Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta,
adalah karya saya sendiri, dengan bimbingan para Komisi Pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
NRP. B251064084
ABSTRACT
MUJIATUN. Detection of Avian Influenza Virus in Day Old Chick (DOC)
Transported in Soekarno Hatta Airport. Under direction of RETNO D.
SOEJOEDONO and SRI MURTINI.
The aims of this research was detecting and isolating AIV in DOC.
Samples were taken from DOC which transported through Soekarno Hatta Airport
Quarantine Station. The detect disease method with convenience sampling
methods was used with the estimation of prevalence at about 0.9%. The total
samples were 346 DOC. There were 58 pooled samples of tracheas and lungs,
which collected from 6 DOC per pooled. Afterwards, sera and egg yolks were
individually collected. Sera were tested with haemagglutinin inhibition (HI) test.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assays were
performed to the pooled tracheas and lungs. This RT-PCR were carried out to
prove the presence of Influenza virus A using a pair of matrix primers (F-MatrikAI; R-Matrik-AI). The samples which were positively AIV detected by RT-PCR
assays using matrix primers were tested using H5 primers (F-H5-AI; R-H5-AI).
The RT-PCR assays were also generated to the egg yolks. These assays were
performed to confirm the absence of AIV in the DOC which were negatively
detected by RT-PCR assays. In this detection, three pairs of matrix primers were
used (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI), (M-Flu 1; M-Flu 2) and (FAI; RAI). The
detected matrix protein of AIV in those samples were tested with H5 primers
(FH5; RH5) and (HA-1444; H5-1735R). Geometric mean titer (GMT) of the
samples were 11.7 while mean titer of the positive AIV were 32. It also identified
that 6 of 58 samples were positively detected by AIV matrix primers but negative
by H5 primers. Third teen samples negatively detected by matrix primers, 8
samples were positively identified in egg yolks by RT-PCR assays. Influenza
virus A were positively identified in those 8 samples using matrix primers (M-Flu
1; M-Flu 2), while 3 of 13 samples were positively detected using different matrix
primers (FAI; RAI) and one of them positive by H5 primers (FH5; RH5). The
differences between RT-PCR results, it can cause difference of genetic sequences
and also resulted from the different target of primer annealing. Also, this research
was verifying the possibility of AIV to be transmitted vertically to the DOC. This
verification were concluded from the high concentration of AIV detected in egg
yolk compared with AIV concentration in tracheas and lungs.
Key words: day old chick, influenza A, avian influenza virus, matrix, H5, primer
RINGKASAN
MUJIATUN. Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang
Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta. Di bawah bimbingan RETNO
D. SOEJOEDONO dan SRI MURTINI.
Perpindahan hewan dari suatu daerah/negara ke daerah/negara lain
berpotensi menyebarkan penyakit. Salah satu penyakit penting yang bersifat
transboundary animal diseases adalah Avian Influenza (AI). Day Old Chick
(DOC) diduga berpotensi terinfeksi dan menyebarkan Virus Avian Influenza
(VAI) kepada unggas lain melalui importasi dari negara lain dan transportasi dari
Jawa ke pulau lain di Indonesia. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas yang tidak memiliki peternakan pembibitan karena sentra industri
peternakan unggas sebagian besar terletak di Pulau Jawa yang merupakan daerah
tertular. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan pendekatan metode Detect Diseases.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Pengujian untuk pooling
sampel organ paru-paru dan trakhea digunakan primer matrik: F-matrik-AI; Rmatrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI (Lee et.al 2001). Setelah diketahui proporsi
sampel DOC positif AI, kemudian dilakukan konfirmasi untuk meyakinkan bahwa
sampel yang negatif pada organ trakhea dan paru-paru dengan primer Lee et al.
(2001) benar-benar negatif. Pengujian dilakukan pada organ kuning telur secara
individu dengan 3 jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al.
2001), M-Flu 1; M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
dilanjutkan dengan 2 jenis primer H5 yaitu FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan
HA-1444; H5-1735R (WHO 2002). Beberapa sampel positif pada pooling organ
trakhea dan paru-paru dilakukan penelusuran pada kuning telur secara individu
menggunakan primer matrik: FAI; RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004).
