Produksi dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan dari Tiga Jenis Ikan Budidaya
PRODUKSI DAN BIOAKTIVITAS PROTEIN REKOMBINAN
HORMON PERTUMBUHAN DARI TIGA JENIS
IKAN BUDIDAYA
INDRA LESMANA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Produksi Dan
Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan
Budidaya” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
Juni 2010
Indra Lesmana
NRP.C151070191
ABSTRACT
INDRA LESMANA. Production and Bioactivity of Recombinant Protein for
Growth Hormone of Three Cultured Fish Species. Under direction of AGUS
OMAN SUDRAJAT, and ODANG CARMAN
This study was aim to produce the growth hormone recombinant protein
(rGH) of giant grouper (Epinephelus lanceolatus), giant gouramy (Osphronemus
gouramy), and common carp (Cyprinus carpio) and compare their bioactivity by
using of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) injecting their product. Fragment
DNA encoding mature GH protein of giant grouper (El-mGH), giant gouramy
(Og-mGH) and common carp (Cc-mGH) was amplified by PCR method and PCR
products were then ligated to pCold 1 to generate pCold/El-mGH, pCold/OgmGH, and pCold/Cc-mGH protein expression vector, respectively. Each of those
expression vectors was transformed into the Escherichia coli BL21. E. coli BL21
was cultured using LB medium and protein production was induced by cold shock
at 15±1oC for overnight. The inclusion bodies of E. coli transformants containing
protein expression vector were isolated by sonication method, and rGH
production was analyzed by SDS-PAGE. Juvenile of Nile tilapia in average body
weight of 11±1g was intramuscularly injected once a week for 4 weeks with rGH
solution containing of 1 μg inclusion body of bacterial per gram fish body weight.
The results showed that rGH in molecular weight of about 25 kDa was obtained.
Fish injected with rGH of El-mGH, Cc-mGH and Og-mGH grew 20.94%, 18.09%
and 16.99% faster, respectively, compared with control. This result indicated that
all rGH produced in E. coli possessed biological activity when tested in Nile
tilapia, and it may be useful to improve growth of other aquaculture fish species.
Keywords: Production, Bioactivity, Recombinant Proteins, Growth Hormone,
Fish Aquacultures
RINGKASAN
INDRA LESMANA. Produksi Dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon
Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan Budidaya. Dibimbing oleh AGUS OMAN
SUDRAJAT, dan ODANG CARMAN.
Pertumbuhan merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan usaha
budidaya perikanan. Pertumbuhan yang lambat akan menyebabkan lamanya
waktu pemeliharaan dan besarnya biaya yang harus dikeluarkan, lamanya waktu
pemeliharaan juga akan meningkatkan resiko-resiko dalam pemeliharaan, seperti
terserang penyakit, kematian massal, dan sebagainya. Berdasarkan hal tersebut
maka penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode pemberian protein
rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) untuk meningkatkan laju pertumbuhan.
Pada penelitian ini, protein rGH dari ikan kerapu kertang (Epinephelus
lanceolatus), ikan gurame (Osphronemus gouramy) dan ikan mas (Cyprinus
carpio) diproduksi dengan teknologi protein rekombinan melalui bakteri E. coli.
Bioaktivitas rGH diuji dengan mengamati pertumbuhan ikan nila (Oreochromis
niloticus) yang diinjeksi dengan rGH tersebut dibandingkan dengan ikan yang
hanya diinjeksi dengan PBS atau protein dari pCold 1 tanpa fragmen DNA GH.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu solusi untuk
meningkatkan laju pertumbuhan ikan-ikan budidaya.
