Variasi Gen Cyt b Mitokondria pada ikan belida

iv

ABSTRAK

EVI ALFIAH TAUKHID. Variasi Gen Cyt b Mitokondria pada Ikan Belida. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan ARIF WIBOWO.

Ikan belida merupakan ikan air tawar, famili Notopteridae yang tersebar di India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand dan Indonesia bagian barat. Ikan ini sangat populer untuk konsumsi dan ikan hias, sebagai salah satu ikan air tawar yang dilindungi, studi ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi, karena penyebarannya di laut yang tidak mudah dan garis evolusinya berkaitan dengan sejarah geologis. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi runutan nukleotida gen cyt b ikan belida asal Kalimantan (Sungai Mahakam) dan Sumatera (Sungai Indragiri) sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya. Ikan belida sebanyak 38 sampel diambil dari dua sungai, sembilan sampel dari Sungai Mahakam dan 29 sampel dari Sungai Indragiri. Amplifikasi gen cyt b berhasil pada tujuh sampel (KALTIM02, TU02, TU06, TU07, KCO001, KCO005, dan PP03). Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter berdasarkan dua basa pertama setiap kodon serta asam amino. Topografi keduanya menunjukkan bahwa enam sampel berada pada kelompok yang sama dengan Chitala lopis, sedangkan satu sampel dari Sungai Indragiri terpisah dari sampel lain. Keragaman paling tinggi terdapat di Sungai Indragiri dan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Sungai Mahakam.

ABSTRACT

EVI ALFIAH TAUKHID. Variation of Mitochondrial Cyt b Gene in Knife Fish. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and ARIF WIBOWO.

Knife fish is freshwater fish belonging to the Notopteridae famili distributed across India, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Thailand and western part of Indonesia. This fish is very popular for consumption and ornamental fish. Studies of freshwater fishes, especially in the protected freshwater fish form is an important aspect of biogeographical studies, because they do not disperse easily through saltwater areas, and thus their evolution may be tightly linked to the geological histories. This study aimed to analyze cyt b gene sequence variation of knife fish from the Mahakam River (Borneo) and Indragiri River (Sumatra) as a base for studying their population and phylogenetic position. Samples of 38 fish samples taken from two rivers, nine samples from the Mahakam River and 29 samples from the Indragiri River. Cyt b gene amplification succeeded in seven samples (KALTIM02, TU02, TU06, TU07, KCO001, KCO005, dan PP03). Phylogeny analysis performed using Kimura-2-parameter based on the first two bases of each codon and amino acid. Both topography show that six samples are in the same clade with Chitala lopis, whereas one sample of the Indragiri River separate from the other. The knife fish from Indragiri River have higher diversity than Mahakam River and closest intrapopulation relationship found in Mahakam River population.

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae. Anggota Notopteridae yang menyebar di Asia adalah dari genus Chitala dan Notopterus (Lampiran 1). Daerah persebaran ikan belida dari genus Chitala meliputi India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand, dan Indonesia (Jawa, Sumatera, dan Kalimantan) (Inoue et al. 2009).

Ikan belida atau ikan pipih mempunyai mulut lebar dan kepala kecil. Bentuk tubuhnya seperti pisau, punggung meninggi dengan bagian perut yang tampak lebar dan pipih. Sirip anal menyambung dengan sirip ekor berawal tepat di belakang sirip perut dan dihubungkan dengan sisik-sisik kecil. Betina memiliki sirip perut relatif pendek dan tidak menutup bagian urogenital, alat kelamin berbentuk bulat. Jantan memiliki sirip perut lebih panjang dan menutup bagian urogenital, alat kelamin berbentuk tabung, ukurannya lebih kecil daripada betina. Ukuran ikan bervariasi dari 15-90 cm.

Di Sumatera Selatan, ikan belida digunakan sebagai maskot yang sering dijadikan bahan pembuatan makanan khas. Hal ini karena daging ikan belida yang memiliki kandungan lemak yang tinggi sehingga mempunyai rasa yang gurih (Sunarno 2002), berserat lembut, renyah, dan tidak amis. Selain sebagai bahan makanan, ikan belida sering kali dijadikan sebagai ikan hias karena mempunyai bentuk kepala dan variasi warna yang menarik, dan juga mudah dipelihara (Wibowo et al. 2006).

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Ikan ini termasuk langka karena sulitnya proses pemijahan, eksploitasi yang berlebih dan introduksi ikan asing ke dalam habitat asalnya. Dibandingkan dengan jenis ikan lainnya, belida lebih sulit berkembang karena hanya mampu memproduksi telur sebanyak 5% dari berat tubuhnya. Saat ini, ikan belida sudah termasuk ke dalam ikan air tawar yang dilindungi. Menurut Peraturan Pemerintah nomor 7 tanggal 27 Januari 1999 tentang Jenis-jenis Tumbuhan dan Satwa yang dilindungi, salah satu jenis ikan yang masuk di dalamnya adalah semua jenis dari genus Notopterus.

Sebagai salah satu penggerak ekonomi masyarakat yang berbasis sumber daya alam, maka berbagai upaya untuk mempelajari populasi ikan belida harus dilakukan. Salah

satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah dengan mengumpulkan informasi morfologi maupun genetiknya. Informasi genetik antara lain didapatkan dengan melakukan karakterisasi gen cyt b dalam genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutan yang terkait dengan populasi belida. Selain itu, studi mengenai ikan belida dan ikan air tawar lainnya memiliki aspek penting dari sisi biogeografi. Dengan begitu, pola persebaran ikan belida pada saat ini merupakan cerminan dari sejarah geologis (Inoue et al. 2009; Lundberg 1993). Penelitian Lavoué dan Sullivana (2004) yang menggunakan penanda molekular cyt b menyatakan bahwa Notopterus notopterus membentuk satu klad dengan Chitala ornata. Berdasarkan genom mitokondria dari 10 Osteglossomorphs, klad N. notopterus dari Thailand dan India berkerabat lebih dekat dengan Chitala lopis dibandingkan dengan Chitala blanci dan Chitala ornata.

Gen cyt b merupakan gen yang paling sering digunakan dalam analisis filogenetik hewan. Kebanyakan gen cyt b digunakan untuk membuat status sebagai “universal metric”, artinya studi dapat dibandingkan dengan mudah (Irwin et al. 1991). Gen cyt b biasanya digunakan untuk menduga komposisi dasar, laju variasi di antara keturunan, kejenuhan tiga posisi kodon, serta informasi mengenai filogenetik (Meyer 1994). Genom mitokondria vertebrata berbentuk sirkular yang terdiri atas 13 gen penyandi protein, 2 gen penyandi rRNA, 22 gen penyandi tRNA, dan satu ruas tidak menyandikan yang dikenal sebagai d-loop atau ruas pengontrol (control region). Selain itu, genom mitokondria diwariskan secara uniparental. Beberapa gen genom mitokondria seringkali digunakan untuk mempelajari berbagai fenomena populasi, baik intraspesies maupun interspesies (Solihin 1994).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi runutan nukleotida gen cyt b dalam genom mitokondria ikan belida anggota famili Notopteridae sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Agustus 2010. Pengambilan sampel dilakukan di Sungai Mahakam dan Indragiri. Analisis DNA dilakukan di bagian Fungsi

2

Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 38 sampel darah ikan belida yang diambil dari Sungai Mahakam (Kalimantan), dan Sungai Indragiri (Sumatera). Sampel-sampel tersebut merupakan koleksi Bapak Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai Riset Perikanan Perairan Umum, Palembang.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dari darah menggunakan Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid) yang dimodifikasi. Modifikasi dilakukan untuk mencuci alkohol sebagai pengawet sampel agar tidak mengganggu proses-proses berikutnya. Pencucian dilakukan dengan cara mengendapkan sampel dan merendamnya dalam bufer TE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0), kemudian sel-sel darah dilisis dengan sodium duodesil sulfat 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oC selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid).

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria

menggunakan pasangan primer W8 (5’ -TGA-TAT-GAA-AAA-CCA-TCG-TTG) dan W7

(5’-CTT-CGA-TCT-TCG-RTT-TAC-AAG) (Lavoue´ dan Sullivana 2004). Pasangan primer ini mengapit ruas gen cyt b sepanjang 1236 bp mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dibandingkan ke genom mitokondria Chitala lopis (GeneBank Accession number AP008922). Komposisi reaksi PCR dalam volume akhir 50 µ l terdiri atas sampel DNA sekitar 10-100 ng, primer masing-masing 2 µM dan Taq ready mix 25 µ l (enzim polimerase 0.05 unit/µ l, bufer dengan Mg2+ 25 mM, dNTP 0.4 mM). Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler BIOER dengan kondisi tahap pradenaturasi 95°C selama 10 menit, tahap berikutnya terdiri atas 35 siklus masing-masing mencakup tahap denaturasi 94°C selama satu menit, penempelan primer 42°C selama satu menit, pemanjangan 72°C selama 1.5 menit, dan tahap terakhir adalah pemanjangan akhir 72°C selama 7 menit.

Produk PCR diuji menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 6% dalam bufer TBE 1x (Tris-HCL 10 mM, asam borat 1 M, dan EDTA 0.1 mM) yang dijalankan pada kondisi 200 mV selama 30 menit, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstorm 1986).

Perunutan Produk PCR

Pada kondisi reaksi PCR dengan suhu penempelan sangat rendah, maka diperoleh banyak amplikon non-spesifik. Jika ditemukan ada amplikon yang berukuran sekitar 1236 bp maka amplikon tersebut dipotong kemudian dimurnikan dengan metode agarose-gel-cutting yang diikuti dengan spin-coloumn DNA extaraction from gel. Amplikon yang sudah dimurnikan dijadikan cetakan dalam PCR untuk perunutan DNA menggunakan bigdye cycle sequencing kits (Applied Biosystem) dan primer yang sama dengan amplifikasi awal.

