Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan Gen Pembungaan Hd3a dari Padi

TRANSFORMASI GENETIK Nicotiana benthamiana DENGAN
GEN PEMBUNGAAN Hd3a DARI PADI

LAILA NUR SYAFITRI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

ABSTRAK
LAILA NUR SYAFITRI. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan Gen Pembungaan
Hd3a dari Padi. Dibimbing oleh SUHARSONO dan SRI KOERNIATI.
Pembungaan adalah salah satu peristiwa penting dalam siklus hidup tanaman tingkat
tinggi dan karakter yang sangat penting untuk menentukan kemampuan spesies beradaptasi pada
berbagai kondisi lingkungan. Gen Hd3a adalah salah satu gen yang berhubungan dengan waktu
pembungaan di padi. Ekspresi berlebih Hd3a menyebabkan pembungaan lebih awal pada padi.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
Hd3a dari padi. Transformasi genetik dilakukan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens
LBA4404 dengan metode kokultivasi. Seleksi tunas transgenik putatif dilakukan dengan 30 mg/l

higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa proses transformasi N. benthamiana
menghasilkan tunas transgenik putatif dengan nilai efisiensi transformasi cukup tinggi yaitu 86%.
Analisis molekuler dengan PCR terhadap tanaman transgenik putatif menunjukkan bahwa tanaman
tersebut mengandung gen hpt yang bertanggung jawab terhadap resistensi tanaman terhadap
higromisin. Keberadaan bagian gen hpt dalam genom Nicotiana benthamiana transgenik ini juga
menunjukkan keberadaan gen pembungaan Hd3a. Tunas Nicotiana benthamiana transgenik yang
mengandung gen Hd3a berbunga lebih awal, sehingga gen Hd3a mempunyai peranan dalam
memicu pembungaan.

ABSTRACT
LAILA NUR SYAFITRI. Genetic Transformation of Nicotiana benthamiana with Hd3a flowering
gene from rice. Supervised by SUHARSONO and SRI KOERNIATI.
Flowering is one of the fundamental events in the life cycle of many higher plants and is a
very important trait for determining the ability of a species to adapt to various environmental
conditions. Hd3a gene is one gene that is associated with the flowering time in rice.
Overexpression of Hd3a caused early flowering in rice. This research had an objective to
transform genetically Nicotiana benthamiana by Hd3a gene from rice. Genetic transformation was
carried out by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by co-cultivation method. Putative transgenic
shoots were selected by using 30 mg/l hygromycin. The results showed that genetic transformation
of N. benthamiana resulted the putative transgenic shoots with high eficiency i.e 86%. Molecular

analysis by PCR of putative transgenic plants showed that these plants contained hpt genes
responsible for plant resistance to hygromycin. The presence of the hpt gene in the genome of
transgenic Nicotiana benthamiana also indicated the presence of Hd3a flowering gene. The shoot
of transgenic Nicotiana benthamiana containing Hd3a gene had flower very early, so the Hd3a
gene has a role in triggering flowering.

TRANSFORMASI GENETIK Nicotiana benthamiana DENGAN
GEN PEMBUNGAAN Hd3a DARI PADI

LAILA NUR SYAFITRI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Judul

: Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan Gen
Pembungaan Hd3a dari Padi
: Laila Nur Syafitri
: G34060962

Nama
NIM

Disetujui :

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA.
NIP 19610428 198703 1 003

Dr. Ir. Sri Koerniati, M.Sc.
NIP 19610915 198603 2 001

Diketahui :
Ketua Departemen Biologi,

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan pada bulan Agustus 2010 hingga Mei 2011 ini ialah Transformasi Genetik Nicotiana
benthamiana dengan Gen Pembungaan Hd3a dari Padi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA dan Ibu Dr. Ir.
Sri Koerniati, M.Sc selaku pembimbing atas segala bimbingan, dukungan, pengarahan, nasihat,
kesabaran dan saran yang telah diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Ahcmad Farajallah, M.Si selaku dosen penguji

yang telah bersedia menguji dan memberikan saran serta masukan dalam penulisan karya ilmiah
ini.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada proyek penelitian KKP3T yang berjudul :
“Perbaikan genetik Jatropha curcas untuk produksi biji dan toleransinya terhadap pH rendah dan
aluminium melalui pendekatan biologi molekuler”dengan SPK no 642/LB.620/I.1/2/2009 tanggal
20 Februari 2009 atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
Terima kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi beserta
seluruh staf dan karyawan atas sarana, prasarana, dan bantuannya selama penulis melakukan
penelitian di Laboratorium Biorin dan Biologi Molekuler Seluler Tanaman. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada Pak Mulya, Mbak Pepi, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep,
dan Pak Iri atas bantuan, dan kerjasamanya. Terima kasih kepada teman-teman biologi angkatan
43. Terima kasih kepada rekan-rekan peneliti di Laboratorium Biorin dan Biologi Molekuler
Seluler Tanaman yaitu Pak Muzuni, Bu Hanum, Bu Yohana, Pak Ulung, Bu Ratna, Pak Radit, Kak
Nurul, Kak Anita, Kak Ophie, Fajri, Yulita, Indah, Iin, Rian, serta semua pihak yang tidak dapat
disebutkan satu-persatu atas segala kerjasamanya, bantuan, nasihat, diskusi yang diberikan, saling
menguatkan semangat, persahabatan, kekeluargaan dan keceriaan. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada Bapak, Ibu, kakak, dan adik penulis, serta seluruh keluarga, atas segala doa,
pengertian, dukungan, kesabaran, dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2012

Laila Nur Syafitri

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 5 Desember 1987 dari ayah Syafril MZ dan ibu
Nursyamsi. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara.
Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 103 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis terpilih masuk
Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO)
sebagai staf divisi Pengembangan Sumber Daya Manusia (PSDM) pada tahun 2007/2008. Penulis
pernah melaksanakan studi lapang di Taman Wisata Alam Situ Gunung Sukabumi pada tahun
2008, dengan judul makalah “Eksplorasi bakteri endofit asal tanaman obat sebagai sumber
senyawa antimikrob”. Penulis juga pernah melaksanakan praktik lapangan di PT. Sinar Sosro,
Cakung-Bekasi pada bulan Juli-Agustus 2009, dengan judul makalah “Analisis mikrobiologi
produk Fruit Tea Botol (FTB) di Laboratorium Mikrobiologi R&D (Research and Development),
PT. Sinar Sosro-Cakung”.

