ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA PEPTIDA DARI MIKROALGA LAUT , Spirulina sp. YANG DIKULTIVASI DENGAN MEDIA POME (PALM OIL MILL EFFLUENT)

ABSTRACT

ISOLATION AND IDENTIFICATION PEPTIDE FROM MARINE MICROALGAE, Spirulina sp.CULTIVATED WITH MEDIA OF POME

(PALM OIL MILL EFFLUENT)

By

DIAH ASTIKA WINAHYU

Studied of antioxidant compound from cyanobacteria, Spirulina sp. in the media of 5% POME has been done. In the initial antioxidant test using DPPH reagent showed that Spirulina sp. excreted the antioxidant compounds. The result from 5 L elution media filtrate using XAD 16 obtained extract as much as 0.485 g. The 0.485 g extract were obtained from the 5 L POME media with the XAD 16. The TLC test using the specific reagents Dragendorf (orange) and ninhydrin (purple) indicated that the extract of the active compounds are included in peptide compounds. The result of UV-Vis analysis showed maximum absorption at a wavelength of 228 nm and 277 nm. The data interpretation of FTIR spectra indicates absorption of C = O amide at 1635.64 cm-1 region and mass spectrum analysis shows the value of m/z 982.0037 with molecular formula C53H78N10O8 which is as one of the homologous compounds microcystin. Furthermore, a quantitative test result antioxidant compound has a value of 14.3%. Based on the above data, it was concluded that the filtrate Spirulina sp. POME media is a potential source of antioxidant compounds.

ABSTRAK

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA PEPTIDA DARI MIKROALGA LAUT , Spirulina sp. YANG DIKULTIVASI DENGAN MEDIA POME

(PALM OIL MILL EFFLUENT)

Oleh

DIAH ASTIKA WINAHYU

Telah dilakukan kajian senyawa antioksidan pada Cyanobacteria, Spirulina sp. dalam media POME 5%. Hasil uji awal antioksidan menggunakan pereaksi DPPH pada media filtrat menunjukkan bahwa Spirulina sp. mengekskresi senyawa antioksidan. Hasil elusi 5 L filtrat media menggunakan XAD 16 diperoleh ekstrak sebanyak 0,485 g. Hasil uji KLT dengan pereaksi spesifik Dragendorf (orange) dan ninhidrin (ungu) mengindikasikan ekstrak senyawa aktif termasuk ke dalam senyawa peptida. Hasil uji analisis UV-Vis menunjukkan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang 228 nm dan 277 nm. Intrepretasi data spektrum FTIR mengindikasikan adanya serapan uluran C=O amida pada daerah 1635,64 cm-1 dan analisis spektrum massa memperlihatkan nilai m/z 982,0037 dengan rumus molekul C53H78N10O8 yang merupakan sebagai salah satu senyawa homolog Microcystin. Selanjutnya, hasil uji secara kuantitatif senyawa antioksidan memiliki nilai sebesar 14,3 %. Berdasarkan data di atas, disimpulkan bahwa filtrat Spirulina sp. pada media POME merupakan sumber potensial senyawa antioksidan.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA PEPTIDA DARI MIKROALGA LAUT , Spirulina sp. YANG DIKULTIVASI DENGAN

MEDIA POME (PALM OIL MILL EFFLUENT)

Oleh

DIAH ASTIKA WINAHYU

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar MAGISTER SAINS

Pada

Program Pascasarjana Magister Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung

PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2015

iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Pengamatan Spirulina sp. di bawah mikroskop ……….…... 10 2. Senyawa metabolit dari mikroalga ... 12 3. Struktur senyawa a. aprotoksin D aprotoksin, b. symplostatin 1, ... 15 4. Proses Elusi pada Kromatografi Lapis Tipis (a) wadah pengelusi (b)

kromatogram ... 18 5. Skema interaksi peptida dengan ligan hidrofobik amobil ... 21 6. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal bebas

(Gordon, 1990) ... 22 7. Struktur Diphenylpycrilhydrazil dan Diphenylpycrilhydrazine ... 23 8. Diagram skema sistem LC/MS (Kazakevich and Lobrutto, 2007

... 28 9. Spektrum massa dari senyawa oktapeptida (Agilent technologies,

2001)... 28 10. Kultivasi aklimatisasi Spirulina sp. dalam media POME 5%, 10% dan 15% ... 35 11. Kultivasi Spirulina sp. dalam media POME 5% ... 36 12. Pengamatan mikroskop Spirulina sp. dengan perbesaran 400 X.

(a) Spirulina sp. dalam media Conway. (b) Spirulina sp. dalam media POME 5% ... 36 13. (a) Filtrasi Spirulina sp. (b) Biomassa Spirulina sp. (c) Filtrat

Spirulina sp. ... 37 14. Fikobiliprotein Spirulina sp. ... 39

v

15. (a) KLT menggunakan pereaksi ninhidrin (b) KLT menggunakan

pereaksi Dragendorf (c) KLT menggunakan pereaksi serium sulfat... 40

16. Ekstrak DN ... 41

17. (a) KLT menggunakan pereaksi ninhidrin (b) KLT menggunakan pereaksi Dragendorf (c) KLT menggunakan pereaksi serium sulfat ... 41

18. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak awal ... 42

19. Kromatogram HPLC ekstrak DN ... 43

20. KLT ekstrak DN menggunakan eluen MeOH : H2O (5: 1) ... 44

21. Kromatogram MPLC gradien MeOH : H2O ... 45

22. KLT fraksi senyawa DN571-8 ... 46

23. Uji aktivitas antioksidan senyawa DN571-8 ... 47

24. Gambar mekanisme antioksidan DPPH ... 48

25. Spektrum UV-Vis senyawa DN571-8 ... 49

26. Spektrum FTIR DN571-8 ... 50

27. Spektrum LC senyawa DN571-8 ... 51

28. Spektrum MS senyawa DN571-8 ... 52

29. Struktur senyawa Microcystin dengan asam amino Ala, Arg, Glu, Leu, Asp ... 53

30. Struktur senyawa DN571-8 dengan asam amino Ala, Val, Arg, Leu, Phe ... 54

i

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... iv

DAFTAR TABEL ... vi

I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang ... 1

B. Tujuan Penelitian ... 3

C. Manfaat Penelitian ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

A. Mikroalga ... 4

B. Potensi Mikroalga ... 7

C. Limbah Cair Kelapa Sawit (Palm Oil Mill Effluent/POME) ... 8

D. Spirulina sp. ………... 9

E. Senyawa Metabolit ... 11

F. Senyawa Peptida ………... 12

G. Metode Pemisahan ………... 16

1. Ekstraksi ... 16

2. Kromatografi... 17

ii

b. Kromatografi Kolom ... 19

c. High Performance Liquid Chromatography ... 20

H. Antioksidan ... 22

I. Identifikasi ... 24

1. Spektroskopi Ultra Violet – Visible (UV – Vis) ... 24

2. Spektroskopi Fourier Transform Infrared (FTIR) ... 25

3. Spektroskopi Liquid Chromatography/Mass Spectroscopy (LC/MS) ... 27

III. METODE PENELITIAN ……... 29

A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 30

B. Alat dan Bahan ... 30

C. Metode Penelitian ... 30

1. Kultivasi Spirulina sp. ………... 30

2. Pemanenan Biomassa Mikroalga …………... 31

3. Isolasi Senyawa Peptida ... 31

4. Uji Antioksidan ... 32

5. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV – Vis ... 33

6. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR ... 33

7. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer LC/MS ... 33

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Kultivasi Spirulina sp. ………... 34

B. Pemanenan Biomassa Mikroalga ……….... 37

C. Isolasi Senyawa Peptida ... 37

iii

E. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV – Vis ... 48

F. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR ... 50

G. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer LC/MS ... 51

V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 55

DAFTAR PUSTAKA ... 57

vi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Asam amino esensial dan non esensial ...………... 13

2. Serapan gugus fungsi ... 26

3. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak awal ... 42

4. Uji aktivitas antioksidan senyawa DN571-8 ....……….... 47

Fakta hidup tak selalu seindah impian Banyak cerita tercipta, tak terduga Resah memburu, air mata membanjir

Saat cerita tak sesuai harap, saat impian seakan kandas Deru debu di hati kian tak menentu, mulut kian membisu Namun, Inilah hidup

Nyata! Bukan mimpi atau fatamorgana Semakin lama, akan semakin indah,

Jika dimaknai apa arti hidup yang sebenarnya

Semua mengalir dan akan indah bila telah sampai pada waktunya

Jadikan sabar dan solat sebagai penolong (QS. 2 : 45)

Barang siapa yang bertakwa kepada Alloh, maka Alloh akan

menunjukkan kepadanya jalan keluar dari kesusahan, dan

diberikannya rezeki dari jalan yang tidak disangka-sangka, dan

barang siapa mencukup keperluannya

(QS. 65 : 2-3)

PERSEMBAHAN

Sebuah karya sederhana ini penulis persembahkan teruntuk:

Almarhum Ayahanda Tercinta

Bapak, Ibuku Tercinta

Yang selalu memberikan kasih sayangnya, tak pernah lelah

bermandi peluh dan selalu mendoakanku dalam sujudnya

Kakak, Adik-adikku dan Keponakan

–

keponakanku Tersayang

Sebagai Penyala Semangat, Emosi dan Jiwaku

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di desa Wonodadi, Kecamatan Gadingrejo, Kabupaten Pringsewu pada tanggal 19 Januari 1986. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Drs. Kasimin (Alm.) dan Hj. Sri Hariyati, S.Pd.