Analisis DNA

Hasil perunutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual berdasarkan kromatogram mesin perunut DNA. Runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan menggunakan program Clustal W yang tertanam dalam MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007) dengan melibatkan beberapa runutan gen cyt b anggota famili Notopteridae, yaitu C. blanci (AP008921), C. lopis (AP008922), C. ornata (AP008923), N. notopterus (AP008924). Hasil pensejajaran kemudian diedit ulang secara manual berdasarkan triplet kodon.

Deskripsi perbandingan runutan nukelotida dan analisis filogeni Neighbor Joining (NJ) dilakukan menggunakan MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007) berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter dengan bootstrap 1000x.

HASIL

Amplifikasi Gen Cyt b Ikan Belida

Gen cyt b yang menjadi target amplifikasi menggunakan pasangan primer W8 dan W7 berukuran sekitar 1200 bp. Amplikon dengan ukuran 1200 bp hanya bisa muncul pada kondisi PCR dengan suhu penempelan serendah 42oC. Jika suhu penempelan dinaikkan, pita DNA target tidak teramplifikasi. Primer W8-W7 menunjukkan fragmen DNA multiband karena spesifitasnya kurang dari 100% (Gambar 1). Primer yang disejajarkan dengan empat spesies Genebank

secara keseluruhan, primer W8 sebagai forward dengan 21 basa, hanya menempel pada 14 basa dan primer W7 sebagai reverse dengan 21 basa, hanya menempel pada 16 basa, sehingga diperoleh nilai identitas masing-masing 67% dan 76%. Dari 38 sampel yang diamplifikasi, pita DNA target berhasil ditemukan pada tujuh sampel (Gambar 2). Setelah DNA target dimurnikan, kemudian dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing maka diperoleh 7 sampel yang menunjukkan kromatogram yang bisa dibaca dengan jelas. Ketujuh sampel tersebut adalah KALTIM02, TU02, TU06, TU07 (Sungai Mahakam), KCO001, KCO005, dan PP03 (Sungai Indragiri). Lima sampel sisanya (KALTIM03, KCO002, PB02, PB34, dan TP04) tidak menghasilkan amplikon yang sesuai dengan target ukuran atau intensitas amplikon yang muncul di atas gel poliakrilamid terlalu tipis.

Analisis Keragaman Nukleotida

Tujuh runutan DNA ikan belida yang diperoleh kemudian saling disejajarkan dengan ruas mtDNA yang homolog dari C. blanci (AP008921), C. lopis (AP008922), C. ornata (AP008923), N. notopterus (AP008924). Dari hasil pensejajaran, diperoleh panjang ruas DNA sebesar 830 nt yang homolog ruas gen Cyt b dengan posisi 14666–15495 (Lampiran 2). Dari 830 nt, ditemukan ada 623 nt sama untuk semua sampel. Dari 207 nt nukleotida yang berbeda, 109 nukleotida ditemukan berbeda minimal pada dua sampel sedangkan 98 nukleotida ditemukan berbeda hanya pada satu sampel (Lampiran 3). Selain itu, setelah ruas gen cyt b diterjemahkan ke polipeptida menggunakan The Vertebrate Mitochondrial Code diperoleh polipeptida yang tersusun atas 276 asam amino. Rata-rata komposisi nukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A=30.2%; T=26.9%; G=13.3%; C=29.6%.

Jarak genetik antar sampel dibandingkan dengan sampel spesies yang ada di Genebank berdasarkan basa pertama dan kedua dengan model substitusi K2P (Tabel 1) menghasilkan nilai rata-rata sebesar 0.035. Jarak genetik tertinggi sebesar 0.059 ditemukan antara KCO001 dengan N. notopterus dengan 113 nt

yang berbeda, serta jarak genetik terendah sebesar 0.000 antara PP03 dengan C. lopis serta TU02 dengan TU07 yang berarti tidak ada perbedaan nukleotida. Rata-rata jarak genetik keseluruhan antara Sungai Mahakam, dan Indragiri (interpopulasi) adalah 0.026; dan rata-rata jarak genetik intrapopulasi Sungai Mahakam dan Indragiri berturut adalah 0.002 dan 0.033.

Rata-rata keragaman seluruh populasi sampel berdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.05. Jika runutan nukleotida pembanding ikut dianalisis, rasio transisi terhadap transversi (Tabel 1) yang terkecil yaitu 0.0 ditemukan antara KCO005 dengan PP03 dan KCO005 dengan C. lopis, sedangkan yang terbesar yaitu 19.5 ditemukan antaraPP03 dengan TU06 dan TU06 dengan C. lopis.

Analisis Filogeni

Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ, ME, dan MP untuk nukleotida menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan metode Poisson Correction untuk data asam amino (b) dari tujuh sampel dan empat spesies pembanding (Gambar 3). Topologi keduanya mengelompokkan struktur populasi berdasarkan mtDNA ini setidaknya membagi populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam dan Indragiri menjadi dua kelompok. Kelompok I menunjukkan bahwa sampel KALTIM02, TU02, TU06, TU07, dan C. lopis berada pada klad yang sama. Kelompok II merupakan spesies-spesies lain dari Notopteridae, yaitu N. Notopterus, C. ornata, C. blanci.

Sampel yang berasal dari Sungai Mahakam berada pada satu bagian yang sama dalam kelompok I, sampel dari Sungai Indragiri berada pada bagian yang sama dengan spesies dari Genebank (C. lopis), kecuali sampel KCO001. Jarak evolusi pada sampel KCO001 lebih besar dibandingkan dengan sampel lainnya, ditunjukkan dengan lengan percabangannya yang lebih panjang dan terpisah dari kelompoknya serta berada pada klad yang berbeda dari sampel yang lain.

Gambar 1Spesifitas primer universal dibandingkan dengan perbedaan keseluruhan spesies yang ada di Genebank

4

Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan empat spesies pembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) Menggunakan metode NJ (angka cetak tebal), ME (angka dengan garis bawah), MP (angka italik) dan asam amino (b) Pada ruas gen cyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x.

Tabel 1 Jarak genetik (bawah diagonal) dan rasio transisi terhadap transversi (atas diagonal) antara tujuh sampel dan empat spesies anggota Notopteridae dari Genebank

No. Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1. KALTIM02 7.3 9.8 13.0 1.0 2.0 1.0 5.9 13.0 7.7 2.6

2. KCO001 0.049 6.4 8.8 8.1 6.6 6.0 4.2 8.8 5.1 2.2

3. KCO005 0.033 0.049 0.0 12.7 13.0 9.3 5.2 0.0 6.5 2.5

4. PP03 0.032 0.043 0.005 19.0 19.5 12.3 6.5 - 8.6 2.5

5. TU02 0.002 0.047 0.032 0.030 0.5 0.3 5.4 19.0 6.9 2.5

6. TU06 0.004 0.049 0.033 0.032 0.002 2.0 6.4 19.5 8.5 2.5

7. TU07 0.002 0.047 0.032 0.030 0.000 0.002 5.9 12.3 7.5 2.4

8. C. blanci 0.051 0.051 0.051 0.045 0.049 0.051 0.049 6.5 8.4 2.4

9. C. lopis 0.032 0.043 0.005 0.000 0.030 0.032 0.030 0.045 8.6 2.5

10. C. ornate 0.045 0.037 0.045 0.041 0.043 0.045 0.043 0.030 0.041 3.2

11. N. notopterus 0.047 0.059 0.043 0.041 0.045 0.047 0.045 0.037 0.041 0.037

Gambar 2 Produk PCR hasil running pada PAGE 6% dengan target sekitar 1200 bp; Keterangan: 1. KCO001 2. KCO005 3. PP03 4. KALTIM02 5. TU02 6. TU06 7. TU07.

PEMBAHASAN

Hasil amplifikasi gen cyt b dengan menggunakan pasangan primer W8-W7 selalu diperoleh amplikon yang tidak spesifik (unspecific PCR products). Pita multiband yang dihasilkan dari amplifikasi fragmen DNA target diduga disebabkan oleh spesifisitas primer. Spesifitas primer adalah ukuran ketepatan primer menempel pada DNA target.

Spesifitas primer terhadap genom pada beberapa spesies berkisar antara 66-86% terhadap runutan nukleotida genom mtDNA pada beberapa spesies pembanding. Primer yang digunakan merupakan primer universal untuk gen cyt b sehingga primer tidak 100% menempel pada gen target (Lavoue´ S dan Sullivana 2004). Selain masalah primer yang digunakan, ketidakberhasilan PCR juga dapat terjadi akibat kualitas sampel DNA dan pereaksi PCR lainnya. Walaupun begitu, ukuran amplikon yang sesuai dengan desain primer kemudian dipotong setelah dipisahkan menggunakan metode gel extraction-spin coloumn.

Jarak genetik merupakan nilai kekerabatan yang diukur dari jumlah mutasi nukleotida dan dianalisis berdasarkan dua basa pertama setiap kodon untuk ruas gen yang menyandikan mRNA. Jarak genetik antar populasi lokal spesies yang diperoleh dari Sungai Mahakam dan Indragiri yang dibandingkan dengan spesies lainnya. Dilihat dari tingkat kesamaan dengan sampel yang lain, ada peluang bahwa sampel KCO001 bukan C. lopis. Dari topografi, dapat dilihat bahwa sampel KCO001 memiliki jarak evolusi lebih besar, karena terpisah dengan sampel lainnya yang berada dalam satu kelompok dan bagian yang sama dengan spesies dari Genebank (C. lopis). Hal ini dapat dijelaskan oleh pernyataan Iguchi et al. (1999) bahwa isolasi perbedaan jarak merupakan salah satu faktor yang dipertimbangkan akan mempengaruhi laju penghanyutan gen antara lokasi yang terpisah dan pada akhirnya akan mengakibatkan meningkatnya perbedaan genetik. Alikodra (2002) menjelaskan bahwa fluktuasi permukaan laut dan iklim mengisolasi satuan-satuan daratan dari sesamanya. Hal ini menjadi keadaan yang ideal bagi pembentukan spesies baru akibat fragmentasi habitat.