Penelusuran dilakukan untuk mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC.
Sampel-sampel yang menunjukkan hasil positif AI dilakukan inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) untuk mendapatkan isolat
virus AI dari DOC.
Sebanyak 346 sampel DOC dan 172 serum diperoleh dari DOC hidup
yang dikirim ke luar pulau jawa (antar area). Trakhea dan paru-paru dikumpulkan
dalam pooling, setiap pooling terdiri dari 6 organ DOC dan diperoleh sejumlah 58
pooling. Pooling berdasarkan perusahan produsen/importir dan tanggal menetas.
Serum diuji dengan metode penghambatan haemaglutinasi atau haemaglutinasi
inhibition (HI) tes mengikuti standar OIE (2005). Supernatan suspensi organ dan
kuning telur diekstraksi dengan TRIzol-LS (Invitrogen).
Pengujian RT-PCR menggunakan enzim Superscript TM One-Step RT-PCR
with Platimum ® Taq (Invitrogen Cat. No. 10928-034) dengan total reaksi 25 µl
yang mengandung 12.5 µl 2x Reaction Mix, 3 µl RNA, 0.5 µl RT/Platinum® Taq
Mix, 0.5 µl (0.2 µM) primer forward, 0.5 µl (0.2 µM) primer reverse dan 17
ddH2O. Formulasi reaksi RT-PCR ini berlaku untuk semua jenis primer. Proses
amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycle Sprint Hybaid dan Gene Amp®.
Masing-masing reaksi dianalisis dengan menggunakan elektroforesis 135 volt
selama 35 menit (Mupid-x Japan) dan elektroforesis 100 volt, 400 mA selama 60
menit (Owl Model OSP-300) dengan konsentrasi agar rose 1.5 % (Invitrogen)
dengan pewarnaan ethidium bromida (Sigma), DNA marker 100 bp (Invitrogen
dan Fermentas) dan 50 bp (Invitrogen) selanjutnya hasil dibaca dengan UV
transilluminator. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil dubius, positif lemah
dan positif dilakukan inokulasi pada TAB-SPF mengikuti standar OIE (2005). Uji
korelasi Spearman digunakan untuk melihat korelasi antara maternal antibodi
dengan keberadaan virus AI pada sampel.
Rataan titer maternal antibodi pada sampel adalah 23.5 (11.7). Uji korelasi
Spearman antara titer maternal antibodi dengan primer matrik tidak signifikan
pada α = 0.05 artinya keberadaan virus Influenza A pada DOC tidak dipengaruhi
oleh adanya maternal antibodi. Penelitian ini juga menunjukkan rataan titer
antibodi AI dari sampel positif virus dengan uji RT-PCR sebesar 25 (32). Rataan
titer dari masing-masing sampel tesebut belum cukup untuk memproteksi unggas
terhadap infeksi dan eksresi (shedding) virus AI.
Sejumlah 58 pooling sampel yang diuji terdapat 6 sampel yang
menunjukkan positif Influenza A dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-MatrikAI) tetapi negatif pada pengujian dengan primer H5 (F-H5-AI; R-H5-A1). Jika
diasumsikan bahwa dalam 1 pooling organ terdapat sekurang-kurangnya 1 sampel
organ DOC mengandung virus Influenza A maka dapat dihitung angka prevalensi.
Total sampel 346, sebanyak 6 sampel positif Influenza A (1.73%). Sampel antar
area 174, sebanyak 3 sampel positif Influenza A (1.72%). Berdasarkan daerah asal
dapat diperoleh angka prevalensi untuk Cianjur yang menunjukkan 1 sampel
positif dari 48 sampel DOC (2.08%), Subang 1 sampel positif dari 66 sampel
DOC (1.51%) dan Tangerang 1 sampel positif dari 42 sampel DOC (2.38%),
sementara itu untuk sampel dari Bogor dan Sukabumi negatif terhadap AI. Sampel
kadaver DOC impor dari USA menunjukkan prevalensi virus Influenza A sebesar
3 sampel positif dari 172 sampel kadaver DOC (1.74%).
