TUGAS BIOTEKNOLOGI KELAS B Oleh
TUGAS BIOTEKNOLOGI
KELAS B
Oleh :
Atika Sari Dyah P.
132210101050
SOAL :
1. Apa perbedaan dari macam-macam vektor :
• Plasmid
• Bakteriofaga
• Cosmid
• Yeast Artificial Chromosom
2. Apa fungsi dari vektor pRSET A,B,C dan pEASY’T ?
JAWABAN :
1. A. Plasmid
Plasmid adalah DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami
dimiliki suatu makhluk hidup, berbentuk pita ganda sirkular. Sebuah vektor plasmid dapat
dibuat secara alami dan buatan. Plasmid buatan dapat dibuat dengan menambahkan potonganpotongan DNA lain, sedangkan plasmid alami dari segmen-segmen yang tidak perlu dihapus
dan urutan DNA yang ingin dikode disisipkan. Untuk mengkloning sebuah sampel DNA,
enzim restriksi yang sama harus digunakan untuk memotong kedua vektordan sampel DNA.
Oleh karena itu, vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali beberapa
enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning berbagai sampel DNA.
Plasmid polylinker dan Gen penanda untuk skrining biru-putih
Sebuah vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali
beberapa enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning
berbagai sampel DNA.
Koloni dengan plasmid rekombinan yang putih, dan koloni dengan plasmid non
rekombinan berwarna biru. Contoh: pUC19
Keuntungan
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan
Kerugian
Kurang bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
DNA ukuran kecil (< 10kbp)
B. Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya
yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel
inang bakteri. Kegunaannya adalah untuk konstruksi kloning gen. Bacteriophage ini dapat
dengan mudah untuk bereplikasi serta dimanupulasi saat di laboratorium. Bacteriophage juga
mempunyai fragmens sekitar lima ribu pasang basa.
Keuntungan
efisiensi transformasi yang tinggi,
Kerugian
Lebih sulit pengerjaannya
sekitar 1000 kali lebih efisien
daripada vektor plasmid
Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (10 23 kbp)
Seleksi berdasarkan ukuran
C. Cosmid
Cosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor dan situs COS yang memungkinkan target
DNA untuk
dimasukkan
ke
dalam
kepala
λ-fage.
Kegunaannya
adalah
untuk
pemasukan/pegumpulan kromosom ke ƛ dalam kepala fag dan memanfaatkan pula uruturutan (bagian tengah cosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi.
Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan
cosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.
Keuntungan
Kerugian
Bermanfaat untuk mengklon potongan
Tidak terlalu mudah untuk
DNA berukuran sangat besar (32 - 47
kbp)
mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
D. Vektor YAC (Ye a s t A r t i f i c i a l C h r o m o s o m e )
YAC adalah romosom ragi buatan, vektor mampu membawa fragmen
DNA besar (hingga 2 Mb), tetapi efisiensi transformasi sangat rendah. Penggunaan Yeast
Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom
kompleks secara lengkap. YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari
1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk meng-clone gen utuh manusia, misalnya
gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs
sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Human
Genome Project.
Komponen penting vektor YAC, meliputi:
a) Sentromer (CEN), telomer (TEL) and sekuen untuk replikasi otonom (ARS = autonomous
replicating sequence) untuk proliferasi di dalam sel inang.
b) ampr, amplifikasi spesifik dan sebagai marker / penanda bagi DNA TRP1 dan URA3 untuk
mengidentifikasi sel yang mengandung vektor YAC.
c) situs yang dapat dikenal oleh enzim restriksi, contohnya EcoRI dan BamHI. Vecktor YAC
dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast Vektor BAC
2. Perbedaan dari :
PERBEDAAN
FUNGSI
Vektor pRSET A,B,C
pEASY-T1
Ekspresi ini diinduksi oleh
dirancang untuk kloning
T7 RNA polymerase di
dan secuensing produk
E.coli. Sel-sel ini juga
PCR yang diamplifikasi.
memproduksi T7 lisozim
untuk mengurangi ekspresi
MARKA SELEKSI
basal gen target
Ketahanan: antibiotik
Ketahanan antibiotik
ampicillin. Vektor ini bisa
kanamycin dan ampicillin
diseleksi dengan Ampicillin.
serta seleksi biru putih
(Lac Z).
a. Vektor pRSET A,B,C
Vektor pRSET dirancang untuk ekspresi prokariotik tingkat tinggi yang
dikendalikan oleh promotor bkteriofag T7 yang kuat. Selain itu, sisipan DNA berada di
posisi hilir (awal) dan berada dalam urutan yang mengkodekan fusi N-terminal peptida.