Populasi yang bermukim di pulau tertentu pada suatu saat memperoleh kembali hubungan gen dengan populasi daratan utama.

Beberapa diantaranya, merupakan spesies-spesies yang masih memiliki gen yang sama. Walaupun demikian, banyak diantara populasi lainnya telah cukup terpisah sehingga tidak dapat melakukan perkembangbiakan silang dengan individu-individu di daratan utama. Hal ini terjadi karena banyak penghalang reproduktif sehingga anggota populasi yang bersangkutan telah menjadi spesies baru.

Transisi merupakan substitusi basa purin (A atau G) dengan basa purin yang berbeda atau substitusi basa pirimidin (C atau T) dengan basa pirimidin yang berbeda, sedangkan transversi adalah substitusi basa purin dengan basa pirimidin atau sebaliknya. Substitusi nukleotida pada protein coding region yang menghasilkan kodon berbeda tetapi penyusun protein yang sama disebut dengan substitusi sinonim, sedangkan apabila menghasilkan kodon berbeda dan menyusun protein yang berbeda pula maka disebut substitusi nonsinonim. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basa ke-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar dan Nei 2000).

Rata-rata keragaman seluruh populasi sampel relatif rendah yaitu 0.05. Rendahnya nilai keragaman tersebut dapat disebabkan karena populasi terisolasi dan tidak ada aliran gen yang masuk. Pada populasi yang kecil dan terisolasi variasi genetik akan turun secara drastis. Penurunan tersebut dapat terjadi karena adanya perkawinan antar kerabat dekat (Maes dan Volckaert 2007).

Hasil Penelitian Madang (1999) pada ikan belida yang diperoleh dari Sungai Sunur, Kelekar, dan Lematang diperoleh data jarak genetik terendah 0.008 pada Sungai Sunur dengan Kelekar dan jarak genetik tertinggi 0.948 pada Sungai Kelekar dengan Lematang. Dari kedekatan jarak genetik menunjukkan bahwa populasi ikan belida dari Sungai Sunur dengan Kelekar memiliki kekerabatan yang lebih erat dibandingkan dengan populasi dari Sungai Lematang. Hal tersebut disebabkan adanya kedekatan jarak geografi antara Sungai Sunur dengan Kelekar, sehingga masih memungkinkan terjadinya aliran gen dibandingkan dengan Sungai Lematang.

Pada ikan belida yang diambil dari Sungai Kampar (Fatimah 2010), diperoleh hasil kekerabatan paling erat hingga paling rendah ialah antara Langgam dengan Rantau Baru, Waduk kuto Panjang dengan Rantau Baru, dan Waduk Kuto Panjang dengan Langgam. Diduga bahwa populasi langgam dan Rantau Baru berasal dari induk yang sama. Semakin

6

ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besar karena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka. Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman jenis ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996).

Hasil dari kedua penelitian tersebut menunjukkan bahwa kekerabatan individu dalam satu aliran sungai memungkinkan perpindahan individu dari satu tempat ke tempat lain. Menurut Sarre (1995), adanya tipe haplotipe yang konsisten menunjukkan populasi tersebut tidak terganggu akibat efek jarak geografi yang menimbulkan tingginya tingkat keragaman.

Adanya hubungan positif antara kekayaan jenis dengan suatu area yang ditempati tergantung pada dua faktor. Pertama, peningkatan jumlah mikro habitat akan dapat meningkatkan keragaman. Kedua, area yang lebih luas sering memiliki variasi habitat yang lebih besar dibanding dengan area yang lebih sempit (Yustina 2001). Keanekaragaman dan kelimpahan ikan juga ditentukan oleh karakteristik habitat perairan. Karakteristik habitat di sungai sangat dipengaruhi oleh kecepatan aliran sungai. Kecepatan aliran tersebut ditentukan oleh perbedaan kemiringan sungai, keberadaan hutan atau tumbuhan di sepanjang daerah aliran sungai yang akan berasosiasi dengan keberadaan hewan-hewan penghuninya (Yustina 2001).

Nilai rata-rata keseluruhan jarak genetik antara Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri menunjukkan bahwa populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam lebih berkerabat dibandingkan dengan populasi ikan belida dari Sungai Indragiri yang memiliki nilai rata-rata jarak genetik cukup tinggi. Bahagiawati et al. (2006) melaporkan bahwa laju migrasi yang rendah menyebabkan populasi lokal berkembang secara lebih bebas dari populasi lokal lainnya dan terjadi pergeseran genetik. Terbatasnya ruang gerak individu-individu dalam populasi akibat adanya penghalang tertentu menyebabkan keterbatasan interaksi. Kondisi seperti ini jika berlangsung cukup lama bisa berujung pada terbentuknya adaptasi lokal pada sub-sub populasi yang terpisah, akibatnya kelompok kecil ini akan memiliki karakter genetik yang berbeda dengan kelompok asalnya.

Pola penyebaran ikan belida sangat berkaitan erat dengan arus. Sebagai predator air tawar, ikan belida hidup di habitat sungai dan daerah yang sering tergenang banjir. Hidupnya di dataran rendah dengan ketinggian tidak lebih dari 30 mdpl

(Widyastuti 1993). Ditegaskan pula oleh Sjafei et al. (1989) bahwa ikan ini merupakan contoh ikan yang berdistribusi di dataran rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi distribusi ikan air tawar adalah faktor fisik yang meliputi suhu, derajat fluktuasi air, gradien, urutan aliran, dan turbiditas; faktor kimia yang meliputi oksigen terlarut, pH, senyawa nitrogen, klorinitas, dan salinitas; serta faktor biologi yang meliputi hubungan predator dan mangsa, kompetisi, dan simbiosis.

SIMPULAN

Keragaman genetik dan hubungan filogeni berdasarkan gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari Sungai Mahakam; Kalimantan dan Sungai Indragiri; Sumatera berada dalam kelompok yang sama dengan Chitala lopis, kecuali sampel KCO001 yang berasal dari Sungai Indragiri. Kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Sungai Mahakam.

SARAN

Dibutuhkan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen pada mtDNA selain gen cyt b dan pengambilan sampel dari berbagai populasi yang berbeda dari Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri untuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C. lopis.

DAFTAR PUSTAKA

Alikodra HS. 2002. Pengelolaan Satwa Liar. Yayasan Penerbit Fakultas Kehutanan IPB. Bogor. Hal 38-83.

Bahagiawati B, Damayanti, Nurindah, Rizjaani, Dwinita WU, Sahari B, Sari A. 2006. Struktur populasi (Trichogrammatoidea armigera). J Agro Biogen. 2: 52-58.

Fatimah RAS. 2010. Karakterisasi genom Mitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Haryono. 2008. Potensi ikan belida dan upaya konservasinya. Fauna Indonesia. 8: 5-8. Iguchi K, Tanimura Y, Takeshima H, Nishida

M. 1999. Genetic variation and geographic population structure of amphidromous ayu Plecoglossus altivelis as examined by mitochondrial DNA sequencing. J Fisheries Science 65:63-67.

ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besar karena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka. Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman jenis ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996).

Hasil dari kedua penelitian tersebut menunjukkan bahwa kekerabatan individu dalam satu aliran sungai memungkinkan perpindahan individu dari satu tempat ke tempat lain. Menurut Sarre (1995), adanya tipe haplotipe yang konsisten menunjukkan populasi tersebut tidak terganggu akibat efek jarak geografi yang menimbulkan tingginya tingkat keragaman.

Adanya hubungan positif antara kekayaan jenis dengan suatu area yang ditempati tergantung pada dua faktor. Pertama, peningkatan jumlah mikro habitat akan dapat meningkatkan keragaman. Kedua, area yang lebih luas sering memiliki variasi habitat yang lebih besar dibanding dengan area yang lebih sempit (Yustina 2001). Keanekaragaman dan kelimpahan ikan juga ditentukan oleh karakteristik habitat perairan. Karakteristik habitat di sungai sangat dipengaruhi oleh kecepatan aliran sungai. Kecepatan aliran tersebut ditentukan oleh perbedaan kemiringan sungai, keberadaan hutan atau tumbuhan di sepanjang daerah aliran sungai yang akan berasosiasi dengan keberadaan hewan-hewan penghuninya (Yustina 2001).

Nilai rata-rata keseluruhan jarak genetik antara Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri menunjukkan bahwa populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam lebih berkerabat dibandingkan dengan populasi ikan belida dari Sungai Indragiri yang memiliki nilai rata-rata jarak genetik cukup tinggi. Bahagiawati et al. (2006) melaporkan bahwa laju migrasi yang rendah menyebabkan populasi lokal berkembang secara lebih bebas dari populasi lokal lainnya dan terjadi pergeseran genetik. Terbatasnya ruang gerak individu-individu dalam populasi akibat adanya penghalang tertentu menyebabkan keterbatasan interaksi. Kondisi seperti ini jika berlangsung cukup lama bisa berujung pada terbentuknya adaptasi lokal pada sub-sub populasi yang terpisah, akibatnya kelompok kecil ini akan memiliki karakter genetik yang berbeda dengan kelompok asalnya.

Pola penyebaran ikan belida sangat berkaitan erat dengan arus. Sebagai predator air tawar, ikan belida hidup di habitat sungai dan daerah yang sering tergenang banjir. Hidupnya di dataran rendah dengan ketinggian tidak lebih dari 30 mdpl

(Widyastuti 1993). Ditegaskan pula oleh Sjafei et al. (1989) bahwa ikan ini merupakan contoh ikan yang berdistribusi di dataran rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi distribusi ikan air tawar adalah faktor fisik yang meliputi suhu, derajat fluktuasi air, gradien, urutan aliran, dan turbiditas; faktor kimia yang meliputi oksigen terlarut, pH, senyawa nitrogen, klorinitas, dan salinitas; serta faktor biologi yang meliputi hubungan predator dan mangsa, kompetisi, dan simbiosis.

