Transformasi Genetik Pada Padi Indica Menggunakan Metode Infeksi Awal Jaringan Skutelum
TRANSFORMASI GENETIK PADA PADI INDICA
MENGGUNAKAN METODE INFEKSI AWAL JARINGAN
SKUTELUM
Melania
Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
2010
TRANSFORMASI GENETIK PADA PADI INDICA
MENGGUNAKAN METODE INFEKSI AWAL JARINGAN
SKUTELUM
MELANIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
2010
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Transformasi Genetik Pada Padi Indica Menggunakan Metode
Infeksi Awal Jaringan Skutelum
: Melania
: G34060231
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr.Ir. Sri Koerniati, M.Sc
(NIP. 19610916 198603 2 001)
Dr.Ir. Suharsono, DEA
(NIP. 19610428 198703 1 003)
Mengetahui
Ketua Departemen Biologi
Dr.Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
(NIP. 19641002 198903 1 002)
Tanggal lulus
:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan pada Tuhan Yang Maha Esa atas terselenggaranya
penelitian dan pembuatan karya ilmiah dengan judul Transformasi Genetik Pada Padi Indica
Menggunakan Metode Infeksi Awal Jaringan Skutelum. Penelitian dilaksanakan selama enam
bulan dari Maret 2010 sampai dengan Agustus 2010 bertempat di Laboratorium Biologi Molekular
milik Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian, Bogor. Selama menjalankan penelitian, penulis mendapatkan pengetahuan baru terkait
kultur jaringan dan transformasi.
Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Kedua orang tua dan kelurga yang telah memberikan bantuan moril berupa nasehat, doa,
dorongan semangat dan kasih sayang.
2. Bapak Dr.Ir.Suharsono, DEA selaku pembimbing pertama yang telah bersedia
membimbing dan memberikan saran pada penulis selama dalam pengerjaan karya ilmiah
ini.
3. Ibu Dr.Ir.Sri Koerniati, M.Sc. selaku pembimbing kedua yang telah meluangkan waktu
untuk membimbing penulis selama dalam penelitian dan pembuatan karya ilmiah.
4. Kak Hani Widhianata yang telah bersedia menjelaskan banyak hal selama penelitian
berlangsung.
5. Kak Fauziatun Nisak yang telah memberi masukan kepada penulis.
6. Kak Anto yang telah membantu selama proses penelitian.
7. Pak Hery, Pak Umar, Ibu Nur dan semua staf di kelompok peneliti Biologi Molekular
yang telah membantu pelaksanaan penelitian dari awal pealaksanaan hingga akhir.
8. Novita, Sira, Dorothy, Magda, Vina, Laila, kakak kelas dan teman-teman Biologi 43 yang
telah memberikan dukungan dan semangat kepada penulis.
Demikianlah karya tulis ini dibuat, semoga bermanfaat.
Bogor, 29 Oktober 2010
Melania
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan lalu di Jakarta pada tanggal 24 Februari 1989 dan merupakan anak
tunggal dari pasangan ayah Djohan Tjahaya dan ibu Inawaty Taher. Penulis bersekolah di SD St.
Agnes Padang pada tahun 1994 selama 6 tahun. Pada tahun 2000 penulis melanjutkan pendidikan
di SMP St. Maria dan pada tahun 2003 di SMU Don Bosco Padang. Penulis kemudian diterima
masuk di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006 melalui jalur seleksi penerimaan mahasiswa
baru dan menjadi bagian dari mahasiswa Biologi pada tahun 2007.
Selama masa perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota sekretariat Keluarga Mahasiswa
Katholik IPB (Kemaki). Penulis juga aktif menjadi anggota beberapa kepanitian yang diadakan
oleh IPB seperti menjadi anggota sie acara Revolusi Sains pada tahun 2008, anggota leading
operational pada acara Pesta Sains 2008, leading operational pada acara LCTB (Lomba Cepat
Tepat Biologi) tahun 2008, anggota sie acara Biologi Cinta Lingkungan pada tahun 2008, anggota
sie dekorasi pada acara HOKI (Hari Olahraga Kemaki) tahun 2008, dan menjadi penasihat sie
acara Revolusi Sains tahun 2009. Penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang pada tahun 2009
di Laboratorium Biologi Molekular milik Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi
dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor.
ABSTRAK
MELANIA. Transformasi Genetik Pada Padi Indica Menggunakan Metode Infeksi Awal
Jaringan Skutelum. Dibimbing oleh Dr.Ir.SUHARSONO, DEA dan Dr.Ir.SRI KOERNIATI,
M.Sc
Transformasi genetik pada padi indica yaitu varietas Ciherang, Inpari6, dan Bio110 telah
berhasil dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 yang
mengandung gen SNAC1 dan Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 yang mengandung gen
HVA1 yang diinfeksikan ke jaringan skutelum biji yang berkecambah. Vektor biner yang terdapat
di dalam kedua A. tumefaciens tersebut mengandung gen penanda seleksi higromisin
fosfotransferase (hpt). Efisiensi transformasi pada Ciherang adalah 5,69%, dan pada Inpari6
1,6%-5,88%. Setelah regenerasi, transformasi ini menghasilkan 18 tanaman putatif transgenik
yang resisten terhadap agen seleksi higromisin. Analisis PCR terhadap tanaman putatif transgenik
menunjukkan bahwa 14 tanaman mengandung gen sisipan hpt yang terdiri dari 7 padi Ciherang,
dan 7 padi Inpari6.
ABSTRACT
MELANIA. Genetic Transformation of Indica Rice Use Early Infection of Scutellum Tissue.
Supervised by Dr.Ir.SUHARSONO, DEA and Dr.Ir.SRI KOERNIATI, M.Sc.
Genetic transformation of indica rice cultivar such as Ciherang, Inpari6, and Bio110 were
successfully use Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 contains SNAC1 gene and A.tumefaciens
strain EHA105 contains HVA1 gene which introduced to scutellum tissue. The binery vector in
both of A.tumefaciens contain hygromycin fosfotransferase (hpt) as selection marker gene.
Efficiency of transformation for Ciherang was 5,69%, and for Inpari6 was 1,6%-5,88%. After
regeneration stage, this transformation was produced 18 putative transgenic plants which
resistance for hpt selection agent. The PCR analysis for transgenic plants shown that 14 plants
contain hpt gene, consist of 7 Ciherang rice and 7 inpari6 rice.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi indica merupakan salah satu
subspesies padi yang ada di dunia. Padi
indica umumnya terdapat di daerah tropis
sehingga termasuk varietas hari panjang.
Padi ini sensitif terhadap beberapa kondisi
stres abiotik seperti salinitas, kekeringan,
dan rentan terkena penyakit (Saharan, 2004).
Suatu usaha perlu dilakukan untuk
mengatasi masalah tersebut, salah satunya
adalah dengan transformasi genetik.
Transformasi genetik menggunakan
bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens
sudah
banyak
diaplikasikan
untuk
mendapatkan varietas-varietas tanaman
unggul yang toleran terhadap kekeringan.
Teknik ini memiliki beberapa keunggulan
seperti efisiensi transformasi dengan salinan
gen tunggal yang tinggi, dapat dilakukan
dengan
peralatan
sederhana,
dan
pengerjaannya mudah (Rahmawati, 2006).
Meskipun
keberhasilan
transformasi padi indica telah dilaporkan
namun tingkat efisiensinya masih rendah
atau keberhasilannya hanya terjadi pada
genotipe tertentu (Zhang et al, 1997).
Beberapa peneliti seperti Zhang et al (1997),
Mohanty et al (1999), Kumria et al (2001),
Khanna & Raina (2002) telah melakukan
percobaan transformasi terhadap beberapa
varietas padi indica. Frekwensi keberhasilan
transformasi yang dilakukan pada varietas
IR72 sebesar 4,2%, pada varietas IR64
sebesar 2,5%, sedangkan pada varietas
TSC10 hanya sebesar 0,7% (Hiei &
Toshihiko, 2006). Keberhasilan transformasi
padi indica yang telah dilaporkan ini
menggunakan metode kalus embriogenik
dan immature embryo.
Sifat toleran kekeringan disandikan
oleh banyak gen. Shinozaki dan Yamaguchi
(1997) mengklasifikasikan gen-gen tersebut
ke dalam dua kelompok utama. Pertama, gen
penyandi protein yang terkait dengan
perlindungan sel selama kekeringan
(proteksi makromolekul, enzim untuk
biosintesis osmolit, enzim detoksifikasi,
aliran air, transpoter) contohnya gen HVA1 ;
dan kedua adalah gen penyandi protein
regulator (protein kinase, protein fosfat,
enzim fosfolipid serta faktor transkripsi)
contohnya gen SNAC1 (Shinozaki &
Yamaguchi, 1997).
Gen HVA1 pertama kali diisolasi
dari permukaan aleuron biji barley
(Hordeum vulgare L.) sebagai ABA-
inducible-gen. Gen HVA1 menyandikan
golongan 3 protein LEA (3 late embryogenesis
abundant). Protein LEA berperan dalam
pemeliharaan protein atau struktur membran,
perintah ion, pengikatan air, operasi molekul
chaperon dan menjaga toleransi kekeringan
pada tanaman padi transgenik melalui
perlindungan sel membran (Xu D et al, 1996).
SNAC1 adalah faktor transkripsi yang
berperan dalam pengendali sifat ketahanan stres
abiotik yaitu salinitas, dan kekeringan pada
stadia reproduktif padi. SNAC1 diinduksi di
dalam sel penjaga oleh kekeringan dan
menyandi faktor transkripsi NAM, ATAF, dan
CUC (Hu et al, 2006).
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengetahui efisiensi transformasi genetik pada
beberapa varietas padi indica menggunakan
metode infeksi awal jaringan skutelum.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di laboratorium
Biologi Molekular, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian Bogor dan dilaksanakan dari
bulan Maret 2010 hingga Agustus 2010.
Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 yang
mengandung vektor biner pCambia1301
(Lampiran 1) yang telah disisipi gen SNAC1
(Nisak, 2009) serta Agrobacterium tumefaciens
strain
EHA105
dengan
vektor
biner
pAY560326 (Lampiran 1) yang mengandung
gen HVA1 (Widhianata, 2010) digunakan untuk
transformasi genetik padi indica varietas
Inpari6, Ciherang, dan Bio110.
Pembuatan Sel Kompeten Agrobacterium
tumefaciens strain EHA105
Koloni
tunggal
Agrobacterium
tumefaciens strain EHA105 ditanam pada media
LB cair yang mengandung rifampicin 50
mg/ml, diinkubasi dan digoyang selama 48 jam
pada suhu ruang. Kultur bakteri diukur nilai
OD600 hingga mencapai nilai 0.4 – 0.8.
Sebanyak 1 ml biakan bakteri yang telah diukur
OD nya dimasukkan dalam eppendorf 1,5ml
lalu disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama semenit pada suhu 40C. Supernatan yang
terbentuk dibuang kemudian ditambahkan 1 ml
CaCl2. Setelah dihomogenkan biakan bakteri
diinkubasi di dalam es selama 15 menit.
Biakan bakteri kemuadian disentrifuse
kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama
semenit pada suhu 40C. Supernatan yang
terbentuk dibuang dan endapan yang
tertinggal ditambah dengan 200µl CaCl2.
Setelah dihomogenkan sebentar, biakan
bakteri diinkubasi kembali di dalam es
selama 15 menit. Sel kompeten bakteri siap
untuk ditransformasi.