Penulis mulai mengenal dunia pendidikan di Taman Kanak-Kanak Patria Desa Wonodadi, Gadingrejo dan diselesaikan pada tahun 1992. Pendidikan Sekolah Dasar Negeri III Wonodadi, Gadingrejo diselesaikan pada tahun 1998. Penulis melanjutkan pendidikan dan tercatat lulus dari SLTP Negeri I Gadingrejo pada tahun 2001. Setelah itu, penulis menyelesaikan pendidikan di SMU Negeri I Gadingrejo pada tahun 2004. Pada tahun yang sama, penulis melanjutkan pendidikan ke perguruan tinggi dan diterima sebagai mahasiswa di Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Selama menjadi mahasiswa , penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar I dan II, Kimia Organik Jurusan Biologi FMIPA Unila, Kimia Organik II Jurusan Kimia FMIPA Unila, Kimia AgroIndustri, Kimia Organik Analisis.

Pada tahun 2013, penulis melanjutkan pendidikan ke program studi magister kimia Universitas Lampung.

SANWACANA

Alhamdulilah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Alloh SWT yang Maha Indah dan Mencintai Keindahan, atas Rahmat dan Hidayah-Nya telah memberikan kemampuan penulis untuk menyelesaikan tesis yang berjudul : “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Peptida Mikroalga Laut, Spirulina sp. yang Dikultivasi dengan Media POME (Palm Oil Mill Effluent)”.

Penelitian dan penulisan tesis ini tidak terwujud tanpa izin Alloh SWT, serta bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, dengan segala ketulusan dan kerendahan hati penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada :

1. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku Pembimbing Utama sekaligus Pembimbing Akademik yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, pikiran serta selalu bersabar hati dan penuh perhatian dalam memberikan bimbingan, ilmu, arahan dan dukungan dalam menyelesaikan tesis ini.

2. Ibu Dr. Noviany, M.Si., selaku Pembimbing Kedua yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, pikiran, selalu bersabar hati dan penuh perhatian

dalam memberikan bimbingan, ilmu, arahan dan dukungan dalam menyelesaikan tesis ini.

3. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, selaku dosen penguji dan Ketua Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung yang telah banyak memberikan masukan, koreksi, kritik dan saran demi kesempurnaan tesis ini.

4. Prof. Sutopo Hadi, Ph.D., selaku Ketua Program Pascasarjana Magister Kimia Universitas Lampung.

5. Seluruh staf dosen dan karyawan Jurusan Kimia FMIPA Unila.

6. Prof. Suharso, Ph.D., selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Lampung. 7. Staf administrasi FMIPA Unila.

8. Bapak Prof. Dr. Ir. H. Sugeng P. Harianto, M.S., selaku Rektor Universitas Lampung.

9. Ayahanda tersayang Drs. Kasimin (Alm.) dan Ibunda tersayang Sri Hariyati, S.Pd., serta Ayahanda tersayang Suhadi atas segala doa yang tak henti menyemai bibit kasih sayang, perhatian, pengertian dan semangat.

10.Mas Kaharudi Setiawan, S.I.Kom., Agustian Kahar Hidayat, S.Pd. & Eka Destiani, A.Md.Keb, Diah Astin Maulina, S.ST., keponakanku tersayang M. Rafi Setiawan dan Inara Ayudia Anjani; serta keluarga besarku tersayang yang senantiasa memberiku doa, semangat, perhatian dan keceriaannya. Kalian adalah penyala semangat, emosi dan jiwaku.

11.Keluarga besar UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung.

12.Teman seperjuangan di Laboratorium Biomassa Terpadu : Yulistia Anggraini dan Tutik. Terima kasih untuk kebersamaan, kisah dan semangat yang sungguh luar biasa.

13.Teman – teman di Magister Kimia Universitas Lampung angkatan 2013: Yulistia Anggraini, Devy Cendekia, Viqqi Kurnianda, M.Si., Bapak Irwan Sudarmanto, Ibu Sri Muwartiningsih, Ibu Tati Fatimah (peer group organik), Tutik, Raffel Stevano, Septhian Try Sulistiyo, Mba Laila Susanti, Ibu Rina Mediasari, Bpk. Rodhiansyah, Bpk. Iip Sugiharta, Mba Wiria Saputri, Ibu Nanik Suwarso, Ibu Nopiani, Ibu Syamsinar, Ibu Nurhaeni, Ni Putu Naris Berdianti, Bpk. Sigit Mariyanto, Bpk. Iwan Sariyanto, Bpk. Nuris Salam, M.Si., Bpk. Bambang Kaidi, Ibu Hastin Kurniasih, Ibu Loecy Antari, Ibu Tri Endah, Widyastuti, Ibu Novi Akam Sabrina, Ibu Suparwati, Mba Novita, Bpk. Yudi, Bpk. Armanto, dan Ibu Ika. Terima kasih atas kebersamaan, kerja sama, semangat, keceriaan dan bantuannya.

14.Teman – teman magister kimia angkatan 2014. Terima kasih atas kebersamaannya.

15.Teman – teman seperjuangan bimbingan Bapak Andi Setiawan, Ph.D. : Yulistia Anggraini, Viqqi Kurnianda, Lia Andriyani, Ari Wibowo Slamet Effendi, Sifa Kusuma Wardani, Fajria Faiza, Miftahur Rahman, Wagiran, Tri, Intan, dan Dewi. Terima kasih atas kebersamaan, kerja sama, semangat, keceriaan dan bantuannya.

16.Teman – teman chemistry 2004. Terima kasih untuk kebersamaannya selalu, semangat, doa dan keceriaannya.

17.Teman – teman dan pihak yang tidak bisa disebut satu per satu. Terima kasih untuk semuanya.

Semoga kebaikan yang telah diberikan mendapat balasan yang berlipat ganda dari Alloh SWT. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penelitian ini. Oleh karena itu, saran dan kritik sangat diharapkan.

Bandar Lampung, Juli 2015 Penulis

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroalga merupakan mikroorganisme akuatik fotosintetik berukuran mikroskopik, yang dapat ditemukan di dalam air tawar dan air laut, paling tidak terdapat pada lokasi yang lembab, serta melakukan proses fotosintesis untuk membuat makanannya sendiri karena termasuk ke dalam jenis makhluk hidup fotoautotrof. Mikroalga memiliki potensi cukup beragam meliputi bidang pertanian, obat-obatan, industri pangan, dan sebagai sumber bioenergi terbaharukan. Berdasarkan nutrisinya, mikroalga merupakan sumber mikronutrisi, vitamin dan trace elemen bagi komunitas perairan (Richmond and Emeritus, 2013; .Barsanti and Gualtieri, 2014).

Terkait kemampuannya mengkonversi energi matahari melalui fotosintesis, mikroalga yang habitatnya di lingkungan perairan memiliki efektivitas dan efisiensi lebih tinggi. Namun dalam perkembangannya, kultivasi mikroalga mengalami beberapa kendala, misalnya kontaminasi bakteri dan besarnya biaya untuk media kultivasi. Oleh karena itu, untuk menggali dan memanfaatkan berbagai potensi mikroalga, perlu dilakukan uji coba kultivasi mikroalga. Dalam penelitian ini, akan dilakukan kultivasi mikroalga dengan memanfaatan media

2

dari limbah cair kelapa sawit (Palm Oil Mill Effluent / POME) yang mengandung bahan organik pada POME dapat dimanfaatkan sebagai sumber karbon untuk media kultivasi. Pemanfaatan POME bertujuan untuk mengurangi biaya kultivasi dan menangani pembuangan limbah yang saat ini dianggap tidak memadai selain beresiko merusak ekosistem juga membutuhkan biaya yang tinggi (Clarent et al., 2010; Lam and Lee, 2011).

Spirulina sp. merupakan salah satu jenis mikroalga yang dapat dikultivasi pada media POME (Hadiyanto et al., 2013). Hasil dari beberapa penelitian, menunjukkan bahwa Spirulina sp. merupakan salah satu spesies mikroalga yang berpotensi untuk dikembangkan. Hal ini disebabkan karena Spirulina sp. mengandung komposisi senyawa kimia dengan nilai gizi dan ekonomi tinggi, seperti mengandung protein, peptida, asam lemak esensial, vitamin, mineral, fikobiliprotein dan eksopolisakarida (Vonshak, 2002; Richmond and Emeritus, 2013).

Senyawa peptida merupakan senyawa dengan molekul yang terbentuk dari dua atau lebih asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Peptida terdapat pada setiap makhluk hidup dan berperan pada beberapa aktivitas biokimia. Senyawa peptida memiliki beragam aktivitas biologis lainnya seperti sebagai antioksidan (Sheih et al., 2010; Samarakon and Jeon, 2012), antikanker (Richmond and Emeritus, 2013), dan antimikroba (Amaral et al., 2012; Richmond and Emeritus, 2013; Tareq et al., 2014).

3

Berdasarkan uraian di atas, senyawa antioksidan merupakan salah satu senyawa yang mendapat perhatian khusus dibidang kajian senyawa bioaktif. Telah diketahui bahwa senyawa antioksidan mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara membentuk radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif, sehingga dapat menghambat kerusakan sel (Samarakon and Jeon, 2012).