SIMPULAN

Keragaman genetik dan hubungan filogeni berdasarkan gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari Sungai Mahakam; Kalimantan dan Sungai Indragiri; Sumatera berada dalam kelompok yang sama dengan Chitala lopis, kecuali sampel KCO001 yang berasal dari Sungai Indragiri. Kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Sungai Mahakam.

SARAN

Dibutuhkan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen pada mtDNA selain gen cyt b dan pengambilan sampel dari berbagai populasi yang berbeda dari Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri untuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C. lopis.

DAFTAR PUSTAKA

Alikodra HS. 2002. Pengelolaan Satwa Liar. Yayasan Penerbit Fakultas Kehutanan IPB. Bogor. Hal 38-83.

Bahagiawati B, Damayanti, Nurindah, Rizjaani, Dwinita WU, Sahari B, Sari A. 2006. Struktur populasi (Trichogrammatoidea armigera). J Agro Biogen. 2: 52-58.

Fatimah RAS. 2010. Karakterisasi genom Mitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Haryono. 2008. Potensi ikan belida dan upaya konservasinya. Fauna Indonesia. 8: 5-8. Iguchi K, Tanimura Y, Takeshima H, Nishida

M. 1999. Genetic variation and geographic population structure of amphidromous ayu Plecoglossus altivelis as examined by mitochondrial DNA sequencing. J Fisheries Science 65:63-67.

VARIASI GEN CYT B MITOKONDRIA PADA IKAN BELIDA

EVI ALFIAH TAUKHID

G34062381

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Inoue JG, Kumazawa Y, Miya M ,Nishida M. 2009. The historical biogeography of the freshwater knifefishes using mitogenomic approaches: A mesozoic origin of the Asian Notopterids (Actinopterygii: Osteoglossomorpha). Mol Phyl and Evol 51:486–499.

Irwin DM, Kocher TD, Wilson AC. 1991. Evolution of the cytochrome b gene of mammals. J. Mol. Evol. 32: 128-144. Kottelat M, Whitten JA, Wirjoatmodjo S,

Kartikasari SN. 1996. Freshwater Fishes of Western Indonesia and Sulawesi. Jakarta: Periplus Edition Ltd.Kumar S, Nei M. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press.

Kumar S, Dudley J, Nei M, Tamura K. 2008. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9:299-306.

Lavoue´ S, Sullivana JP. 2004. Simultaneous analysis of five molecular markers provides a well-supported phylogenetic hypothesis for the living bony-tongue fishes (Osteoglossomorpha: Teleostei). Molecular Phylogenetics and Evolution 33: 171–185.

Lundberg JG. 1993. African-South American Freshwater Fish Clades and Continental Drift: Problems with Paradigm. Di dalam: Goldblatt P, editor. Biological relationship between Africa and South America. New Haven: Yale University Press. hlm 156-159.

Madang K. 1999. Morfologi Habitat dan Keragaman Genetik Kerabat Ikan Belida di Perairan Sumatera Selatan [tesis]. Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Maes GE, Volckaert FAMJ. 2007. Challenges for genetic research in European eel management ICES J. Mar. Sci./J. Cons. int. Explor. Mer 67: 1463-1471.

Meyer A. 1994. Shortcomings of the cytochrome b gene as a molecular marker. Trends Ecol. Evol. 9:278-280.

Sarre S. 1995. Mitochondrial DNA variation among population of Oedurareticulate (Gekkonidae) in remnant vegetation: implications formetapopulation structure and population decline. Molecular Ecology. 4: 395-405.

Sjafei S, Rahardjo MF, Affandi R, Brodjo M. 1989. Sistematika Ikan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Pusat Antar

Universitas Ilmu Hayat, Institut Pertanian Bogor.

Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik dan biologi populasi pada hewan. J Hayati 1:1-4.

Sunarno MTD. 2002. Selamatkan plasma nutfah ikan belida. Warta Penelitian Perikanan Indonesia. 8(4): 2-6.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 10.1093/molbev/msm092.

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural populations: an improve routine for the screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Elecytrophoresis 7:226-229.

Wibowo A, Sunarno MTD, Makmur S, Subagja, Muflikhah N. 2006. Ikan Belida (Chitala lopis) Potensinya Sebagai Ikan Hias Unggulan dan Berbagai Hambatan Pengembangannya. Palembang: Balai Riset Perikanan Perairan Umum.

Widyastuti YE. 1993. Flora-Fauna Maskot Nasional dan Propinsi. Penebar Swadaya: Jakarta.

Yustina. 2001. Keanekaragaman jenis ikan di sepanjang perairan Sungai Rangau, Riau Sumatera. J. Nat. Indonesia. 4: 1-14.

VARIASI GEN CYT B MITOKONDRIA PADA IKAN BELIDA

EVI ALFIAH TAUKHID

G34062381

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

VARIASI GEN CYT B MITOKONDRIA PADA IKAN BELIDA

EVI ALFIAH TAUKHID

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Pada Fakultas Matematika dan IPA

Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

iii

Judul Skripsi

: Variasi Gen Cyt b Mitokondriapada Ikan Belida

Nama

: Evi Alfiah Taukhid

NRP

: G34062381

Menyetujui:

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si.

Arif Wibowo, SP. M.Si.

NIP. 19650427 199002 1 002

NIP.19770226 200312 1 002

Mengetahui:

Ketua Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena

NIP. 19641002 198903 1 002

ABSTRAK

EVI ALFIAH TAUKHID. Variasi Gen Cyt b Mitokondria pada Ikan Belida. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan ARIF WIBOWO.

Ikan belida merupakan ikan air tawar, famili Notopteridae yang tersebar di India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand dan Indonesia bagian barat. Ikan ini sangat populer untuk konsumsi dan ikan hias, sebagai salah satu ikan air tawar yang dilindungi, studi ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi, karena penyebarannya di laut yang tidak mudah dan garis evolusinya berkaitan dengan sejarah geologis. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi runutan nukleotida gen cyt b ikan belida asal Kalimantan (Sungai Mahakam) dan Sumatera (Sungai Indragiri) sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya. Ikan belida sebanyak 38 sampel diambil dari dua sungai, sembilan sampel dari Sungai Mahakam dan 29 sampel dari Sungai Indragiri. Amplifikasi gen cyt b berhasil pada tujuh sampel (KALTIM02, TU02, TU06, TU07, KCO001, KCO005, dan PP03). Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter berdasarkan dua basa pertama setiap kodon serta asam amino. Topografi keduanya menunjukkan bahwa enam sampel berada pada kelompok yang sama dengan Chitala lopis, sedangkan satu sampel dari Sungai Indragiri terpisah dari sampel lain. Keragaman paling tinggi terdapat di Sungai Indragiri dan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Sungai Mahakam.

ABSTRACT

EVI ALFIAH TAUKHID. Variation of Mitochondrial Cyt b Gene in Knife Fish. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and ARIF WIBOWO.

Knife fish is freshwater fish belonging to the Notopteridae famili distributed across India, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Thailand and western part of Indonesia. This fish is very popular for consumption and ornamental fish. Studies of freshwater fishes, especially in the protected freshwater fish form is an important aspect of biogeographical studies, because they do not disperse easily through saltwater areas, and thus their evolution may be tightly linked to the geological histories. This study aimed to analyze cyt b gene sequence variation of knife fish from the Mahakam River (Borneo) and Indragiri River (Sumatra) as a base for studying their population and phylogenetic position. Samples of 38 fish samples taken from two rivers, nine samples from the Mahakam River and 29 samples from the Indragiri River. Cyt b gene amplification succeeded in seven samples (KALTIM02, TU02, TU06, TU07, KCO001, KCO005, dan PP03). Phylogeny analysis performed using Kimura-2-parameter based on the first two bases of each codon and amino acid. Both topography show that six samples are in the same clade with Chitala lopis, whereas one sample of the Indragiri River separate from the other. The knife fish from Indragiri River have higher diversity than Mahakam River and closest intrapopulation relationship found in Mahakam River population.

v

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga dapat menyelesaikan karya ilmiah dari bulan Februari-Agustus sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor yang berjudul Variasi Gen Cyt b Mitokondria pada Ikan Belida.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si danBapak Arif Wibowo, SP. M.Si selaku pembimbing, yang telah memberikan ilmu, pengarahan dan bimbingannya kepada penulis, kepada Ibu Dr. Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc selaku penguji yang telah memberikan banyak masukan. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta, terutama ibu, bapak, dan adik atas segala doa yang tiada henti, kasih sayang, dan dukungannya serta semua keluarga besar zoologi, Biologi yang telah berbagi ilmu dan segala dukungannya, untuk teman seperjuangan Dewinta Mandela dan Raden Ajeng S.F atas bantuan dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian. Selain itu terima kasih kepada teman-teman Biologi angkatan 43 yang telah memberikan motivasi kepada penulis.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan menambah khasanah ilmu pengetahuan kita semua.

Bogor, Januari 2011

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 4 September 1988 dari Bapak Ir. H. Taukhid, M.Sc dan Ibu Hj. Kesih Mulyatin. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.

Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur penerimaan Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Selama studi di IPB, penulis aktif di Badan Pengawas HIMABIO (BPH) dan berorganisasi di beberapa kepanitiaan seperti Public Speaking, Pesta Sains, Program Penghijauan Mahasiswa Biologi, Revolusi Sains, dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) angkatan 44. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata ajaran Struktur Hewan dan Fisiologi Tumbuhan pada semester genap (2009/2010). Penulis telah melakukan praktik lapangan di Balai Penelitian Tanah, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementrian Pertanian, Bogor (2009) dan pernah mengikuti magang di Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Badan Penelitian dan Pengembangan Kelautan dan Perikanan, Kementrian Kelautan dan Perikanan, Bogor (2009).

vii

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI... vii

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN ... viii

PENDAHULUAN... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 1

Waktu dan Tempat ... 1

BAHAN DAN METODE ... 2

Bahan ... 2

Ekstraksi dan Isolasi DNA ... 2

Perunutan Produk PCR ... 2

Analisis DNA ... 2

HASIL ... 2

Amplifikasi Gen Cyt b Ikan Belida ... 2

Analisis Keragaman Nukleotida... 3

Analisis Filogeni ... 3

PEMBAHASAN ... 5

SIMPULAN ... 6

SARAN ... 6

DAFTAR PUSTAKA... 6

DAFTAR TABEL

Halaman 1. Jarak genetik (bawah diagonal) dan rasio transisi terhadap transversi (atas diagonal) antara

tujuh sampel dan empat spesies anggota Notopteridae dari Genebank ... 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Spesifitas primer universal dibandingkan dengan perbedaan keseluruhan spesies yang ada di

Genebank ... 3 2. Produk PCR hasil running pada PAGE 6% dengan target sekitar 1200 bp; Keterangan: 1.