Transformasi Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105 Dengan Gen HVA1
Sebanyak 1µl plasmid pAY560326
yang mengandung gen HVA1 dicampur
dengan 100µl sel kompeten. Biakan bakteri
diinkubasi di dalam es selama 30 menit
kemudian diberi perlakuan heatshock
dengan suhu 420C selama 50 detik. Suspensi
sel ditambah 750µL media LB (Lampiran 2)
dan diinkubasi dalam shaker bergoyang pada
suhu ruang selama 60 menit. Setelah 60
menit, biakan bakteri disentrifuse dengan
kecepatan 6000 rpm selama 2 menit.
Endapan yang terbentuk ditambah
dengan 5 µL media LB yang digunakan
untuk melarutkan endapan, kemudian
disebar ke media LB padat yang
mengandung rifampicin 50 mg/L dan
kanamycin 50 mg/l dan diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 270C selama 2 hari.
Bakteri dengan koloni tunggal dipilih
kemudian dibiakkan dalam 5ml LB cair
yang telah ditambahkan 50mg/l rifampicin
dan 50mg/l kanamycin. Kultur bakteri
kemudian diinkubasi di shaker bergoyang
selama 2 hari.
Konfirmasi Hasil Transformasi
PCR dilakukan untuk melihat
keberhasilan transformasi. Proses PCR yang
dilakukan
menggunakan enzim Taq
polymerase supermix (Invitrogen) dan
primer
spesifik
gen
HVA,
5’TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3’
(Forward
primer)
dan
5’ACGACTAAAGGAACGGAAAT-3’
(Reverse primer). Satu kali reaksi PCR
mengandung 10ng DNA template bakteri
(Stok dalam 1µL), 1µL Primermix dan
22.5µL Taq polymerase.
PCR dilakukan dengan 20 siklus
dengan kondisi reaksinya adalah pra
denaturasi pada suhu 950C selama 2 menit,
denaturasi pada 940C selama 1 menit, tahap
annealing pada suhu 500C selama 45 detik,
extension awal pada 720C selama 1 menit,
dan extension akhir pada suhu 720C selama
15 menit. Tahap termination pada suhu 100C
selama 15 menit, dan perlahan suhu turun pada
40C. Produk PCR kemudian dimigrasikan
dalam 1% gel agarose dalam bufer TAE 1x
(Lampiran 3).
Penumbuhan Agrobacterium tumefaciens
Setelah dikonfirmasi dengan PCR,
bakteri yang mengandung gen HVA1 kemudian
ditumbuhkan dalam media AB (Lampiran 2)
yang mengandung 50mg/l higromisin dan
50mg/l kanamisin. Kultur diinkubasi selama 2-3
hari dalam inkubator bersuhu 270C dan bakteri
siap untuk digunakan.
Persiapan Eksplan
Benih padi varietas Ciherang, Inpari 6,
Bio 110 terlebih dahulu disterilisasi. Benih
disterilisasi dengan cara merendam benih padi
dalam alkohol 70% selama 1 menit. Kemudian
benih padi direndam selama 30 menit dalam
larutan bayclean 20% yang telah ditambahkan
satu tetes larutan Tween. Selanjutnya benih
dibilas dengan akuades steril beberapa kali dan
dikeringanginkan
beberapa
saat.
Benih
kemudian ditanam dalam media pre kultur N6D
(Lampiran 4) dan disimpan dalam ruang gelap
selama 5 hari.
Transformasi Kecambah Padi
Benih yang telah berkecambah
ditransformasi
dengan
cara
merendam
kecambah dalam larutan AAM (Lampiran 4)
yang telah mengandung bakteri Agrobacterium
tumefaciens dengan OD600 0,02 selama 15
menit. Setelah dikeringkan, benih ditanam pada
media kokultivasi 2N6-AS (Lampiran 4) di
dalam ruang gelap selama 4 hari.
Seleksi, Regenersi, dan Aklimatisasi
Setelah kokultivasi selama 4 hari,
eksplan dipindahkan ke media seleksi N6D-AB
(Lampiran 4) yang mengandung 100mg/l
vancomisin, 400mg/l cefotaxime, dan 50mg/l
higromisin dan diinkubasi dalam ruang gelap
pada suhu 230C selama seminggu. Eksplan
kemudian disubkultur ke media yang sama
selama seminggu.
Eksplan selanjutnya dipindahkan ke
media regenerasi RE-III (lampiran 4) hingga
eksplan berwarna hijau dan membentuk planlet.
Apabila telah terbentuk akar tersier, planlet
dipindahkan ke media perakaran yaitu media air
untuk menghilangkan sisa media dan
membersihkan akar yang dilakukan selama
seminggu. Kemudian planlet siap ditanam di
rumah kaca.
Isolasi DNA Total Tanaman dan PCR
Isolasi DNA dalam jumlah yang
sedikit, dilakukan menggunakan alat Retsch
Miller MM301. Sebanyak 0,5-1 g sampel
daun dimasukkan dalam tabung dengan
ironball didalamnya untuk menjaga agar
tetap dingin dan tidak merusak jaringan
daun, nitrogen cair dituangkan ke dalam
tabung dan ditutup. Tabung diletakkan pada
Retsch Miller MM301 untuk proses
penggerusan.
Sebanyak 400µL larutan penyangga
(Lampiran 5) ditambahkan ke dalam tabung
yang berisi suspensi sel daun, digoyang
dalam waterbath 650C selama 15 menit.
Sebanyak
400µL larutan chloroform :
isoamylalcohol (24:1) ditambahkan ke
dalam suspensi sel, dicampur perlahan-lahan
dan digoyang selama 15 menit. Suspensi sel
disentrifuge dengan kecepatan 12000rpm
selama 5 menit. Supernatant yang terbentuk
diambil, dipindahkan dalam minitube baru.
Etanol absolute dingin ditambahkan
sebanyak 2X volume supernatant dan
dibalik-balik perlahan, didiamkan dalam es
selama 15-30 menit, kemudian disentrifuge
dengan kecepatan 12000rpm selama 15
menit.
Endapan
dicuci
dengan
menambahkan etanol 70% dan disetrifuge
12000rpm selama 15menit. Supernatan yang
terbentuk dibuang. Pencucian ini dilakukan
2 kali.
DNA berupa endapan dalam
minitube
dikeringkan
dengan
oven.
Kemudian DNA dilarutkan dalam 100 µL
TE (Lampiran 6) yang mengandung 10µg/ml
RNase untuk menghilangkan RNA.
Tahapan terakhir adalah PCR. Kondisi
PCR yang dilakukan adalah sama dengan
kondisi
PCR
yang
dilakukan
untuk
mengkonfirmasi keberadaan gen HVA pada
bakteri. Komposisi reaksi PCR yang digunakan
tertera pada lampiran 7.
Analisis Hasil
Hasil yang didapat kemudian dianalisis
dengan cara menghitung efisiensi transformasi
dan efisiensi regenerasi. Efisiensi transformasi
didefinisikan sebagai jumlah eksplan yang
menghasilkan tanaman transgenik dibandingkan
dengan total eksplan yang ditransformasi.
Efisiensi regenerasi didefinisikan sebagai
jumlah eksplan yang menghasilkan tunas
dibandingkan dengan jumlah eksplan yang
ditumbuhkan di media regenerasi (Lee, 2004).
HASIL
Transformasi dengan menggunakan
dua konstruksi gen berbeda dengan strain
bakteri yang berbeda yaitu A. tumefaciens strain
AGL1 yang mengandung plasmid pCambia
1301-SNAC1
dan A. tumefaciens strain
EHA105
yang
mengandung
plasmid
pAY560326-HVA1
telah
menghasilkan
tanaman padi transgenik.
Setelah dikulturkan dalam media N6
(Lampiran 4) selama 5 hari, benih membentuk
kecambah seperti pada gambar 1 yang dijadikan
eksplan.
Eksplan
kecambah
yang
ditransformasi, diseleksi dan diregenerasikan
membentuk plantlet pada hari ke 47 (Gambar
2). Hanya satu tunas plantlet yang dapat
dihasilkan oleh satu eksplan. Planlet yang
terbentuk kemudian dipindahkan ke ember
(Gambar 3). Hasil percobaan transformasi padi
indica disajikan pada tabel 1.
Gambar 1 Benih dalam media N6
prekultur 5 hari
Gambar 2 Planlet yang terbentuk
pada hari ke 47
Gambar 3 Padi indica cv Ciherang dan Inpari 6 putatif transgenik
Keterangan : No. 2 adalah padi indica cv Inpari 6 yang ditransformasi dengan AGL1-SNAC1
No. 18 adalah padi indica cv Inpari 6 yang ditransformasi dengan EHA105-HVA1
No. 3 adalah padi indica cv Ciherang yang ditransformasi dengan EHA105-HVA1
Tabel 1 Efisiensi transformasi padi indica yang ditransformasi dengan A.tumefaciens strain AGL1
(gen SNAC1) dan strain EHA105 (gen HVA1)
AGL1 – SNAC1
EHA105 – HVA1
Parameter yang diamati
Ciherang
Inpari6
Bio110
Ciherang
Inpari6
Bio110
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
Jumlah
eksplan
yang 110
85
107
123
125
68
ditransformasi
Jumlah eksplan tahan higromisin
22
20
27
31,76
10
9,34
47
38,21
25
20
10 14,71
Jumlah eksplan yang beregenerasi
3
13,64
8
29,63
0
0
13
27,66
6
24
0
0
Jumlah plantlet yang hidup
0
0
6
0
0
8
4
0
0
setelah aklimatisasi
Jumlah tanaman transgenik
0
0
5
5,88
0
0
7
5,69
2
1,6
0
0
Analisis integrasi transgen ke
dalam genom padi dilakukan dengan PCR
menggunakan primer spesifik untuk gen hpt.
Hasil PCR dimigrasikan di gel dengan
elektroforesis dengan menggunakan 1kb
M 1 2
3
ladder plus (Invitrogen) sebagai penanda ukuran
DNA. Hasil elektroforesis DNA hasil PCR dari
tanaman yang diduga transgenik dan non
transgenik disajikan pada gambar 4, dan
diringkas di tabel 2.
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
500bp
Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR DNA tanaman yang diduga transgenik.
M: marker, 1,8,9 & 13: tidak ada sisipan gen hpt, 2-7, 10-12 &14-18:
sisipan gen hpt teramplifikasi
No.
1.
2.
Tabel 2 Ringkasan hasil PCR gen hpt padi indica
Hasil PCR
Strain bakteri - gen
Ciherang
Inpari6
∑
+ PCR
%
∑
+ PCR
AGL1 – SNAC1
0
0
0
6
5
EHA105 – HVA1
8
7
87,5
4
2
PEMBAHASAN
Transformasi
diawali
dengan
mengkulturkan benih selama 5 hari dalam
media N6 sesuai dengan metode yang
dilakukan oleh Toki et al (2006). Menurut
Toki et al (2006) jaringan skutelum yang
berasal dari kecambah yang berumur 5 hari
cocok dijadikan target transformasi karena
sel-selnya
telah
menjadi
kompeten.
Sterilisasi menggunakan alkohol dengan
penambahan larutan Tween 20 bukan hanya
efektif dalam mensterilkan benih tapi juga
mampu menghilangkan berbagai jenis
minyak dan parafin dari benih yang dapat
menghalangi penetrasi ke jaringan skutelum.
