erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, laminar air flow, pipet mikro 1 mL, tip, oven, dan autoklaf, vorteks. Media yang digunakan untuk isolasi mikrob antara
lain King B untuk isolasi Pseudomonas, media seleksi Azotobacter, media NFB Nitrogen Free Broth untuk isolasi Azospirillum, Media CMC Carboxyl Methyl
Celullose untuk isolasi mikrob pendegradasi selulosa, media Skim Milk untuk
isolasi mikrob pendegradasi protein, media Pikovskaya untuk isolasi mikrob pelarut fosfat, media Verstraete untuk isolasi Nitrosomonas, dan media seleksi
Nitrobacter .
3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Pengambilan Sampel Tanah
Pengambilan sampel tanah dilakukan pada perakaran tebu transgenik di lahan percobaan PG Djatiroto, Lumajang, Jawa Timur. Tiap perakaran klon tebu
diambil sampel tanah pada daerah perakaran tebu sedalam 15-30 cm. Sampel tanah diambil secara komposit dari 9 titik secara acak pada perakaran tebu lalu
dicampur jadi satu kemudian diambil 200 gram. Pengambilan sampel tanah dilakukan dua kali ulangan duplo.
3.3.2. Isolasi Mikrob Tanah
Sampel diambil 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 mL larutan fisiologis 0,85 NaCl dan dihomogenkan dengan vorteks
selama 3-5 menit. Dari tabung reaksi pertama dipipet lagi sebanyak 1 mL. Prosedur ini dilakukan sampai pengenceran yang diinginkan dan dilakukan dalam
tempat yang aseptik agar terjaga dari kontaminan. Penghitungan jumlah mikrob dilakukan dengan metode hitung cawan Lay,
1994 dan MPN Most Probable Number. Populasi mikrob tanah yang dihitung menggunakan metode hitung cawan antara lain Azotobacter, Pseudomonas,
mikrob pelarut fosfat, mikrob pendegradasi protein, mikrob pendegradasi selulosa. Metode MPN digunakan untuk menghitung populasi Nitrosomonas,
Nitrobacter dan Azospirillum.
Pada metode hitung cawan, seri pengenceran yang telah ditentukan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah disediakan. Setelah seri pengenceran
dimasukkan kedalam cawan petri maka siap dituang media yang telah disterilkan sebanyak 10-20 mL. Media yang dituang dalam kondisi yang tidak terlalu panas,
sekitar 40
o
C. Inkubasi dilakukan 3-7 hari di dalam inkubator pada suhu 35
o
C. Setelah mikrob diinkubasi sampai waktu yang ditentukan, maka mikrob dihitung
populasinya menggunakan metode hitung cawan dengan satuan CFU colony formed unit
gram tanah.
Gambar 3. Pembuatan seri pengenceran, a metode hitung cawan, b metode MPN
dengan 3 tabung
9 mL Larutan
fisiologis 1
mL
1
mL
1
mL
1
mL
Sampel tanah 1 gram
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
1 mL 1 mL
tabung reaksi yang sudah terisi media 1 mL
1 mL 1 mL
9 mL Larutan
fisiologis
Sampel tanah 1 gram
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
1 mL 1 mL
1 mL
a
b
Metode MPN dilakukan dengan cara seri pengenceran yang ditentukan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media yang telah disterilkan
sebanyak 1 mL. Setiap seri pengenceran yang diinginkan dimasukkan ke dalam 3 atau 5 tabung reaksi yang telah terisi media. Inkubasi untuk menumbuhkan
Nitosomonas dan Nitrobacter membutuhkan selama 3-4 minggu dan untuk
Azospirillum selama 5-7 hari. Setelah masa inkubasi yang telah ditentukan, tabung
yang diinkubasikan dicocokkan dengan tabel MPN sesuai dengan jumlah tabung yang positif. Hasil perhitungan metode MPN memiliki satuan selgram tanah.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Populasi Bakteri Penambat N