KCO001 2. KCO005 3. PP03 4. KALTIM02 5. TU02 6. TU06 7. TU07 ... 4 3. Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan empat spesies pembanding

berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) Menggunakan metode NJ (angka cetak tebal), ME (angka dengan garis bawah), MP (angka italic) dan asam amino (b) Pada ruas gen cyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x. ... 4

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Morfologi Notopteridae Asia dan sampel ikan belida dari Sungai Indragiri ... 9 2. Ruas DNA sebesar 830 nt yang homolog ruas gen Cyt b dengan posisi 14666–15495. ... 10 3. Hasil pensejajaran tujuh runutan DNA ikan belida dari Sungai Mahakam dan Indragiri

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae. Anggota Notopteridae yang menyebar di Asia adalah dari genus Chitala dan Notopterus (Lampiran 1). Daerah persebaran ikan belida dari genus Chitala meliputi India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand, dan Indonesia (Jawa, Sumatera, dan Kalimantan) (Inoue et al. 2009).

Ikan belida atau ikan pipih mempunyai mulut lebar dan kepala kecil. Bentuk tubuhnya seperti pisau, punggung meninggi dengan bagian perut yang tampak lebar dan pipih. Sirip anal menyambung dengan sirip ekor berawal tepat di belakang sirip perut dan dihubungkan dengan sisik-sisik kecil. Betina memiliki sirip perut relatif pendek dan tidak menutup bagian urogenital, alat kelamin berbentuk bulat. Jantan memiliki sirip perut lebih panjang dan menutup bagian urogenital, alat kelamin berbentuk tabung, ukurannya lebih kecil daripada betina. Ukuran ikan bervariasi dari 15-90 cm.

Di Sumatera Selatan, ikan belida digunakan sebagai maskot yang sering dijadikan bahan pembuatan makanan khas. Hal ini karena daging ikan belida yang memiliki kandungan lemak yang tinggi sehingga mempunyai rasa yang gurih (Sunarno 2002), berserat lembut, renyah, dan tidak amis. Selain sebagai bahan makanan, ikan belida sering kali dijadikan sebagai ikan hias karena mempunyai bentuk kepala dan variasi warna yang menarik, dan juga mudah dipelihara (Wibowo et al. 2006).

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Ikan ini termasuk langka karena sulitnya proses pemijahan, eksploitasi yang berlebih dan introduksi ikan asing ke dalam habitat asalnya. Dibandingkan dengan jenis ikan lainnya, belida lebih sulit berkembang karena hanya mampu memproduksi telur sebanyak 5% dari berat tubuhnya. Saat ini, ikan belida sudah termasuk ke dalam ikan air tawar yang dilindungi. Menurut Peraturan Pemerintah nomor 7 tanggal 27 Januari 1999 tentang Jenis-jenis Tumbuhan dan Satwa yang dilindungi, salah satu jenis ikan yang masuk di dalamnya adalah semua jenis dari genus Notopterus.

Sebagai salah satu penggerak ekonomi masyarakat yang berbasis sumber daya alam, maka berbagai upaya untuk mempelajari populasi ikan belida harus dilakukan. Salah

satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah dengan mengumpulkan informasi morfologi maupun genetiknya. Informasi genetik antara lain didapatkan dengan melakukan karakterisasi gen cyt b dalam genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutan yang terkait dengan populasi belida. Selain itu, studi mengenai ikan belida dan ikan air tawar lainnya memiliki aspek penting dari sisi biogeografi. Dengan begitu, pola persebaran ikan belida pada saat ini merupakan cerminan dari sejarah geologis (Inoue et al. 2009; Lundberg 1993). Penelitian Lavoué dan Sullivana (2004) yang menggunakan penanda molekular cyt b menyatakan bahwa Notopterus notopterus membentuk satu klad dengan Chitala ornata. Berdasarkan genom mitokondria dari 10 Osteglossomorphs, klad N. notopterus dari Thailand dan India berkerabat lebih dekat dengan Chitala lopis dibandingkan dengan Chitala blanci dan Chitala ornata.

Gen cyt b merupakan gen yang paling sering digunakan dalam analisis filogenetik hewan. Kebanyakan gen cyt b digunakan untuk membuat status sebagai “universal metric”, artinya studi dapat dibandingkan dengan mudah (Irwin et al. 1991). Gen cyt b biasanya digunakan untuk menduga komposisi dasar, laju variasi di antara keturunan, kejenuhan tiga posisi kodon, serta informasi mengenai filogenetik (Meyer 1994). Genom mitokondria vertebrata berbentuk sirkular yang terdiri atas 13 gen penyandi protein, 2 gen penyandi rRNA, 22 gen penyandi tRNA, dan satu ruas tidak menyandikan yang dikenal sebagai d-loop atau ruas pengontrol (control region). Selain itu, genom mitokondria diwariskan secara uniparental. Beberapa gen genom mitokondria seringkali digunakan untuk mempelajari berbagai fenomena populasi, baik intraspesies maupun interspesies (Solihin 1994).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi runutan nukleotida gen cyt b dalam genom mitokondria ikan belida anggota famili Notopteridae sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Agustus 2010. Pengambilan sampel dilakukan di Sungai Mahakam dan Indragiri. Analisis DNA dilakukan di bagian Fungsi

Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 38 sampel darah ikan belida yang diambil dari Sungai Mahakam (Kalimantan), dan Sungai Indragiri (Sumatera). Sampel-sampel tersebut merupakan koleksi Bapak Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai Riset Perikanan Perairan Umum, Palembang.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dari darah menggunakan Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid) yang dimodifikasi. Modifikasi dilakukan untuk mencuci alkohol sebagai pengawet sampel agar tidak mengganggu proses-proses berikutnya. Pencucian dilakukan dengan cara mengendapkan sampel dan merendamnya dalam bufer TE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0), kemudian sel-sel darah dilisis dengan sodium duodesil sulfat 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oC selama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNA mini kit for fresh blood (Geneaid).

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria

menggunakan pasangan primer W8 (5’ -TGA-TAT-GAA-AAA-CCA-TCG-TTG) dan W7

(5’-CTT-CGA-TCT-TCG-RTT-TAC-AAG) (Lavoue´ dan Sullivana 2004). Pasangan primer ini mengapit ruas gen cyt b sepanjang 1236 bp mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dibandingkan ke genom mitokondria Chitala lopis (GeneBank Accession number AP008922). Komposisi reaksi PCR dalam volume akhir 50 µ l terdiri atas sampel DNA sekitar 10-100 ng, primer masing-masing 2 µM dan Taq ready mix 25 µ l (enzim polimerase 0.05 unit/µ l, bufer dengan Mg2+ 25 mM, dNTP 0.4 mM). Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler BIOER dengan kondisi tahap pradenaturasi 95°C selama 10 menit, tahap berikutnya terdiri atas 35 siklus masing-masing mencakup tahap denaturasi 94°C selama satu menit, penempelan primer 42°C selama satu menit, pemanjangan 72°C selama 1.5 menit, dan tahap terakhir adalah pemanjangan akhir 72°C selama 7 menit.

Produk PCR diuji menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 6% dalam bufer TBE 1x (Tris-HCL 10 mM, asam borat 1 M, dan EDTA 0.1 mM) yang dijalankan pada kondisi 200 mV selama 30 menit, kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstorm 1986).

Perunutan Produk PCR

Pada kondisi reaksi PCR dengan suhu penempelan sangat rendah, maka diperoleh banyak amplikon non-spesifik. Jika ditemukan ada amplikon yang berukuran sekitar 1236 bp maka amplikon tersebut dipotong kemudian dimurnikan dengan metode agarose-gel-cutting yang diikuti dengan spin-coloumn DNA extaraction from gel. Amplikon yang sudah dimurnikan dijadikan cetakan dalam PCR untuk perunutan DNA menggunakan bigdye cycle sequencing kits (Applied Biosystem) dan primer yang sama dengan amplifikasi awal.

Analisis DNA

Hasil perunutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual berdasarkan kromatogram mesin perunut DNA. Runutan nukleotida yang telah diedit kemudian saling disejajarkan menggunakan program Clustal W yang tertanam dalam MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007) dengan melibatkan beberapa runutan gen cyt b anggota famili Notopteridae, yaitu C. blanci (AP008921), C. lopis (AP008922), C. ornata (AP008923), N. notopterus (AP008924). Hasil pensejajaran kemudian diedit ulang secara manual berdasarkan triplet kodon.

Deskripsi perbandingan runutan nukelotida dan analisis filogeni Neighbor Joining (NJ) dilakukan menggunakan MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007) berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter dengan bootstrap 1000x.