Beberapa faktor dapat menjelaskan
tentang keberhasilan transformasi ini. Selain
sifat sel, masa periode eksplan juga
menentukan. Semakin cepat eksplan ditanam
dalam kondisi in vitro, semakin tinggi
efisiensinya. Kemampuan regenerasi akan
semakin menurun jika berada dalam kondisi
in vitro yang lama (Wu et al, 1998).
Keberhasilan suatu transformasi
genetik sangat terkait dengan keberhasilan
pembentukan planlet dan sistem regenerasi
tanaman. Menurut Ge et al (2006) potensi
regenerasi kultur jaringan padi sangat
tergantung pada beberapa faktor seperti
genotipe tanaman donor, komposisi dan
konsentrasi garam, komponen organik dan
hormon pengatur pertumbuhan dalam media.
Dari sejumlah faktor tersebut genotipe
merupakan faktor utama.
Media N6 adalah media yang
digunakan untuk regenerasi tanaman dengan
metode sederhana seperti kalus yang berasal
dari embrio dewasa (Rance et al 1994).
Pembengkakan pada jaringan skutelum
mulai terlihat di hari ketiga di media N6
karena penambahan asam amino seperti
prolin, glutamin, dan casamino acid (Hare &
Cress, 1997).
Tabel 1 memperlihatkan perbedaan
hasil transformasi menggunakan konstruksi
gen dan strain bakteri yang berbeda. Total
benih yang ditransformasi menggunakan
AGL1-SNAC1 ada sebanyak 302 benih dan
%
83,33
50
sebanyak 316 benih yang ditransformasi
menggunakan EHA105-HVA1.
Hasil menunjukkan bahwa padi
Ciherang memiliki efisiensi transformasi yang
baik pada transformasi dengan EHA105-HVA1
yaitu sebesar 5,69%. Sebaliknya padi Inpari6
lebih efisien pada transformasi menggunakan
AGL1-SNAC1 dengan efisiensi sebesar 5,88%.
Sementara besar efisiensi padi Inpari6 dengan
menggunakan EHA105-HVA1 adalah 1,6%.
Kondisi terbaik perlu diciptakan agar
transformasi lebih efektif. Kondisi yang turut
berperan antara lain waktu perendaman eksplan
dalam
suspensi
bakteri,
penggunaan
asetosyringone,
lama
kokultivasi,
dan
konsentrasi bakteri yang digunakan (Ozawa,
2009). Lama perendaman jaringan dalam
suspensi
bakteri
berpengaruh
terhadap
persentase regenerasi eksplan. Semakin lama
eksplan direndam maka kesempatan bakteri
untuk menenpel dan menginfeksi eksplan
tersebut juga akan semakin lama sehingga
peluang untuk transfer T-DNA ke dalam genom
tanaman akan lebih tinggi (Purnamaningsih,
2010).
Menurut Siregar (1999), tanaman
monokotil lebih sulit diinfeksi oleh A.
tumefaciens sehingga biasanya membutuhkan
waktu perendaman yang lebih lama. Namun
jika perendaman dilakukan lebih dari 30 menit
akan menyebabkan infeksi bakteri terlalu
banyak sehingga jaringan tanaman menjadi
stres dan tidak dapat tumbuh. Waktu
perendaman yang digunakan pada penelitian ini
adalah 15 menit.
Lamanya kokultivasi antara bakteri
dan eksplan menentukan keefektifan kerja
bakteri. Idealnya waktu kokultivasi berkisar 3-5
hari. Apabila waktu terlalu cepat, infeksi bakteri
kurang baik sehingga bakteri belum bekerja
optimal mentransfer T-DNA ke jaringan sel.
Jika waktu terlalu lama akan menimbulkan
infeksi bakteri yang berlebih. Waktu kokultivasi
pada penelitian ini adalah 4 hari.
Penggunaan acetosyringone bertujuan
untuk menginduksi ekspresi gen-gen vir yang
berfungsi
dalam
mentransfer
T-DNA.
Penambahan senyawa fenolik tersebut pada
media menjadi penting untuk meningkatkan
daya infeksi bakteri karena tidak semua
tanaman memproduksi senyawa fenolik
(Godwin, 1991). Konsentrasi OD600 bakteri
merupakan faktor selanjutnya. Konsentrasi
yang
disarankan
adalah
0,01-0,1.
Konsentrasi yang terlalu besar akan
menyebabkan pertumbuhan yang berlebihan,
sementara konsentrasi yang terlalu kecil
tidak akan efektif. Oleh sebab itu, pada
penelitian ini konsentrasi yang dipakai
adalah 0,02 (Ishida et al, 1996).
Kecepatan eksplan berproliferasi
pada medium seleksi yang mengandung
higromisin
50
mg/l
menunjukkan
kemampuan
eksplan
mendetoksifikasi
higromisin pada media. Hal ini merupakan
indikasi
awal
bahwa
gen
yang
diintroduksikan terdapat dalam genom
tanaman meskipun masih harus dibuktikan
dengan analisis PCR (Maftuchah, 2003).
Penggunaan antibiotik seperti higromisin
pada media seleksi bertujuan untuk
menyeleksi galur transgenik.
Higromisin merupakan sistem
seleksi untuk ketahanan antibiotik yang
banyak
digunakan
pada
tanaman
monokotiledon terutama graminae (Bashir et
al, 2004). Higromisin akan menghambat
sintesis protein dengan mengganggu
translokasi
sehingga
menyebabkan
kesalahan translasi pada ribosom 80S.
Enzim higromisin fosfotransferase yang
dihasilkan gen hpt, dapat mendetoksifikasi
antibiotik higromisin B dan mengkatalis
fosforilasi kelompok hydroxyl dalam
higromisin sehingga menjadi tidak aktif dan
tidak meracuni sel tanaman (Bashir et al,
2004). Penggunaan higromisin dengan
konsentrasi 50mg/L masih memungkinkan
adanya tanaman tidak terseleksi yaitu
tanaman yang tahan higromisin tapi tidak
mengandung
gen
target.
Sehingga
peningkatan kosentrasi higromisin secara
bertahap diharapkan dapat menekan
pertumbuhan tanaman non transgenik (Park,
1996).
Pada penelitian ini regenerasi
diupayakan melalui organogenesis langsung
yaitu eksplan langsung membentuk tunas
dan menghindarkan pembentukan kalus.
Setelah transformasi, kurang lebih pada hari
ke 39 mulai terbentuk calon tunas berwarna
hijau. Spot berwarna hijau yang akan
beregenerasi menjadi calon tunas terbentuk
di media regenerasi. Regenerasi terus
berlangsung hingga membentuk plantlet
sempurna sekitar hari ke 47 setelah
transformasi (terlihat pada gambar 2).
Eksplan yang dapat beregenerasi tidak
semuanya dapat membentuk tunas yang hidup.
Beberapa eksplan tetap membentuk calon tunas,
tetapi calon tunas tersebut menjadi coklat dan
akhirnya mati. Beberapa tunas yang pada
awalnya dapat tumbuh dengan baik setelah
disubkultur beberapa kali tidak dapat bertahan
hidup dan akhirnya mati.
Jumlah waktu yang dibutuhkan adalah
relatif sama untuk kedua galur A. tumefaciens
yang digunakan untuk transformasi. Total
waktu yang diperlukan pada penelitian ini jika
dibandingkan dengan metode serupa yang
diaplikasikan pada padi japonica lebih lama.
Total waktu yang dibutuhkan padi japonica
untuk tumbuh adalah sekitar 36 hari (Toki et al,
2005). Namun, jika dibandingkan dengan
metode immature embryo dan kalus
embriogenik, total waktu 47 hari tergolong
singkat.
Dari 141 eksplan yang tahan
higromisin, hanya 30 eksplan yang mampu
beregenerasi membentuk 30 tunas. Dari 30
plantlet hanya 18 plantlet yang dapat tumbuh
normal setelah aklimatisasi, lainnya mengalami
kematian akibat perbedaan kondisi lingkungan.
Tanaman transgenik memerlukan waktu kurang
lebih sebulan agar dapat tumbuh tegak besar
(Lampiran 8).
Analisis molekular untuk melihat hasil
transformasi berupa keberadaan gen hpt yang
telah masuk pada tanaman regeneran dilakukan
dengan PCR. Total 18 tanaman yang berhasil
tumbuh terdiri dari 8 tanaman padi Ciherang
dan 10 tanaman padi Inpari6. DNA dari 18
nomor tanaman yang ada telah berhasil diisolasi
dan dilakukan PCR. Hasil PCR menunjukkan
14 tanaman mengandung gen hpt dengan
ukuran pita DNA 500 bp (Tabel 2). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman tersebut adalah
transgenik
Tanaman transgenik yang berhasil
tumbuh adalah varietas Ciherang dan Inpari6.
Sebanyak 7 tanaman padi Ciherang transgenik
diperoleh dari transformasi dengan EHA105HVA1 dan 6 tanaman padi Inpari6 transgenik
terdiri dari 5 tanaman dari transformasi dengan
AGL1-SNAC1 dan 1 tanaman dari transformasi
dengan EHA105-HVA1.
Padi indica merupakan jenis padi
rekalsitran
(sulit
beregenerasi
dan
ditransformasi) dalam kegiatan kultur jaringan
dan transformasi genetik. Jika dibandingkan
dengan padi japonica, efisiensi pada padi
japonica lebih tinggi dari pada padi indica.
Efisiensi transformasi padi japonica dapat
mencapai 80% (Hiei and Toshihiko, 2006).
Toki et al (2006) melaporkan bahwa metode
infeksi pada awal jaringan skutelum telah
menghasilkan tanaman padi transgenik
hanya pada satu varietas padi indica yaitu
Basmati 370 (data tidak ditunjukkan).
Meskipun angka efisiensi yang didapat kecil,
namun hasil penelitian ini membuktikan
bahwa metode infeksi awal pada jaringan
skutelum dapat menghasilkan 14 tanaman
transgenik padi indica dengan efisiensi
transformasi berkisar antara 1,6%-5,88%.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Sebanyak 18 tanaman telah berhasil
diregenerasikan dari hasil transformasi
menggunakan metode infeksi awal jaringan
skutelum. Setelah PCR, dari 18 tanaman 14
tanaman adalah transgenik yang berasal dari
varietas Inpari6 dan Ciherang. Transformasi
menggunakan Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105–HVA1 lebih efisien dari
pada strain AGL1-SNAC1 dengan efisiensi
transformasi pada padi Ciherang adalah
5,69% dan pada padi Inpari6 1,6-5,88%.
Saran
Untuk memastikan tanaman yang
dihasilkan adalah transgenik dan mengetahui
jumlah kopi dari DNA sisipan, hibridisasi
Southern terhadap 14 tanaman transgenik
perlu dilakukan.
Ucapan terima kasih dihaturkan
atas terselenggaranya penelitian ini yang
sepenuhnya didanai oleh proyek BB-Biogen.
DAFTAR PUSTAKA
Bashir et al. 2004. Hygromycin based
selection of transformant in a local
inbred line of Zea mays (L).
Pakistan Journal of Biological
Sciencs 7 : 18-323.
Ge X, Chu Z, Lin Y, and Wang S. 2006. A
tissue culture system for different
germplasms of indica rice. Plant
Cell Report 25 : 392-402.
Godwin I, Todd G, Ford B, Newburry HJ.
