g. Pembuatan sediaan histopatologi
agian n
kan
impan dalam refrigerator 4 −6ºC. Setiap blok parafin yang berisi
jari
rmic 10 hingga tulang menjadi lunak dan
h. P
Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop dan video akukan terhadap: 1 Perhitungan jumlah dan tinggi
epit Setiap sampel organ diiris tipis trimming dengan ukuran ± 0,5 cm. Setiap b
saluran pernapasan sinus hidung dan setiap lobus paru lobus apikalis kiri da an, lobus medialis kiri dan kanan, lobus diafragmatikus kiri dan kanan, serta lobus
assesorius dimasukkan ke dalam cassette yang berbeda. Organ tersebut kemudian dimasukkan dalam automatic tissue processor otomatis dengan tujuan menghilangkan
kandungan air dalam jaringansampel. Dalam alat tersebut secara otomatis jaringan akan didehidrasi dengan alkohol bertingkat alkohol 70, alkohol 80, alkohol 90,
alkohol 95, alkohol 100, setelah itu jaringan dimasukkan dalam xylol untuk melarutkan alkohol yang terdapat dalam jaringansampel agar mudah terjadi infiltrasi
oleh parafin. Embedding
merupakan proses penanaman jaringan ke dalam blok parafin yang kemudian dis
ngansampel diiris menggunakan mikrotom dengan ketebalan 3-4 μm. Potongan
jaringan yang sangat tipis diletakkan diatas permukaan air hangat supaya jaringan tidak mengerut, dan diletakkan diatas gelas objek untuk diinkubasi selama ± 24 jam
supaya jaringan melekat di atas gelas objek. Khusus jaringan sinus hidung yang berada diantara tulang kepala, dilakukan
proses dekalsifikasi menggunakan Asam Fo diproses bersama jaringan lainnya. Dalam pembuatan preparat histopatologi,
pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff AB- PAS Lihat Lampiran 3 dan hematoxylin-eosin HE Lihat Lampiran 4. Beberapa
potong jaringan paru diproses hingga tercetak di dalam resin, kemudian diiris menggunakan ultra-mikrotom dengan pisau khusus diamond knife setebal 200 nm
metode semi thin dan diwarnai dengan toluidine blue.
engamatan Histopatologis
mikrometer. Pengamatan dil el bersilia, serta perhitungan rasio sel epitelia bersilia dengan sel goblet.
Pengamatan dilakukan pada 10 =n lapang pandang LP masing-masing pada
mukosa sepanjang 1000 μm dari jaringan sinus hidung, trakhea, bronkhus, dan
bronkhiolus ; 2 Penilaian reaksi jaringan interstitium paru pada 10 =n LP masing- masing seluas 1,6x1,3
μm
2
. Analisis respon jaringan dinilai secara kualitatif dan kemudian dilakukan skoring terhadap perubahan tersebut sehingga memungkinkan
dilakukan analisis kuantitatif statistika. Penilaian skor 1, 2, 3, dan 4 diberikan jika dalam LP terdapat 25, 50, 75 dan 100 jaringan paru mengalami pneumonia
interstitialis ; 3 Penghitungan jumlah sel makrofag alveolaris serta pneumosit tipe I dan II pada 10 =n LP, masing-masing seluas 1,6x1,3
μm
2
.
buatan preparat semi-thin Pem
1. Sampel dalam blok resin dipotong menggunakan ultramicrotome dengan pisau gga ketebalan 200 nm
ang dipasang tidak terlalu panas, agar tidak terbentuk gelembung udara di
4. ran pewarnanya dibiarkan menguap.