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang............................................................................................................................. 1
Tujuan Penelitian ......................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................................................... 1
Bahan ........................................................................................................................................... 1
Metode ......................................................................................................................................... 1
Persiapan Tanaman In Vitro................................................................................................... 1
Penumbuhan Agrobacterium tumefaciens.............................................................................. 2
Transformasi Genetik N. benthamiana .................................................................................. 2
Seleksi, Regenerasi, dan Perbanyakan Tunas ........................................................................ 2
Analisis Tanaman Transgenik ................................................................................................ 2
Analisis Molekuler ........................................................................................................... 2
Analisis Fenotipe .............................................................................................................. 3
HASIL
Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana ............................................................................ 3

Analisis Tanaman Transgenik ..................................................................................................... 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 6
SARAN ............................................................................................................................................. 6
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 7

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Rata-rata Efisiensi transformasi N. benthamiana ......................................................................... 4
2 Rata-rata jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan .................................................................. 4

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Peta fisik daerah T-DNA di dalam pCambia 1300-Hd3a ............................................................. 1
2 Eksplan pada media seleksi yang mengandung higromisin pada umur 6 minggu
setelah tanam ................................................................................................................................. 3
3 Pengujian eksplan non transgenik sebagai kontrol ........................................................................ 4
4 Hasil elektroforesis produk PCR dari DNA tanaman transgenik putatif ....................................... 4
5 Pertumbuhan tunas in vitro pada umur 6 minggu setelah tanam ................................................... 5

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi media MS (Murashige & Skoog 1962) ........................................................................ 8
2 Perhitungan efisiensi transformasi dan jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan .................... 9

PENDAHULUAN

BAHAN DAN METODE

Latar Belakang
Pembungaan merupakan transisi dari
fase vegetatif ke fase generatif/reproduksi.
Pembungaan adalah salah satu peristiwa
penting dalam siklus hidup tanaman tingkat
tinggi dan karakter yang sangat penting untuk
menentukan kemampuan spesies beradaptasi
pada berbagai kondisi lingkungan. Adapun
faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi
pembungaan

meliputi
panjang
hari
(fotoperiod), suhu, dan ketersediaan air.
Gen Hd3a adalah salah satu gen yang
berhubungan dengan waktu pembungaan.
Gen Hd3a yang berasal dari padi telah
diisolasi oleh Tamaki et al. (2007). Gen ini
menyandi aktivator utama pembungaan pada
padi dalam kondisi hari pendek (Kojima et al.
2002; Tamaki et al. 2007). Selain gen Hd3a,
pada Arabidopsis thaliana dikenal gen
flowering locus T (FT) yang berperan
memacu pembungaan pada tanaman hari
panjang. Berdasarkan percobaan, ekspresi
berlebih (overexpression) Hd3a dan FT
menyebabkan pembungaan lebih awal pada
padi dan juga pembungaan lebih awal pada A.
thaliana. Kemiripan fungsi dan sekuen
menunjukkan bahwa Hd3a merupakan

ortolog dari FT (Kojima et al. 2002).
Transformasi genetik merupakan
perubahan genetik karena adanya DNA asing
yang masuk dan terintegrasi di dalam
kromosom sel (hidup) inang. Transformasi
genetik dilakukan untuk mengintegrasikan
gen ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan tanaman baru yang mampu
mengekspresikan gen tersebut. Salah satu
teknik transformasi genetik yang digunakan
adalah melalui bantuan Agrobacterium
tumefaciens. Teknik transformasi tersebut
merupakan teknik transformasi secara tidak
langsung yang paling sering digunakan.
Teknik ini mempunyai beberapa keunggulan
seperti efisiensi transformasi dengan salinan
gen tunggal lebih tinggi dan dapat dilakukan
dengan
peralatan
laboratorium
yang
sederhana.
Tanaman Nicotiana benthamiana
merupakan tanaman model yang biasa
digunakan untuk menguji peranan suatu gen.

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Agustus 2010 − Mei 2011 di Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research IndonesiaThe Netherlands) dan Biologi Molekular
Seluler
Tanaman,
Pusat
Penelitan
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB
(PPSHB-IPB), Institut Pertanian Bogor.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan
tanaman Nicotiana benthamiana transgenik
yang mengandung Hd3a.

Bahan
Nicotiana
benthamiana
yang
ditumbuhkan secara in vitro digunakan
sebagai bahan tanaman yang di transformasi
secara genetik. Agrobacterium tumefaciens
galur LBA4404 yang mengandung plasmid
pCambia 1300-Hd3a yang membawa gen
Hd3a di bawah kontrol promoter 35S CaMV
(Sulistyaningsih 2012) digunakan untuk
melakukan transformasi genetik. Primer HpF (5’AAGGAATCGGTCAATACACTAC3’)
dan Hp-R (5’ACTATCGGCGAGTACTTC
TACA3’) digunakan untuk menganalisis
keberadaan gen hpt di dalam tanaman
transgenik putatif. Primer Hp-F didesain
berdasarkan urutan nukleotida ke- 416-437
dan primer Hp-R didesain berdasarkan urutan
nukleotida ke- 963-984 dari gen hpt (Hannum
2012). Peta fisik daerah T-DNA disajikan
pada Gambar 1.
L
B

hpt

35S
Pro

Hd3a

35S
Pro

R
B

Gambar 1 Peta fisik daerah T-DNA di dalam
pCambia 1300-Hd3a. LB: left
border, RB: right border, 35S pro:
promoter 35S dari Cauliflower
mosaic virus (CaMV), Hd3a: gen
Hd3a dari padi, hpt: gen resistensi
terhadap higromisin
(Sulistyaningsih 2012).
Metode
Persiapan Tanaman In Vitro
Biji N. benthamiana disterilisasi
dalam laminar air flow dengan cara
merendam biji dalam alkohol 70% selama 2
menit. Selanjutnya biji dicuci menggunakan
aquades steril sebanyak satu kali, lalu
direndam dalam 20% larutan bayclean (atau
1,05% NaClO) selama 5-10 menit. Kemudian
biji dicuci kembali menggunakan aquades
steril sebanyak 3-4 kali. Biji yang sudah
disterilisasi ditanam dalam media dasar