Dalam penelitian ini, telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa peptida dari Spirulina sp. yang dikultivasi pada media POME. Lebih lanjut, hasil isolasi senyawa peptida telah diuji antioksidan menggunakan DPPH.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah :

1. Mengisolasi senyawa peptida dari Spirulina sp. yang dikultivasi pada media POME.

2. Mengidentifikasi senyawa peptida yang dihasilkan 3. Menguji antioksidan senyawa peptida yang dihasilkan

C. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi mengenai senyawa peptida sehingga bermanfaat bagi ilmu pengetahuan kimia yang dapat diaplikasi dalam bidang kimia, farmasi dan kedokteran.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Mikroalga

Mikroalga merupakan mikroorganisme akuatik fotosintetik berukuran mikroskopik, yang dapat ditemukan di dalam air tawar dan air laut, terdapat pada lokasi yang lembab, serta melakukan proses fotosintesis untuk membuat makanannya sendiri karena termasuk ke dalam jenis makhluk hidup fotoautotrof. Mikroalga merupakan jenis sel tunggal yang terpisah menyendiri atau berkelompok, tergantung pada jenisnya, ukuran mereka dapat terbentang beberapa mikrometer (µm) hingga beberapa ratus mikrometer. Tidak sama dengan tumbuhan lain, mikroalga tidak mempunyai akar, batang dan daun-daun. Mikroalga mampu untuk melakukan fotosintes, menghasilkan oksigen dan pada waktu yang sama mikroalga mengambil karbondioksida di lingkungannya sehingga mengurangi efek rumah kaca dan meminimalisasi terjadinya global warming, sesuai dengan reaksi berikut:

6 CO2 + 6 H2O + cahaya matahari C6H12O6 (glukosa) + 6 O2 (Anderson, 2005).

5

Klasifikasi mikroalga adalah sebagai berikut : 1. Chlorophyta (alga hijau)

Alga hijau adalah kelompok alga yang paling maju dan memiliki banyak sifat-sifat tanaman tingkat tinggi. Kelompok ini adalah organisme prokariotik dan memiliki struktur-struktur sel khusus yang dimiliki sebagaian besar alga. Mereka memiliki kloroplas, DNA–nya berada dalam sebuah nukleus, dan beberapa jenisnya memiliki flagella. Dinding sel alga hijau sebagaian besar berupa selulosa, meskipun ada beberapa yang tidak mempunyai dinding sel. Mikroalga

mempunyai klorofil a dan beberapa karotenoid, dan biasanya mereka berwarna hijau

rumput. Pada saat kondisi budidaya menjadi padat dan cahaya terbatas, sel akan

memproduksi lebih banyak klorofil dan menjadi hijau gelap. Kebanyakan alga hijau

menyimpan zat tepung sebagai cadangan makanan meskipun ada diantaranya

menyimpan minyak atau lemak.

2. Chrysophyta (alga keemasan)

Alga keemasan sebagian besar termasuk jenis alga yang hidup di air tawar, namun ada juga yang hidup di air laut. Beberapa anggota kelompok alga ini memiliki flagella dan motil. Semua memiliki kloroplas dan memilki DNA yang terdapat di dalam nukleusnya. Alga ini hanya memiliki klorofil a dan c serta beberapa karotenoid seperti fucoxanthin yang memberikan warna kecoklatan. Alga ini seringkali dibudidayakan dalam bentuk uniseluler pada usaha budidaya sebagai sumber pakan. Alga keemasan digolongkan ke dalam 3 kelas, yaitu :

a. Kelas alga hijau-kuning (Xanthophyceae) b. Kelas alga kuning keemasan (Chrysophyceae) c. Kelas diatom (Bacillariophyceae)

6

3. Cyanobacteria (alga biru hijau)

Cyanobacteria atau alga biru hijau adalah kelompok alga yang paling primitif dan memiliki sifat-sifat bakterial dan alga. Kelompok ini adalah organisme prokariotik yang tidak memiliki struktur-struktur sel seperti yang ada pada alga lainnya, contohnya nukleus dan kloroplas. Mereka hanya memiliki klorofil a, namun mereka juga memiliki variasi fikobilin seperti halnya karotenoid. Pigmen-pigmen ini memiliki beragam variasi sehingga warnanya bisa bermacam-macam dari mulai hijau sampai ungu bahkan merah. Alga biru hijau tidak pernah memiliki flagella, namun beberapa filamen membuat mereka bergerak ketika berhubungan dengan permukaan. Unicell, koloni, dan filamen-filamen Cyanobacteria adalah kelompok yang umum dalam budidaya, baik sebagai makan maupun sebagai organisme pengganggu (Kawaroe et al., 2010).

Kondisi yang mempengaruhi pertumbuhan mikroalga :

1. Suhu : suhu optimal yang digunakan untuk kultivasi antara 24-30 oC

2. Nutrien : unsur hara yang dibutuhkan terdiri dari makronutrien (C, H, N, P, K, S, Mg, dan Ca) dan mikronutrien ( Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Mo, Bo, Vn, dan Si)

3. Intensitas cahaya : digunakan untuk mengasimilasi karbon anorganik untuk dikonversi menjadi materi organik

4. Aerasi : dibutuhkan sebagai sumber karbon untuk fotosintesis dalam bentuk CO2 dan dibutuhkan untuk mencegah terjadinya sedimentasi pada sistem kultivasi mikroalga

7

5. Salinitas : digunakan untuk mempertahankan tekanan osmotik yang baik antara protoplasma organisme dengan air sebagai lingkungan hidup

6. Derajat keasaman (pH) : umumnya pH yang digunakan antara 7 – 9 (Kawaroe et al., 2010)

B. Potensi Mikroalga

Mikroalga memiliki peranan penting dalam ekosistem perairan sebagai sumber makanan, pelindung fisik bagi organisme perairan karena dalam biomassa mikroalga mengandung komposisi kimia yang potensial. Mikroalga juga merupakan mikroorganisme fotosintetik yang menjadi salah satu sumber energi baru dan terbarukan berbasis laut. Secara umum, mikroalga mempunyai kandungan lipid sekitar 8 – 15 % dan protein sebanyak 30 – 50 %, selain itu mikroalga juga mempunyai kandungan karbohidrat yang mencapai 20 - 40%. Dari jumlah total karbohidrat, 45-97 % merupakan polisakarida (Richmond and Emeritus, 2013; Barsanti and Gualtieri, 2014).

Pigmen utama mikroalga adalah klorofil hijau, sedangkan untuk karotenoid kuning, orange dan merah sekitar 0,5-5 % berat kering. Kandungan asam nukleat antara 1-10 % berat kering, tetapi umumnya sekitar 4-6 %. Kandungan mineral pada sel alga sekitar 6-10 %. Vitamin utama mikroalga adalah tiamin (B1), riboflavin (B2), pyridoxine (B6), cyanocobalamin (B12), biotin, asam askorbat, asam nikotinat, asam pantotenat, kolin, inositol, tokoferol (E), dan karoten (Barsanti and Gualtieri. 2014).

8

Selain beberapa potensi biokimia di atas, mikroalga juga berpotensi sebagai salah satu alternatif baru sumber energi terbaharukan. Beberapa spesies mikroalga sedang dikembangkan di beberapa negara sebagai penghasil biooil yang dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi biodiesel. Selain itu juga, potensi mikroalga yang saat ini cukup mendapat perhatian khusus adalah sebagai penghasil biohidrogen yang dapat digunakan sebagai energi terbaharukan (Richmond and Emeritus, 2013; Barsanti and Gualtieri, 2014).

C. Limbah Cair Kelapa Sawit (Palm Oil Mill Effluent / POME)

Industri kelapa sawit memiliki suplai energi yang cukup dari pemanfaatan limbah padat (serat dan cangkang sawit). Kelebihan akan ketersedian energi tersebut juga didukung oleh kemudahannya didapat dan investasinya murah. Hal ini menyebabkan pemanfaatan limbah dengan sistem tertutup untuk mendapatkan biogas tidak lagi menarik untuk digunakan. Upaya mengaplikasi POME dengan perlakuan biologi untuk irigasi merupakan suatu metoda yang banyak digunakan di berbagai pabrik kelapa sawit. Permasalahan yang sering terjadi proses ini tidak dilakukan dengan hati-hati. Kesalahan dalam pemanfaatan bahan baku POME dapat menyebabkan kerusakan pada tanah karena tingginya kandungan minyak dan lemak, senyawa asam organik dan senyawa nitrogen, sebagai akibat pemakaian yang berlebih. Beberapa laporan menyatakan bahwa kesalahan pemakaian POME dalam jangka panjang menyebabkan akumulasi magnesium dan menghambat ketersediaan kalium. Dalam kasus ini, kalium harus di

9

tambahkan. Nilai pH tanah (pH 4.5 to 5.5) mungkin juga akan meningkat (Clarent et al., 2010; Lam and Lee, 2011).

Limbah cair kelapa sawit memiliki memiliki kandungan bahan organik yang sangat tinggi. Secara umum POME memiliki nilai pH 4.72 – 5.38, sedangkan nilai BOD5 berkisar antara 1.2000 – 42.000 (mg/L) dan nilai COD antara 16.000 – 66.000 mg/L. Ratio untuk BOD5/COD untuk air limbah dari pabrik kelapa sawit berkisar antara 0.63 – 0.85. Limbah cair kelapa sawit juga mengandung senyawa organik asam sebagai hasil dari proses mikroorganisme. Hasil analisis unsur nutrien pada limbah cair kelapa sawit juga menunjukkan adanya unsur nitrogen, fosfat dan mineral seperti Na, K Mg, Fe, Zn dan Cu. Kajian secara laboratorium menunjukkan nilai pH dari limbah cair kelapa sawit dapat ditingkatkan dengan penambahan senyawa basa. Sedangkan tingginya kandungan bahan organik dapat diturunkan dengan memanfaatkannya terlebih dahulu untuk menghasilkan biogas. Kombinasi dari kedua cara tersebut dapat dimanfaatkan dalam upaya memproduksi biomassa mikroalga (Kawaroe et al., 2010, Hadiyanto et al., 2013).

D. Spirulina sp.

Spirulina sp. adalah mikroalga berwarna hijau kebiruan yang hidupnya tersebar luas dalam semua ekosistem, mencakup ekosistem daratan dan ekosistem perairan baik itu air tawar, air payau, maupun air laut.

10

Klasifikasi Spirulina sp. adalah sebagai berikut :

Kingdom : Protista Divisi : Cyanophyta Kelas : Cyanophyceae Ordo : Nostocales Famili : Oscilatoriaceae Genus : Spirulina Spesies : Spirulina sp.