Pemer ltrastruktur Jaringan
ilakukan pemeriksaan ultrastruktur paru-paru tikus tanpa pajanan kontrol dan dengan n Transmission Electron Microscope TEM Jeol
khusus diamond knife hin 2. Hasil potongan semi thin diletakkan di atas objek glass yang telah ditetesi akuades
steril 3. Air pada potongan dibiarkan menguap proses ini dapat dibantu menggunakan hot
plate y
bawah helaian resin. Setelah kering, potongan semi-thin kemudian ditetesi dengan pewarnaan toluidine
blue 1, kemudian cai 5. Hasil potongan ditutup dengan coverglass dan diamati menggunakan mikroskop
cahaya.
iksaan U
D pajanan asap rokok dengan menggunaka
JM 1010.
Pembuatan Preparat untuk Pemeriksaan Ultrastruktur
Fiksasi
Jaringan yang berukuran 1x1x1 mm
3
direndam ke dalam larutan campuran glutaraldehyde, buffer cacodylate 0,1 M dengan pH 7,4 dan 3 sukrosa selama 24 jam.
Pencucian jaringan dilakukan dengan menggunakan buffer cacodylate 0,1 M dengan pH 7,4 selama 15 menit sebanyak 3 kali. Setelah fiksasi dilakukan, jaringan dimasukkan ke
dalam larutan osmium tetroksida dan K
3
FeCN
6
selama dua jam. Kemudian jaringan dicuci kembali dengan menggunakan buffer cacodylate selama 15 menit sebanyak 2 kali.
Semua tahapan fiksasi dilakukan pada suhu 4°C dan dalam kondisi teragitasi.
Dehidrasi dan Infiltrasi
Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan larutan etanol secara bertingkat dari konsentrasi 10 sampai dengan absolut. Lama jaringan dalam larutan etanol berkisar
antara 10 menit hingga 30 menit. Proses dehidrasi berjalan dalam kondisi teragitasi dan pada suhu 4°C.
Proses infiltrasi menggunakan perbandingan larutan etanol absolute dan propylene oxide secara bertingkat hingga hanya menggunakan larutan propylene murni.
Infiltrasi dilakukan dalam kondisi teragitasi dan pada suhu ruang selama 30 menit untuk setiap tahapannya.
Embedding
Larutan yang digunakan dalam proses embedding adalah campuran Spurr. Sebelum jaringan direndam dengan menggunakan spurr terlebih dahulu direndam dalam
campuran larutan propylene okside dengan spurr secara bertahap selama 30 menit per tahapannya. Dalam proses embedding diupayakan agar tidak terdapat gelembung udara
karena dapat mengganggu proses selanjutnya pemotongan blok sehingga pada tahap jaringan direndam pada spurr dilakukan dalam kondisi tervakum selama satu malam.
Proses polimerisasi spurr hingga menghasilkan blok dilakukan dalam inkubator vakum selama 16-18 jam pada suhu 70°C.
Pemotongan Blok Sampel
Blok sampel yang telah dibuat di trimming agar mendapatkan daerah jaringan yang diinginkan dengan ukuran kecil sekitar 1x1 mm. Daerah jaringan berbentuk
trapesium untuk memudahkan dalam proses pengumpulan potongan. Diusahakan jaringan yang diinginkan berada di tengah daerah trapesium agar pada saat pengamatan di
mikroskop elektron daerah yang dikehendaki dapat terlihat secara keseluruhan. Tebal potongan agar dapat diobservasi di bawah mikroskop elektron berkisar
antara 50-60 nm. Proses pemotongan menggunakan glass knife yaitu pisau yang terbuat dari kaca. Untuk mendapatkan potongan yang tipis digunakan diamond knife.
Hasil potongan dengan ukuran tipis dikumpulkan dan diletakkan pada permukaan grid yang dilapisi oleh larutan 0,5 formvar Sigma dalam chloroform. Kemudian
dilakukan pewarnaan menggunakan uranil asetat dan lead sitrat. Setelah proses pewarnaan, grid yang telah tertempel oleh jaringan siap untuk diamati di mikroskop
elektron transmisi Bozzola 1991.
5. Analisis dan Interpretasi Data
Kategori