2
Murashige dan Skoog (MS) (Lampiran 1),
yang mengandung 3 g/l phytagel, dan
diletakkan di dalam ruang gelap selama 3
hari, kemudian dipindahkan ke dalam
ruangan bercahaya, suhu 26-27oC. Setelah
biji berkecambah, tunas disubkultur ke botol
kultur dan dipelihara dalam ruang kultur
selama satu bulan.
Penumbuhan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens galur
LBA4404 yang membawa gen Hd3a di
dalam plasmid pC1300-Hd3a diperbanyak
dengan menumbuhkan satu koloni tunggal di
dalam 10 ml media LB (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) cair yang
mengandung 50 mg/l kanamisin dan 25 mg/l
rifampisin. Biakan digoyang menggunakan
inkubator bergoyang pada suhu ruang selama
semalam (kondisi gelap) hingga OD600
mencapai 0,5-0,8.
Transformasi genetik N. benthamiana
Sebelum melakukan transformasi,
biakan
A.
tumefaciens
diendapkan
menggunakan alat sentrifuse pada kecepatan
5000 rpm selama 10 menit dan endapan
diresuspensi dengan penambahan 10 ml
media Murashige dan Skoog (MS) cair yang
mengandung 0,5 mg/l BAP dan 100 mg/l
asetosiringon hingga OD600 mencapai 0,5-0,8.
Transformasi
dilakukan
dengan
metode
kokultivasi
menggunakan
A.
tumefaciens menurut prosedur Horsch et al.
(1985) yang dimodifikasi. Daun-daun N.
benthamiana yang diperoleh dari kultur in
vitro yang berumur 4 minggu dipotong
menjadi berukuran ± 1 cm2 dan direndam
dalam suspensi A. tumefaciens OD600 0,5-0,8,
digoyang menggunakan inkubator bergoyang
pada suhu ruang selama 10-15 menit.
Selanjutnya eksplan dikeringkan dengan tissu
steril dan ditanam pada media MS padat yang
mengandung 0,5 mg/l BAP, dan 100 mg/l
asetosiringon selama 3 hari di dalam ruang
gelap.
Seleksi, Regenerasi, dan Perbanyakan
Tunas
Setelah 3 hari, eksplan dicuci dengan
aquades steril sebanyak tiga kali dan dengan
larutan 200 mg/l cefotaxime. Eksplan
dikeringkan dengan tissu steril dan
dipindahkan ke media seleksi yaitu media
MS yang mengandung 0,5 mg/l BAP, 30
mg/l higromisin, dan 200 mg/l cefotaxime.
Selanjutnya, eksplan di simpan dalam ruang
kultur pada suhu 26-27oC. Tunas yang

terbentuk dipindahkan ke dalam media MS
yang mengandung 30 mg/l higromisin, dan
200 mg/l cefotaxime hingga tunas menjadi
besar. Eksplan yang menghasilkan tunas
transgenik putatif dihitung untuk mengetahui
efisiensi transformasi. Rumus efisiensi
transformasi disajikan pada Lampiran 2.
Eksplan non transgenik (sebagai
kontrol) yang tidak di kokultivasi dengan A.
tumefaciens diperlakukan dengan metode dan
kondisi yang sama dengan eksplan yang di
kokultivasi dengan A. tumefaciens yang di
tanam pada dua media perlakuan yaitu
mengandung
higromisin
dan
tanpa
higromisin.
Analisis Tanaman Transgenik
Analisis Molekuler
DNA total tanaman diisolasi dari daun
N. benthamiana dengan metode Suharsono
(2002) yang dimodifikasi. Untuk itu, daun
sebanyak 0,1-0,2 g, dipotong-potong,
dimasukkan ke dalam mortar, dan digerus
dengan bantuan nitrogen cair hingga halus.
Bubuk jaringan daun ini kemudian
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang
berisi 600 µl larutan penyangga 2 x CTAB
(2% CTAB, 0,1 M Tris-HCl, 20 mM EDTA,
1,4 M NaCl, pH 8,0) dan 1,2 µl βmercaptoetanol. Suspensi diinkubasikan pada
suhu 65oC selama 30 menit, kemudian
ditambahkan larutan Chloroform:Isoamylalcohol (CI) (24:1) sebanyak 1 x volume
ekstrak. Suspensi dibolak-balik secara
perlahan hingga tercampur merata, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm
(Jouan BR-4i) pada suhu 4oC selama 10
menit. Untuk mendapatkan DNA murni,
cairan bagian atas diambil dan dicampur
dengan larutan Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (PCI) (25:24:1) sebanyak 1 x volume,
dibolak-balik secara perlahan, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm
pada suhu 4oC selama 5 menit. Cairan bagian
atas diambil untuk dipresipitasi (diendapkan)
dengan menambahkan 2 M NaOAC pH 5,2
sebanyak 0,1 x volume dan etanol absolut
(EtOH 100%) sebanyak 2 x volume.
Campuran diinkubasi di freezer selama 30
menit,
kemudian
disentrifugasi
pada
kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC selama
15 menit. Endapan dibilas dengan 500µl
etanol 70%, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC selama
5 menit. Cairan dibuang, lalu pelet
dikeringkan dengan vakum selama ± 30
menit dan disuspensikan dengan ± 20-50 µl
aquades steril. Untuk menghilangkan RNA,

ditambah dengan RNAse (10 µg/µl)
sebanyak 0,1 x volume dan diinkubasikan
pada suhu 37oC selama semalam.
Analisis molekuler untuk mengetahui
keberadaan
gen
hpt
(hygromycin
phosphotransferase) dilakukan dengan PCR
(Polymerase
Chain
Reaction).
PCR
dilakukan dengan total volume 10 µl yang
mengandung 100 ng DNA total (1 µl), 10
pmol primer Hp-F (0,5 µl), 10 pmol primer
Hp-R (0,5 µl), 2 mM dNTP (1 µl), 1 unit taq
polimerase (0,2 µl), 1x buffer (1 µl) dan air
bebas ion (ddH2O) hingga mencapai volume
10 µl. Kondisi PCR adalah pra-PCR 95oC
selama 5 menit, denaturasi 94oC selama 30
detik, annealing (penempelan) 56oC selama
30 detik, extension (pemanjangan) 72oC
selama 1 menit, pasca-PCR 72oC selama 5
menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Hasil PCR kemudian dicek dengan
elektroforesis di gel agarosa 1% dalam
larutan buffer penyangga 1xTAE (40 mM
Tris-acetate, 1 mM EDTA) pada tegangan
100 volt selama 27 menit. Pita DNA pada
agarosa divisualisasi dengan cahaya UV
setelah gel direndam di larutan ethidium
bromida (0,5 µg/ml).
Analisis Fenotipe
Analisis fenotipe dilakukan dengan
pengamatan terhadap munculnya kuncup
bunga pada tunas in vitro.

HASIL
Transformasi
Genetik
Nicotiana
benthamiana
Eksplan N. benthamiana yang telah
dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang
mengandung pC1300-Hd3a yang mampu

(a)

bertahan hidup di dalam media seleksi yang
mengandung 30 mg/l higromisin membentuk
tonjolan kalus mulai minggu ke-2. Pada
minggu ke-4 dan ke-5, eksplan mulai
menghasilkan tunas dari tonjolan kalus
tersebut. Sedangkan eksplan yang tidak
dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang di
tanam di dalam media seleksi yang sama
mengalami kematian dan tidak menghasilkan
tunas (Gambar 2). Eksplan yang mati
menunjukkan tidak mempunyai gen resistensi
terhadap higromisin.
Untuk mengetahui efisiensi media
seleksi, eksplan non transgenik (sebagai
kontrol) yang tidak dikokultivasi dengan A.
tumefaciens yang mengandung pC1300-Hd3a
ditanam di dua media yang berbeda yaitu
media yang mengandung higromisin dan
media tanpa higromisin. Eksplan yang
ditanam pada media yang mengandung
higromisin mengalami kematian dan tidak
mampu menghasilkan tunas, sedangkan
eksplan yang ditanam pada media tanpa
higromisin tumbuh dengan baik dan mampu
menghasilkan tunas (Gambar 3).
Tunas yang tumbuh dari eksplan di
media seleksi adalah tunas transgenik putatif.
Berdasarkan
jumlah
eksplan
yang
menghasilkan tunas transgenik putatif, ratarata efisiensi transformasi pada N.
benthamiana adalah 86% (Tabel 1).
Kemampuan eksplan menghasilkan tunas
dalam media yang mengandung higromisin
dapat
menunjukkan
eksplan
tersebut
mengandung gen hpt yang difusikan dengan
gen Hd3a.
Setiap
eksplan
transforman
menghasilkan jumlah tunas berbeda. Ratarata jumlah tunas transgenik tiap eksplan
berkisar 3 – 4 tunas (Tabel 2).