Gambar 1. Pengamatan Spirulina sp. di bawah mikroskop (Henrickson, 2009).

Spirulina sp. merupakan mikroorganisme autrotrof berwarna hijau-kebiruan dengan sel berkolom membentuk filamen terpilin menyerupai spiral (helix), sehingga disebut alga biru-hijau berfilamen (Cyanobacterium). Bentuk tubuh Spirulina sp. yang menyerupai benang merupakan rangkaian sel yang berbentuk silindris dengan dinding sel yang tipis, berdiameter 1-12 mikrometer. Filamen Spirulina sp. hidup berdiri sendiri dan dapat bergerak bebas (Richmond, 2004; Richmond and Emeritus, 2013).

11

Kandungan protein pada Spirulina sp berkisar antara 63-68 %, kabohidrat 18-20 %, dan lemak 2-3 %, dengan kandungan protein yang tinggi ini maka spirulina sp mempunyai sumber protein yang potensial bagi makhluk hidup. Spirulina sp. mengandung pigmen biru yang umum disebut phycocyanin (pigmen yang dapat meningkatkan kekebalan tubuh dan menghasilkan antikanker). Phycocyanin, protein kompleks yang terdapat lebih dari 20% dalam seluruh berat keringnya, adalah pigmen terpenting dari mikroalga Spirulina.sp. Pigmen ini dapat berfungsi pula sebagai antioksidan, pewarna alami untuk makanan, kosmetika, dan obat-obatan khususnya sebagai pengganti warna sintetik (Richmond, 2004; Richmond and Emeritus, 2013)

E. Senyawa Metabolit

Senyawa metabolit didefinisikan sebagai senyawa dengan berat molekul rendah yang diperlukan mikroorganisme. Beberapa metabolit yang dihasilkan oleh mikroorganisme tampaknya merupakan ciri khas dari tempat mikroorganisme itu berada. Pencarian senyawa metabolit baru seringkali difokuskan pada organisme-organisme yang hidup di tempat yang sifatnya unik. Senyawa metabolit yang bersumber pada bahan alam memiliki berbagai karakteristik (Sukara, 2006).

Senyawa metabolit yang dihasilkan dari mikroalga antara lain karoten (1), eksopolisakarida (2), fikobiliprotein (3) yang ditunjukkan pada Gambar 2. (Barsanti and Gualtieri, 2014).

12

Gambar 2. Senyawa metabolit dari mikroalga

F. Senyawa Peptida

Senyawa peptida merupakan senyawa dengan molekul yang terbentuk dari dua atau lebih asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Peptida terdapat pada setiap makhluk hidup dan berperan pada beberapa aktivitas biokimia. Peptida dapat berupa enzim, hormon, antibiotik, dan reseptor. Ikatan peptida terjadi jika atom nitrogen pada salah satu asam amino berikatan dengan gugus karboksil dari asam amino lain (Lehninger, 1998)

 Peptida tunggal : Peptida yang mengandung 2-10 asam amino

13

Senyawa peptida memberikan reaksi kimia yang khas, dua tipe reaksi yang terpenting yaitu hidrolisis ikatan peptida dengan pemanasan polipeptida dalam suasana asam atau basa kuat (konsentrasi tinggi). sehingga dihasilkan asam amino Hidrolisa ikatan peptida dengan cara ini merupakan langkah penting untuk menentukan komposisi asam amino dalam sebuah protein dan sekaligus dapat menetapkan urutan asam amino pembentuk protein tersebut. Asam amino ditunjukkan pada Tabel 1. (Poedjadi, 1994).

Tabel 1. Asam amino esensial dan non esensial

Esensial Non Esensial

Fenilalanin (Phe) _{Asam glutamat (Glu)}

Triptofan (Trp)

Glutamin (Gln)

Isoleusin (Ile)

Glisin (Gly)

14

Lisin (Lys)

Asparagin (Asn)

Metionin (Met)

Alanin (Ala)

Treonin (Thr)

Prolin (Pro)

Valin (Val) _{Serin (Ser)}

Arginin (Arg) Tirosin (Tyr)

15

Beberapa contoh senyawa peptida contohnya aprotoksin (Gutierrez, et al., 2008), Symplostatin 1 (Moobery et al., 2003) dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur senyawa a. aprotoksin D aprotoksin, b. symplostatin 1

G. Metode Pemisahan Senyawa 1. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Prinsip ekstraksi didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling

16

bercampur (Khopkar, 2002). Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk fasa yang diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair-padat. Untuk ekstraksi cair-cair dapat menggunakan corong pisah, sedangkan ekstraksi cair-padat terdiri dari beberapa cara yaitu maserasi, perkolasi dan sokletasi (Harborne, 1984).

Maserasi merupakan proses ekstraksi dengan cara perendaman sampel menggunakan pelarut organik pada suhu ruang. Proses ini sangat menguntungkan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam karena dengan perendaman sampel akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik serta struktur senyawa tidak akan mudah rusak (Harborne, 1984).

2. Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan dua atau lebih senyawa yang terdistribusi antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi dapat dibedakan berdasarkan kedua fasa tersebut, yaitu kromatografi padat-cair (kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas, kromatografi kolom), kromatografi cair-cair dan kromatografi gas-cair (Hostettman et al., 1995). Adapun kromatografi yang dipakai pada penelitian ini adalah kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom (KK).

17

a. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu kromatografi padat-cair yang fase diamnya direkatkan pada lempengan tipis alumunium atau kaca. KLT digunakan untuk mengidentifikasi komponen dan mendapatkan eluen yang tepat untuk kromatografi kolom dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal), kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (Hostettman et al., 1995).

Pada kromatografi lapis tipis, fasa diam (adsorben) yang sering digunakan adalah serbuk silika gel, alumina dan selulosa yang mempunyai ukuran butir sangat kecil, yaitu 0,063-0,125 mm. Fasa diam yang umum digunakan adalah silika gel yang dapat dipakai untuk memisahkan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil (Hostettman et al., 1995).

Komponen-komponen senyawa yang dianalisis dapat dipisahkan dan dibedakan berdasar harga Rf (Retention Factor/Faktor retensi). Faktor retensi didefinisikan sebagai perbandingan jarak perjalanan suatu senyawa dengan jarak perjalanan suatu pelarut (eluen) pada suatu waktu yang sama.

Jarak perjalanan suatu senyawa Rf =

18

Harga Rf ini bergantung pada beberapa parameter yaitu sistem pelarut, adsorben (ukuran butir, kandungan air, ketebalan), jumlah bahan yang ditotolkan pada plat, dan suhu (Khopkar, 2002). Proses elusi pada kromatografi dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 4. Proses elusi pada kromatografi lapis tipis

Keuntungan kromatografi lapis tipis adalah dapat memisahkan senyawa yang sangat berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintesis, kompleks organik dan anorganik serta ion anorganik dalam waktu singkat menggunakan alat yang tidak terlalu mahal. Metode ini kepekaannya cukup tinggi dengan jumlah cuplikan beberapa mikrogram. Kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah dapat digunakan pereaksi asam sulfat pekat yang bersifat korosif, kelemahannya adalah harga Rf yang tidak tetap (Hostettman et al., 1995).

19

b. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi. Terjadinya pemisahan komponen-komponen suatu zat dalam eluen yang bergerak melalui fasa diam sebagai adsorben, karena adanya perbedaan daya adsorpsi pada komponen-komponen tersebut. Fasa diam diisikan ke dalam kolom gelas, sedangkan eluennya disesuaikan dengan sampel yang akan dipisahkan. Metode elusi dapat dilakukan dengan elusi isokratik atau elusi landaian. Elusi isokratik adalah adanya penggunaan eluen yang tidak berubah selama proses pemisahan berlangsung. Elusi gradien adalah kebalikan dari isokratik, dimana terjadi pergantian eluen yang dipakai saat proses pemisahan berlangsung (Johnson dan Stevenson, 1991).

Menurut Hostettman et al., (1995) bahwa berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, kromatografi kolom dapat dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu :

1. Kromatografi kolom fasa normal (Normal phase)

Pada kromatografi ini, fasa diam yang digunakan bersifat polar sedangkan fasa gerak bersifat non polar, sehingga komponen yang memiliki kepolaran paling rendah akan terelusi lebih dulu.

2. Kromatografi kolom fasa terbalik (Reversed phase)

Pada kromatografi ini, fasa diam yang digunakan bersifat non polar sedangkan fasa gerak bersifat polar, sehingga komponen yang memiliki kepolaran paling tinggi akan terelusi lebih dulu.

20

c. High Peformance Liquid Chromatography (HPLC)

High Peformance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak. cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Hostettmann et al., 1998; Johnson and Stevenson, 1991). Kelebihan itu antara lain:

• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

• mudah melaksanakannya

• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

• dapat menghindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

• resolusi yang baik

• dapat menggunakan bermacam-macam detektor

• kolom dapat digunakan kembali

• mudah melakukan "sample recovery"

Secara khusus, HPLC juga memainkan peran penting dalam kajian tingkat lanjut bidang biologi dan biomedik. Metode analisis sampel yang paling umum digunakan adalah HPLC fasa terbalik (fasa gerak lebih polar dari fasa diam),

meskipun mekanisme pemisahan HPLC fasa normal (fasa diam lebih polar dari fasa gerak) juga bisa digunakan (Aguilar, 2008). HPLC fasa terbalik melibatkan pemisahan molekul berdasarkan hidrofobisitas seperti terlihat pada Gambar 5.