Urutan ini mencakup ATG inisiasi terjemahan kodon yang menstabilkan urutan dari gen 10
dari fag T7, Xpress™ epitop, dan tempat pembelahan enterokinase.
Satu set ketiga vektor disediakan (A, B, dan C). Masing-masing memiliki Nterminal tag coding dengan urutan kerangka pembacaan yang relatif berbeda terhadap situs
kloning beberapa untuk menyederhanakan di-frame kloning gen Anda. Mereka hanya
berbeda dalam jarak antara urutan kode untuk peptida N-terminal dan beberapa situs
kloning. Untuk ekspresi yang tepat, ditentukan dulu situs restriksi yang sesuai untuk ligase.
b. pEASY-T1
pEASY-T1 menyediakan metode yang sangat efisien untuk kloning Taq polymerase
produk PCR secara langsung yang menghasilkan produk berupa vector plasmid. Ekspresi
vektor ini memiliki T7 / lac kontrol promotor yang tepat, dan ekspresi ini memiliki
kemampuan efisien yang tinggi. Ukuran insert fragmen 750 bp, dan protein tujuan adalah
sekitar 27 kDa. Produk PCR tidak perlu pemurnian dan intisari enzim. Efisiensi kloning
tinggi. Kontrol promotor ekspresi T7 / lac tepat. Protein rekombinan mudah dimurnikan
oleh terminal 6xHis.
a.
Ketahanan Antibiotik Ampisillin dan Kanamycin
Vektor pEASY-T1 resisten terhadap Ampisillin dan Kanamycin. Hal ini
menunjukkan bahwa ketika vector diletakkan pada wadah yang dbieri antibiotik Ampisillin
maka vector tersebut akan tetap hidup, begitu juga ketika diletakkan pada wadah yang
diberi antibiotik Kanamisin maka akan tetap hidup pula karena vektor itu telah resisten
terhadap antibiotik-antibiotik tersebut.
b.
Seleksi Biru Putih
Kebanyakan vektor kloning modern, memiliki suatu MCS dalam gen lacZ. Gen ini
dalam keberadaan suatu induser seperti IPTG (isopropil-β-Dtiogalaktosida) akan
menghasilkan enzim β-galaktosidase, yang akan mengkonversi laktosa menjadi galaktosa
dan glukosa. Enzim ini dalam kondisi normal akan disintesis oleh E.coli jika ada laktosa,
dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa (Stryer, 2000).
Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oleh DNA asing
pada bagian gen lacZ. Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak akan
menghasilkan β-galaktosidase) karena telah disisipi DNA asing.
Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA
rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Adapun koloni berwarna biru berarti sel
kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid saja (tidak disisipi gen terget).
Dengan kata lain, bila gen lacZ-nya rusak atau dirusak maka sel akan membentuk
koloni yang berwarna putih. Jadi, dengan mata telanjang bisa disimpulkan bahwa apabila
sel bakteri membentuk koloni berwarna biru berarti gen lacZ-nya masih berfungsi,
sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ-nya sudah rusak dan tidak berfungsi.
DAFTAR PUSTAKA :
Anonim. 2010. pRSET A, B, And C for High-Level Expression of Recombinant Proteins In E.
Coli. Invitrogen. Cat. no . V351-20
Noviendri, Dedi. 2007.Teknologi Dna Rekombinan Dan Aplikasinya Dalam Eksplorasi
Mikroba Laut. IPB. Bogor. 9 pp.
https://www.academia.edu/8566220/DNA_vectors (Diakses pada 12 Maret 2016)
KELAS B
Oleh :
Atika Sari Dyah P.