(b)

Gambar 2 Eksplan pada media seleksi yang mengandung higromisin pada umur 6 minggu setelah
tanam. (a) eksplan yang dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang mengandung
pC1300-Hd3a, dan (b) eksplan kontrol (eksplan yang tidak dikokultivasi dengan A.
tumefaciens yang mengandung pC1300-Hd3a).

4

(a)
(b)
Gambar 3 Pengujian eksplan non transgenik sebagai kontrol. Eksplan non transgenik berumur 3
minggu setelah tanam. (a) di media seleksi yang mengandung 30 mg/l higromisin, dan
(b) di media tanpa higromisin.
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi N. Benthamiana
Jumlah eksplan
Menghasilkan
≠ menghasilkan
tunas transgenik
tunas transgenik
putatif
putatif
25
24
1
28
21
7
Rata-rata efisiensi transformasi

Jumlah eksplan
total yang
ditransformasi

Ulangan
1
2

Efisiensi
transformasi (%)
96%
75%
86%

Tabel 2 Rata-rata jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan
Ulangan

Jumlah eksplan menghasilkan tunas
transgenik putatif

1
2

Jumlah total tunas transgenik
putatif yang dihasilkan

Jumlah
tunas/eksplan

24
89
21
62
Rata-rata jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan

dalam genom N. benthamiana transgenik ini
juga
menunjukkan
keberadaan
gen
pembungaan Hd3a.
Selain analisis molekuler dilakukan
juga
pengamatan
terhadap
fenotipe.
Pengamatan terhadap tunas in vitro
transgenik
saat
proses
regenerasi
memperlihatkan adanya beberapa tunas in
vitro transgenik menghasilkan kuncup bunga.
Terbentuknya kuncup bunga saat masih
dalam tunas in vitro ini tidak ditemukan pada
tunas in vitro non transgenik (Gambar 5).
Begitu pula pada proses tunas menjadi besar
(tanaman utuh) di dalam tabung. Tunas yang
dihasilkan dari proses kokultivasi juga
berbunga lebih cepat dibandingkan tanaman
kontrol non transgenik.

Analisis Tanaman Transgenik
Tanaman transgenik putatif di analisis
secara molekuler melalui PCR dengan
menggunakan primer Hp-F dan Hp-R yang
mengamplifikasi DNA yang berukuran
sekitar 570 pb yang merupakan bagian dari
gen hpt. Dari 12 nomer tanaman transgenik
putatif yang diambil secara acak, analisis
PCR menunjukkan bahwa 12 nomer tanaman
tersebut mengandung gen hpt yang
ditunjukkan oleh adanya pita DNA hasil
amplifikasi yang berukuran sekitar 570 pb.
Ukuran ini sesuai dengan ukuran urutan
nukleotida gen hpt yaitu 569 pb. Analisis
yang sama terhadap tanaman non transgenik
sebagai
kontrol,
tidak
menghasilkan
amplikon (Gambar 4). Keberadaan gen hpt
M

1

2

3

4

5

3.71
2.95
3.33

6

7

8

9

10

11

12

13

14

650 pb
500 pb

Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR dari DNA tanaman transgenik putatif. (M) marker 1 kb
ladder, (1) plasmid mengandung gen Hd3a, (2) tanaman non transgenik (kontrol), dan
(3-14) tanaman transgenik.

a

b

Gambar 5 Pertumbuhan tunas in vitro pada umur 6 minggu setelah tanam. (a) tunas transgenik
yang berbunga, dan (b) tunas non transgenik.

PEMBAHASAN
Nicotiana banyak digunakan sebagai
tanaman model untuk transformasi genetik
karena tanaman ini mudah diregenerasikan,
mudah tumbuh dan berumur relatif pendek.
Chaidamsari et al. (2006) telah menggunakan
N. tabacum untuk menguji ekspresi gen
APETALA1 dari tanaman coklat, sedangkan
penelitian ini menggunakan N. benthamiana
untuk menguji ekspresi gen pembungaan
Hd3a dari tanaman padi.
Regenerasi tanaman pada penelitian
ini dilakukan melalui organogenesis yaitu
pembentukan organ atau tunas langsung dari
eksplan tanpa melalui pembentukan kalus
terlebih dahulu. Eksplan pada penelitian ini
adalah daun. Untuk melakukan proses
transformasi, daun N. benthamiana terlebih
dahulu dilukai dengan dipotong menjadi
beberapa bagian. Pelukaan pada tanaman
akan menyebabkan sel pada bagian tanaman
terluka mengeluarkan senyawa kelompok
fenol
yang
dikenal
dengan
nama
asetosiringon.
Asetosiringon
berperan
menginduksi gen-gen vir yang berfungsi
dalam mentransfer T-DNA ke dalam sel
tanaman dan penambahan asetosiringon
meningkatkan
efisiensi
infeksi
Agrobacterium (Orlikowska et al. 1995),
sehingga dapat meningkatkan jumlah sel
yang transforman. Untuk meningkatkan
efisiensi transformasi, pada penelitian ini
asetosiringon juga ditambahkan dalam media
kokultivasi.
Menurut
Ozawa
(2009),
penggunaan asetosiringon merupakan salah
satu kondisi terbaik yang perlu diciptakan
agar transformasi lebih efektif.
Transformasi genetik pada penelitian
ini menggunakan gen Hd3a di bawah kendali
promoter 35S CaMV yang difusikan dengan
gen resistensi terhadap higromisin yang
merupakan gen penanda seleksi. Gen
penanda seleksi sangat penting dalam
kegiatan transformasi genetik karena berguna