21

Gambar 5. Skema interaksi peptida dengan ligan hidrofobik amobil

Hasil pemisahan pada HPLC fasa terbalik bergantung pada sifat ikatan hidrofobik

molekul terlarut dalam fasa gerak terhadap ligan hidrofobik amobil yang terikat

pada fasa diam. Secara teknis, campuran zat terlarut mula-mula diaplikasikan pada kolom menggunakan alat suntik (injector) dan dielusi dengan pelarut organik

sebagai fasa gerak. Seperti pada kromatografi kolom, proses elusi dapat berupa

isokratik atau dengan elusi landaian. Komponen campuran zat terlarut dielusi

berdasarkan peningkatan hidrofobisitas. Komponen yang bersifat hidrofil akan

cenderung lebih mudah terelusi dibandingkan komponen hidrofobik (Aguilar, 2008).

H. Antioksidan

Antioksidan adalah sebagai senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit karsinogenis, kardiovaskuler dan penuaan. Antioksidan diperlukan karena tubuh manusia tidak memiliki sistem pertahanan antioksidan yang berlebihan, sehingga apabila terjadi paparan radikal berlebihan, maka tubuh akan membutuhkan antioksidan eksogen (berasal dari luar) (Rohman dan Riyanto, 2005).

22

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi utama antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan disingkat (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal bebas. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal bebas kebentuk lebih stabil (Gordon 1990).

Gambar 6. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal bebas (Gordon, 1990)

Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi tiga golongan, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier. Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa radikal bebas baru. Contoh antioksidan ini adalah enzim superoksida dismutase (SOD) yang berfungsi sebagai pelindung hancurnya sel-sel dalam tubuh serta mencegah proses peradangan karena radikal bebas. Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin E,

23

vitamin C, dan β-karoten. Antioksidan tersier berfungsi memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas. Sebagai contoh adalah metionin sulfoksidan reduktase, enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel. Adanya enzim yang dapat memperbaiki DNA ini berguna untuk mencegah penyakit kanker (Antholovich, 2002).

Salah satu metode pengukuran antioksidan yang umum digunakan yaitu dengan menggunakan radikal bebas stabil diphenilpycrylhydrazil (DPPH). Pada metode ini, larutan DPPH yang berperan sebagai radikal bebas akan bereaksi dengan senyawa antioksidan, sehingga DPPH akan berubah menjadi diphenilpycrilhydrazine yang bersifat non-radikal dapat dilihat pada Gambar 7. berikut. Meningkatnya jumlah diphenilpycrilhydrazine akan ditandai dengan perubahan warna ungu pada larutan menjadi warna kuning pucat. Hasil dari metode DPPH umumnya dibuat dalam bentuk IC50 (Inhibitor Concentration 50), yang didefinisikan sebagai konsentrasi larutan substrat atau sampel yang akan menyebabkan tereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin besar aktivitas antioksidan maka nilai IC50 akan semakin kecil. Molyneux (2004) menyatakan bahwa suatu senyawa antioksidan dinyatakan baik jika nilai IC50-nya semakin kecil (Molyneux, 2004).

24

I. Identifikasi

1. Spektroskopi Ultra Violet – Visible (UV-Vis)

Spektrofotometri UV-Vis adalah teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik UV (200 – 400 nm) dan visible (400 – 800 nm) dengan menggunakan instrumen spetrofotometer. Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibanding kualitatif. Bila suatu molekul menyerap cahaya UV-Vis, maka sebuah elektron akan dipromosikan dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi kemudian kembali ke keadaan dasar. Salah satu cara molekul tereksitasi dengan elektron-elektron dalam keadaan berenergi terendah kemudian kembali ke keadaan dasar yaitu dengan melepaskan energinya dalam bentuk cahaya. Terdapat tiga macam distribusi elektron di dalam suatu molekul organik, yaitu orbital elektron phi (π), orbital elektron sigma (σ), orbital elektron tidak berpasangan (n) (Silverstein et al., 2005).

2. Spektroskopi Fourier Transform Infrared (FTIR)

Pada dasarnya spektrofotometer FTIR adalah sama dengan Spektrofotometer Infra Red dispersi, perbedaannya adalah pengembangan pada sistem optiknya sebelum berkas sinar infra merah melewati contoh. Dari deret Fourier tersebut intensitas gelombang dapat digambarkan sebagai daerah waktu atau daerah frekuensi. Perubahan gambaran intensitas gelombang radiasi elektromagnetik dari daerah

25

waktu ke daerah frekwensi atau sebaliknya disebut Transformasi Fourier (Fourier Transform). Selanjutnya pada sistem optik peralatan instrumen Fourier Transform Infra Red dipakai dasar daerah waktu yang non dispersif (Silverstein et al., 2005).

Secara keseluruhan, analisis menggunakan spektrofotometer ini memiliki dua kelebihan utama dibandingkan Spektrofotometer Infra Red dispersi yaitu :

 Dapat digunakan pada semua frekuensi dari sumber cahaya secara simultan sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat.

 Sensitifitas dari metoda Spektrofotometri FTIR lebih besar daripada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistem detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui celah (Hsu, 1994).

Spektroskopi FTIR merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa organik. Gugus fungsi ini dapat ditentukan berdasarkan vibrasi dari tiap atom. Prinsip kerja dari metode ini adalah sinar yang terserap menyebabkan molekul dari senyawa tervibrasi dan energi vibrasi diukur oleh detektor dan energi vibrasi dari gugus fungsi tertentu akan menghasilkan frekuensi yang spesifik. Alat ini mempunyai kemampuan lebih sensitif dibanding dengan alat dispersi dan dapat digunakan pada daerah yang sangat sulit atau tidak mungkin dianalisis dengan alat dispersi. Radiasi infra merah mempunyai spektrum elektromagnetik pada bilangan gelombang 4000 – 400 cm-1 atau panjang gelombang dari 0,78-1000 µm.

26

Penggunaan spektrum infra merah untuk menentukan gugus fungsi suatu struktur senyawa organik biasanya antara 4000-400 cm-1 (2.5 sampai 25 µm). Daerah di bawah frekuensi 400 cm-1 (25 µm) disebut daerah infra merah jauh, dan daerah di atas 4000 cm-1 (2.5 µm) disebut daerah inframerah dekat (Silverstein et al., 1986).

Tabel 2. Serapan gugus fungsi

Gugus fungsi Bilangan gelombang (cm-1)

C=O keton 1700 - 1725

C=O aldehida 1720 - 1740 C=O asam karboksilat 1700 - 1725

C=O ester 1735 - 1750

C=O amida 1630 - 1690

Amida 1240 – 1300

C – O, C - C 1000 - 1178

C≡N nitril 2220 – 2260

C=C aromatik 1650 - 1450

C=C alkena 1640 - 1680

N-H amina 3300 – 3500

N-H Amida 3500 – 3800

O-H alkohol 3200 - 3600

O-H asam karboksilat 3600 - 2500

C-H alkana 3000 - 2850

C-H alkena 3020 - 3000

C-H alkuna 3030 - 3000

C-H aromatik 3050 – 3070

C-O eter 1120 – 1140

C-O ester 1300 – 1000

P = O 1085

27

3. Spektroskopi Liquid Chromatography/Mass Spectroscopy (LC/MS)

Spektrokopi LC/MS merupakan dua alat yang digabungkan menjadi satu, yang berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan kepolarannya, kromatografi cair dapat dengan aman memisahkan rentang yang sangat luas untuk senyawa organik, seperti peptida dan protein (Agilent technologies, 2001; Eichhorn and Knepper, 2001). Di dalam kolom terjadi pemisahan yang dipengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam senyawa-senyawa dalam kolom sehingga senyawa yang akan keluar atas berdasarkan perbedaan kepolaran. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama (Skoog et al., 2013; Silverstein et al., 2005).

Sampel yang telah terpisah dengan liquid chromatography diidentifikasi berat molekulnya menggunakan mass spectroscopy. Hasil spektrum mass spectroscopy berupa perbandingan antara intensitas (%) terhadap massa (m/z). Intensitas (%) yang paling tinggi sebagai base peak dan mass (m/z) yang paling besar sebagai [M+H+] (Silverstein et al., 2005). Diagram skema LC/MS dapat dilihat pada Gambar 8.

Dalam alat LC/MS, memiliki sumber ion dengan teknik ionisasi berdasarkan tingkat polaritasnya terbagi menjadi tiga yaitu Atmospheric Pressure Photoionization (APPI) yaitu digunakan dengan kromatografi fase normal untuk senyawa yang sangat nonpolar dan tingkat aliran rendah (<100 ml / menit),

28

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) yaitu digunakan dengan kromatografi fase normal karena analit biasanya nonpolar dan Electrospray Ionization (ESI) yaitu menggunakan kromatografi fasa terbalik yang sangat berguna untuk menganalisis molekul dari ukuran kecil sampai ukuran besar yang bersifat polar maupun sangat polar (Agilent technologies, 2001).

Gambar 8. Diagram skema sistem LC/MS (Kazakevich and Lobrutto, 2007)

Contoh spektrum massa dari senyawa peptida dapat dilihat pada Gambar 9.

Gambar 9. Spektrum massa dari senyawa oktapeptida (Agilent technologies, 2001)

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2014 – Mei 2015 di UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung, analisis FTIR dilaksanakan di UGM Yogyakarta, dan analisis LC/MS dilaksanakan di LIPI Serpong.

B. Alat dan bahan 1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah culture flash, gelas kimia, labu ukur, gelas ukur, pipet ukur, erlenmeyer, corong kaca, tabung reaksi, rak tabung reaksi, spatula, akuarium, lampu, selang, pompa aerator, lampu UV, kain saring 400 mesh, pinset, sentrifuse, kaca preparat, mikroskop (Axioo 10 Carl-Zeiss), oven, neraca analitik, botol sampel, desikator, lemari pendingin, lampu UV (kohler/SN402006), chamber, pinset, kolom, HPLC (Shimadzu/LC-20A Prominence), MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) (Buchi/Sepacoterm), microplate reader (Hospitex Diagnostics), spektrofotometer UV-Vis (Varian/Cary 50 Probe), spektrofotometer FTIR (Shimadzu Prestige-21), spektrofotometer LC/MS Mariner.