HASIL

Amplifikasi Gen Cyt b Ikan Belida

Gen cyt b yang menjadi target amplifikasi menggunakan pasangan primer W8 dan W7 berukuran sekitar 1200 bp. Amplikon dengan ukuran 1200 bp hanya bisa muncul pada kondisi PCR dengan suhu penempelan serendah 42oC. Jika suhu penempelan dinaikkan, pita DNA target tidak teramplifikasi. Primer W8-W7 menunjukkan fragmen DNA multiband karena spesifitasnya kurang dari 100% (Gambar 1). Primer yang disejajarkan dengan empat spesies Genebank

3

secara keseluruhan, primer W8 sebagai forward dengan 21 basa, hanya menempel pada 14 basa dan primer W7 sebagai reverse dengan 21 basa, hanya menempel pada 16 basa, sehingga diperoleh nilai identitas masing-masing 67% dan 76%. Dari 38 sampel yang diamplifikasi, pita DNA target berhasil ditemukan pada tujuh sampel (Gambar 2). Setelah DNA target dimurnikan, kemudian dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing maka diperoleh 7 sampel yang menunjukkan kromatogram yang bisa dibaca dengan jelas. Ketujuh sampel tersebut adalah KALTIM02, TU02, TU06, TU07 (Sungai Mahakam), KCO001, KCO005, dan PP03 (Sungai Indragiri). Lima sampel sisanya (KALTIM03, KCO002, PB02, PB34, dan TP04) tidak menghasilkan amplikon yang sesuai dengan target ukuran atau intensitas amplikon yang muncul di atas gel poliakrilamid terlalu tipis.

Analisis Keragaman Nukleotida

Tujuh runutan DNA ikan belida yang diperoleh kemudian saling disejajarkan dengan ruas mtDNA yang homolog dari C. blanci (AP008921), C. lopis (AP008922), C. ornata (AP008923), N. notopterus (AP008924). Dari hasil pensejajaran, diperoleh panjang ruas DNA sebesar 830 nt yang homolog ruas gen Cyt b dengan posisi 14666–15495 (Lampiran 2). Dari 830 nt, ditemukan ada 623 nt sama untuk semua sampel. Dari 207 nt nukleotida yang berbeda, 109 nukleotida ditemukan berbeda minimal pada dua sampel sedangkan 98 nukleotida ditemukan berbeda hanya pada satu sampel (Lampiran 3). Selain itu, setelah ruas gen cyt b diterjemahkan ke polipeptida menggunakan The Vertebrate Mitochondrial Code diperoleh polipeptida yang tersusun atas 276 asam amino. Rata-rata komposisi nukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A=30.2%; T=26.9%; G=13.3%; C=29.6%.

Jarak genetik antar sampel dibandingkan dengan sampel spesies yang ada di Genebank berdasarkan basa pertama dan kedua dengan model substitusi K2P (Tabel 1) menghasilkan nilai rata-rata sebesar 0.035. Jarak genetik tertinggi sebesar 0.059 ditemukan antara KCO001 dengan N. notopterus dengan 113 nt

yang berbeda, serta jarak genetik terendah sebesar 0.000 antara PP03 dengan C. lopis serta TU02 dengan TU07 yang berarti tidak ada perbedaan nukleotida. Rata-rata jarak genetik keseluruhan antara Sungai Mahakam, dan Indragiri (interpopulasi) adalah 0.026; dan rata-rata jarak genetik intrapopulasi Sungai Mahakam dan Indragiri berturut adalah 0.002 dan 0.033.

Rata-rata keragaman seluruh populasi sampel berdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.05. Jika runutan nukleotida pembanding ikut dianalisis, rasio transisi terhadap transversi (Tabel 1) yang terkecil yaitu 0.0 ditemukan antara KCO005 dengan PP03 dan KCO005 dengan C. lopis, sedangkan yang terbesar yaitu 19.5 ditemukan antaraPP03 dengan TU06 dan TU06 dengan C. lopis.

Analisis Filogeni

Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ, ME, dan MP untuk nukleotida menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan metode Poisson Correction untuk data asam amino (b) dari tujuh sampel dan empat spesies pembanding (Gambar 3). Topologi keduanya mengelompokkan struktur populasi berdasarkan mtDNA ini setidaknya membagi populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam dan Indragiri menjadi dua kelompok. Kelompok I menunjukkan bahwa sampel KALTIM02, TU02, TU06, TU07, dan C. lopis berada pada klad yang sama. Kelompok II merupakan spesies-spesies lain dari Notopteridae, yaitu N. Notopterus, C. ornata, C. blanci.

Sampel yang berasal dari Sungai Mahakam berada pada satu bagian yang sama dalam kelompok I, sampel dari Sungai Indragiri berada pada bagian yang sama dengan spesies dari Genebank (C. lopis), kecuali sampel KCO001. Jarak evolusi pada sampel KCO001 lebih besar dibandingkan dengan sampel lainnya, ditunjukkan dengan lengan percabangannya yang lebih panjang dan terpisah dari kelompoknya serta berada pada klad yang berbeda dari sampel yang lain.

Gambar 1Spesifitas primer universal dibandingkan dengan perbedaan keseluruhan spesies yang ada di Genebank

Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan empat spesies pembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) Menggunakan metode NJ (angka cetak tebal), ME (angka dengan garis bawah), MP (angka italik) dan asam amino (b) Pada ruas gen cyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x.

Tabel 1 Jarak genetik (bawah diagonal) dan rasio transisi terhadap transversi (atas diagonal) antara tujuh sampel dan empat spesies anggota Notopteridae dari Genebank

No. Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1. KALTIM02 7.3 9.8 13.0 1.0 2.0 1.0 5.9 13.0 7.7 2.6

2. KCO001 0.049 6.4 8.8 8.1 6.6 6.0 4.2 8.8 5.1 2.2

3. KCO005 0.033 0.049 0.0 12.7 13.0 9.3 5.2 0.0 6.5 2.5

4. PP03 0.032 0.043 0.005 19.0 19.5 12.3 6.5 - 8.6 2.5

5. TU02 0.002 0.047 0.032 0.030 0.5 0.3 5.4 19.0 6.9 2.5

6. TU06 0.004 0.049 0.033 0.032 0.002 2.0 6.4 19.5 8.5 2.5

7. TU07 0.002 0.047 0.032 0.030 0.000 0.002 5.9 12.3 7.5 2.4

8. C. blanci 0.051 0.051 0.051 0.045 0.049 0.051 0.049 6.5 8.4 2.4

9. C. lopis 0.032 0.043 0.005 0.000 0.030 0.032 0.030 0.045 8.6 2.5

10. C. ornate 0.045 0.037 0.045 0.041 0.043 0.045 0.043 0.030 0.041 3.2

11. N. notopterus 0.047 0.059 0.043 0.041 0.045 0.047 0.045 0.037 0.041 0.037

Gambar 2 Produk PCR hasil running pada PAGE 6% dengan target sekitar 1200 bp; Keterangan: 1. KCO001 2. KCO005 3. PP03 4. KALTIM02 5. TU02 6. TU06 7. TU07.

5

PEMBAHASAN

Hasil amplifikasi gen cyt b dengan menggunakan pasangan primer W8-W7 selalu diperoleh amplikon yang tidak spesifik (unspecific PCR products). Pita multiband yang dihasilkan dari amplifikasi fragmen DNA target diduga disebabkan oleh spesifisitas primer. Spesifitas primer adalah ukuran ketepatan primer menempel pada DNA target.

Spesifitas primer terhadap genom pada beberapa spesies berkisar antara 66-86% terhadap runutan nukleotida genom mtDNA pada beberapa spesies pembanding. Primer yang digunakan merupakan primer universal untuk gen cyt b sehingga primer tidak 100% menempel pada gen target (Lavoue´ S dan Sullivana 2004). Selain masalah primer yang digunakan, ketidakberhasilan PCR juga dapat terjadi akibat kualitas sampel DNA dan pereaksi PCR lainnya. Walaupun begitu, ukuran amplikon yang sesuai dengan desain primer kemudian dipotong setelah dipisahkan menggunakan metode gel extraction-spin coloumn.

Jarak genetik merupakan nilai kekerabatan yang diukur dari jumlah mutasi nukleotida dan dianalisis berdasarkan dua basa pertama setiap kodon untuk ruas gen yang menyandikan mRNA. Jarak genetik antar populasi lokal spesies yang diperoleh dari Sungai Mahakam dan Indragiri yang dibandingkan dengan spesies lainnya. Dilihat dari tingkat kesamaan dengan sampel yang lain, ada peluang bahwa sampel KCO001 bukan C. lopis. Dari topografi, dapat dilihat bahwa sampel KCO001 memiliki jarak evolusi lebih besar, karena terpisah dengan sampel lainnya yang berada dalam satu kelompok dan bagian yang sama dengan spesies dari Genebank (C. lopis). Hal ini dapat dijelaskan oleh pernyataan Iguchi et al. (1999) bahwa isolasi perbedaan jarak merupakan salah satu faktor yang dipertimbangkan akan mempengaruhi laju penghanyutan gen antara lokasi yang terpisah dan pada akhirnya akan mengakibatkan meningkatnya perbedaan genetik. Alikodra (2002) menjelaskan bahwa fluktuasi permukaan laut dan iklim mengisolasi satuan-satuan daratan dari sesamanya. Hal ini menjadi keadaan yang ideal bagi pembentukan spesies baru akibat fragmentasi habitat.

Populasi yang bermukim di pulau tertentu pada suatu saat memperoleh kembali hubungan gen dengan populasi daratan utama.

Beberapa diantaranya, merupakan spesies-spesies yang masih memiliki gen yang sama. Walaupun demikian, banyak diantara populasi lainnya telah cukup terpisah sehingga tidak dapat melakukan perkembangbiakan silang dengan individu-individu di daratan utama. Hal ini terjadi karena banyak penghalang reproduktif sehingga anggota populasi yang bersangkutan telah menjadi spesies baru.

Transisi merupakan substitusi basa purin (A atau G) dengan basa purin yang berbeda atau substitusi basa pirimidin (C atau T) dengan basa pirimidin yang berbeda, sedangkan transversi adalah substitusi basa purin dengan basa pirimidin atau sebaliknya. Substitusi nukleotida pada protein coding region yang menghasilkan kodon berbeda tetapi penyusun protein yang sama disebut dengan substitusi sinonim, sedangkan apabila menghasilkan kodon berbeda dan menyusun protein yang berbeda pula maka disebut substitusi nonsinonim. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basa ke-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar dan Nei 2000).