Tahapan dalam memproduksi rGH dari ikan kerapu kertang, ikan gurame,
dan ikan mas adalah fragmen DNA penyandi protein GH mature (mGH) dari
masing-masing ikan diamplifikasi dengan PCR dengan cetakan plasmid pGEM-T
Easy yang mengandung cDNA yang telah diisolasi dari ikan kerapu kertang
(Mulyadi et al. 2008), ikan gurame (Nugroho et al. 2007), dan ikan mas
berdasarkan database Bank Gen no. akses M27000. Primer yang digunakan untuk
amplifikasi mGH ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward El-mGHF 5’- ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3’ dan primer reverse El-mGH-R 5’aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3’ yang masing-masing dilengkapi dengan
situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer untuk
amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah primer
forward Og-mGH-F 5’- ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3’ dan reverse OgmGH-R 5’- gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3’ yang dilengkapi dengan situs
restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen DNA
GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5’- ggatcc tca
gac aac cag cgg ctc ttc - 3’ dan reverse Cc-mGH-R 5’- gtcgac cta cag ggt gca gtt
gga atc cag - 3’ yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan SalI.
Fragmen DNA produk PCR diligasi (disambungkan) ke vektor kloning
pGEM-T Easy menggunakan T4 DNA ligase, dan plasmid yang dihasilkan disebut
sebagai pT-mGH. pT-mGH produk ligasi ditransformasikan ke sel kompeten
bakteri E. coli DH5α. Bakteri E. coli DH5α yang mengandung plasmid pT-mGH
diseleksi menggunakan metode cracking (Alimuddin et al. 2008), dan selanjutnya
bakteri tersebut dikultur pada media padat 2xYT (+Ampisilin).
Plasmid pT-mGH diekstraksi dari bakteri E. coli DH5α menggunakan kit
GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai
dengan manual kit yang digunakan. pT-mGH dipotong dengan enzim restriksi
seperti dijelaskan dalam sekuens primer yang digunakan dalam PCR, untuk isolasi
dan purifikasi fragmen DNA mGH. Fragmen DNA mGH tersebut selanjutnya
diligasi dengan vektor pCold 1 yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi
yang sama dengan yang digunakan memotong pT-mGH. Produk ligasi yang
disebut dengan pCold-mGH ditransformasi ke dalam bakteri E. coli DH5α untuk
diperbanyak secara in vivo. Plasmid pCold-mGH hasil perbanyakan selanjutnya
ditransformasi ke bakteri E. coli BL21 untuk memproduksi protein rGH.
Bakteri E. coli BL21 yang mengandung plasmid pCold-mGH dikultur pada
media 2xYT (+Ampisilin), dan diinduksi dengan IPTG pada suhu inkubasi 15 oC
selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dipanen dan disentrifugasi untuk
mengendapkan sel bakteri. Pelet bakteri yang dihasilkan disonikasi untuk
memecah dinding selnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri dianalisis menggunakan
metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid 10%, dan protein
divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran protein rGH
diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kDa protein sama dengan 270 bp
DNA.
Hasil amplifikasi PCR dengan primer spesifik untuk mGH ikan gurame
(Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH)
menghasilkan pita DNA dengan panjang fragmen masing-masing sekitar 576 bp,
579 bp, dan 576 bp. Masing-masing fragmen DNA mGH tersebut diligasi ke
vektor kloning pGEM-T Easy (plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pT-mGH),
selanjutnya ditransformasi ke bakteri E. coli DH5α, dan hasil cracking
menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri E. coli tersebut membawa plasmid
pT-mGH.
Hasil ligasi DNA mGH dengan pCold 1 untuk menghasilkan vektor ekspresi
protein rekombinan pCold-mGH ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli
DH5α untuk diperbanyak secara in vivo. Ukuran plasmid yang dihasilkan menjadi
lebih besar dibandingkan dengan ukuran plasmid pCold 1. Plasmid-plasmid
pCold-mGH tersebut selanjutnya disekuensing untuk mengetahui klon bakteri
yang membawa mGH dengan sekuens DNA yang menyandikan asam amino
lengkap dan sesuai dengan yang dilaporkan peneliti-peneliti sebelumnya. Dari
hasil sekuensing, diperoleh 1 klon untuk pCold/Og-mGH, 2 klon untuk pCold/ElmGH dan 2 klon untuk pCold/Cc-mGH. Selanjutnya plasmid-plasmid pColdmGH dengan sekuens yang benar tersebut diisolasi untuk ditransformasikan ke
dalam bakteri ekspresi E. coli BL21, dari hasil cracking didapatkan sebagian
besar klon membawa plasmid pCold-mGH.