untuk menyeleksi sel, jaringan, organ atau
tanaman yang sudah mengalami transformasi
(transgenik). Penelitian ini menggunakan 30
mg/l higromisin untuk seleksi karena pada
konsentrasi ini eksplan non transgenik tidak
mampu
melakukan
regenerasi
untuk
membentuk tunas, dan kemudian eksplan
mengalami kematian (Gambar 2 dan 3).
Berdasarkan
jumlah
eksplan
yang
beregenerasi di media seleksi, rata-rata
efisiensi transformasi pada penelitian ini
yaitu 86%. Efisiensi transformasi ini adalah
tinggi jika dibandingkan dengan transformasi
pada Jatropha curcas L. (Sulistyaningsih
2012).
Analisis PCR dilakukan dengan
menggunakan primer untuk gen penyeleksi
hpt. Posisi gen hpt pada daerah T-DNA
dalam pC1300-Hd3a berdampingan dengan
LB (batas kiri) dan Hd3a berdampingan
dengan RB (batas kanan) (Gambar 1).
Keberadaan gen hpt dapat merupakan
indikasi keberadaan gen lain dalam satu TDNA yang sama di dalam genom tanaman
transgenik. Hal ini disebabkan oleh proses
integrasi daerah T-DNA di dalam genom
tanaman
yang
dimulai
dari
RB
(Sheng&Citovsky 1996). Dengan demikian
jika hasil PCR menunjukkan keberadaan gen
hpt dalam genom tanaman transgenik maka
gen target sisipan Hd3a juga telah terintegrasi
dalam genom tanaman tersebut. Hasil PCR
terhadap 12 tunas yang diduga transgenik
yang dapat hidup di media seleksi yang
diambil secara acak menunjukkan bahwa
kedua belas tanaman tersebut mengandung
gen hpt yang bertanggungjawab terhadap
resistensi tanaman terhadap higromisin yang
ditunjukkan oleh adanya pita DNA hasil
amplifikasi yang berukuran sekitar 570 pb.
Pengamatan
fenotipe
terhadap
tanaman transgenik menunjukkan bahwa N.
benthamiana
transgenik
menghasilkan
kuncup bunga pada saat proses regenerasi
tunas dan berbunga pada saat tunas di dalam

8

tabung (Gambar 5), sedangkan tunas non
transgenik tidak dapat menghasilkan kuncup
bunga pada proses tersebut. Hal ini
menunjukkan bahwa gen Hd3a dapat memicu
pembungaan pada N. benthamiana. Hasil ini
memperkuat penelitian sebelumnya pada
padi. Padi transgenik yang mengekspresikan
gen Hd3a berbunga lebih cepat dari pada
padi tipe liarnya pada kondisi hari pendek
(Kojima et al. 2002). Ekspresi gen Hd3a di
Jatropha curcas juga menghasilkan tunas
yang berbunga sangat dini pada saat tunas
masih di dalam tabung. Pembungaan dini ini
disebabkan oleh ekspresi gen Hd3a di bawah
kendali promoter konstitutif p35S CaMV
(Sulistyaningsih 2012) .

SIMPULAN
Proses
transformasi
Nicotiana
benthamiana
melalui
Agrobacterium
tumefaciens telah berhasil dilakukan dengan
nilai efisiensi transformasi cukup tinggi.
Analisis molekuler dengan PCR terhadap
tanaman transgenik putatif menunjukkan
bahwa tunas yang tumbuh di media seleksi
mengandung gen hpt. Karena gen hpt
difusikan dengan gen Hd3a, maka tanaman
transgenik ini mengandung gen Hd3a. Tunas
transgenik yang mengandung gen Hd3a
berbunga awal, sehingga gen Hd3a
mempunyai
peranan
dalam
memicu
pembungaan.

SARAN
Tanaman
transgenik
perlu
diaklimatisasi hingga menghasilkan biji
generasi T1 untuk analisis segregasi dan
kestabilan transgen, serta ekspresi gen.

DAFTAR PUSTAKA
Chaidamsari T, Samanhudi, Budiani A,
Poerwanto R, Santoso D. 2006.
Ekspresi fenotipe gen APETALAI
kakao
(TcAPI)
pada
eksplan
tembakau. Menara Perkebunan 74(1):
1-9.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan, dan
analisis ekspresi gen penyandi copperzinc superoxide dismutase (CuZnSOD) dari Melastoma malabathricum

L. [Disertasi]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, Eichholtz
D, Rogers SG, Fraley RT. 1985. A
simple and general method
for
transferring genes into plants. Science
227 : 1229-1231.
Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y,
Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M.
2002. Hd3a, a rice ortholog of the
Arabidopsis FT gene, promotes
transition to flowering downstream of
Hd1 under short-day conditions. Plant
Cell Physiol. 43: 1096-1105.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassay
with tobacco tissue cultures. Plant
Physiol 15:473-497.
Orlikowska TK, Cranston HJ, Dyer WE.
1995.
Factor
influencing
Agrobacterium tumefaciens–mediated
transformation and regeneration of the
sunflower cultivar contennial. Plant
Cell Tiss. & Org. Cult.
40: 8591.
Ozawa K. 2009. Establishment of a high
efficiency Agrobacterium mediated
transformation system of rice (Oryza
sativa L.). Plant Science 176: 522527.
Sheng J, Citovsky V. 1996. Agrobacteriumplant cell DNA transport: have
virulence protein, will travel. Plant
cell 8: 1699-1710.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom
kedelai kultivar Slamet. Hayati
9(3):67-70.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi
gen pembungaan Hd3a pada tanaman
Jarak Pagar (Jatropha curcas L.)
[Disertasi].
Bogor:
Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Tamaki S, Matsuo S, Wong HL, Yokoi S,
Shimamoto K . 2007. Hd3a protein is
a mobile flowering signal in rice.
Science 316: 1033–1036.

LAMPIRAN

8

Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige & Skoog 1962)
Bahan
Hara makro

Hara mikro

Vitamin

Sukrosa
pH

NH4NO3
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KNO3
KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
ZnSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
CuSO4.5H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H20
Myo-Inositol
Pyridoxin-HCl
Nicotinic acid
Thiamin-HCl
Glycine

Konsentrasi
(mg/l)
1650
440
370
1900
170
6,2
0,25
0,025
0,83
8,6
22,3
0,025
37,2
27,8
100
0,5
0,5
0,1
2
30 g/l
5,8

9

Lampiran 2 Perhitungan efisiensi transformasi dan jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan

% efisiensi transformasi =

jumlah eksplan menghasilkan tunas transgenik putatif
× 100%
jumlah eksplan total yang ditransformasi

jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan =

jumlah total tunas transgenik putatif
jumlah eksplan yang menghasilkan tunas transgenik putatif

ABSTRAK
LAILA NUR SYAFITRI. Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan Gen Pembungaan
Hd3a dari Padi. Dibimbing oleh SUHARSONO dan SRI KOERNIATI.
Pembungaan adalah salah satu peristiwa penting dalam siklus hidup tanaman tingkat
tinggi dan karakter yang sangat penting untuk menentukan kemampuan spesies beradaptasi pada
berbagai kondisi lingkungan. Gen Hd3a adalah salah satu gen yang berhubungan dengan waktu
pembungaan di padi. Ekspresi berlebih Hd3a menyebabkan pembungaan lebih awal pada padi.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen
Hd3a dari padi. Transformasi genetik dilakukan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens
LBA4404 dengan metode kokultivasi. Seleksi tunas transgenik putatif dilakukan dengan 30 mg/l
higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa proses transformasi N. benthamiana
menghasilkan tunas transgenik putatif dengan nilai efisiensi transformasi cukup tinggi yaitu 86%.
Analisis molekuler dengan PCR terhadap tanaman transgenik putatif menunjukkan bahwa tanaman
tersebut mengandung gen hpt yang bertanggung jawab terhadap resistensi tanaman terhadap
higromisin. Keberadaan bagian gen hpt dalam genom Nicotiana benthamiana transgenik ini juga
menunjukkan keberadaan gen pembungaan Hd3a. Tunas Nicotiana benthamiana transgenik yang
mengandung gen Hd3a berbunga lebih awal, sehingga gen Hd3a mempunyai peranan dalam
memicu pembungaan.