Penelusuran pengujian RT-PCR pada organ kuning telur dengan 3 macam
primer, dilakukan pada 13 sampel negatif AI pada paru-paru dan trakhea yang
telah diuji dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI). Kuning telur diuji
menggunakan primer matrix (M-Flu 1; M-Flu 2) menunjukkan 8 sampel positif
dan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan 3 sampel positif. Hasil positif
berbeda-beda pada setiap pasangan primer, hal ini dapat terjadi karena perbedaan
gen penyusun dari masing-masing virus dan perbedaan target annealing dari
masing-masing primer. Satu sampel positif matrik dengan primer matrik (FAI;
RAI) menunjukkan positif H5 dengan primer H5 (FH5; RH5).
Konfirmasi pengujian dilakukan pada sampel positif. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa sampel yang positif dengan primer matrik (F-Matrik-AI; RMatrik-AI) ketika dikonfirmasi dengan pasangan primer matrik (FAI; RAI) dan
H5 (FH5; RH5) menunjukkan hasil yang tetap positif. Berdasarkan penelitian ini
ditemukan bahwa DOC mengandung virus AI subtipe H5, namun tidak menutup
kemungkinan adanya subtipe virus Influenza A lain. Hasil inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) dari sampel kuning telur yang
menunjukkan hasil positif AI dengan metode RT-PCR diperoleh isolat virus
Avian Influenza.
Penelusuran untuk mengetahui pola penularan AI dilakukan pengujian RTPCR pada sampel positif dan negatif pada organ paru-paru dan trakhea
menggunakan pasangan primer marik dan H5 dari Lee & Suarez (2004). Virus
Avian Influenza negatif pada organ trakhea dan paru-paru DOC dengan RT-PCR,
tetapi setelah dilakukan penelusuran pada sampel kuning telur menunjukkan hasil
yang dubius, positif lemah dan positif (37,5%). Sampel-sampel yang
menunjukkan positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru tetap
menunjukkan hasil yang positif (62,5%). Pooling sampel trakhea dan paru-paru
positif matrik setelah diinokulasikan pada TAB-SPF menunjukkan hasil negatif
(100%). Sebanyak 100% sampel kuning telur yang positif RT-PCR dengan
primer matrik dan H5 menunjukkan hasil positif setelah dilakukan inokulasi pada
TAB-SPF. Hasil inokulasi TAB-SPF pada pooling organ paru-paru dan trakhea
negatif karena jumlah virus dalam organ tersebut masih sedikit sehingga belum
mencapai 1 EID50 (jumlah virus minimal untuk dapat tumbuh pada TAB). Virus
AI pada kuning telur dapat tumbuh pada TAB-SPF karena jumlahnya lebih
banyak dari 1 EID50. Penelitian ini menunjukkan adanya fenomena bahwa virus
Avian Influenza dapat ditularkan secara vertikal.
Kata kunci: day old chick, influenza A, virus avian influenza, matriks, H5, primer.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009
Hak cipta ini dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC
yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta
: Mujiatun
: B 251064084
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Retno D Soejoedono MS
Ketua
Dr. drh. Sri Murtini, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr. drh. Denny Widaya Lukman, MSi.
Tanggal Ujian : 19 Januari 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.
Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Ekowati Handaryani, MSi
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta,
adalah karya saya sendiri, dengan bimbingan para Komisi Pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
NRP. B251064084
ABSTRACT
MUJIATUN. Detection of Avian Influenza Virus in Day Old Chick (DOC)
Transported in Soekarno Hatta Airport. Under direction of RETNO D.
SOEJOEDONO and SRI MURTINI.
The aims of this research was detecting and isolating AIV in DOC.
Samples were taken from DOC which transported through Soekarno Hatta Airport
Quarantine Station. The detect disease method with convenience sampling
methods was used with the estimation of prevalence at about 0.9%. The total
samples were 346 DOC. There were 58 pooled samples of tracheas and lungs,
which collected from 6 DOC per pooled. Afterwards, sera and egg yolks were
individually collected. Sera were tested with haemagglutinin inhibition (HI) test.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assays were
performed to the pooled tracheas and lungs. This RT-PCR were carried out to
prove the presence of Influenza virus A using a pair of matrix primers (F-MatrikAI; R-Matrik-AI). The samples which were positively AIV detected by RT-PCR
assays using matrix primers were tested using H5 primers (F-H5-AI; R-H5-AI).