Hasil PCR untuk mengetahui klon bakteri E. coli BL21 yang membawa
plasmid pCold-mGH dengan arah ligasi mGH yang benar menunjukkan bahwa
pita DNA produk PCR dengan ukuran sekitar 0,65 kb (sekitar 0,6 kb fragmen
DNA mGH dan 0,05 kb fragmen DNA pCold 1) yang berarti bahwa klon bakteri
tersebut mengandungkan plasmid pCold-mGH dengan orientasi ligasi mGH
benar. Dari hasil uji orientasi arah ligasi didapatkan 10 klon untuk pCold/OgmGH, 10 klon untuk pCold/El-mGH dan 6 klon untuk pCold/Cc-mGH
Protein rGH ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu
kertang (El-mGH) pada bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pCold
1 berhasil diproduksi, sebanyak 200 ml media kultur 2xYT cair (+Ampisilin)
dapat menghasilkan ±0,93 gram pelet bakteri yang mengandung rGH. Tingkat
produksi protein rGH diperkirakan 8 - 12.04% (diprediksi menggunakan software
Totallab TL 120) dari total protein yang dihasilkan sel E. coli BL21.
Hasil visualisasi protein rGH menunjukan bahwa tingkat produksi rGH
(ukuran sekitar 25 kDa) untuk ketiga sumber mGH tersebut relatif sama,
meskipun jumlah dan ukuran protein lainnya bervariasi. Sementara itu, protein
yang dihasilkan oleh bakteri BL21 yang hanya membawa pCold 1 tanpa fragmen
mGH adalah tidak memproduksi protein rGH dan protein yang lainnya seperti
halnya pada BL21 yang membawa pCold-mGH. Selanjutnya, ukuran protein rGH
adalah 25 kDa, yang terdiri dari 22 kDa prediksi ukuran rGH berdasarkan panjang
fragmen DNA dan sisanya berasal dari vektor pCold 1, yaitu His-tag dan Factor
Xa site.
Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rGH lebih tinggi (P
HORMON PERTUMBUHAN DARI TIGA JENIS
IKAN BUDIDAYA
INDRA LESMANA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Produksi Dan
Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan
Budidaya” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor,
Juni 2010
Indra Lesmana
NRP.C151070191
ABSTRACT
INDRA LESMANA. Production and Bioactivity of Recombinant Protein for
Growth Hormone of Three Cultured Fish Species. Under direction of AGUS
OMAN SUDRAJAT, and ODANG CARMAN
This study was aim to produce the growth hormone recombinant protein
(rGH) of giant grouper (Epinephelus lanceolatus), giant gouramy (Osphronemus
gouramy), and common carp (Cyprinus carpio) and compare their bioactivity by
using of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) injecting their product. Fragment
DNA encoding mature GH protein of giant grouper (El-mGH), giant gouramy
(Og-mGH) and common carp (Cc-mGH) was amplified by PCR method and PCR
products were then ligated to pCold 1 to generate pCold/El-mGH, pCold/OgmGH, and pCold/Cc-mGH protein expression vector, respectively. Each of those
expression vectors was transformed into the Escherichia coli BL21. E. coli BL21
was cultured using LB medium and protein production was induced by cold shock
at 15±1oC for overnight. The inclusion bodies of E. coli transformants containing
protein expression vector were isolated by sonication method, and rGH
production was analyzed by SDS-PAGE. Juvenile of Nile tilapia in average body
weight of 11±1g was intramuscularly injected once a week for 4 weeks with rGH
solution containing of 1 μg inclusion body of bacterial per gram fish body weight.
The results showed that rGH in molecular weight of about 25 kDa was obtained.
Fish injected with rGH of El-mGH, Cc-mGH and Og-mGH grew 20.94%, 18.09%
and 16.99% faster, respectively, compared with control. This result indicated that
all rGH produced in E. coli possessed biological activity when tested in Nile
tilapia, and it may be useful to improve growth of other aquaculture fish species.