ABSTRACT
LAILA NUR SYAFITRI. Genetic Transformation of Nicotiana benthamiana with Hd3a flowering
gene from rice. Supervised by SUHARSONO and SRI KOERNIATI.
Flowering is one of the fundamental events in the life cycle of many higher plants and is a
very important trait for determining the ability of a species to adapt to various environmental
conditions. Hd3a gene is one gene that is associated with the flowering time in rice.
Overexpression of Hd3a caused early flowering in rice. This research had an objective to
transform genetically Nicotiana benthamiana by Hd3a gene from rice. Genetic transformation was
carried out by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by co-cultivation method. Putative transgenic
shoots were selected by using 30 mg/l hygromycin. The results showed that genetic transformation
of N. benthamiana resulted the putative transgenic shoots with high eficiency i.e 86%. Molecular
analysis by PCR of putative transgenic plants showed that these plants contained hpt genes
responsible for plant resistance to hygromycin. The presence of the hpt gene in the genome of
transgenic Nicotiana benthamiana also indicated the presence of Hd3a flowering gene. The shoot
of transgenic Nicotiana benthamiana containing Hd3a gene had flower very early, so the Hd3a
gene has a role in triggering flowering.

PENDAHULUAN

BAHAN DAN METODE

Latar Belakang
Pembungaan merupakan transisi dari
fase vegetatif ke fase generatif/reproduksi.
Pembungaan adalah salah satu peristiwa
penting dalam siklus hidup tanaman tingkat
tinggi dan karakter yang sangat penting untuk
menentukan kemampuan spesies beradaptasi
pada berbagai kondisi lingkungan. Adapun
faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi
pembungaan
meliputi
panjang
hari
(fotoperiod), suhu, dan ketersediaan air.
Gen Hd3a adalah salah satu gen yang
berhubungan dengan waktu pembungaan.
Gen Hd3a yang berasal dari padi telah
diisolasi oleh Tamaki et al. (2007). Gen ini
menyandi aktivator utama pembungaan pada
padi dalam kondisi hari pendek (Kojima et al.
2002; Tamaki et al. 2007). Selain gen Hd3a,
pada Arabidopsis thaliana dikenal gen
flowering locus T (FT) yang berperan
memacu pembungaan pada tanaman hari
panjang. Berdasarkan percobaan, ekspresi
berlebih (overexpression) Hd3a dan FT
menyebabkan pembungaan lebih awal pada
padi dan juga pembungaan lebih awal pada A.
thaliana. Kemiripan fungsi dan sekuen
menunjukkan bahwa Hd3a merupakan
ortolog dari FT (Kojima et al. 2002).
Transformasi genetik merupakan
perubahan genetik karena adanya DNA asing
yang masuk dan terintegrasi di dalam
kromosom sel (hidup) inang. Transformasi
genetik dilakukan untuk mengintegrasikan
gen ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan tanaman baru yang mampu
mengekspresikan gen tersebut. Salah satu
teknik transformasi genetik yang digunakan
adalah melalui bantuan Agrobacterium
tumefaciens. Teknik transformasi tersebut
merupakan teknik transformasi secara tidak
langsung yang paling sering digunakan.
Teknik ini mempunyai beberapa keunggulan
seperti efisiensi transformasi dengan salinan
gen tunggal lebih tinggi dan dapat dilakukan
dengan
peralatan
laboratorium
yang
sederhana.
Tanaman Nicotiana benthamiana
merupakan tanaman model yang biasa
digunakan untuk menguji peranan suatu gen.

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Agustus 2010 − Mei 2011 di Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research IndonesiaThe Netherlands) dan Biologi Molekular
Seluler
Tanaman,
Pusat
Penelitan
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB
(PPSHB-IPB), Institut Pertanian Bogor.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan
tanaman Nicotiana benthamiana transgenik
yang mengandung Hd3a.

Bahan
Nicotiana
benthamiana
yang
ditumbuhkan secara in vitro digunakan
sebagai bahan tanaman yang di transformasi
secara genetik. Agrobacterium tumefaciens
galur LBA4404 yang mengandung plasmid
pCambia 1300-Hd3a yang membawa gen
Hd3a di bawah kontrol promoter 35S CaMV
(Sulistyaningsih 2012) digunakan untuk
melakukan transformasi genetik. Primer HpF (5’AAGGAATCGGTCAATACACTAC3’)
dan Hp-R (5’ACTATCGGCGAGTACTTC
TACA3’) digunakan untuk menganalisis
keberadaan gen hpt di dalam tanaman
transgenik putatif. Primer Hp-F didesain
berdasarkan urutan nukleotida ke- 416-437
dan primer Hp-R didesain berdasarkan urutan
nukleotida ke- 963-984 dari gen hpt (Hannum
2012). Peta fisik daerah T-DNA disajikan
pada Gambar 1.
L
B

hpt

35S
Pro

Hd3a

35S
Pro

R
B

Gambar 1 Peta fisik daerah T-DNA di dalam
pCambia 1300-Hd3a. LB: left
border, RB: right border, 35S pro:
promoter 35S dari Cauliflower
mosaic virus (CaMV), Hd3a: gen
Hd3a dari padi, hpt: gen resistensi
terhadap higromisin
(Sulistyaningsih 2012).
Metode
Persiapan Tanaman In Vitro
Biji N. benthamiana disterilisasi
dalam laminar air flow dengan cara
merendam biji dalam alkohol 70% selama 2
menit. Selanjutnya biji dicuci menggunakan
aquades steril sebanyak satu kali, lalu
direndam dalam 20% larutan bayclean (atau
1,05% NaClO) selama 5-10 menit. Kemudian
biji dicuci kembali menggunakan aquades
steril sebanyak 3-4 kali. Biji yang sudah
disterilisasi ditanam dalam media dasar