30

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spirulina sp. dari BBPBL - Lampung, akuades, alkohol 70%, air laut, limbah POME, kertas saring, indikator pH universal, natrium karbonat, natrium hidroksida, asam klorida, asam sulfat, glukosa, natrium dihidrogen fosfat.monohidrat, dinatrium hidrogen fosfat tujuh hidrat, ammonium sulfat, tembaga sulfat lima hidrat, natrium klorida, media Conway/Walne, pupuk (Urea, ZA, TSP), Amberlite XAD 16 (Sigma), Cosmosil 75C18 - OPN, silika, plat KLT C18, plat KLT silika, alumunium foil, plastik wrap, kapas, kasa, pereaksi ninhidrin, pereaksi dragendorf, pereaksi serium sulfat, isopropanol, etanol, diklorometana, metanol, asam askorbat dan DPPH.

C.Metode Penelitian 1. Kultivasi Spirulina sp.

Spirulina sp. dikultivasi pada media POME 5%. Pembuatan media kultivasi diawali dengan mengatur derajat keasaman dari nilai pH 4 menjadi nilai pH 8 – 10 yang sesuai untuk pertumbuhan Spirulina sp., dengan cara menambahkan 4 gram Na2CO3 ke dalam 1 Liter POME. Kemudian membuat media pupuk (0,03 gram ZA, 0,03 gram Urea, 0,01 gram TSP untuk 1 Liter air laut, Anindiastuti et al., 2007) yang di dalamnya mengandung POME. Untuk kultivasi awal dilakukan adaptasi pada media POME 5%, 10% dan 15% dengan skala 250 mL. Setelah itu, bibit Spirulina sp. dikultivasi yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari, serta dilakukan pengamatan secara mikroskopik.

31

Kultivasi Spirulina sp. dilakukan menggunakan akuarium skala 80 L menggunakan media POME 5% yang dilengkapi dengan sistem aerasi udara, sistem pencahayaan dengan sinar matahari dan berlangsung selama 10 – 14 hari.

2. Pemanenan Spirulina sp.

Spirulina sp. yang telah dikultivasi selama 2 minggu dilakukan pemanenan menggunakan kain saring berukuran 400 mesh (Vonshak, 2002). Biomassa dan filtrat Spirulina sp. ditampung di wadah terpisah.

3. Isolasi Senyawa Peptida

Sebanyak 50 gram biomassa Spirulina sp. ditambah dengan 100 mL air, kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Selanjutnya padatan diekstraksi menggunakan pelarut metanol : air (7 : 3), kemudian diultrasonifikasi selama 30 menit. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC, kemudian dilakukan pemisahan antara filtrat dan padatan. Filtrat yang didapat, dikeringkan menggunakan rotary evaporator.

Sebanyak 5 L filtrat Spirulina sp. dilakukan isolasi metode kromatografi kolom secara ionik berdasarkan pertukaran ion menggunakan resin XAD 16 (Visscher et al., 2008), kemudian dielusi dengan etanol 30%, isopropanol 20%, isopropanol 40% dan isopropanol 70% pH 2. Fraksi isopropanol 70% pH 2 adalah fraksi yang positif, fraksi tersebut dikeringkan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak yang

32

didapat diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis dengan C18 sebagai fase diam dan metanol : air + TFA 0,1% (8 : 1) sebagai fase gerak, kemudian dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom sesuai dengan kondisi tersebut. Fraksi yang positif mengandung senyawa peptida diidentifikasi menggunakan MPLC, menggunakan kolom C18 dielusi secara gradien dengan eluen MeOH : H2O.

4. Uji Antioksidan

Uji aktivitas antioksidan juga dilakukan secara kuantitatif menggunakan microplate reader (Anggraini, 2012). Ekstrak kasar (± 2 mg) dilarutkan dalam metanol sehingga diperoleh kadar 2000 ppm. Sampel dimasukkan ke dalam plate 96-well sebanyak 100 l dan ditambah dengan 100 l larutan DPPH 0,2 mM dalam metanol. Blanko yang digunakan adalah metanol. Sampel dan blanko yang sudah ditambahkan larutan DPPH diinkubasi di ruang gelap pada suhu kamar selama 30 menit lalu diukur pada panjang gelombang 492 nm menggunakan microplate reader. Reaksi positif akan memberikan perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Persentasi peredaman radikal DPPH oleh senyawa antioksidan dihitung berdasarkan persamaan :

Dimana Ablank merupakan absorbansi balnko dan Atest merupakan absorbansi ekstrak sampel.

33

5. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV – Vis

Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan dilakukan analisis menggunakan spektrofotometer UV – Vis dengan pelarut metanol pada panjang gelombang 200

– 400 nm.

6. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer FTIR

Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian di pres pada pelet KBr dengan perbandingan sampel dan KBr 1 : 100. Background yang digunakan adalah pelet KBr murni. Spektrum direkam pada mode transmitan pada bilangan gelombang 4000–400 cm-1.

7. Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer LC/MS (Liquid Chromatography/Mass Spectroscopy)

Sampel senyawa peptida yang telah dimurnikan kemudian dilakukan analisis LC/MS Mariner dengan metode flow rate 0,05 mL/min, volume injeksi 2 L, eluen metanol.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :

1. Spirulina sp. dapat dikultivasi pada media POME 5%, tanpa mempengaruhi bentuk spiral dan diameter hifa (8,78 µm).

2. Spirulina sp. mengeksresikan senyawa peptida yang bersifat polar, UV aktif, dan memiliki aktivitas antioksidan sebesar 14,30% menggunakan metode DPPH.

3. Identifikasi senyawa peptida DN571-8 menggunakan spektrofotometer FTIR menunjukkan adanya serapan uluran C=O amida pada daerah 1635,64 cm-1 .

4. Identifikasi senyawa peptida DN571-8 menggunakan LCMS menunjukkan senyawa dengan nilai m/z 982,0037 dengan rumus molekul C53H78N10O8 yang merupakan salah satu senyawa homolog Microcystin dengan asam amino Ala, Val, Arg, Leu, Phe.

56

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh pada penelitian ini, untuk penelitian selanjutnya disarankan :

1. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut mengenai identifikasi struktur senyawa peptida yang dihasilkan menggunakan 1H dan 13C NMR.

2. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut untuk menentukan stereostruktur dari senyawa peptida yang dihasilkan.

3. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut mengenai efektivitas aktivitas antioksidan yang dihasilkan.

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2001. Basic of LC/MS Agilent. USA. 5988-2045EN.

Aguilar, M.I.. 2008. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. Pp 9-22 In: HPLC of Peptides and Proteins:Methods and Protocols. M.I. Aguilar (ed). Springer-Verlag. New York. Pp 395.

Aitken, A. and M. P. Learmonth. 2008. Protein Determination by UV Absorption.

The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition. Humana Press Inc., Totowa.

Amaral, A. C., O. N. Silva, N. C.C.R. Mundim, M. J.A. de Carvalho, L. Migliolo, J. R.S.A. Leite , M. V. Prates, A. L. Bocca, O. L. Franco, M. S.S. Felipe. 2012. Predicting Antimicrobial Peptides from Eukaryotic Genomes: In Silico Dtrategies to develop Antibiotics. Peptides. 37: 301–308.

Anderson, R.A. 2005. Algal Culturing Technique. Elsevier Academic Press. London. 2005.

Aneiros, A. and, Anoland Garateix. 2004. Bioactive peptides from marine sources: pharmacological properties and isolation procedures. J. Chromatogr. B 803: 41–53.

Anggraini, Y. 2012. Penapisan dan Karakterisasi Senyawa Antioksidan Actinomycetes yang Berasosiasi dengan Sponga. Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Anindiastuti, H. A. Sarwono, dan A. Antoro. 2007. Budidaya Zooplankton dan Fitoplankton. Balai Besar Pengembangan Budidaya Laut Lampung. Padang Cermin.

Antolovich, M., P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, and K. Robards. 2002. Methods for Testing Antioxidant Activity. Analyst. 127: 183–198. Barsanti, L. and P. Gualtieri. 2014. Algae Anatomy, Biochemistry and

Biotechnology Second Edition. Taylor & Francis Group, the academic division of T&F Informa plc. 2014.

58

Clarent, A.F, Resurreccion EP, White MA, Colosi LM. 2010. Environmental life cycle comparison of algae to other bioenergy feedstocks. Environ Sci Technol 2010;44:1813–9.

Colegate, S. M. and R.J. Molyneux, 2009. Bioactive Natural Product, Detection, Isolation and Structural Determination Second Edition. CRC Press. Taylor and Francis Group. US. 2009.

Eichhorn, P. and Knepper,T.P. 2001. Electrospray ionization mass spectrometric studies on the amphoteric surfactant cocamidopropylbetaine. J. Mass Spectroscopy, 36: 677-684.

Gordon, M.H 1990. The Mechanism of Antioxidants Action In Vitro. Di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. London: Elsivier Applied Science. Gutierrez, M., T.L. Suyama, N. Engene, J.S. Wingerd, T. Matainaho, W.H.

Gerwick,. 2008. Apratoxin D, a Potent Cytotoxic Cyclodepsipeptide from Papua New Guinea Collections of the Marine Cyanobacteria Lyngbya majuscula and Lyngbya sordida. J. Nat. Prod. 71: 1099–1103.

Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Alih bahasa oleh K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit ITB. Bandung. 354 hlm.

Hadiyanto, M. Christwardana, and D. Soetrisnanto. 2013. Phytoremediation of Palm Oil Effluent Mill (POME) by Using Aquatic Plants and Microalgae for Biomass Production. J. Env. Science and Technology 6 (2), 79-90 : 2013 Henrikson, R. 2009. Earth Food Spirulina. Ronore Interprise Inc. USA.