132210101050
SOAL :
1. Apa perbedaan dari macam-macam vektor :
• Plasmid
• Bakteriofaga
• Cosmid
• Yeast Artificial Chromosom
2. Apa fungsi dari vektor pRSET A,B,C dan pEASY’T ?
JAWABAN :
1. A. Plasmid
Plasmid adalah DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami
dimiliki suatu makhluk hidup, berbentuk pita ganda sirkular. Sebuah vektor plasmid dapat
dibuat secara alami dan buatan. Plasmid buatan dapat dibuat dengan menambahkan potonganpotongan DNA lain, sedangkan plasmid alami dari segmen-segmen yang tidak perlu dihapus
dan urutan DNA yang ingin dikode disisipkan. Untuk mengkloning sebuah sampel DNA,
enzim restriksi yang sama harus digunakan untuk memotong kedua vektordan sampel DNA.
Oleh karena itu, vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali beberapa
enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning berbagai sampel DNA.
Plasmid polylinker dan Gen penanda untuk skrining biru-putih
Sebuah vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali
beberapa enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning
berbagai sampel DNA.
Koloni dengan plasmid rekombinan yang putih, dan koloni dengan plasmid non
rekombinan berwarna biru. Contoh: pUC19
Keuntungan
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan
Kerugian
Kurang bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
DNA ukuran kecil (< 10kbp)
B. Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya
yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel
inang bakteri. Kegunaannya adalah untuk konstruksi kloning gen. Bacteriophage ini dapat
dengan mudah untuk bereplikasi serta dimanupulasi saat di laboratorium. Bacteriophage juga
mempunyai fragmens sekitar lima ribu pasang basa.
Keuntungan
efisiensi transformasi yang tinggi,
Kerugian
Lebih sulit pengerjaannya
sekitar 1000 kali lebih efisien
daripada vektor plasmid
Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (10 23 kbp)
Seleksi berdasarkan ukuran
C. Cosmid
Cosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor dan situs COS yang memungkinkan target
DNA untuk
dimasukkan
ke
dalam
kepala
λ-fage.
Kegunaannya
adalah
untuk
pemasukan/pegumpulan kromosom ke ƛ dalam kepala fag dan memanfaatkan pula uruturutan (bagian tengah cosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi.
Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan
cosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.
Keuntungan
Kerugian
Bermanfaat untuk mengklon potongan
Tidak terlalu mudah untuk
DNA berukuran sangat besar (32 - 47
kbp)
mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
D. Vektor YAC (Ye a s t A r t i f i c i a l C h r o m o s o m e )
YAC adalah romosom ragi buatan, vektor mampu membawa fragmen
DNA besar (hingga 2 Mb), tetapi efisiensi transformasi sangat rendah. Penggunaan Yeast
Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom
kompleks secara lengkap. YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari
1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk meng-clone gen utuh manusia, misalnya
gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs
sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Human
Genome Project.
Komponen penting vektor YAC, meliputi:
a) Sentromer (CEN), telomer (TEL) and sekuen untuk replikasi otonom (ARS = autonomous
replicating sequence) untuk proliferasi di dalam sel inang.
b) ampr, amplifikasi spesifik dan sebagai marker / penanda bagi DNA TRP1 dan URA3 untuk
mengidentifikasi sel yang mengandung vektor YAC.
c) situs yang dapat dikenal oleh enzim restriksi, contohnya EcoRI dan BamHI. Vecktor YAC
dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast Vektor BAC
2. Perbedaan dari :
PERBEDAAN
FUNGSI
Vektor pRSET A,B,C
pEASY-T1
Ekspresi ini diinduksi oleh
dirancang untuk kloning
T7 RNA polymerase di
dan secuensing produk
E.coli. Sel-sel ini juga
PCR yang diamplifikasi.
memproduksi T7 lisozim
untuk mengurangi ekspresi
MARKA SELEKSI
basal gen target
Ketahanan: antibiotik
Ketahanan antibiotik
ampicillin. Vektor ini bisa
kanamycin dan ampicillin
diseleksi dengan Ampicillin.
serta seleksi biru putih
(Lac Z).
a. Vektor pRSET A,B,C
Vektor pRSET dirancang untuk ekspresi prokariotik tingkat tinggi yang
dikendalikan oleh promotor bkteriofag T7 yang kuat. Selain itu, sisipan DNA berada di
posisi hilir (awal) dan berada dalam urutan yang mengkodekan fusi N-terminal peptida.