The RT-PCR assays were also generated to the egg yolks. These assays were
performed to confirm the absence of AIV in the DOC which were negatively
detected by RT-PCR assays. In this detection, three pairs of matrix primers were
used (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI), (M-Flu 1; M-Flu 2) and (FAI; RAI). The
detected matrix protein of AIV in those samples were tested with H5 primers
(FH5; RH5) and (HA-1444; H5-1735R). Geometric mean titer (GMT) of the
samples were 11.7 while mean titer of the positive AIV were 32. It also identified
that 6 of 58 samples were positively detected by AIV matrix primers but negative
by H5 primers. Third teen samples negatively detected by matrix primers, 8
samples were positively identified in egg yolks by RT-PCR assays. Influenza
virus A were positively identified in those 8 samples using matrix primers (M-Flu
1; M-Flu 2), while 3 of 13 samples were positively detected using different matrix
primers (FAI; RAI) and one of them positive by H5 primers (FH5; RH5). The
differences between RT-PCR results, it can cause difference of genetic sequences
and also resulted from the different target of primer annealing. Also, this research
was verifying the possibility of AIV to be transmitted vertically to the DOC. This
verification were concluded from the high concentration of AIV detected in egg
yolk compared with AIV concentration in tracheas and lungs.
Key words: day old chick, influenza A, avian influenza virus, matrix, H5, primer
RINGKASAN
MUJIATUN. Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang
Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta. Di bawah bimbingan RETNO
D. SOEJOEDONO dan SRI MURTINI.
Perpindahan hewan dari suatu daerah/negara ke daerah/negara lain
berpotensi menyebarkan penyakit. Salah satu penyakit penting yang bersifat
transboundary animal diseases adalah Avian Influenza (AI). Day Old Chick
(DOC) diduga berpotensi terinfeksi dan menyebarkan Virus Avian Influenza
(VAI) kepada unggas lain melalui importasi dari negara lain dan transportasi dari
Jawa ke pulau lain di Indonesia. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas yang tidak memiliki peternakan pembibitan karena sentra industri
peternakan unggas sebagian besar terletak di Pulau Jawa yang merupakan daerah
tertular. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan pendekatan metode Detect Diseases.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Pengujian untuk pooling
sampel organ paru-paru dan trakhea digunakan primer matrik: F-matrik-AI; Rmatrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI (Lee et.al 2001). Setelah diketahui proporsi
sampel DOC positif AI, kemudian dilakukan konfirmasi untuk meyakinkan bahwa
sampel yang negatif pada organ trakhea dan paru-paru dengan primer Lee et al.
(2001) benar-benar negatif. Pengujian dilakukan pada organ kuning telur secara
individu dengan 3 jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al.
2001), M-Flu 1; M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
dilanjutkan dengan 2 jenis primer H5 yaitu FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan
HA-1444; H5-1735R (WHO 2002). Beberapa sampel positif pada pooling organ
trakhea dan paru-paru dilakukan penelusuran pada kuning telur secara individu
menggunakan primer matrik: FAI; RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004).
Penelusuran dilakukan untuk mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC.
Sampel-sampel yang menunjukkan hasil positif AI dilakukan inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) untuk mendapatkan isolat
virus AI dari DOC.
Sebanyak 346 sampel DOC dan 172 serum diperoleh dari DOC hidup
yang dikirim ke luar pulau jawa (antar area). Trakhea dan paru-paru dikumpulkan
dalam pooling, setiap pooling terdiri dari 6 organ DOC dan diperoleh sejumlah 58
pooling. Pooling berdasarkan perusahan produsen/importir dan tanggal menetas.
Serum diuji dengan metode penghambatan haemaglutinasi atau haemaglutinasi
inhibition (HI) tes mengikuti standar OIE (2005). Supernatan suspensi organ dan
kuning telur diekstraksi dengan TRIzol-LS (Invitrogen).