2
Murashige dan Skoog (MS) (Lampiran 1),
yang mengandung 3 g/l phytagel, dan
diletakkan di dalam ruang gelap selama 3
hari, kemudian dipindahkan ke dalam
ruangan bercahaya, suhu 26-27oC. Setelah
biji berkecambah, tunas disubkultur ke botol
kultur dan dipelihara dalam ruang kultur
selama satu bulan.
Penumbuhan Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens galur
LBA4404 yang membawa gen Hd3a di
dalam plasmid pC1300-Hd3a diperbanyak
dengan menumbuhkan satu koloni tunggal di
dalam 10 ml media LB (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) cair yang
mengandung 50 mg/l kanamisin dan 25 mg/l
rifampisin. Biakan digoyang menggunakan
inkubator bergoyang pada suhu ruang selama
semalam (kondisi gelap) hingga OD600
mencapai 0,5-0,8.
Transformasi genetik N. benthamiana
Sebelum melakukan transformasi,
biakan
A.
tumefaciens
diendapkan
menggunakan alat sentrifuse pada kecepatan
5000 rpm selama 10 menit dan endapan
diresuspensi dengan penambahan 10 ml
media Murashige dan Skoog (MS) cair yang
mengandung 0,5 mg/l BAP dan 100 mg/l
asetosiringon hingga OD600 mencapai 0,5-0,8.
Transformasi
dilakukan
dengan
metode
kokultivasi
menggunakan
A.
tumefaciens menurut prosedur Horsch et al.
(1985) yang dimodifikasi. Daun-daun N.
benthamiana yang diperoleh dari kultur in
vitro yang berumur 4 minggu dipotong
menjadi berukuran ± 1 cm2 dan direndam
dalam suspensi A. tumefaciens OD600 0,5-0,8,
digoyang menggunakan inkubator bergoyang
pada suhu ruang selama 10-15 menit.
Selanjutnya eksplan dikeringkan dengan tissu
steril dan ditanam pada media MS padat yang
mengandung 0,5 mg/l BAP, dan 100 mg/l
asetosiringon selama 3 hari di dalam ruang
gelap.
Seleksi, Regenerasi, dan Perbanyakan
Tunas
Setelah 3 hari, eksplan dicuci dengan
aquades steril sebanyak tiga kali dan dengan
larutan 200 mg/l cefotaxime. Eksplan
dikeringkan dengan tissu steril dan
dipindahkan ke media seleksi yaitu media
MS yang mengandung 0,5 mg/l BAP, 30
mg/l higromisin, dan 200 mg/l cefotaxime.
Selanjutnya, eksplan di simpan dalam ruang
kultur pada suhu 26-27oC. Tunas yang

terbentuk dipindahkan ke dalam media MS
yang mengandung 30 mg/l higromisin, dan
200 mg/l cefotaxime hingga tunas menjadi
besar. Eksplan yang menghasilkan tunas
transgenik putatif dihitung untuk mengetahui
efisiensi transformasi. Rumus efisiensi
transformasi disajikan pada Lampiran 2.
Eksplan non transgenik (sebagai
kontrol) yang tidak di kokultivasi dengan A.
tumefaciens diperlakukan dengan metode dan
kondisi yang sama dengan eksplan yang di
kokultivasi dengan A. tumefaciens yang di
tanam pada dua media perlakuan yaitu
mengandung
higromisin
dan
tanpa
higromisin.
Analisis Tanaman Transgenik
Analisis Molekuler
DNA total tanaman diisolasi dari daun
N. benthamiana dengan metode Suharsono
(2002) yang dimodifikasi. Untuk itu, daun
sebanyak 0,1-0,2 g, dipotong-potong,
dimasukkan ke dalam mortar, dan digerus
dengan bantuan nitrogen cair hingga halus.
Bubuk jaringan daun ini kemudian
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang
berisi 600 µl larutan penyangga 2 x CTAB
(2% CTAB, 0,1 M Tris-HCl, 20 mM EDTA,
1,4 M NaCl, pH 8,0) dan 1,2 µl βmercaptoetanol. Suspensi diinkubasikan pada
suhu 65oC selama 30 menit, kemudian
ditambahkan larutan Chloroform:Isoamylalcohol (CI) (24:1) sebanyak 1 x volume
ekstrak. Suspensi dibolak-balik secara
perlahan hingga tercampur merata, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm
(Jouan BR-4i) pada suhu 4oC selama 10
menit. Untuk mendapatkan DNA murni,
cairan bagian atas diambil dan dicampur
dengan larutan Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (PCI) (25:24:1) sebanyak 1 x volume,
dibolak-balik secara perlahan, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm
pada suhu 4oC selama 5 menit. Cairan bagian
atas diambil untuk dipresipitasi (diendapkan)
dengan menambahkan 2 M NaOAC pH 5,2
sebanyak 0,1 x volume dan etanol absolut
(EtOH 100%) sebanyak 2 x volume.
Campuran diinkubasi di freezer selama 30
menit,
kemudian
disentrifugasi
pada
kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC selama
15 menit. Endapan dibilas dengan 500µl
etanol 70%, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC selama
5 menit. Cairan dibuang, lalu pelet
dikeringkan dengan vakum selama ± 30
menit dan disuspensikan dengan ± 20-50 µl
aquades steril. Untuk menghilangkan RNA,

ditambah dengan RNAse (10 µg/µl)
sebanyak 0,1 x volume dan diinkubasikan
pada suhu 37oC selama semalam.
Analisis molekuler untuk mengetahui
keberadaan
gen
hpt
(hygromycin
phosphotransferase) dilakukan dengan PCR
(Polymerase
Chain
Reaction).
PCR
dilakukan dengan total volume 10 µl yang
mengandung 100 ng DNA total (1 µl), 10
pmol primer Hp-F (0,5 µl), 10 pmol primer
Hp-R (0,5 µl), 2 mM dNTP (1 µl), 1 unit taq
polimerase (0,2 µl), 1x buffer (1 µl) dan air
bebas ion (ddH2O) hingga mencapai volume
10 µl. Kondisi PCR adalah pra-PCR 95oC
selama 5 menit, denaturasi 94oC selama 30
detik, annealing (penempelan) 56oC selama
30 detik, extension (pemanjangan) 72oC
selama 1 menit, pasca-PCR 72oC selama 5
menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Hasil PCR kemudian dicek dengan
elektroforesis di gel agarosa 1% dalam
larutan buffer penyangga 1xTAE (40 mM
Tris-acetate, 1 mM EDTA) pada tegangan
100 volt selama 27 menit. Pita DNA pada
agarosa divisualisasi dengan cahaya UV
setelah gel direndam di larutan ethidium
bromida (0,5 µg/ml).
Analisis Fenotipe
Analisis fenotipe dilakukan dengan
pengamatan terhadap munculnya kuncup
bunga pada tunas in vitro.