Hostettman, K., Hostettman, M dan Marston, A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hal. 1-38

Hsu, C.P. S. 1994. Infrared Spectroscopy. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry.

Huang, R.M., Ma. W., Jun-De.D., Xue-Feng.Z., Xu, T., Lee, K.J., Yang, X., Shi-Hai, X and Liu, Y. 2010. A New 1,4-Diazepine from South China Sea Marine Sponge Callyspongia Species. Molecules Journal, 15: 871-877.

Hunt, D. F., J. R. Yates, J. Shabanowitz, S. Winston, and C. R. Hauer. 1986. Protein Sequencing By Tandem Mass Spectrometry. Proc. Nati. Acad. Sci. Usa Vol. 83, Pp. 62334237.

Johnson, E. L. dan R.Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Diterjemahkan oleh K.Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. 365 Hal.

59

Jork, H., W. Funk, W. Fischer, and H. Wimmer. 1990. TLC Reagents & Detection Methods – Physical & Chemical Detection Methods: Fundamentals, Reagents,I, Vol. 1a

Kawaroe, M., T. Prartono, A. Sunuddin, D. W. Sari, dan D. Augustine. 2010. Mikroalga Potensi dan Pemanfaatannya Untuk Produksi Bio Bahan Bakar. IPB Press. Bogor.

Kazakevich, Y., and R. Lobrutto. 2007. HPLC for Pharmacheutical Scientist. Wiley Interscience A. John Willey and Son. New Jersey. 34 Hal.

Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.Saptorahardjo. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Hal.84-311

Krishnamurthy, T., L. Szafraniec, D. F. Hunt, J. Shabanowitz, J. R. Yates, C. R. Hauer, W. W. Carmichael, O. Skulberg, G. A. Coddi, And S. Missler. 1989. Structural Characterization Of Toxic Cyclic Peptides From Blue-Green Algae By Tandem Mass Spectrometry. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 770-774.

Lam,M.K., and K. T. Lee. 2011. Renewable and sustainable bioenergies production from palm oil mill effluent (POME): Win–win strategies toward better environmental protection. Biotechnology Advances 29 (2011) 124–141 Lehninger. 1998. Dasar – Dasar Biokimia Jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta. Liang, L. 2003. Investigation of Secondary Metabolites of North Sea Bacteria:

Fermentation, Isolation, Structure Elucidation and Bioactivity. Dissertation Institut für Organische Chemie der Universität. Gottingen.

Nathaniel I. Martin, Haijing Hu, Matthew M. Moake, John J. Churey, Randy Whittal, Randy W. Worobo, and John C. Vederas. 2003. Isolation, Structural Characterization, and Properties of Mattacin (Polymyxin M), a Cyclic Peptide Antibiotic Produced by Paenibacillus kobensis M. The Journal Of Biological Chemistry Vol. 278, No. 15, Issue of April 11, pp. 13124–13132, 2003

Maquelin, K., C. Kirschner, L.-P. Choo-Smith, N. v. d. Braak, H. P. Endtz, D. Naumann, & G. J. Puppels. 2002. Identification of medically relevant

microorganisms by vibrational spectroscopy’. J. Microbiol. Methods 2002. 51, 255–271.

Mbah, J.A., Ngemenya, M.N., Abawah, A.L., Babiaka, S.B., Nubed, L.N., Nyongbela, K.D., Lemuh, N.D. and Efange, S. M. 2012. Bioassay-guided discovery of antibacterial agents: in vitro screening of Peperomia vulcanica, Peperomia fernandopoioana and Scleria striatinux. Journal Annals Of Clinical Microbiology And Antimicrobials, 11:10.

60

Molyneux. P. 2004. The Use Of The Stable Free Radical Dyhenylpicrylhydrazil (DPPH) For Estimating Antioxidant Activity. Journals science and technology: 26:211-219

Mooberry, S. L., R. M. Leal, T. L.Tinley, H. Luesch, R. E. Moore, T. H. Corbett. 2003. The Molecular Pharmacology of Symplostatin 1: a New Antimitotic Dolastatin 10 Analog. Int. J. Cancer. 104: 512–521.

Nat, R. 1979. Characterization Of Bacteria, Antibiotics Of The Fluoroquinolone Type And Their Biological Targets DNA And Gyrase Utilizing The Unique Potential Of Vibrational Spectroscopy. Universität Jena. Erfurt.

Richmond, Amos. 2004. Handbook of Microalgal Culture : Biotechnology and Apllied Phychology. Blackwell Science Ltd. 2004.

Richmond, A. and Emeritus. 2013. Handbook of Microalgal Culture Applied Phycology and Biotechnology. Wiley-Blackwell

Rohman A, Riyanto S. 2005. Daya antioksidan ekstrak etanol daun kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) secara in-vitro. Majalah Farmasi Indonesia 16(3):136-140.

Samarakon, K. And Y. J. Jeon. 2012. Bio-functionalities of proteins derived from marine algae — A review. Food Research International 48 (2012) 948–960 Sheih,I. C., T. J. Fang, T. K. Wu, and P. H. Lin. 2010. Anticancer and

Antioxidant Activities of the Peptide Fraction from Algae Protein Waste. J. Agric. Food Chem. 58: 1202–1207.

Silverstein, R.M., G.C. Bassler dan T.C. Morril. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Edisi keempat. Alih bahasa A.J. Hartono dan Purba A.V. Erlangga. Jakarta. Hal. 3-330.

Silverstein, R.M., Webster, F.X. and Kiemle, D.J. 2005. Spectrometric Identification Of Organic Compounds. 7th edition. State University of New York. John Wiley & Sons, Inc.

Sivonen, K., W. W. Carmichael, M. Namikoshi, K. L. Rinehart, A. M. Dahlem,And S. I. Niemela. 1989. Occurrence Of The Hepatotoxic Cyanobacterium Nodularia Spumigena In The Baltic Sea And Structure Of The Toxin. Applied And Environmental Microbiology. Vol. 55, No. 8. P. 1990-1995.

Sivonen, K., W. W. Carmichael, M. Namikoshi, K. L. Rinehart, A. M. Dahlem,And S. I. Niemela. 1990. Isolation And Characterization Of Hepatotoxic Microcystin Homologs From The Filamentous Freshwater Cyanobacterium Nostoc Sp. Strain 152. Applied And Environmental Microbiology, Sept. 1990, Vol. 56, No. 9. P. 2650-2657

61

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, J.F. and Crouch, S.R. 2013. Fundamental of Analytical Chemistry. 9th Edition. Nelson Education, Ltd.

Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Oraganik. Ghalia Indonesia. Bandung. 285 Hal.

Sukara, E. 2006. Biotrends. Puslit Bioteknologi LIPI. Majalah Populer Bioteknologi. Vol. 1 No.2

Tareq, F. S., M. A. Lee, H. S. Lee, J. S. Lee, Y. J. Lee, and H. J. Shin. 2014. Gageostatins A–C, Antimicrobial Linear Lipopeptides from a Marine Bacillus subtilis. Mar. Drugs. 12: 871-885.

Visscher, L. A. M., M. J. V. Belkum, S. G. Tsodikova, R. M. Whittal, J. Zheng, L. M. McMullen, and J. C. Vederas. 2008. Isolation and Characterization of Carnocyclin A, a Novel Circular Bacteriocin Produced by Carnobacterium maltaromaticum Ual30. Applied And Environmental Microbiology, Aug. 2008, p. 4756–4763 Vol. 74, No. 15

Vonshak, A. 2002. Spirulina Platensis (Arthrospira) : Physiology, Cell-Biology and Biotechnology. Taylor and Francis e-library 2002.

Wu, Q., C. Zheng, Z.-X. Ning and B. Yang. 2007. Modification of Low Molecular Weight Polysaccharides from Tremella Fuciformis and Their Antioxidant Activity in Vitro. J. Mol. Sci. 2007, 8, 670-679

56

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh pada penelitian ini, untuk penelitian selanjutnya disarankan :

1. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut mengenai identifikasi struktur senyawa peptida yang dihasilkan menggunakan 1H dan 13C NMR.

2. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut untuk menentukan stereostruktur dari senyawa peptida yang dihasilkan.

3. Perlu adanya pengkajian lebih lanjut mengenai efektivitas aktivitas antioksidan yang dihasilkan.

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2001. Basic of LC/MS Agilent. USA. 5988-2045EN.

Aguilar, M.I.. 2008. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. Pp 9-22 In: HPLC of Peptides and Proteins:Methods and Protocols. M.I. Aguilar (ed). Springer-Verlag. New York. Pp 395.

Aitken, A. and M. P. Learmonth. 2008. Protein Determination by UV Absorption. The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition. Humana Press Inc., Totowa. Amaral, A. C., O. N. Silva, N. C.C.R. Mundim, M. J.A. de Carvalho, L. Migliolo,

J. R.S.A. Leite , M. V. Prates, A. L. Bocca, O. L. Franco, M. S.S. Felipe. 2012.

Predicting Antimicrobial Peptides from Eukaryotic Genomes: In Silico Dtrategies to develop Antibiotics. Peptides. 37: 301–308.

Anderson, R.A. 2005. Algal Culturing Technique. Elsevier Academic Press. London. 2005.

Aneiros, A. and, Anoland Garateix. 2004. Bioactive peptides from marine sources: pharmacological properties and isolation procedures. J. Chromatogr. B 803: 41–53.

Anggraini, Y. 2012. Penapisan dan Karakterisasi Senyawa Antioksidan Actinomycetes yang Berasosiasi dengan Sponga. Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Anindiastuti, H. A. Sarwono, dan A. Antoro. 2007. Budidaya Zooplankton dan Fitoplankton. Balai Besar Pengembangan Budidaya Laut Lampung. Padang Cermin.