1991. The effect of acetosyringone
and pH on Agrobacteriummediated transformation varies
according to plant species. Plant
Cell 9: 671-675.
Hare PD, Cress WA. 1997. Metabolic
implications of stress induce praline
accumulation in plant. Plant Growth
Regulation 21 : 79-102.
Hiei Y, Toshihiko K. 2006. Improved protocols
for transformation of indica rice
mediated
by
Agrobacterium
tumefaciens. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 85 : 271-28.
Hodges TK, Jianying P, Leszek AL, David SK.
1991.
Transformation
and
Regeneration of Rice Protoplasts.
USA : Perdue University
Hu H et al. 2006. Over-expressing a NAM,
ATAF and CUC (NAC) transcription
factor enhances drought resistance and
salt tolerance in rice. PNAS 103:
12987-12992.
Ishida Y et al. 1996. High efficiency
transformation of maize mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Research
Article: 745-751.
Lee YH. 2004. A new selection method for
pepper transformation
: callus
mediated shoot formation. Plant Cell
Rep. 23: 50-58.
Maftuchah. 2003 Transformasi genetic padi
indica dengan gen crylA(b) dan crylB
melalui Agrobacterium tumefaciens
untuk ketahanan terhadap hama
peggerek batang. [disertasi]. Bogor:
Program
Pascasarjana,
Institut
Pertanian Bogor.
Mulyaningsih ES, Regy H, Inez H, Slamet L.
2009. Genetic transformation of
transcription factor gene into rice
genome and transformant analysis of
hpt gene by PCR and hygromycin
resistance test. Biodiversitas 10 : 6369.
Nisak F. 2009. Transformasi padi (Oryza sativa
L.) Japonica cv Nipponbare dengan
gen
SNAC1
menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. [tesis].
Malang:
Program
Pascasarjana,
Universitas Brawijaya
Ozawa K. 2009. Establishment of a high
efficiency Agrobacterium mediated
transformation system of rice (Oryza
sativa L.). Plant Science 176 : 522527.
Park SH, Pinson SMR, Smith RH. 1996. TDNA integration into genomic DNA of
rice
following
A.
tumefaciens
inoculation of isolated
shoot apices. Plant Mol Biol. 32: 11351148.
Purnamaningsih R. 2010. Introduksi gen
DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM ke
dalam
genom
tanaman
tomat
menggunakan
vektor
Agrobacterium tumefaciens. Jurnal
AgroBiogen 6(1) : 18-25.
Rance I et al. 1994. Partial desiccation of
mature emryo-derived calli, a
simple treatment that dramatically
enhanced the regeneration ability of
indica rice. Plant Cell Rep. 13 :
647-651.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan
perbaikan sifat genetik padi
menggunakan
transformasi
Agrobacterium.
AgroBiogen
2(1):36-44.
Saharan V, Yadav RC, Yadav RM, Ram K.
2004. Studies on improved
Agrobacterium
mediated
transformation in two indica rice
(Oryza sativa L.). African Journal
of Biotechnology 3(11): 572-575
Sambrook JE, Fritsch F, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning a Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. New York.
Shinozaki K, Yamaguchi K. 1997. Gene
expression and signal transduction
in water stress response. Plant
Physiology 115: 327-334.
Siregar EBM. 1999. Transformasi genetika
dan regenerasi tanaman cabai
transgenic
dengan
bantuan
Agrobacterium. [disertasi]. Bogor :
Institut Pertanian Bogor.
Siregar H. 1981. Budidaya Tanaman Padi di
Indonesia. Jakarta : PT Sastra Hudaya.
Toki S. et al. 2006. Early infection of scutellum
tissue with Agrobacterium allows high
speed transformation of rice. The Plant
Journal 47 : 969-976.
Utami DW et al. 2005. Gen Pengendali Sifat
Ketahanan Blas (Pyricularia grisea
Sacc.) Pada Spesies Padi Liar Oryza
rufipogin Griff. dan Padi Budi Daya
IR64. Jurnal AgroBiogen 1(1) : 1-6.
Widhianata H. 2010. Konstruksi plasmid vector
dengan gen responsif kekeringan
HVA1 dan introduksinya ke dalam
Agrobacterium tumefaciens strain
EHA105. [tesis]. Malang: Program
Pascasarjana, Universitas Brawijaya.
Wu H., Mccormac AC, Elliot MC, and Chen
DF. 1998. Agrobacterium mediated
stable
transformation
of
cell
suspension
cultures
of
barley
(Hordeum vulgare). Plant Cell Tissue
Organ Cult. 4 : 161-171.
Xu D et al. 1996. Expression of a late
embryogenesis abundant protein gene,
HVA I, from barley confers tolerance
to water deficit and salt stress in
transgenic rice. Plant Physiology 110:
249-257.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Peta plasmid
Gambar 5 Peta Plasmid pCambia 1301
Eco ICRI (14)
Ban II (16)
Sac I (16)
3 'NOS
MCS
Spe I (319)
Acc 65I (326)
35S
Kpn I (330)
Bgl II (333)
Xho I (340)
HptII
Sci I (342)
Eco RI (346)
Sal I (352)
CaMV polyA
LB
pAY56 03 26
9946 bp
Bpl I (355)
35S
RB
aadA
Gambar 6 Peta plasmid pAY56026
Lampiran 2 Komposisi Media Kultur Bakteri
a.
b.
Media LB (Luria-Bertani Broth)
Bacto trypton
NaCl
Yeast extract
Bacto Agar (solid)
10 g/L
10 g/L
5 g/L
15 g/L
AB medium
50 ml AB buffer stock :
K2HPO4
NaH2PO4
50 ml AB salt stock :
NH4Cl
MgSO4.7H2O
KCl
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
900 ml aquades untuk melarutkan :
Glucose
Bacto Agar
60 g/L
20 g/L
20 g/L
6 g/L
3 g/L
0.2g/L
50mg/L
5 g/L
15 g/L
Lampiran 3 Komposisi bufer TAE
50x TAE (untuk 1 liter) :
Tris base
Glacial acetic acid
0.5M EDTA
ddH2O
1x TAE :
50x TAE
ddH2O
: 242 g
: 57,1 ml
: 50 ml
: 892.9 ml
:20 ml
:980 ml
Lampiran 4 Komposisi berbagai media kultur (Toki et al., 2006)
Komposisi
Komponen makro
KNO3
NH4Cl
NH4NO3
(NH4)2.7H2O
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
NaH2PO4.2H2O
K2HPO4
KH2PO4
KCl
Komponen Mikro
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Fe-EDTA
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
KI
H3BO3
Na2MoO4.2H2 O
Komponen organik
Casamino acid
Glycine
L-arginine
L-proline
L-glutamine
L-aspartic acid
Myo-inositol
Nicotinic acid
Prydoxine HCl
Thiamine HCL
Fitohormon
2,4-D
NAA
Kinetin
Acetosyringone
Antibiotik
Hygromicin
Vancomycin
Cefotaxime
Sumber karbon
Sukrosa
Sorbitol
Glukosa
pH
Agarosa
N6D
2N6-AS
2380
4000
463
185
166
463
185
166
AAM
250
150
150
Resting
N6D-AB
RE-III
1900
1900
1900
1650
1650
1650
370
440
370
440
370
440
170
170
170
37,3
27,8
37,3
27,8
37,3
27,8
22,3
8,6
0,025
0,025
0,83
6,2
0,25
22,3
8,6
0,025
0,025
0,83
6,2
0,25
22,3
8,6
0,025
0,025
0,8
6,2
0,25
2000
2
2000
2
100
0,5
0,5
0,1
100
0,5
0,5
0,1
3000
37,3
27,8
37,3
27,8
4,4
1,5
4,4
1,5
0,8
1,6
0,8
1,6
300
2
300
2
40
10
2
0.025
0,025
0,75
3,0
0,25
500
7,5
176,7
2878
100
0,5
0,5
1
100
0,5
0,5
1
2
2
900
300
100
1
1
10
100
0,5
0,5
0,1
2
10~20
10~20
30000
30000
68500
5,8
7000
10000
5,2
7000
36000
5,2
100
400
50
100
400
20
100
100
30000
30000
30000
5,8
7000
5,8
7000
5,8
7000
Lampiran 5 Komposisi bufer TE
Buffer TE (untuk 1 liter):
1 M Tris-HCl pH 8
0.5M EDTA pH 8
ddH2O
:10 ml
: 2 ml
: 988 ml
Lampiran 6 Komposisi larutan penyangga
STR3X loading buffer (untuk 100 ml) :
4M NaOH
95%formamide
Bromophenol blue
Xylene cyanol FF
ddH2O
Lampiran 7 Komposisi reaksi PCR
DNA
Primer higromisin F
Primer higromisin R
2x Taq Polimerase
MQ
MgCl2
1 µl
0,1 µl
0,1 µl
5 µl
2,7 µl
0,3 µl
10 µl
: 0,25 ml
: 95 ml
: 50 mg
: 50 mg
: 4.75 ml
Lampiran 8 Gambar padi transgenik
Gambar 7 Padi Inpari6 dengan perlakuan AGL1-SNAC1
Gambar 8 Padi Inpari6 dengan perlakuan EHA105-HVA1
Gambar 9 Padi Ciherang dengan perlakuan EHA105-HVA1
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………..…............................... VII
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..................................VII
DAFTAR TABEL ......................................................................................................................... VII
PENDAHULUAN ............................................................................................................................1
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................... 1
Bahan ................................................................................................................................ 1
Metode .............................................................................................................................. 1
Pembuatan sel kompeten A. tumefaciens
strain EHA105.................................................................................................... 1
Transformasi A. tumefaciens strain EHA105 dengan gen
HVA1 .................................................................................................................. 2
Konfirmasi hasil transformasi............................................................................. 2
Penumbuhan A. tumefaciens............................................................................... 2
Persiapan Eksplan............................................................................................... 2
Transformasi kecambah...................................................................................... 2
Pasca Transformasi ............................................................................................ 2
Isolasi DNA dan PCR......................................................................................... 3
Analisis Hasil ..................................................................................................... 3
HASIL ............................................................................................................................................. 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................. 5
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................................................... 7
Kesimpulan ....................................................................................................................... 7
Saran ................................................................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Gambar benih dalam media N6 prekultur 5 hari .............................................................. 3
Gambar plantlet yang terbentuk di hari ke-47 .................................................................. 3
Gambar padi putatif transgenik ........................................................................................ 4
Gambar hasil elektroforesis produk PCR ......................................................................... 4
Gambar peta plasmid pCambia 1301 ............................................................................... 10
Gambar peta plasmi pAY560236 .................................................................................... 10
Gambar tanaman transgenik ............................................................................................. 16
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Halaman
Peta plasmid ..................................................................................................................... 10
Komposisi media kultur bakteri ....................................................................................... 11
Komposisi buffer TAE ..................................................................................................... 12
Komposisi media kultur ................................................................................................... 13
Komposisi bufer TE ......................................................................................................... 14
Komposisi larutan penyangga .......................................................................................... 14
Komposisi reaksi PCR ..................................................................................................... 14
Gambar tanaman transgenik ............................................................................................. 15
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Efisiensi transformasi padi indica yang ditransformasi dengan A.tumefaciens strain AGL1
(gen
SNAC1)
dan
strain
EHA105
(gen
HVA1)
............................................................................................................................................ 4
Ringkasan hasil PCR 18 nomer padi indica ....................................................................... 5
19
MENGGUNAKAN METODE INFEKSI AWAL JARINGAN
SKUTELUM
Melania
Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
2010
TRANSFORMASI GENETIK PADA PADI INDICA
MENGGUNAKAN METODE INFEKSI AWAL JARINGAN
SKUTELUM
MELANIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
2010
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Transformasi Genetik Pada Padi Indica Menggunakan Metode
Infeksi Awal Jaringan Skutelum
: Melania
: G34060231
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr.Ir. Sri Koerniati, M.Sc
(NIP. 19610916 198603 2 001)
Dr.Ir. Suharsono, DEA
(NIP. 19610428 198703 1 003)
Mengetahui
Ketua Departemen Biologi
Dr.Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
(NIP. 19641002 198903 1 002)
Tanggal lulus
:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan pada Tuhan Yang Maha Esa atas terselenggaranya
penelitian dan pembuatan karya ilmiah dengan judul Transformasi Genetik Pada Padi Indica
Menggunakan Metode Infeksi Awal Jaringan Skutelum. Penelitian dilaksanakan selama enam
bulan dari Maret 2010 sampai dengan Agustus 2010 bertempat di Laboratorium Biologi Molekular
milik Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian, Bogor. Selama menjalankan penelitian, penulis mendapatkan pengetahuan baru terkait
kultur jaringan dan transformasi.
Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Kedua orang tua dan kelurga yang telah memberikan bantuan moril berupa nasehat, doa,
dorongan semangat dan kasih sayang.
2. Bapak Dr.Ir.Suharsono, DEA selaku pembimbing pertama yang telah bersedia
membimbing dan memberikan saran pada penulis selama dalam pengerjaan karya ilmiah
ini.
3. Ibu Dr.Ir.Sri Koerniati, M.Sc. selaku pembimbing kedua yang telah meluangkan waktu
untuk membimbing penulis selama dalam penelitian dan pembuatan karya ilmiah.
4. Kak Hani Widhianata yang telah bersedia menjelaskan banyak hal selama penelitian
berlangsung.
5. Kak Fauziatun Nisak yang telah memberi masukan kepada penulis.
6. Kak Anto yang telah membantu selama proses penelitian.
7. Pak Hery, Pak Umar, Ibu Nur dan semua staf di kelompok peneliti Biologi Molekular
yang telah membantu pelaksanaan penelitian dari awal pealaksanaan hingga akhir.
8. Novita, Sira, Dorothy, Magda, Vina, Laila, kakak kelas dan teman-teman Biologi 43 yang
telah memberikan dukungan dan semangat kepada penulis.
Demikianlah karya tulis ini dibuat, semoga bermanfaat.
Bogor, 29 Oktober 2010
Melania
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan lalu di Jakarta pada tanggal 24 Februari 1989 dan merupakan anak
tunggal dari pasangan ayah Djohan Tjahaya dan ibu Inawaty Taher. Penulis bersekolah di SD St.
Agnes Padang pada tahun 1994 selama 6 tahun. Pada tahun 2000 penulis melanjutkan pendidikan
di SMP St. Maria dan pada tahun 2003 di SMU Don Bosco Padang. Penulis kemudian diterima
masuk di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006 melalui jalur seleksi penerimaan mahasiswa
baru dan menjadi bagian dari mahasiswa Biologi pada tahun 2007.
Selama masa perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota sekretariat Keluarga Mahasiswa
Katholik IPB (Kemaki). Penulis juga aktif menjadi anggota beberapa kepanitian yang diadakan
oleh IPB seperti menjadi anggota sie acara Revolusi Sains pada tahun 2008, anggota leading
operational pada acara Pesta Sains 2008, leading operational pada acara LCTB (Lomba Cepat
Tepat Biologi) tahun 2008, anggota sie acara Biologi Cinta Lingkungan pada tahun 2008, anggota
sie dekorasi pada acara HOKI (Hari Olahraga Kemaki) tahun 2008, dan menjadi penasihat sie
acara Revolusi Sains tahun 2009. Penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang pada tahun 2009
di Laboratorium Biologi Molekular milik Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi
dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor.
ABSTRAK
MELANIA. Transformasi Genetik Pada Padi Indica Menggunakan Metode Infeksi Awal
Jaringan Skutelum. Dibimbing oleh Dr.Ir.SUHARSONO, DEA dan Dr.Ir.SRI KOERNIATI,
M.Sc
Transformasi genetik pada padi indica yaitu varietas Ciherang, Inpari6, dan Bio110 telah
berhasil dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 yang
mengandung gen SNAC1 dan Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 yang mengandung gen
HVA1 yang diinfeksikan ke jaringan skutelum biji yang berkecambah. Vektor biner yang terdapat
di dalam kedua A. tumefaciens tersebut mengandung gen penanda seleksi higromisin
fosfotransferase (hpt). Efisiensi transformasi pada Ciherang adalah 5,69%, dan pada Inpari6
1,6%-5,88%. Setelah regenerasi, transformasi ini menghasilkan 18 tanaman putatif transgenik
yang resisten terhadap agen seleksi higromisin. Analisis PCR terhadap tanaman putatif transgenik
menunjukkan bahwa 14 tanaman mengandung gen sisipan hpt yang terdiri dari 7 padi Ciherang,
dan 7 padi Inpari6.
ABSTRACT
MELANIA. Genetic Transformation of Indica Rice Use Early Infection of Scutellum Tissue.
Supervised by Dr.Ir.SUHARSONO, DEA and Dr.Ir.SRI KOERNIATI, M.Sc.
Genetic transformation of indica rice cultivar such as Ciherang, Inpari6, and Bio110 were
successfully use Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 contains SNAC1 gene and A.tumefaciens
strain EHA105 contains HVA1 gene which introduced to scutellum tissue. The binery vector in
both of A.tumefaciens contain hygromycin fosfotransferase (hpt) as selection marker gene.
Efficiency of transformation for Ciherang was 5,69%, and for Inpari6 was 1,6%-5,88%. After
regeneration stage, this transformation was produced 18 putative transgenic plants which
resistance for hpt selection agent. The PCR analysis for transgenic plants shown that 14 plants
contain hpt gene, consist of 7 Ciherang rice and 7 inpari6 rice.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi indica merupakan salah satu
subspesies padi yang ada di dunia. Padi
indica umumnya terdapat di daerah tropis
sehingga termasuk varietas hari panjang.
Padi ini sensitif terhadap beberapa kondisi
stres abiotik seperti salinitas, kekeringan,
dan rentan terkena penyakit (Saharan, 2004).
Suatu usaha perlu dilakukan untuk
mengatasi masalah tersebut, salah satunya
adalah dengan transformasi genetik.
Transformasi genetik menggunakan
bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens
sudah
banyak
diaplikasikan
untuk
mendapatkan varietas-varietas tanaman
unggul yang toleran terhadap kekeringan.
Teknik ini memiliki beberapa keunggulan
seperti efisiensi transformasi dengan salinan
gen tunggal yang tinggi, dapat dilakukan
dengan
peralatan
sederhana,
dan
pengerjaannya mudah (Rahmawati, 2006).
Meskipun
keberhasilan
transformasi padi indica telah dilaporkan
namun tingkat efisiensinya masih rendah
atau keberhasilannya hanya terjadi pada
genotipe tertentu (Zhang et al, 1997).
Beberapa peneliti seperti Zhang et al (1997),
Mohanty et al (1999), Kumria et al (2001),
Khanna & Raina (2002) telah melakukan
percobaan transformasi terhadap beberapa
varietas padi indica. Frekwensi keberhasilan
transformasi yang dilakukan pada varietas
IR72 sebesar 4,2%, pada varietas IR64
sebesar 2,5%, sedangkan pada varietas
TSC10 hanya sebesar 0,7% (Hiei &
Toshihiko, 2006). Keberhasilan transformasi
padi indica yang telah dilaporkan ini
menggunakan metode kalus embriogenik
dan immature embryo.
Sifat toleran kekeringan disandikan
oleh banyak gen. Shinozaki dan Yamaguchi
(1997) mengklasifikasikan gen-gen tersebut
ke dalam dua kelompok utama. Pertama, gen
penyandi protein yang terkait dengan
perlindungan sel selama kekeringan
(proteksi makromolekul, enzim untuk
biosintesis osmolit, enzim detoksifikasi,
aliran air, transpoter) contohnya gen HVA1 ;
dan kedua adalah gen penyandi protein
regulator (protein kinase, protein fosfat,
enzim fosfolipid serta faktor transkripsi)
contohnya gen SNAC1 (Shinozaki &
Yamaguchi, 1997).
Gen HVA1 pertama kali diisolasi
dari permukaan aleuron biji barley
(Hordeum vulgare L.) sebagai ABA-
inducible-gen. Gen HVA1 menyandikan
golongan 3 protein LEA (3 late embryogenesis
abundant). Protein LEA berperan dalam
pemeliharaan protein atau struktur membran,
perintah ion, pengikatan air, operasi molekul
chaperon dan menjaga toleransi kekeringan
pada tanaman padi transgenik melalui
perlindungan sel membran (Xu D et al, 1996).
SNAC1 adalah faktor transkripsi yang
berperan dalam pengendali sifat ketahanan stres
abiotik yaitu salinitas, dan kekeringan pada
stadia reproduktif padi. SNAC1 diinduksi di
dalam sel penjaga oleh kekeringan dan
menyandi faktor transkripsi NAM, ATAF, dan
CUC (Hu et al, 2006).
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengetahui efisiensi transformasi genetik pada
beberapa varietas padi indica menggunakan
metode infeksi awal jaringan skutelum.
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di laboratorium
Biologi Molekular, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian Bogor dan dilaksanakan dari
bulan Maret 2010 hingga Agustus 2010.
Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 yang
mengandung vektor biner pCambia1301
(Lampiran 1) yang telah disisipi gen SNAC1
(Nisak, 2009) serta Agrobacterium tumefaciens
strain
EHA105
dengan
vektor
biner
pAY560326 (Lampiran 1) yang mengandung
gen HVA1 (Widhianata, 2010) digunakan untuk
transformasi genetik padi indica varietas
Inpari6, Ciherang, dan Bio110.
Pembuatan Sel Kompeten Agrobacterium
tumefaciens strain EHA105
Koloni
tunggal
Agrobacterium
tumefaciens strain EHA105 ditanam pada media
LB cair yang mengandung rifampicin 50
mg/ml, diinkubasi dan digoyang selama 48 jam
pada suhu ruang. Kultur bakteri diukur nilai
OD600 hingga mencapai nilai 0.4 – 0.8.
Sebanyak 1 ml biakan bakteri yang telah diukur
OD nya dimasukkan dalam eppendorf 1,5ml
lalu disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama semenit pada suhu 40C. Supernatan yang
terbentuk dibuang kemudian ditambahkan 1 ml
CaCl2. Setelah dihomogenkan biakan bakteri
diinkubasi di dalam es selama 15 menit.
Biakan bakteri kemuadian disentrifuse
kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama
semenit pada suhu 40C. Supernatan yang
terbentuk dibuang dan endapan yang
tertinggal ditambah dengan 200µl CaCl2.
Setelah dihomogenkan sebentar, biakan
bakteri diinkubasi kembali di dalam es
selama 15 menit. Sel kompeten bakteri siap
untuk ditransformasi.