HASIL
Transformasi
Genetik
Nicotiana
benthamiana
Eksplan N. benthamiana yang telah
dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang
mengandung pC1300-Hd3a yang mampu

(a)

bertahan hidup di dalam media seleksi yang
mengandung 30 mg/l higromisin membentuk
tonjolan kalus mulai minggu ke-2. Pada
minggu ke-4 dan ke-5, eksplan mulai
menghasilkan tunas dari tonjolan kalus
tersebut. Sedangkan eksplan yang tidak
dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang di
tanam di dalam media seleksi yang sama
mengalami kematian dan tidak menghasilkan
tunas (Gambar 2). Eksplan yang mati
menunjukkan tidak mempunyai gen resistensi
terhadap higromisin.
Untuk mengetahui efisiensi media
seleksi, eksplan non transgenik (sebagai
kontrol) yang tidak dikokultivasi dengan A.
tumefaciens yang mengandung pC1300-Hd3a
ditanam di dua media yang berbeda yaitu
media yang mengandung higromisin dan
media tanpa higromisin. Eksplan yang
ditanam pada media yang mengandung
higromisin mengalami kematian dan tidak
mampu menghasilkan tunas, sedangkan
eksplan yang ditanam pada media tanpa
higromisin tumbuh dengan baik dan mampu
menghasilkan tunas (Gambar 3).
Tunas yang tumbuh dari eksplan di
media seleksi adalah tunas transgenik putatif.
Berdasarkan
jumlah
eksplan
yang
menghasilkan tunas transgenik putatif, ratarata efisiensi transformasi pada N.
benthamiana adalah 86% (Tabel 1).
Kemampuan eksplan menghasilkan tunas
dalam media yang mengandung higromisin
dapat
menunjukkan
eksplan
tersebut
mengandung gen hpt yang difusikan dengan
gen Hd3a.
Setiap
eksplan
transforman
menghasilkan jumlah tunas berbeda. Ratarata jumlah tunas transgenik tiap eksplan
berkisar 3 – 4 tunas (Tabel 2).

(b)

Gambar 2 Eksplan pada media seleksi yang mengandung higromisin pada umur 6 minggu setelah
tanam. (a) eksplan yang dikokultivasi dengan A. tumefaciens yang mengandung
pC1300-Hd3a, dan (b) eksplan kontrol (eksplan yang tidak dikokultivasi dengan A.
tumefaciens yang mengandung pC1300-Hd3a).

4

(a)
(b)
Gambar 3 Pengujian eksplan non transgenik sebagai kontrol. Eksplan non transgenik berumur 3
minggu setelah tanam. (a) di media seleksi yang mengandung 30 mg/l higromisin, dan
(b) di media tanpa higromisin.
Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi N. Benthamiana
Jumlah eksplan
Menghasilkan
≠ menghasilkan
tunas transgenik
tunas transgenik
putatif
putatif
25
24
1
28
21
7
Rata-rata efisiensi transformasi

Jumlah eksplan
total yang
ditransformasi

Ulangan
1
2

Efisiensi
transformasi (%)
96%
75%
86%

Tabel 2 Rata-rata jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan
Ulangan

Jumlah eksplan menghasilkan tunas
transgenik putatif

1
2

Jumlah total tunas transgenik
putatif yang dihasilkan

Jumlah
tunas/eksplan

24
89
21
62
Rata-rata jumlah tunas transgenik putatif tiap eksplan

dalam genom N. benthamiana transgenik ini
juga
menunjukkan
keberadaan
gen
pembungaan Hd3a.
Selain analisis molekuler dilakukan
juga
pengamatan
terhadap
fenotipe.
Pengamatan terhadap tunas in vitro
transgenik
saat
proses
regenerasi
memperlihatkan adanya beberapa tunas in
vitro transgenik menghasilkan kuncup bunga.
Terbentuknya kuncup bunga saat masih
dalam tunas in vitro ini tidak ditemukan pada
tunas in vitro non transgenik (Gambar 5).
Begitu pula pada proses tunas menjadi besar
(tanaman utuh) di dalam tabung. Tunas yang
dihasilkan dari proses kokultivasi juga
berbunga lebih cepat dibandingkan tanaman
kontrol non transgenik.

Analisis Tanaman Transgenik
Tanaman transgenik putatif di analisis
secara molekuler melalui PCR dengan
menggunakan primer Hp-F dan Hp-R yang
mengamplifikasi DNA yang berukuran
sekitar 570 pb yang merupakan bagian dari
gen hpt. Dari 12 nomer tanaman transgenik
putatif yang diambil secara acak, analisis
PCR menunjukkan bahwa 12 nomer tanaman
tersebut mengandung gen hpt yang
ditunjukkan oleh adanya pita DNA hasil
amplifikasi yang berukuran sekitar 570 pb.
Ukuran ini sesuai dengan ukuran urutan
nukleotida gen hpt yaitu 569 pb. Analisis
yang sama terhadap tanaman non transgenik
sebagai
kontrol,
tidak
menghasilkan
amplikon (Gambar 4). Keberadaan gen hpt
M

1

2

3

4

5

3.71
2.95
3.33

6

7

8

9

10

11

12

13

14

650 pb
500 pb

Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR dari DNA tanaman transgenik putatif. (M) marker 1 kb
ladder, (1) plasmid mengandung gen Hd3a, (2) tanaman non transgenik (kontrol), dan
(3-14) tanaman transgenik.

a

b

Gambar 5 Pertumbuhan tunas in vitro pada umur 6 minggu setelah tanam. (a) tunas transgenik
yang berbunga, dan (b) tunas non transgenik.

PEMBAHASAN
Nicotiana banyak digunakan sebagai
tanaman model untuk transformasi genetik
karena tanaman ini mudah diregenerasikan,
mudah tumbuh dan berumur relatif pendek.
Chaidamsari et al. (2006) telah menggunakan
N. tabacum untuk menguji ekspresi gen
APETALA1 dari tanaman coklat, sedangkan
penelitian ini menggunakan N. benthamiana
untuk menguji ekspresi gen pembungaan
Hd3a dari tanaman padi.
Regenerasi tanaman pada penelitian
ini dilakukan melalui organogenesis yaitu
pembentukan organ atau tunas langsung dari
eksplan tanpa melalui pembentukan kalus
terlebih dahulu. Eksplan pada penelitian ini
adalah daun. Untuk melakukan proses
transformasi, daun N. benthamiana terlebih
dahulu dilukai dengan dipotong menjadi
beberapa bagian. Pelukaan pada tanaman
akan menyebabkan sel pada bagian tanaman
terluka mengeluarkan senyawa kelompok
fenol
yang
dikenal
dengan
nama
asetosiringon.
Asetosiringon
berperan
menginduksi gen-gen vir yang berfungsi
dalam mentransfer T-DNA ke dalam sel
tanaman dan penambahan asetosiringon
meningkatkan
efisiensi
infeksi
Agrobacterium (Orlikowska et al. 1995),
sehingga dapat meningkatkan jumlah sel
yang transforman. Untuk meningkatkan
efisiensi transformasi, pada penelitian ini
asetosiringon juga ditambahkan dalam media
kokultivasi.
Menurut
Ozawa
(2009),
penggunaan asetosiringon merupakan salah
satu kondisi terbaik yang perlu diciptakan
agar transformasi lebih efe