 1.4 dalam menghasilkan aktivitas proteolitik dan
amilolitik menunjukkan bahwa bakteri ini memiliki pengaruh menguntungkan
terhadap proses pencernaan ikan. Menurut Fardiaz (1992) sebagian dari Bacillus
sp. mempunyai sifat proteolitik yang dapat mensekresikan enzim protease,
sebagian bersifat amilolitik yang dapat mensekresikan enzim amilase dan bersifat
lipolitik yang dapat mensekresikan enzim lipase. Uji aktivitas proteolitik dan
amilolitik yang dilakukan hanya bersifat kualitatif berdasarkan zona bening yang
dihasilkan, sehingga untuk mengetahui aktivitas enzimnya secara kuantitatif
dilakukan pengukuran aktivitas enzim ekstraselulernya.
Enzim protease merupakan salah satu jenis enzim yang paling banyak
digunakan dalam indutrsi. Protease merupakan enzim yang berfungsi
menghidrolisis ikatan peptida pada protein m