Rata-rata keragaman seluruh populasi sampel relatif rendah yaitu 0.05. Rendahnya nilai keragaman tersebut dapat disebabkan karena populasi terisolasi dan tidak ada aliran gen yang masuk. Pada populasi yang kecil dan terisolasi variasi genetik akan turun secara drastis. Penurunan tersebut dapat terjadi karena adanya perkawinan antar kerabat dekat (Maes dan Volckaert 2007).

Hasil Penelitian Madang (1999) pada ikan belida yang diperoleh dari Sungai Sunur, Kelekar, dan Lematang diperoleh data jarak genetik terendah 0.008 pada Sungai Sunur dengan Kelekar dan jarak genetik tertinggi 0.948 pada Sungai Kelekar dengan Lematang. Dari kedekatan jarak genetik menunjukkan bahwa populasi ikan belida dari Sungai Sunur dengan Kelekar memiliki kekerabatan yang lebih erat dibandingkan dengan populasi dari Sungai Lematang. Hal tersebut disebabkan adanya kedekatan jarak geografi antara Sungai Sunur dengan Kelekar, sehingga masih memungkinkan terjadinya aliran gen dibandingkan dengan Sungai Lematang.

Pada ikan belida yang diambil dari Sungai Kampar (Fatimah 2010), diperoleh hasil kekerabatan paling erat hingga paling rendah ialah antara Langgam dengan Rantau Baru, Waduk kuto Panjang dengan Rantau Baru, dan Waduk Kuto Panjang dengan Langgam. Diduga bahwa populasi langgam dan Rantau Baru berasal dari induk yang sama. Semakin

ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besar karena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka. Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman jenis ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996).

Hasil dari kedua penelitian tersebut menunjukkan bahwa kekerabatan individu dalam satu aliran sungai memungkinkan perpindahan individu dari satu tempat ke tempat lain. Menurut Sarre (1995), adanya tipe haplotipe yang konsisten menunjukkan populasi tersebut tidak terganggu akibat efek jarak geografi yang menimbulkan tingginya tingkat keragaman.

Adanya hubungan positif antara kekayaan jenis dengan suatu area yang ditempati tergantung pada dua faktor. Pertama, peningkatan jumlah mikro habitat akan dapat meningkatkan keragaman. Kedua, area yang lebih luas sering memiliki variasi habitat yang lebih besar dibanding dengan area yang lebih sempit (Yustina 2001). Keanekaragaman dan kelimpahan ikan juga ditentukan oleh karakteristik habitat perairan. Karakteristik habitat di sungai sangat dipengaruhi oleh kecepatan aliran sungai. Kecepatan aliran tersebut ditentukan oleh perbedaan kemiringan sungai, keberadaan hutan atau tumbuhan di sepanjang daerah aliran sungai yang akan berasosiasi dengan keberadaan hewan-hewan penghuninya (Yustina 2001).

Nilai rata-rata keseluruhan jarak genetik antara Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri menunjukkan bahwa populasi ikan belida yang berasal dari Sungai Mahakam lebih berkerabat dibandingkan dengan populasi ikan belida dari Sungai Indragiri yang memiliki nilai rata-rata jarak genetik cukup tinggi. Bahagiawati et al. (2006) melaporkan bahwa laju migrasi yang rendah menyebabkan populasi lokal berkembang secara lebih bebas dari populasi lokal lainnya dan terjadi pergeseran genetik. Terbatasnya ruang gerak individu-individu dalam populasi akibat adanya penghalang tertentu menyebabkan keterbatasan interaksi. Kondisi seperti ini jika berlangsung cukup lama bisa berujung pada terbentuknya adaptasi lokal pada sub-sub populasi yang terpisah, akibatnya kelompok kecil ini akan memiliki karakter genetik yang berbeda dengan kelompok asalnya.

Pola penyebaran ikan belida sangat berkaitan erat dengan arus. Sebagai predator air tawar, ikan belida hidup di habitat sungai dan daerah yang sering tergenang banjir. Hidupnya di dataran rendah dengan ketinggian tidak lebih dari 30 mdpl

(Widyastuti 1993). Ditegaskan pula oleh Sjafei et al. (1989) bahwa ikan ini merupakan contoh ikan yang berdistribusi di dataran rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi distribusi ikan air tawar adalah faktor fisik yang meliputi suhu, derajat fluktuasi air, gradien, urutan aliran, dan turbiditas; faktor kimia yang meliputi oksigen terlarut, pH, senyawa nitrogen, klorinitas, dan salinitas; serta faktor biologi yang meliputi hubungan predator dan mangsa, kompetisi, dan simbiosis.

SIMPULAN

Keragaman genetik dan hubungan filogeni berdasarkan gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari Sungai Mahakam; Kalimantan dan Sungai Indragiri; Sumatera berada dalam kelompok yang sama dengan Chitala lopis, kecuali sampel KCO001 yang berasal dari Sungai Indragiri. Kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi Sungai Mahakam.

SARAN

Dibutuhkan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen pada mtDNA selain gen cyt b dan pengambilan sampel dari berbagai populasi yang berbeda dari Sungai Mahakam dan Sungai Indragiri untuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C. lopis.

DAFTAR PUSTAKA

Alikodra HS. 2002. Pengelolaan Satwa Liar. Yayasan Penerbit Fakultas Kehutanan IPB. Bogor. Hal 38-83.

Bahagiawati B, Damayanti, Nurindah, Rizjaani, Dwinita WU, Sahari B, Sari A. 2006. Struktur populasi (Trichogrammatoidea armigera). J Agro Biogen. 2: 52-58.

Fatimah RAS. 2010. Karakterisasi genom Mitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Haryono. 2008. Potensi ikan belida dan upaya konservasinya. Fauna Indonesia. 8: 5-8. Iguchi K, Tanimura Y, Takeshima H, Nishida

M. 1999. Genetic variation and geographic population structure of amphidromous ayu Plecoglossus altivelis as examined by mitochondrial DNA sequencing. J Fisheries Science 65:63-67.

567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 1. KALTIM02 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT 2. KCO001 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAG CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 3. KCO005 ACA CCC GCA AAC CCA TTA GTC ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAA TGA TAC TTC CTA TTT GCG TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 4. PP03 ACA CCC GCA AAC CCA TTA GTC ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAA TGA TAC TTC CTA TTT GCG TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 5. TU02 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT

6. TU06 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT 7. TU07 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT

555 555 555 556 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 899 999 999 990 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 1. KALTIM02 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 2. KCO001 CCT AAT AAG CTA GGA GGA GTC CTA GCC TTA TTA TTC TCG ATC CTT GTA CTA ATA CTA ATA CCA ATC CTA CAT ACA TCC AAA ATA 3. KCO005 CCT AAC AAG CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TTC TCA ATC CTC GTA CTA ATA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCC AAA ATA 4. PP03 CCT AAC AAG CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TTC TCA ATC CTC GTA CTA ATA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCC AAA ATA 5. TU02 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 6. TU06 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 7. TU07 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA

666 666 666 666 666 666 666 666 666 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 1. KALTIM02 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 2. KCO001 CAA ACC ATA ACA TTC CAA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA ATT GCA GAT ATG CTC ATC CTC ACA TGA ATT GGA GGA 3. KCO005 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA GTC GCA GAC ATA GCC ATT CTC ACA TGA ATC GGA GGT 4. PP03 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA GTC GCA GAC ATA GCC ATT CTC ACA TGA ATC GGA GGT 5. TU02 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 6. TU06 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 7. TU07 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC

777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 788 888 888 888 888 888 888 888 888 888 88 555 666 666 666 677 777 777 778 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 23

789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 90 1. KALTIM02 ATA CCA GTA GAA AGC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT 2. KCO001 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATT ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 3. KCO005 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAT ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 4. PP03 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAT ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 5. TU02 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 6. TU06 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT 7. TU07 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT

1.

Chitala

Marga ini dicirikan antara lain terdapatnya sirip dorsal, 13-18 tulang belakang, tulang kepala

bergerigi, sirip perut rudimenter, 10 baris sisik atau lebih sebelum mata, panjang rahang sampai

jauh di batas mata bagian belakang. Karakter utama yang membedakan marga ini dengan

Notopterus

adalah bentuk kepala dekat punggung sangat cekung (Haryono 2008).

2.

Notopterus

Marga ini dicirikan antara lain oleh adanya sirip dorsal, jumlah tulang belakang 13-18, tulang

kepala bergerigi, sirip perut rudimenter, sisik sebelum mata lebih dari 6-8 baris, panjang rahang

hampir berbatasan dengan batas mata bagian belakang. Karakter utama yang membedakan marga

ini dengan

Chitala

adalah bentuk kepala dekat punggung relatif lurus (Haryono 2008).

3. Sampel ikan belida (

Chitala lopis

) dari Sungai Mahakam dan Indragiri

Lampiran 2 Ruas DNA sebesar 830 nt yang homolog ruas gen Cyt b dengan posisi 14666–15495. 14666 ttctt cttcatctgt atctacctac acgtagctcg

14701 aggcctctac tacggctcat atctctataa agaaacatga aacgtagggg ttatcctcct 14761 actcctagta ataatgaccg cctttgtagg atacgtacta ccctgggggc aaatatcatt 14821 ctgaggggcc acagtcatta caaacctttc atccgccgtc ccctacactg gaaatgcttt 14881 agcacaatga atctgaggag gtttttcagt ggacaacgca acactaaccc gatttttcgc 14941 attccacttc ctattcccct tcctaattgc aggcgcaacc atcatacacc tccttttctt 15001 acacgaaaca ggatccagca acccaacagg actaaattca gacacagaca aagtgccatt 15061 tcacccatac ttctcataca aagacctgct cggatttatt attatactcc tagcccttgc 15121 aacactagca ctattttcac caaacctact aggagaccca gaaaacttca cacccgcaaa 15181 cccattagtc acccctccac acatcaaacc cgaatgatac ttcctatttg cgtacgcaat 15241 tctacgatcc attcctaaca agctaggagg cgtcctagcc ctattattct caatcctcgt 15301 actaatacta gtaccaatcc tacacacatc caaaatacga accataacat tccgaccact 15361 atcacaattc ctattctgat ccttagtcgc agacatagcc attctcacat gaatcggagg 15421 tataccagta gaaaacccat atatcatcat tggacaagtc gcatccgtga tttacttcgc 15481 actatttcta ctact

Lampiran 3 Hasil pensejajaran tujuh runutan DNA ikan belida dari Sungai Mahakam dan Indragiri sepanjang 830 nt.