Urutan ini mencakup ATG inisiasi terjemahan kodon yang menstabilkan urutan dari gen 10
dari fag T7, Xpress™ epitop, dan tempat pembelahan enterokinase.
Satu set ketiga vektor disediakan (A, B, dan C). Masing-masing memiliki Nterminal tag coding dengan urutan kerangka pembacaan yang relatif berbeda terhadap situs
kloning beberapa untuk menyederhanakan di-frame kloning gen Anda. Mereka hanya
berbeda dalam jarak antara urutan kode untuk peptida N-terminal dan beberapa situs
kloning. Untuk ekspresi yang tepat, ditentukan dulu situs restriksi yang sesuai untuk ligase.
b. pEASY-T1
pEASY-T1 menyediakan metode yang sangat efisien untuk kloning Taq polymerase
produk PCR secara langsung yang menghasilkan produk berupa vector plasmid. Ekspresi
vektor ini memiliki T7 / lac kontrol promotor yang tepat, dan ekspresi ini memiliki
kemampuan efisien yang tinggi. Ukuran insert fragmen 750 bp, dan protein tujuan adalah
sekitar 27 kDa. Produk PCR tidak perlu pemurnian dan intisari enzim. Efisiensi kloning
tinggi. Kontrol promotor ekspresi T7 / lac tepat. Protein rekombinan mudah dimurnikan
oleh terminal 6xHis.
a.
Ketahanan Antibiotik Ampisillin dan Kanamycin
Vektor pEASY-T1 resisten terhadap Ampisillin dan Kanamycin. Hal ini
menunjukkan bahwa ketika vector diletakkan pada wadah yang dbieri antibiotik Ampisillin
maka vector tersebut akan tetap hidup, begitu juga ketika diletakkan pada wadah yang
diberi antibiotik Kanamisin maka akan tetap hidup pula karena vektor itu telah resisten
terhadap antibiotik-antibiotik tersebut.
b.
Seleksi Biru Putih
Kebanyakan vektor kloning modern, memiliki suatu MCS dalam gen lacZ. Gen ini
dalam keberadaan suatu induser seperti IPTG (isopropil-β-Dtiogalaktosida) akan
menghasilkan enzim β-galaktosidase, yang akan mengkonversi laktosa menjadi galaktosa
dan glukosa. Enzim ini dalam kondisi normal akan disintesis oleh E.coli jika ada laktosa,
dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa (Stryer, 2000).
Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oleh DNA asing
pada bagian gen lacZ. Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak akan
menghasilkan β-galaktosidase) karena telah disisipi DNA asing.
Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA
rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Adapun koloni berwarna biru berarti sel
kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid saja (tidak disisipi gen terget).
Dengan kata lain, bila gen lacZ-nya rusak atau dirusak maka sel akan membentuk
koloni yang berwarna putih. Jadi, dengan mata telanjang bisa disimpulkan bahwa apabila
sel bakteri membentuk koloni berwarna biru berarti gen lacZ-nya masih berfungsi,
sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ-nya sudah rusak dan tidak berfungsi.
DAFTAR PUSTAKA :
Anonim. 2010. pRSET A, B, And C for High-Level Expression of Recombinant Proteins In E.
Coli. Invitrogen. Cat. no . V351-20
Noviendri, Dedi. 2007.Teknologi Dna Rekombinan Dan Aplikasinya Dalam Eksplorasi
Mikroba Laut. IPB. Bogor. 9 pp.
https://www.academia.edu/8566220/DNA_vectors (Diakses pada 12 Maret 2016)