Keywords: Production, Bioactivity, Recombinant Proteins, Growth Hormone,
Fish Aquacultures
RINGKASAN
INDRA LESMANA. Produksi Dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon
Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan Budidaya. Dibimbing oleh AGUS OMAN
SUDRAJAT, dan ODANG CARMAN.
Pertumbuhan merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan usaha
budidaya perikanan. Pertumbuhan yang lambat akan menyebabkan lamanya
waktu pemeliharaan dan besarnya biaya yang harus dikeluarkan, lamanya waktu
pemeliharaan juga akan meningkatkan resiko-resiko dalam pemeliharaan, seperti
terserang penyakit, kematian massal, dan sebagainya. Berdasarkan hal tersebut
maka penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode pemberian protein
rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) untuk meningkatkan laju pertumbuhan.
Pada penelitian ini, protein rGH dari ikan kerapu kertang (Epinephelus
lanceolatus), ikan gurame (Osphronemus gouramy) dan ikan mas (Cyprinus
carpio) diproduksi dengan teknologi protein rekombinan melalui bakteri E. coli.
Bioaktivitas rGH diuji dengan mengamati pertumbuhan ikan nila (Oreochromis
niloticus) yang diinjeksi dengan rGH tersebut dibandingkan dengan ikan yang
hanya diinjeksi dengan PBS atau protein dari pCold 1 tanpa fragmen DNA GH.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu solusi untuk
meningkatkan laju pertumbuhan ikan-ikan budidaya.
Tahapan dalam memproduksi rGH dari ikan kerapu kertang, ikan gurame,
dan ikan mas adalah fragmen DNA penyandi protein GH mature (mGH) dari
masing-masing ikan diamplifikasi dengan PCR dengan cetakan plasmid pGEM-T
Easy yang mengandung cDNA yang telah diisolasi dari ikan kerapu kertang
(Mulyadi et al. 2008), ikan gurame (Nugroho et al. 2007), dan ikan mas
berdasarkan database Bank Gen no. akses M27000. Primer yang digunakan untuk
amplifikasi mGH ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward El-mGHF 5’- ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3’ dan primer reverse El-mGH-R 5’aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3’ yang masing-masing dilengkapi dengan
situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer untuk
amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah primer
forward Og-mGH-F 5’- ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3’ dan reverse OgmGH-R 5’- gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3’ yang dilengkapi dengan situs
restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen DNA
GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5’- ggatcc tca
gac aac cag cgg ctc ttc - 3’ dan reverse Cc-mGH-R 5’- gtcgac cta cag ggt gca gtt
gga atc cag - 3’ yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan SalI.
Fragmen DNA produk PCR diligasi (disambungkan) ke vektor kloning
pGEM-T Easy menggunakan T4 DNA ligase, dan plasmid yang dihasilkan disebut
sebagai pT-mGH. pT-mGH produk ligasi ditransformasikan ke sel kompeten
bakteri E. coli DH5α. Bakteri E. coli DH5α yang mengandung plasmid pT-mGH
diseleksi menggunakan metode cracking (Alimuddin et al. 2008), dan selanjutnya
bakteri tersebut dikultur pada media padat 2xYT (+Ampisilin).
Plasmid pT-mGH diekstraksi dari bakteri E. coli DH5α menggunakan kit
GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai
dengan manual kit yang digunakan. pT-mGH dipotong dengan enzim restriksi
seperti dijelaskan dalam sekuens primer yang digunakan dalam PCR, untuk isolasi
dan purifikasi fragmen DNA mGH. Fragmen DNA mGH tersebut selanjutnya
diligasi dengan vektor pCold 1 yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi
yang sama dengan yang digunakan memotong pT-mGH. Produk ligasi yang
disebut dengan pCold-mGH ditransformasi ke dalam bakteri E. coli DH5α untuk
diperbanyak secara in vivo. Plasmid pCold-mGH hasil perbanyakan selanjutnya
ditransformasi ke bakteri E. coli BL21 untuk memproduksi protein rGH.