Transformasi Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105 Dengan Gen HVA1
Sebanyak 1µl plasmid pAY560326
yang mengandung gen HVA1 dicampur
dengan 100µl sel kompeten. Biakan bakteri
diinkubasi di dalam es selama 30 menit
kemudian diberi perlakuan heatshock
dengan suhu 420C selama 50 detik. Suspensi
sel ditambah 750µL media LB (Lampiran 2)
dan diinkubasi dalam shaker bergoyang pada
suhu ruang selama 60 menit. Setelah 60
menit, biakan bakteri disentrifuse dengan
kecepatan 6000 rpm selama 2 menit.
Endapan yang terbentuk ditambah
dengan 5 µL media LB yang digunakan
untuk melarutkan endapan, kemudian
disebar ke media LB padat yang
mengandung rifampicin 50 mg/L dan
kanamycin 50 mg/l dan diinkubasi dalam
inkubator pada suhu 270C selama 2 hari.
Bakteri dengan koloni tunggal dipilih
kemudian dibiakkan dalam 5ml LB cair
yang telah ditambahkan 50mg/l rifampicin
dan 50mg/l kanamycin. Kultur bakteri
kemudian diinkubasi di shaker bergoyang
selama 2 hari.
Konfirmasi Hasil Transformasi
PCR dilakukan untuk melihat
keberhasilan transformasi. Proses PCR yang
dilakukan
menggunakan enzim Taq
polymerase supermix (Invitrogen) dan
primer
spesifik
gen
HVA,
5’TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3’
(Forward
primer)
dan
5’ACGACTAAAGGAACGGAAAT-3’
(Reverse primer). Satu kali reaksi PCR
mengandung 10ng DNA template bakteri
(Stok dalam 1µL), 1µL Primermix dan
22.5µL Taq polymerase.
PCR dilakukan dengan 20 siklus
dengan kondisi reaksinya adalah pra
denaturasi pada suhu 950C selama 2 menit,
denaturasi pada 940C selama 1 menit, tahap
annealing pada suhu 500C selama 45 detik,
extension awal pada 720C selama 1 menit,
dan extension akhir pada suhu 720C selama
15 menit. Tahap termination pada suhu 100C
selama 15 menit, dan perlahan suhu turun pada
40C. Produk PCR kemudian dimigrasikan
dalam 1% gel agarose dalam bufer TAE 1x
(Lampiran 3).
Penumbuhan Agrobacterium tumefaciens
Setelah dikonfirmasi dengan PCR,
bakteri yang mengandung gen HVA1 kemudian
ditumbuhkan dalam media AB (Lampiran 2)
yang mengandung 50mg/l higromisin dan
50mg/l kanamisin. Kultur diinkubasi selama 2-3
hari dalam inkubator bersuhu 270C dan bakteri
siap untuk digunakan.
Persiapan Eksplan
Benih padi varietas Ciherang, Inpari 6,
Bio 110 terlebih dahulu disterilisasi. Benih
disterilisasi dengan cara merendam benih padi
dalam alkohol 70% selama 1 menit. Kemudian
benih padi direndam selama 30 menit dalam
larutan bayclean 20% yang telah ditambahkan
satu tetes larutan Tween. Selanjutnya benih
dibilas dengan akuades steril beberapa kali dan
dikeringanginkan
beberapa
saat.
Benih
kemudian ditanam dalam media pre kultur N6D
(Lampiran 4) dan disimpan dalam ruang gelap
selama 5 hari.
Transformasi Kecambah Padi
Benih yang telah berkecambah
ditransformasi
dengan
cara
merendam
kecambah dalam larutan AAM (Lampiran 4)
yang telah mengandung bakteri Agrobacterium
tumefaciens dengan OD600 0,02 selama 15
menit. Setelah dikeringkan, benih ditanam pada
media kokultivasi 2N6-AS (Lampiran 4) di
dalam ruang gelap selama 4 hari.
Seleksi, Regenersi, dan Aklimatisasi
Setelah kokultivasi selama 4 hari,
eksplan dipindahkan ke media seleksi N6D-AB
(Lampiran 4) yang mengandung 100mg/l
vancomisin, 400mg/l cefotaxime, dan 50mg/l
higromisin dan diinkubasi dalam ruang gelap
pada suhu 230C selama seminggu. Eksplan
kemudian disubkultur ke media yang sama
selama seminggu.
Eksplan selanjutnya dipindahkan ke
media regenerasi RE-III (lampiran 4) hingga
eksplan berwarna hijau dan membentuk planlet.
Apabila telah terbentuk akar tersier, planlet
dipindahkan ke media perakaran yaitu media air
untuk menghilangkan sisa media dan
membersihkan akar yang dilakukan selama
seminggu. Kemudian planlet siap ditanam di
rumah kaca.
Isolasi DNA Total Tanaman dan PCR
Isolasi DNA dalam jumlah yang
sedikit, dilakukan menggunakan alat Retsch
Miller MM301. Sebanyak 0,5-1 g sampel
daun dimasukkan dalam tabung dengan
ironball didalamnya untuk menjaga agar
tetap dingin dan tidak merusak jaringan
daun, nitrogen cair dituangkan ke dalam
tabung dan ditutup. Tabung diletakkan pada
Retsch Miller MM301 untuk proses
penggerusan.
Sebanyak 400µL larutan penyangga
(Lampiran 5) ditambahkan ke dalam tabung
yang berisi suspensi sel daun, digoyang
dalam waterbath 650C selama 15 menit.
Sebanyak
400µL larutan chloroform :
isoamylalcohol (24:1) ditambahkan ke
dalam suspensi sel, dicampur perlahan-lahan
dan digoyang selama 15 menit. Suspensi sel
disentrifuge dengan kecepatan 12000rpm
selama 5 menit. Supernatant yang terbentuk
diambil, dipindahkan dalam minitube baru.
Etanol absolute dingin ditambahkan
sebanyak 2X volume supernatant dan
dibalik-balik perlahan, didiamkan dalam es
selama 15-30 menit, kemudian disentrifuge
dengan kecepatan 12000rpm selama 15
menit.
Endapan
dicuci
dengan
menambahkan etanol 70% dan disetrifuge
12000rpm selama 15menit. Supernatan yang
terbentuk dibuang. Pencucian ini dilakukan
2 kali.
DNA berupa endapan dalam
minitube
dikeringkan
dengan
oven.
Kemudian DNA dilarutkan dalam 100 µL
TE (Lampiran 6) yang mengandung 10µg/ml
RNase untuk menghilangkan RNA.
Tahapan terakhir adalah PCR. Kondisi
PCR yang dilakukan adalah sama dengan
kondisi
PCR
yang
dilakukan
untuk
mengkonfirmasi keberadaan gen HVA pada
bakteri. Komposisi reaksi PCR yang digunakan
tertera pada lampiran 7.
Analisis Hasil
Hasil yang didapat kemudian dianalisis
dengan cara menghitung efisiensi transformasi
dan efisiensi regenerasi. Efisiensi transformasi
didefinisikan sebagai jumlah eksplan yang
menghasilkan tanaman transgenik dibandingkan
dengan total eksplan yang ditransformasi.
Efisiensi regenerasi didefinisikan sebagai
jumlah eksplan yang menghasilkan tunas
dibandingkan dengan jumlah eksplan yang
ditumbuhkan di media regenerasi (Lee, 2004).
HASIL
Transformasi dengan menggunakan
dua konstruksi gen berbeda dengan strain
bakteri yang berbeda yaitu A. tumefaciens strain
AGL1 yang mengandung plasmid pCambia
1301-SNAC1
dan A. tumefaciens strain
EHA105
yang
mengandung
plasmid
pAY560326-HVA1
telah
menghasilkan
tanaman padi transgenik.
Setelah dikulturkan dalam media N6
(Lampiran 4) selama 5 hari, benih membentuk
kecambah seperti pada gambar 1 yang dijadikan
eksplan.
Eksplan
kecambah
yang
ditransformasi, diseleksi dan diregenerasikan
membentuk plantlet pada hari ke 47 (Gambar
2). Hanya satu tunas plantlet yang dapat
dihasilkan oleh satu eksplan. Planlet yang
terbentuk kemudian dipindahkan ke ember
(Gambar 3). Hasil percobaan transformasi padi
indica disajikan pada tabel 1.
Gambar 1 Benih dalam media N6
prekultur 5 hari
Gambar 2 Planlet yang terbentuk
pada hari ke 47
Gambar 3 Padi indica cv Ciherang dan Inpari 6 putatif transgenik
Keterangan : No. 2 adalah padi indica cv Inpari 6 yang ditransformasi dengan AGL1-SNAC1
No. 18 adalah padi indica cv Inpari 6 yang ditransformasi dengan EHA105-HVA1
No. 3 adalah padi indica cv Ciherang yang ditransformasi dengan EHA105-HVA1
Tabel 1 Efisiensi transformasi padi indica yang ditransformasi dengan A.tumefaciens strain AGL1
(gen SNAC1) dan strain EHA105 (gen HVA1)
AGL1 – SNAC1
EHA105 – HVA1
Parameter yang diamati
Ciherang
Inpari6
Bio110
Ciherang
Inpari6
Bio110
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
∑
%
Jumlah
eksplan
yang 110
85
107
123
125
68
ditransformasi
Jumlah eksplan tahan higromisin
22
20
27
31,76
10
9,34
47
38,21
25
20
10 14,71
Jumlah eksplan yang beregenerasi
3
13,64
8
29,63
0
0
13
27,66
6
24
0
0
Jumlah plantlet yang hidup
0
0
6
0
0
8
4
0
0
setelah aklimatisasi
Jumlah tanaman transgenik
0
0
5
5,88
0
0
7
5,69
2
1,6
0
0
Analisis integrasi transgen ke
dalam genom padi dilakukan dengan PCR
menggunakan primer spesifik untuk gen hpt.
Hasil PCR dimigrasikan di gel dengan
elektroforesis dengan menggunakan 1kb
M 1 2
3
ladder plus (Invitrogen) sebagai penanda ukuran
DNA. Hasil elektroforesis DNA hasil PCR dari
tanaman yang diduga transgenik dan non
transgenik disajikan pada gambar 4, dan
diringkas di tabel 2.
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
500bp
Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR DNA tanaman yang diduga transgenik.
M: marker, 1,8,9 & 13: tidak ada sisipan gen hpt, 2-7, 10-12 &14-18:
sisipan gen hpt teramplifikasi
No.
1.
2.
Tabel 2 Ringkasan hasil PCR gen hpt padi indica
Hasil PCR
Strain bakteri - gen
Ciherang
Inpari6
∑
+ PCR
%
∑
+ PCR
AGL1 – SNAC1
0
0
0
6
5
EHA105 – HVA1
8
7
87,5
4
2
PEMBAHASAN
Transformasi
diawali
dengan
mengkulturkan benih selama 5 hari dalam
media N6 sesuai dengan metode yang
dilakukan oleh Toki et al (2006). Menurut
Toki et al (2006) jaringan skutelum yang
berasal dari kecambah yang berumur 5 hari
cocok dijadikan target transformasi karena
sel-selnya
telah
menjadi
kompeten.
Sterilisasi menggunakan alkohol dengan
penambahan larutan Tween 20 bukan hanya
efektif dalam mensterilkan benih tapi juga
mampu menghilangkan berbagai jenis
minyak dan parafin dari benih yang dapat
menghalangi penetrasi ke jaringan skutelum.
