3. Spektroskopi Liquid ChromatographyMass Spectroscopy LCMS
Spektrokopi LCMS merupakan dua alat yang digabungkan menjadi satu, yang
berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan kepolarannya, kromatografi cair dapat dengan aman memisahkan
rentang yang sangat luas untuk senyawa organik, seperti peptida dan protein Agilent technologies, 2001; Eichhorn and Knepper, 2001. Di dalam kolom
terjadi pemisahan yang dipengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam senyawa-senyawa dalam kolom sehingga senyawa yang akan keluar
atas berdasarkan perbedaan kepolaran. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya
senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama Skoog et al., 2013; Silverstein et al., 2005.
Sampel yang telah terpisah dengan liquid chromatography diidentifikasi berat molekulnya menggunakan mass spectroscopy. Hasil spektrum mass spectroscopy
berupa perbandingan antara intensitas terhadap massa mz. Intensitas yang paling tinggi sebagai base peak dan mass mz yang paling besar sebagai
[M+H
+
] Silverstein et al., 2005. Diagram skema LCMS dapat dilihat pada Gambar 8.
Dalam alat LCMS, memiliki sumber ion dengan teknik ionisasi berdasarkan tingkat polaritasnya terbagi menjadi tiga yaitu Atmospheric Pressure
Photoionization APPI yaitu digunakan dengan kromatografi fase normal untuk senyawa yang sangat nonpolar dan tingkat aliran rendah 100 ml menit,
Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCI yaitu digunakan dengan kromatografi fase normal karena analit biasanya nonpolar dan Electrospray
Ionization ESI yaitu menggunakan kromatografi fasa terbalik yang sangat berguna untuk menganalisis molekul dari ukuran kecil sampai ukuran besar yang
bersifat polar maupun sangat polar Agilent technologies, 2001.
Gambar 8. Diagram skema sistem LCMS Kazakevich and Lobrutto, 2007
Contoh spektrum massa dari senyawa peptida dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Spektrum massa dari senyawa oktapeptida Agilent technologies, 2001
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2014 – Mei 2015 di UPT
Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung, analisis FTIR dilaksanakan di UGM Yogyakarta, dan analisis LCMS
dilaksanakan di LIPI Serpong.
B. Alat dan bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah culture flash, gelas kimia, labu ukur, gelas ukur, pipet ukur, erlenmeyer, corong kaca, tabung reaksi, rak tabung
reaksi, spatula, akuarium, lampu, selang, pompa aerator, lampu UV, kain saring 400 mesh, pinset, sentrifuse, kaca preparat, mikroskop Axioo 10 Carl-Zeiss,
oven, neraca analitik, botol sampel, desikator, lemari pendingin, lampu UV kohlerSN402006, chamber, pinset, kolom, HPLC ShimadzuLC-20A
Prominence, MPLC
Medium Pressure
Liquid Chromatography
BuchiSepacoterm, microplate reader Hospitex Diagnostics, spektrofotometer UV-Vis VarianCary 50 Probe, spektrofotometer FTIR Shimadzu Prestige-21,
spektrofotometer LCMS Mariner.
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spirulina sp. dari BBPBL - Lampung, akuades, alkohol 70, air laut, limbah POME, kertas saring, indikator
pH universal, natrium karbonat, natrium hidroksida, asam klorida, asam sulfat, glukosa, natrium dihidrogen fosfat.monohidrat, dinatrium hidrogen fosfat tujuh
hidrat, ammonium sulfat, tembaga sulfat lima hidrat, natrium klorida, media ConwayWalne, pupuk Urea, ZA, TSP, Amberlite XAD 16 Sigma, Cosmosil
75C
18
- OPN, silika, plat KLT C18, plat KLT silika, alumunium foil, plastik wrap, kapas, kasa, pereaksi ninhidrin, pereaksi dragendorf, pereaksi serium sulfat,
isopropanol, etanol, diklorometana, metanol, asam askorbat dan DPPH.
C. Metode Penelitian
1. Kultivasi Spirulina sp.
Spirulina sp. dikultivasi pada media POME 5. Pembuatan media kultivasi diawali dengan mengatur derajat keasaman dari nilai pH 4 menjadi nilai pH 8
– 10 yang sesuai untuk pertumbuhan Spirulina sp., dengan cara menambahkan 4 gram
Na
2
CO
3
ke dalam 1 Liter POME. Kemudian membuat media pupuk 0,03 gram ZA, 0,03 gram Urea, 0,01 gram TSP untuk 1 Liter air laut, Anindiastuti et al.,
2007 yang di dalamnya mengandung POME. Untuk kultivasi awal dilakukan adaptasi pada media POME 5, 10 dan 15 dengan skala 250 mL. Setelah itu,
bibit Spirulina sp. dikultivasi yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10
– 14 hari, serta dilakukan pengamatan secara mikroskopik.
Kultivasi Spirulina sp. dilakukan menggunakan akuarium skala 80 L menggunakan media POME 5 yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara,
sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari.
2. Pemanenan Spirulina sp.
Spirulina sp. yang telah dikultivasi selama 2 minggu dilakukan pemanenan menggunakan kain saring berukuran 400 mesh Vonshak, 2002. Biomassa dan
filtrat Spirulina sp. ditampung di wadah terpisah.
3. Isolasi Senyawa Peptida
Sebanyak 50 gram biomassa Spirulina sp. ditambah dengan 100 mL air, kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4
o
C, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Selanjutnya padatan diekstraksi menggunakan pelarut
metanol : air 7 : 3, kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4
o
C, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Filtrat yang didapat,
dikeringkan menggunakan rotary evaporator.
Sebanyak 5 L filtrat Spirulina sp. dilakukan isolasi metode kromatografi kolom secara ionik berdasarkan pertukaran ion menggunakan resin XAD 16 Visscher et
al., 2008, kemudian dielusi dengan etanol 30, isopropanol 20, isopropanol 40 dan isopropanol 70 pH 2. Fraksi isopropanol 70 pH 2 adalah fraksi yang
positif, fraksi tersebut dikeringkan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak yang
didapat diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis dengan C18 sebagai fase diam dan metanol : air + TFA 0,1 8 : 1 sebagai fase gerak, kemudian
dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom sesuai dengan kondisi tersebut. Fraksi yang positif mengandung senyawa peptida diidentifikasi
menggunakan MPLC, menggunakan kolom C
18
dielusi secara gradien dengan eluen MeOH : H
2
O.
4. Uji Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan juga dilakukan secara kuantitatif menggunakan microplate reader Anggraini, 2012. Ekstrak kasar ± 2 mg dilarutkan dalam
metanol sehingga diperoleh kadar 2000 ppm. Sampel dimasukkan ke dalam plate 96-well sebanyak 100
l dan ditambah dengan 100 l larutan DPPH 0,2 mM dalam metanol. Blanko yang digunakan adalah metanol. Sampel dan blanko
yang sudah ditambahkan larutan DPPH diinkubasi di ruang gelap pada suhu kamar selama 30 menit lalu diukur pada panjang gelombang 492 nm
menggunakan microplate reader. Reaksi positif akan memberikan perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Persentasi peredaman radikal DPPH oleh
senyawa antioksidan dihitung berdasarkan persamaan :
Dimana A
blank
merupakan absorbansi balnko dan A
test
merupakan absorbansi ekstrak sampel.
Kategori