111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 777 777 788 888 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 1. KALTIM02 TTC TTC TTC ATC TGT ATT TAC CTA CAC GTG GCC CGA GGC CTC TAT TAC GGC TCA TAC CTA TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA

2. KCO001 TTC TTC TTC ATT TGT ATT TAC CTG CAC GTA GCC CGA GGC CTT TAC TAC GGC TCA TAC CTA TAT AAA GAA ACA TGA AAT GTA GGA 3. KCO005 TTC TTC TTC ATC TGT ATC TAC CTA CAC GTA GCT CGA GGC CTC TAC TAC GGC TCA TAT CTC TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA

4. PP03 TTC TTC TTC ATC TGT ATC TAC CTA CAC GTA GCT CGA GGC CTC TAC TAC GGC TCA TAT CTC TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA 5. TU02 TTC TTC TTC ATC TGT ATT TAC CTA CAC GTG GCC CGA GGC CTC TAT TAC GGC TCA TAC CTA TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA

6. TU06 TTC TTC TTC ATC TGT ATT TAC CTA CAC GTG GCC CGA GGC CTC TAT TAC GGC TCA TAC CTC TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA 7. TU07 TTC TTC TTC ATC TGT ATT TAC CTA CAC GTG GCC CGA GGC CTC TAT TAC GGG TCA TAT CTC TAT AAA GAA ACA TGA AAC GTA GGA

111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 1. KALTIM02 GTT ATC CTC CTA ATC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGA CAA ATA TCA TTC TGA GGA GCC ACA 2. KCO001 GTT ATC CTT CTA CTT CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGG TAC GTC TTA CCT TGA GGA CAA ATA TCA TTC TGA GGA GCC ACA 3. KCO005 GTT ATC CTC CTA ATC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGG CAA ATA TCA TTC TGA GGG GCC ACA 4. PP03 GTT ATC CTC CTA CTC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGG CAA ATA TCA TTC TGA GGG GCC ACA 5. TU02 GTT ATC CTC CTA ATC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGA CAA ATA TCA TTC TGA GGA GCC ACA 6. TU06 GTT ATC CTC CTA ATC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGA CAA ATA TCA TTC TGA GGA GCC ACA 7. TU07 GTT ATC CTC CTA ATC CTA GTA ATA ATG ACC GCC TTT GTA GGA TAC GTA CTA CCC TGG GGA CAA ATA TCA TTC TGA GGA GCC ACA

111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 122 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 677 777 777 778 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 444 444 444 555 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 1. KALTIM02 GTC ATT ACA AAC CTT TTA TCC GCC ATC CCC TAC ATT GGA AAT GTT TTA GTA CAA TGA ATC TGA GGA GGC TTT TCA GTA GAC AAC 2. KCO001 GTC ATT ACA AAC CTT TTA TCC GCC ATC CCC TAC ATT GGA AAT GCT CTA GTA CAA TGA ATT TGA GGG GGC TTT TCA GTA GAC AAC 3. KCO005 GTC AAT ACA AAC CTT TCA TCC GCC GTC CCC TAC ACT GGA AAT GCT TTA GCA CAA TGA ATC TGA GGA GGT TTT TCA GTG GAC AAC 4. PP03 GTC ATT ACA AAC CTT TCA TCC GCC GTC CCC TAC ACT GGA AAT GCT TTA GCA CAA TGA ATC TGA GGA GGT TTT TCA GTG GAC AAC 5. TU02 GTC ATT ACA AAC CTT TTA TCC GCC ATC CCC TAC ATT GGA AAT GTT TTA GTA CAA TGA ATC TGA GGA GGC TTT TCA GTA GAC AAC 6. TU06 GTC ATT ACA AAC CTT TTA TCC GCC ATC CCC TAC ATT GGA AAT GTT TTA GTA CAA TGA ATC TGA GGA GGC TTT TCA GTA GAC AAC 7. TU07 GTC ATT ACA AAC CTT TTA TCC GCC ATC CCC TAC ATT GGA AAT GTT TTA GTA CAA TGA ATC TGA GGA GGC TTT TCA GTA GAC AAC

222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 223 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 1. KALTIM02 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC CTA ATT GCA GGC GCA GCC ATC ATA CAC CTC CTT TTC TTA 2. KCO001 GCA ACT TTA ACC CGA TTC TTT GCA TTT CAC TTT CTA TTT CCT TTC CTA ATT GCA GGC GCA ACT GTC ATG CAC CTC CTT TTC TTA 3. KCO005 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC GTA ATT GCA GGC GCA ACC ATC ATA CAC CTC CTTTTC TTA 4. PP03 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC CTA ATT GCA GGC GCA ACC ATC ATA CAC CTC CTT TTC TTA 5. TU02 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC CTA ATT GCA GGC GCA GCC ATC ATA CAC CTC CTT TTC TTA 6. TU06 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC CTA ATT GCA AGC GCA GCC ATC ATA CAC CTC CTT TTC TTA 7. TU07 GCA ACA CTA ACC CGA TTT TTC GCA TTC CAC TTC CTA TTC CCC TTC CTA ATT GCA GGC GCA GCC ATC ATA CAC CTC CTT TTC TTA

333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 444 444 444 444 444 444 444 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 1. KALTIM02 CAC GAA ACA GGA TCC AAC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 2. KCO001 CAC GAA ACA GGG TCC AAC AAT CCA GTA GGA CTA AAC TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 3. KCO005 CAC GAA ACA GGA TCC AGC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 4. PP03 CAC GAA ACA GGA TCC AGC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 5. TU02 CAC GAA ACA GGA TCC AAC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 6. TU06 CAC GAA ACA GGA TCC AAC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 7. TU07 CAC GAA ACA GGA TCC AAC AAC CCA ACA GGA CTA AAT TCA GAC ACA GAC AAA GTG CCA TTT CAC CCA TAC TTC TCA TAC AAA GAC 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 455 555 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 888 888 888 999 999 999 900 000 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234

1. KALTIM02 CTG CTC GGA TTC ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT ACA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAT CCA GAA AAC TTC 2. KCO001 TTA TTC GGA TTC ATT ATT ATA CTC CTC GCC CTC ACA ACA TTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTT CTA GGA GAC CCA GAA AAC TTC 3. KCO005 CTG CTC GGA TTT ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT GCA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAC CCA GAA AAC TTC 4. PP03 CTG CTC GGA TTT ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT GCA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAC CCA GAA AAC TTC 5. TU02 CTG CTC GGA TTC ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT ACA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAT CCA GAA AAC TTC 6. TU06 CTG CTC GGA TTC ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT ACA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAT CCA GAA AAC TTC 7. TU07 CTG CTC GGA TTC ATT ATT ATA CTC CTA GCC CTT ACA ACA CTA GCA CTA TTT TCA CCA AAC CTA CTA GGA GAT CCA GAA AAC TTC

000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 1. KALTIM02 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT 2. KCO001 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAG CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 3. KCO005 ACA CCC GCA AAC CCA TTA GTC ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAA TGA TAC TTC CTA TTT GCG TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 4. PP03 ACA CCC GCA AAC CCA TTA GTC ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAA TGA TAC TTC CTA TTT GCG TAC GCA ATT CTA CGA TCC ATT 5. TU02 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT

6. TU06 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT 7. TU07 ACA CCC GCA AAC CCA CTA GTT ACC CCT CCA CAC ATC AAA CCC GAG TGA TAC TTC CTA TTT GCA TAC GCA ATC CTA CGG TCC ATT

555 555 555 556 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 899 999 999 990 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 666 666 666 777 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 1. KALTIM02 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 2. KCO001 CCT AAT AAG CTA GGA GGA GTC CTA GCC TTA TTA TTC TCG ATC CTT GTA CTA ATA CTA ATA CCA ATC CTA CAT ACA TCC AAA ATA 3. KCO005 CCT AAC AAG CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TTC TCA ATC CTC GTA CTA ATA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCC AAA ATA 4. PP03 CCT AAC AAG CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TTC TCA ATC CTC GTA CTA ATA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCC AAA ATA 5. TU02 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 6. TU06 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA 7. TU07 CCT AAC AAA CTA GGA GGC GTC CTA GCC CTA TTA TCC TCA GTC CTC GTA CTA ACA CTA GTA CCA ATC CTA CAC ACA TCT AAA ATA

666 666 666 666 666 666 666 666 666 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 1. KALTIM02 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 2. KCO001 CAA ACC ATA ACA TTC CAA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA ATT GCA GAT ATG CTC ATC CTC ACA TGA ATT GGA GGA 3. KCO005 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA GTC GCA GAC ATA GCC ATT CTC ACA TGA ATC GGA GGT 4. PP03 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTC CTA TTC TGA TCC TTA GTC GCA GAC ATA GCC ATT CTC ACA TGA ATC GGA GGT 5. TU02 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 6. TU06 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC 7. TU07 CGA ACC ATA ACA TTC CGA CCA CTA TCA CAA TTT CTA TTC TGA TCC TTA GCC GCA GAC ATA GCC ATC CTC ACA TGA ATC GGA AGC

777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 777 788 888 888 888 888 888 888 888 888 888 88 555 666 666 666 677 777 777 778 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 23

789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 90 1. KALTIM02 ATA CCA GTA GAA AGC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT 2. KCO001 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATT ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 3. KCO005 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAT ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 4. PP03 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAT ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC GTG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 5. TU02 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTA CT 6. TU06 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT 7. TU07 ATA CCA GTA GAA AAC CCA TAC ATC ATC ATT GGA CAA GTC GCA TCC ATG ATT TAC TTC GCA CTA TTT CTA CTC CT