Beberapa faktor dapat menjelaskan
tentang keberhasilan transformasi ini. Selain
sifat sel, masa periode eksplan juga
menentukan. Semakin cepat eksplan ditanam
dalam kondisi in vitro, semakin tinggi
efisiensinya. Kemampuan regenerasi akan
semakin menurun jika berada dalam kondisi
in vitro yang lama (Wu et al, 1998).
Keberhasilan suatu transformasi
genetik sangat terkait dengan keberhasilan
pembentukan planlet dan sistem regenerasi
tanaman. Menurut Ge et al (2006) potensi
regenerasi kultur jaringan padi sangat
tergantung pada beberapa faktor seperti
genotipe tanaman donor, komposisi dan
konsentrasi garam, komponen organik dan
hormon pengatur pertumbuhan dalam media.
Dari sejumlah faktor tersebut genotipe
merupakan faktor utama.
Media N6 adalah media yang
digunakan untuk regenerasi tanaman dengan
metode sederhana seperti kalus yang berasal
dari embrio dewasa (Rance et al 1994).
Pembengkakan pada jaringan skutelum
mulai terlihat di hari ketiga di media N6
karena penambahan asam amino seperti
prolin, glutamin, dan casamino acid (Hare &
Cress, 1997).
Tabel 1 memperlihatkan perbedaan
hasil transformasi menggunakan konstruksi
gen dan strain bakteri yang berbeda. Total
benih yang ditransformasi menggunakan
AGL1-SNAC1 ada sebanyak 302 benih dan
%
83,33
50
sebanyak 316 benih yang ditransformasi
menggunakan EHA105-HVA1.
Hasil menunjukkan bahwa padi
Ciherang memiliki efisiensi transformasi yang
baik pada transformasi dengan EHA105-HVA1
yaitu sebesar 5,69%. Sebaliknya padi Inpari6
lebih efisien pada transformasi menggunakan
AGL1-SNAC1 dengan efisiensi sebesar 5,88%.
Sementara besar efisiensi padi Inpari6 dengan
menggunakan EHA105-HVA1 adalah 1,6%.
Kondisi terbaik perlu diciptakan agar
transformasi lebih efektif. Kondisi yang turut
berperan antara lain waktu perendaman eksplan
dalam
suspensi
bakteri,
penggunaan
asetosyringone,
lama
kokultivasi,
dan
konsentrasi bakteri yang digunakan (Ozawa,
2009). Lama perendaman jaringan dalam
suspensi
bakteri
berpengaruh
terhadap
persentase regenerasi eksplan. Semakin lama
eksplan direndam maka kesempatan bakteri
untuk menenpel dan menginfeksi eksplan
tersebut juga akan semakin lama sehingga
peluang untuk transfer T-DNA ke dalam genom
tanaman akan lebih tinggi (Purnamaningsih,
2010).
Menurut Siregar (1999), tanaman
monokotil lebih sulit diinfeksi oleh A.
tumefaciens sehingga biasanya membutuhkan
waktu perendaman yang lebih lama. Namun
jika perendaman dilakukan lebih dari 30 menit
akan menyebabkan infeksi bakteri terlalu
banyak sehingga jaringan tanaman menjadi
stres dan tidak dapat tumbuh. Waktu
perendaman yang digunakan pada penelitian ini
adalah 15 menit.
Lamanya kokultivasi antara bakteri
dan eksplan menentukan keefektifan kerja
bakteri. Idealnya waktu kokultivasi berkisar 3-5
hari. Apabila waktu terlalu cepat, infeksi bakteri
kurang baik sehingga bakteri belum bekerja
optimal mentransfer T-DNA ke jaringan sel.
Jika waktu terlalu lama akan menimbulkan
infeksi bakteri yang berlebih. Waktu kokultivasi
pada penelitian ini adalah 4 hari.
Penggunaan acetosyringone bertujuan
untuk menginduksi ekspresi gen-gen vir yang
berfungsi
dalam
mentransfer
T-DNA.
Penambahan senyawa fenolik tersebut pada
media menjadi penting untuk meningkatkan
daya infeksi bakteri karena tidak semua
tanaman memproduksi senyawa fenolik
(Godwin, 1991). Konsentrasi OD600 bakteri
merupakan faktor selanjutnya. Konsentrasi
yang
disarankan
adalah
0,01-0,1.
Konsentrasi yang terlalu besar akan
menyebabkan pertumbuhan yang berlebihan,
sementara konsentrasi yang terlalu kecil
tidak akan efektif. Oleh sebab itu, pada
penelitian ini konsentrasi yang dipakai
adalah 0,02 (Ishida et al, 1996).
Kecepatan eksplan berproliferasi
pada medium seleksi yang mengandung
higromisin
50
mg/l
menunjukkan
kemampuan
eksplan
mendetoksifikasi
higromisin pada media. Hal ini merupakan
indikasi
awal
bahwa
gen
yang
diintroduksikan terdapat dalam genom
tanaman meskipun masih harus dibuktikan
dengan analisis PCR (Maftuchah, 2003).
Penggunaan antibiotik seperti higromisin
pada media seleksi bertujuan untuk
menyeleksi galur transgenik.
Higromisin merupakan sistem
seleksi untuk ketahanan antibiotik yang
banyak
digunakan
pada
tanaman
monokotiledon terutama graminae (Bashir et
al, 2004). Higromisin akan menghambat
sintesis protein dengan mengganggu
translokasi
sehingga
menyebabkan
kesalahan translasi pada ribosom 80S.
Enzim higromisin fosfotransferase yang
dihasilkan gen hpt, dapat mendetoksifikasi
antibiotik higromisin B dan mengkatalis
fosforilasi kelompok hydroxyl dalam
higromisin sehingga menjadi tidak aktif dan
tidak meracuni sel tanaman (Bashir et al,
2004). Penggunaan higromisin dengan
konsentrasi 50mg/L masih memungkinkan
adanya tanaman tidak terseleksi yaitu
tanaman yang tahan higromisin tapi tidak
mengandung
gen
target.
Sehingga
peningkatan kosentrasi higromisin secara
bertahap diharapkan dapat menekan
pertumbuhan tanaman non transgenik (Park,
1996).
Pada penelitian ini regenerasi
diupayakan melalui organogenesis langsung
yaitu eksplan langsung membentuk tunas
dan menghindarkan pembentukan kalus.
Setelah transformasi, kurang lebih pada hari
ke 39 mulai terbentuk calon tunas berwarna
hijau. Spot berwarna hijau yang akan
beregenerasi menjadi calon tunas terbentuk
di media regenerasi. Regenerasi terus
berlangsung hingga membentuk plantlet
sempurna sekitar hari ke 47 setelah
transformasi (terlihat pada gambar 2).
Eksplan yang dapat beregenerasi tidak
semuanya dapat membentuk tunas yang hidup.
Beberapa eksplan tetap membentuk calon tunas,
tetapi calon tunas tersebut menjadi coklat dan
akhirnya mati. Beberapa tunas yang pada
awalnya dapat tumbuh dengan baik setelah
disubkultur beberapa kali tidak dapat bertahan
hidup dan akhirnya mati.
Jumlah waktu yang dibutuhkan adalah
relatif sama untuk kedua galur A. tumefaciens
yang digunakan untuk transformasi. Total
waktu yang diperlukan pada penelitian ini jika
dibandingkan dengan metode serupa yang
diaplikasikan pada padi japonica lebih lama.
Total waktu yang dibutuhkan padi japonica
untuk tumbuh adalah sekitar 36 hari (Toki et al,
2005). Namun, jika dibandingkan dengan
metode immature embryo dan kalus
embriogenik, total waktu 47 hari tergolong
singkat.
Dari 141 eksplan yang tahan
higromisin, hanya 30 eksplan yang mampu
beregenerasi membentuk 30 tunas. Dari 30
plantlet hanya 18 plantlet yang dapat tumbuh
normal setelah aklimatisasi, lainnya mengalami
kematian akibat perbedaan kondisi lingkungan.
Tanaman transgenik memerlukan waktu kurang
lebih sebulan agar dapat tumbuh tegak besar
(Lampiran 8).
Analisis molekular untuk melihat hasil
transformasi berupa keberadaan gen hpt yang
telah masuk pada tanaman regeneran dilakukan
dengan PCR. Total 18 tanaman yang berhasil
tumbuh terdiri dari 8 tanaman padi Ciherang
dan 10 tanaman padi Inpari6. DNA dari 18
nomor tanaman yang ada telah berhasil diisolasi
dan dilakukan PCR. Hasil PCR menunjukkan
14 tanaman mengandung gen hpt dengan
ukuran pita DNA 500 bp (Tabel 2). Hal ini
menunjukkan bahwa tanaman tersebut adalah
transgenik
Tanaman transgenik yang berhasil
tumbuh adalah varietas Ciherang dan Inpari6.
Sebanyak 7 tanaman padi Ciherang transgenik
diperoleh dari transformasi dengan EHA105HVA1 dan 6 tanaman padi Inpari6 transgenik
terdiri dari 5 tanaman dari transformasi dengan
AGL1-SNAC1 dan 1 tanaman dari transformasi
dengan EHA105-HVA1.
Padi indica merupakan jenis padi
rekalsitran
(sulit
beregenerasi
dan
ditransformasi) dalam kegiatan kultur jaringan
dan transformasi genetik. Jika dibandingkan
dengan padi japonica, efisiensi pada padi
japonica lebih tinggi dari pada padi indica.
Efisiensi transformasi padi japonica dapat
mencapai 80% (Hiei and Toshihiko, 2006).
Toki et al (2006) melaporkan bahwa metode
infeksi pada awal jaringan skutelum telah
menghasilkan tanaman padi transgenik
hanya pada satu varietas padi indica yaitu
Basmati 370 (data tidak ditunjukkan).
Meskipun angka efisiensi yang didapat kecil,
namun hasil penelitian ini membuktikan
bahwa metode infeksi awal pada jaringan
skutelum dapat menghasilkan 14 tanaman
transgenik padi indica dengan efisiensi
transformasi berkisar antara 1,6%-5,88%.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Sebanyak 18 tanaman telah berhasil
diregenerasikan dari hasil transformasi
menggunakan metode infeksi awal jaringan
skutelum. Setelah PCR, dari 18 tanaman 14
tanaman adalah transgenik yang berasal dari
varietas Inpari6 dan Ciherang. Transformasi
menggunakan Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105–HVA1 lebih efisien dari
pada strain AGL1-SNAC1 dengan efisiensi
transformasi pada padi Ciherang adalah
5,69% dan pada padi Inpari6 1,6-5,88%.
Saran
Untuk memastikan tanaman yang
dihasilkan adalah transgenik dan mengetahui
jumlah kopi dari DNA sisipan, hibridisasi
Southern terhadap 14 tanaman transgenik
perlu dilakukan.
Ucapan terima kasih dihaturkan
atas terselenggaranya penelitian ini yang
sepenuhnya didanai oleh proyek BB-Biogen.
DAFTAR PUSTAKA
Bashir et al. 2004. Hygromycin based
selection of transformant in a local
inbred line of Zea mays (L).
Pakistan Journal of Biological
Sciencs 7 : 18-323.
Ge X, Chu Z, Lin Y, and Wang S. 2006. A
tissue culture system for different
germplasms of indica rice. Plant
Cell Report 25 : 392-402.
Godwin I, Todd G, Ford B, Newburry HJ.