Antolovich, M., P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, and K. Robards. 2002. Methods for Testing Antioxidant Activity. Analyst. 127: 183–198. Barsanti, L. and P. Gualtieri. 2014. Algae Anatomy, Biochemistry and

Biotechnology Second Edition. Taylor & Francis Group, the academic division of T&F Informa plc. 2014.

58

Clarent, A.F, Resurreccion EP, White MA, Colosi LM. 2010. Environmental life cycle comparison of algae to other bioenergy feedstocks. Environ Sci Technol 2010;44:1813–9.

Colegate, S. M. and R.J. Molyneux, 2009. Bioactive Natural Product, Detection, Isolation and Structural Determination Second Edition. CRC Press. Taylor and Francis Group. US. 2009.

Eichhorn, P. and Knepper,T.P. 2001. Electrospray ionization mass spectrometric studies on the amphoteric surfactant cocamidopropylbetaine. J. Mass Spectroscopy, 36: 677-684.

Gordon, M.H 1990. The Mechanism of Antioxidants Action In Vitro. Di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. London: Elsivier Applied Science. Gutierrez, M., T.L. Suyama, N. Engene, J.S. Wingerd, T. Matainaho, W.H.

Gerwick,. 2008. Apratoxin D, a Potent Cytotoxic Cyclodepsipeptide from Papua New Guinea Collections of the Marine Cyanobacteria Lyngbya majuscula and Lyngbya sordida.J. Nat. Prod. 71: 1099–1103.

Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Alih bahasa oleh K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit ITB. Bandung. 354 hlm.

Hadiyanto, M. Christwardana, and D. Soetrisnanto. 2013. Phytoremediation of Palm Oil Effluent Mill (POME) by Using Aquatic Plants and Microalgae for Biomass Production. J. Env. Science and Technology 6 (2), 79-90 : 2013 Henrikson, R. 2009. Earth Food Spirulina. Ronore Interprise Inc. USA.

Hostettman, K., Hostettman, M dan Marston, A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hal. 1-38

Hsu, C.P. S. 1994. Infrared Spectroscopy. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry.

Huang, R.M., Ma. W., Jun-De.D., Xue-Feng.Z., Xu, T., Lee, K.J., Yang, X., Shi-Hai, X and Liu, Y. 2010. A New 1,4-Diazepine from South China Sea Marine Sponge Callyspongia Species. Molecules Journal, 15: 871-877.

Hunt, D. F., J. R. Yates, J. Shabanowitz, S. Winston, and C. R. Hauer. 1986.

Protein Sequencing By Tandem Mass Spectrometry. Proc. Nati. Acad. Sci. Usa Vol. 83, Pp. 62334237.

Johnson, E. L. dan R.Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Diterjemahkan oleh K.Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. 365 Hal.

Jork, H., W. Funk, W. Fischer, and H. Wimmer. 1990. TLC Reagents & Detection Methods – Physical & Chemical Detection Methods: Fundamentals, Reagents,I, Vol. 1a

Kawaroe, M., T. Prartono, A. Sunuddin, D. W. Sari, dan D. Augustine. 2010.

Mikroalga Potensi dan Pemanfaatannya Untuk Produksi Bio Bahan Bakar. IPB Press. Bogor.

Kazakevich, Y., and R. Lobrutto. 2007. HPLC for Pharmacheutical Scientist. Wiley Interscience A. John Willey and Son. New Jersey. 34 Hal.

Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.Saptorahardjo. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Hal.84-311

Krishnamurthy, T., L. Szafraniec, D. F. Hunt, J. Shabanowitz, J. R. Yates, C. R. Hauer, W. W. Carmichael, O. Skulberg, G. A. Coddi, And S. Missler. 1989.

Structural Characterization Of Toxic Cyclic Peptides From Blue-Green Algae By Tandem Mass Spectrometry. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 770-774.

Lam,M.K., and K. T. Lee. 2011. Renewable and sustainable bioenergies production from palm oil mill effluent (POME): Win–win strategies toward better environmental protection. Biotechnology Advances 29 (2011) 124–141 Lehninger. 1998. Dasar – Dasar Biokimia Jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta. Liang, L. 2003. Investigation of Secondary Metabolites of North Sea Bacteria:

Fermentation, Isolation, Structure Elucidation and Bioactivity. Dissertation Institut für Organische Chemie der Universität. Gottingen.

Nathaniel I. Martin, Haijing Hu, Matthew M. Moake, John J. Churey, Randy Whittal, Randy W. Worobo, and John C. Vederas. 2003. Isolation, Structural Characterization, and Properties of Mattacin (Polymyxin M), a Cyclic Peptide Antibiotic Produced by Paenibacillus kobensis M. The Journal Of Biological Chemistry Vol. 278, No. 15, Issue of April 11, pp. 13124–13132, 2003

Maquelin, K., C. Kirschner, L.-P. Choo-Smith, N. v. d. Braak, H. P. Endtz, D. Naumann, & G. J. Puppels. 2002. Identification of medically relevant

microorganisms by vibrational spectroscopy’. J. Microbiol. Methods 2002. 51, 255–271.

Mbah, J.A., Ngemenya, M.N., Abawah, A.L., Babiaka, S.B., Nubed, L.N., Nyongbela, K.D., Lemuh, N.D. and Efange, S. M. 2012. Bioassay-guided discovery of antibacterial agents: in vitro screening of Peperomia vulcanica, Peperomia fernandopoioana and Scleria striatinux. Journal Annals Of Clinical Microbiology And Antimicrobials, 11:10.

60

Molyneux. P. 2004. The Use Of The Stable Free Radical Dyhenylpicrylhydrazil (DPPH) For Estimating Antioxidant Activity. Journals science and technology:

26:211-219

Mooberry, S. L., R. M. Leal, T. L.Tinley, H. Luesch, R. E. Moore, T. H. Corbett. 2003. The Molecular Pharmacology of Symplostatin 1: a New Antimitotic Dolastatin 10 Analog. Int. J. Cancer. 104: 512–521.

Nat, R. 1979. Characterization Of Bacteria, Antibiotics Of The Fluoroquinolone Type And Their Biological Targets DNA And Gyrase Utilizing The Unique Potential Of Vibrational Spectroscopy. Universität Jena. Erfurt.

Richmond, Amos. 2004. Handbook of Microalgal Culture : Biotechnology and Apllied Phychology. Blackwell Science Ltd. 2004.

Richmond, A. and Emeritus. 2013. Handbook of Microalgal Culture Applied Phycology and Biotechnology. Wiley-Blackwell

Rohman A, Riyanto S. 2005. Daya antioksidan ekstrak etanol daun kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) secara in-vitro. Majalah Farmasi Indonesia 16(3):136-140.

Samarakon, K. And Y. J. Jeon. 2012. Bio-functionalities of proteins derived from marine algae — A review. Food Research International 48 (2012) 948–960 Sheih,I. C., T. J. Fang, T. K. Wu, and P. H. Lin. 2010. Anticancer and

Antioxidant Activities of the Peptide Fraction from Algae Protein Waste. J. Agric. Food Chem. 58: 1202–1207.

Silverstein, R.M., G.C. Bassler dan T.C. Morril. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Edisi keempat. Alih bahasa A.J. Hartono dan Purba A.V. Erlangga. Jakarta. Hal. 3-330.

Silverstein, R.M., Webster, F.X. and Kiemle, D.J. 2005. Spectrometric Identification Of Organic Compounds. 7th edition. State University of New York. John Wiley & Sons, Inc.

Sivonen, K., W. W. Carmichael, M. Namikoshi, K. L. Rinehart, A. M. Dahlem,And S. I. Niemela. 1989. Occurrence Of The Hepatotoxic Cyanobacterium Nodularia Spumigena In The Baltic Sea And Structure Of The Toxin. Applied And Environmental Microbiology. Vol. 55, No. 8. P. 1990-1995.

Sivonen, K., W. W. Carmichael, M. Namikoshi, K. L. Rinehart, A. M. Dahlem,And S. I. Niemela. 1990. Isolation And Characterization Of Hepatotoxic Microcystin Homologs From The Filamentous Freshwater Cyanobacterium Nostoc Sp. Strain 152. Applied And Environmental Microbiology, Sept. 1990, Vol. 56, No. 9. P. 2650-2657

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, J.F. and Crouch, S.R. 2013. Fundamental of Analytical Chemistry. 9th Edition. Nelson Education, Ltd.

Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Oraganik. Ghalia Indonesia. Bandung. 285 Hal.

Sukara, E. 2006. Biotrends. Puslit Bioteknologi LIPI. Majalah Populer Bioteknologi. Vol. 1 No.2

Tareq, F. S., M. A. Lee, H. S. Lee, J. S. Lee, Y. J. Lee, and H. J. Shin. 2014.

Gageostatins A–C, Antimicrobial Linear Lipopeptides from a Marine Bacillus subtilis. Mar. Drugs. 12: 871-885.

Visscher, L. A. M., M. J. V. Belkum, S. G. Tsodikova, R. M. Whittal, J. Zheng, L. M. McMullen, and J. C. Vederas. 2008. Isolation and Characterization of Carnocyclin A, a Novel Circular Bacteriocin Produced by Carnobacterium maltaromaticum Ual30. Applied And Environmental Microbiology, Aug. 2008, p. 4756–4763 Vol. 74, No. 15

Vonshak, A. 2002. Spirulina Platensis (Arthrospira) : Physiology, Cell-Biology and Biotechnology. Taylor and Francis e-library 2002.

Wu, Q., C. Zheng, Z.-X. Ning and B. Yang. 2007. Modification of Low Molecular Weight Polysaccharides from Tremella Fuciformis and Their Antioxidant Activity in Vitro. J. Mol. Sci. 2007, 8, 670-679