Bakteri E. coli BL21 yang mengandung plasmid pCold-mGH dikultur pada
media 2xYT (+Ampisilin), dan diinduksi dengan IPTG pada suhu inkubasi 15 oC
selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dipanen dan disentrifugasi untuk
mengendapkan sel bakteri. Pelet bakteri yang dihasilkan disonikasi untuk
memecah dinding selnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri dianalisis menggunakan
metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid 10%, dan protein
divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran protein rGH
diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kDa protein sama dengan 270 bp
DNA.
Hasil amplifikasi PCR dengan primer spesifik untuk mGH ikan gurame
(Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH)
menghasilkan pita DNA dengan panjang fragmen masing-masing sekitar 576 bp,
579 bp, dan 576 bp. Masing-masing fragmen DNA mGH tersebut diligasi ke
vektor kloning pGEM-T Easy (plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pT-mGH),
selanjutnya ditransformasi ke bakteri E. coli DH5α, dan hasil cracking
menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri E. coli tersebut membawa plasmid
pT-mGH.
Hasil ligasi DNA mGH dengan pCold 1 untuk menghasilkan vektor ekspresi
protein rekombinan pCold-mGH ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli
DH5α untuk diperbanyak secara in vivo. Ukuran plasmid yang dihasilkan menjadi
lebih besar dibandingkan dengan ukuran plasmid pCold 1. Plasmid-plasmid
pCold-mGH tersebut selanjutnya disekuensing untuk mengetahui klon bakteri
yang membawa mGH dengan sekuens DNA yang menyandikan asam amino
lengkap dan sesuai dengan yang dilaporkan peneliti-peneliti sebelumnya. Dari
hasil sekuensing, diperoleh 1 klon untuk pCold/Og-mGH, 2 klon untuk pCold/ElmGH dan 2 klon untuk pCold/Cc-mGH. Selanjutnya plasmid-plasmid pColdmGH dengan sekuens yang benar tersebut diisolasi untuk ditransformasikan ke
dalam bakteri ekspresi E. coli BL21, dari hasil cracking didapatkan sebagian
besar klon membawa plasmid pCold-mGH.
Hasil PCR untuk mengetahui klon bakteri E. coli BL21 yang membawa
plasmid pCold-mGH dengan arah ligasi mGH yang benar menunjukkan bahwa
pita DNA produk PCR dengan ukuran sekitar 0,65 kb (sekitar 0,6 kb fragmen
DNA mGH dan 0,05 kb fragmen DNA pCold 1) yang berarti bahwa klon bakteri
tersebut mengandungkan plasmid pCold-mGH dengan orientasi ligasi mGH
benar. Dari hasil uji orientasi arah ligasi didapatkan 10 klon untuk pCold/OgmGH, 10 klon untuk pCold/El-mGH dan 6 klon untuk pCold/Cc-mGH
Protein rGH ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu
kertang (El-mGH) pada bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pCold
1 berhasil diproduksi, sebanyak 200 ml media kultur 2xYT cair (+Ampisilin)
dapat menghasilkan ±0,93 gram pelet bakteri yang mengandung rGH. Tingkat
produksi protein rGH diperkirakan 8 - 12.04% (diprediksi menggunakan software
Totallab TL 120) dari total protein yang dihasilkan sel E. coli BL21.
Hasil visualisasi protein rGH menunjukan bahwa tingkat produksi rGH
(ukuran sekitar 25 kDa) untuk ketiga sumber mGH tersebut relatif sama,
meskipun jumlah dan ukuran protein lainnya bervariasi. Sementara itu, protein
yang dihasilkan oleh bakteri BL21 yang hanya membawa pCold 1 tanpa fragmen
mGH adalah tidak memproduksi protein rGH dan protein yang lainnya seperti
halnya pada BL21 yang membawa pCold-mGH. Selanjutnya, ukuran protein rGH
adalah 25 kDa, yang terdiri dari 22 kDa prediksi ukuran rGH berdasarkan panjang
fragmen DNA dan sisanya berasal dari vektor pCold 1, yaitu His-tag dan Factor
Xa site.
Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rGH lebih tinggi (P