1991. The effect of acetosyringone
and pH on Agrobacteriummediated transformation varies
according to plant species. Plant
Cell 9: 671-675.
Hare PD, Cress WA. 1997. Metabolic
implications of stress induce praline
accumulation in plant. Plant Growth
Regulation 21 : 79-102.
Hiei Y, Toshihiko K. 2006. Improved protocols
for transformation of indica rice
mediated
by
Agrobacterium
tumefaciens. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 85 : 271-28.
Hodges TK, Jianying P, Leszek AL, David SK.
1991.
Transformation
and
Regeneration of Rice Protoplasts.
USA : Perdue University
Hu H et al. 2006. Over-expressing a NAM,
ATAF and CUC (NAC) transcription
factor enhances drought resistance and
salt tolerance in rice. PNAS 103:
12987-12992.
Ishida Y et al. 1996. High efficiency
transformation of maize mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Research
Article: 745-751.
Lee YH. 2004. A new selection method for
pepper transformation
: callus
mediated shoot formation. Plant Cell
Rep. 23: 50-58.
Maftuchah. 2003 Transformasi genetic padi
indica dengan gen crylA(b) dan crylB
melalui Agrobacterium tumefaciens
untuk ketahanan terhadap hama
peggerek batang. [disertasi]. Bogor:
Program
Pascasarjana,
Institut
Pertanian Bogor.
Mulyaningsih ES, Regy H, Inez H, Slamet L.
2009. Genetic transformation of
transcription factor gene into rice
genome and transformant analysis of
hpt gene by PCR and hygromycin
resistance test. Biodiversitas 10 : 6369.
Nisak F. 2009. Transformasi padi (Oryza sativa
L.) Japonica cv Nipponbare dengan
gen
SNAC1
menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. [tesis].
Malang:
Program
Pascasarjana,
Universitas Brawijaya
Ozawa K. 2009. Establishment of a high
efficiency Agrobacterium mediated
transformation system of rice (Oryza
sativa L.). Plant Science 176 : 522527.
Park SH, Pinson SMR, Smith RH. 1996. TDNA integration into genomic DNA of
rice
following
A.
tumefaciens
inoculation of isolated
shoot apices. Plant Mol Biol. 32: 11351148.
Purnamaningsih R. 2010. Introduksi gen
DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM ke
dalam
genom
tanaman
tomat
menggunakan
vektor
Agrobacterium tumefaciens. Jurnal
AgroBiogen 6(1) : 18-25.
Rance I et al. 1994. Partial desiccation of
mature emryo-derived calli, a
simple treatment that dramatically
enhanced the regeneration ability of
indica rice. Plant Cell Rep. 13 :
647-651.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan
perbaikan sifat genetik padi
menggunakan
transformasi
Agrobacterium.
AgroBiogen
2(1):36-44.
Saharan V, Yadav RC, Yadav RM, Ram K.
2004. Studies on improved
Agrobacterium
mediated
transformation in two indica rice
(Oryza sativa L.). African Journal
of Biotechnology 3(11): 572-575
Sambrook JE, Fritsch F, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning a Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. New York.
Shinozaki K, Yamaguchi K. 1997. Gene
expression and signal transduction
in water stress response. Plant
Physiology 115: 327-334.
Siregar EBM. 1999. Transformasi genetika
dan regenerasi tanaman cabai
transgenic
dengan
bantuan
Agrobacterium. [disertasi]. Bogor :
Institut Pertanian Bogor.
Siregar H. 1981. Budidaya Tanaman Padi di
Indonesia. Jakarta : PT Sastra Hudaya.
Toki S. et al. 2006. Early infection of scutellum
tissue with Agrobacterium allows high
speed transformation of rice. The Plant
Journal 47 : 969-976.
Utami DW et al. 2005. Gen Pengendali Sifat
Ketahanan Blas (Pyricularia grisea
Sacc.) Pada Spesies Padi Liar Oryza
rufipogin Griff. dan Padi Budi Daya
IR64. Jurnal AgroBiogen 1(1) : 1-6.
Widhianata H. 2010. Konstruksi plasmid vector
dengan gen responsif kekeringan
HVA1 dan introduksinya ke dalam
Agrobacterium tumefaciens strain
EHA105. [tesis]. Malang: Program
Pascasarjana, Universitas Brawijaya.
Wu H., Mccormac AC, Elliot MC, and Chen
DF. 1998. Agrobacterium mediated
stable
transformation
of
cell
suspension
cultures
of
barley
(Hordeum vulgare). Plant Cell Tissue
Organ Cult. 4 : 161-171.
Xu D et al. 1996. Expression of a late
embryogenesis abundant protein gene,
HVA I, from barley confers tolerance
to water deficit and salt stress in
transgenic rice. Plant Physiology 110:
249-257.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Peta plasmid
Gambar 5 Peta Plasmid pCambia 1301
Eco ICRI (14)
Ban II (16)
Sac I (16)
3 'NOS
MCS
Spe I (319)
Acc 65I (326)
35S
Kpn I (330)
Bgl II (333)
Xho I (340)
HptII
Sci I (342)
Eco RI (346)
Sal I (352)
CaMV polyA
LB
pAY56 03 26
9946 bp
Bpl I (355)
35S
RB
aadA
Gambar 6 Peta plasmid pAY56026
Lampiran 2 Komposisi Media Kultur Bakteri
a.
b.
Media LB (Luria-Bertani Broth)
Bacto trypton
NaCl
Yeast extract
Bacto Agar (solid)
10 g/L
10 g/L
5 g/L
15 g/L
AB medium
50 ml AB buffer stock :
K2HPO4
NaH2PO4
50 ml AB salt stock :
NH4Cl
MgSO4.7H2O
KCl
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
900 ml aquades untuk melarutkan :
Glucose
Bacto Agar
60 g/L
20 g/L
20 g/L
6 g/L
3 g/L
0.2g/L
50mg/L
5 g/L
15 g/L
Lampiran 3 Komposisi bufer TAE
50x TAE (untuk 1 liter) :
Tris base
Glacial acetic acid
0.5M EDTA
ddH2O
1x TAE :
50x TAE
ddH2O
: 242 g
: 57,1 ml
: 50 ml
: 892.9 ml
:20 ml
:980 ml
Lampiran 4 Komposisi berbagai media kultur (Toki et al., 2006)
Komposisi
Komponen makro
KNO3
NH4Cl
NH4NO3
(NH4)2.7H2O
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
NaH2PO4.2H2O
K2HPO4
KH2PO4
KCl
Komponen Mikro
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
Fe-EDTA
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
KI
H3BO3
Na2MoO4.2H2 O
Komponen organik
Casamino acid
Glycine
L-arginine
L-proline
L-glutamine
L-aspartic acid
Myo-inositol
Nicotinic acid
Prydoxine HCl
Thiamine HCL
Fitohormon
2,4-D
NAA
Kinetin
Acetosyringone
Antibiotik
Hygromicin
Vancomycin
Cefotaxime
Sumber karbon
Sukrosa
Sorbitol
Glukosa
pH
Agarosa
N6D
2N6-AS
2380
4000
463
185
166
463
185
166
AAM
250
150
150
Resting
N6D-AB
RE-III
1900
1900
1900
1650
1650
1650
370
440
370
440
370
440
170
170
170
37,3
27,8
37,3
27,8
37,3
27,8
22,3
8,6
0,025
0,025
0,83
6,2
0,25
22,3
8,6
0,025
0,025
0,83
6,2
0,25
22,3
8,6
0,025
0,025
0,8
6,2
0,25
2000
2
2000
2
100
0,5
0,5
0,1
100
0,5
0,5
0,1
3000
37,3
27,8
37,3
27,8
4,4
1,5
4,4
1,5
0,8
1,6
0,8
1,6
300
2
300
2
40
10
2
0.025
0,025
0,75
3,0
0,25
500
7,5
176,7
2878
100
0,5
0,5
1
100
0,5
0,5
1
2
2
900
300
100
1
1
10
100
0,5
0,5
0,1
2
10~20
10~20
30000
30000
68500
5,8
7000
10000
5,2
7000
36000
5,2
100
400
50
100
400
20
100
100
30000
30000
30000
5,8
7000
5,8
7000
5,8
7000
Lampiran 5 Komposisi bufer TE
Buffer TE (untuk 1 liter):
1 M Tris-HCl pH 8
0.5M EDTA pH 8
ddH2O
:10 ml
: 2 ml
: 988 ml
Lampiran 6 Komposisi larutan penyangga
STR3X loading buffer (untuk 100 ml) :
4M NaOH
95%formamide
Bromophenol blue
Xylene cyanol FF
ddH2O
Lampiran 7 Komposisi reaksi PCR
DNA
Primer higromisin F
Primer higromisin R
2x Taq Polimerase
MQ
MgCl2
1 µl
0,1 µl
0,1 µl
5 µl
2,7 µl
0,3 µl
10 µl
: 0,25 ml
: 95 ml
: 50 mg
: 50 mg
: 4.75 ml
Lampiran 8 Gambar padi transgenik
Gambar 7 Padi Inpari6 dengan perlakuan AGL1-SNAC1
Gambar 8 Padi Inpari6 dengan perlakuan EHA105-HVA1
Gambar 9 Padi Ciherang dengan perlakuan EHA105-HVA1
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………..…............................... VII
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..................................VII
DAFTAR TABEL ......................................................................................................................... VII
PENDAHULUAN ............................................................................................................................1
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ............................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................... 1
Bahan ................................................................................................................................ 1
Metode .............................................................................................................................. 1
Pembuatan sel kompeten A. tumefaciens
strain EHA105.................................................................................................... 1
Transformasi A. tumefaciens strain EHA105 dengan gen
HVA1 .................................................................................................................. 2
Konfirmasi hasil transformasi............................................................................. 2
Penumbuhan A. tumefaciens............................................................................... 2
Persiapan Eksplan............................................................................................... 2
Transformasi kecambah...................................................................................... 2
Pasca Transformasi ............................................................................................ 2
Isolasi DNA dan PCR......................................................................................... 3
Analisis Hasil ..................................................................................................... 3
HASIL ............................................................................................................................................. 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................. 5
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................................................... 7
Kesimpulan ....................................................................................................................... 7
Saran ................................................................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Gambar benih dalam media N6 prekultur 5 hari .............................................................. 3
Gambar plantlet yang terbentuk di hari ke-47 .................................................................. 3
Gambar padi putatif transgenik ........................................................................................ 4
Gambar hasil elektroforesis produk PCR ......................................................................... 4
Gambar peta plasmid pCambia 1301 ............................................................................... 10
Gambar peta plasmi pAY560236 .................................................................................... 10
Gambar tanaman transgenik ............................................................................................. 16
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Halaman
Peta plasmid ..................................................................................................................... 10
Komposisi media kultur bakteri ....................................................................................... 11
Komposisi buffer TAE ..................................................................................................... 12
Komposisi media kultur ................................................................................................... 13
Komposisi bufer TE ......................................................................................................... 14
Komposisi larutan penyangga .......................................................................................... 14
Komposisi reaksi PCR ..................................................................................................... 14
Gambar tanaman transgenik ............................................................................................. 15
DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
Efisiensi transformasi padi indica yang ditransformasi dengan A.tumefaciens strain AGL1
(gen
SNAC1)
dan
strain
EHA105
(gen
HVA1)
............................................................................................................................................ 4
Ringkasan hasil PCR 18 nomer padi indica ....................................................................... 5
19