Pengujian RT-PCR menggunakan enzim Superscript TM One-Step RT-PCR
with Platimum ® Taq (Invitrogen Cat. No. 10928-034) dengan total reaksi 25 µl
yang mengandung 12.5 µl 2x Reaction Mix, 3 µl RNA, 0.5 µl RT/Platinum® Taq
Mix, 0.5 µl (0.2 µM) primer forward, 0.5 µl (0.2 µM) primer reverse dan 17
ddH2O. Formulasi reaksi RT-PCR ini berlaku untuk semua jenis primer. Proses
amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycle Sprint Hybaid dan Gene Amp®.
Masing-masing reaksi dianalisis dengan menggunakan elektroforesis 135 volt
selama 35 menit (Mupid-x Japan) dan elektroforesis 100 volt, 400 mA selama 60
menit (Owl Model OSP-300) dengan konsentrasi agar rose 1.5 % (Invitrogen)
dengan pewarnaan ethidium bromida (Sigma), DNA marker 100 bp (Invitrogen
dan Fermentas) dan 50 bp (Invitrogen) selanjutnya hasil dibaca dengan UV
transilluminator. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil dubius, positif lemah
dan positif dilakukan inokulasi pada TAB-SPF mengikuti standar OIE (2005). Uji
korelasi Spearman digunakan untuk melihat korelasi antara maternal antibodi
dengan keberadaan virus AI pada sampel.
Rataan titer maternal antibodi pada sampel adalah 23.5 (11.7). Uji korelasi
Spearman antara titer maternal antibodi dengan primer matrik tidak signifikan
pada α = 0.05 artinya keberadaan virus Influenza A pada DOC tidak dipengaruhi
oleh adanya maternal antibodi. Penelitian ini juga menunjukkan rataan titer
antibodi AI dari sampel positif virus dengan uji RT-PCR sebesar 25 (32). Rataan
titer dari masing-masing sampel tesebut belum cukup untuk memproteksi unggas
terhadap infeksi dan eksresi (shedding) virus AI.
Sejumlah 58 pooling sampel yang diuji terdapat 6 sampel yang
menunjukkan positif Influenza A dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-MatrikAI) tetapi negatif pada pengujian dengan primer H5 (F-H5-AI; R-H5-A1). Jika
diasumsikan bahwa dalam 1 pooling organ terdapat sekurang-kurangnya 1 sampel
organ DOC mengandung virus Influenza A maka dapat dihitung angka prevalensi.
Total sampel 346, sebanyak 6 sampel positif Influenza A (1.73%). Sampel antar
area 174, sebanyak 3 sampel positif Influenza A (1.72%). Berdasarkan daerah asal
dapat diperoleh angka prevalensi untuk Cianjur yang menunjukkan 1 sampel
positif dari 48 sampel DOC (2.08%), Subang 1 sampel positif dari 66 sampel
DOC (1.51%) dan Tangerang 1 sampel positif dari 42 sampel DOC (2.38%),
sementara itu untuk sampel dari Bogor dan Sukabumi negatif terhadap AI. Sampel
kadaver DOC impor dari USA menunjukkan prevalensi virus Influenza A sebesar
3 sampel positif dari 172 sampel kadaver DOC (1.74%).
Penelusuran pengujian RT-PCR pada organ kuning telur dengan 3 macam
primer, dilakukan pada 13 sampel negatif AI pada paru-paru dan trakhea yang
telah diuji dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI). Kuning telur diuji
menggunakan primer matrix (M-Flu 1; M-Flu 2) menunjukkan 8 sampel positif
dan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan 3 sampel positif. Hasil positif
berbeda-beda pada setiap pasangan primer, hal ini dapat terjadi karena perbedaan
gen penyusun dari masing-masing virus dan perbedaan target annealing dari
masing-masing primer. Satu sampel positif matrik dengan primer matrik (FAI;
RAI) menunjukkan positif H5 dengan primer H5 (FH5; RH5).
Konfirmasi pengujian dilakukan pada sampel positif. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa sampel yang positif dengan primer matrik (F-Matrik-AI; RMatrik-AI) ketika dikonfirmasi dengan pasangan primer matrik (FAI; RAI) dan
H5 (FH5; RH5) menunjukkan hasil yang tetap positif. Berdasarkan penelitian ini
ditemukan bahwa DOC mengandung virus AI subtipe H5, namun tidak menutup
kemungkinan adanya subtipe virus Influenza A lain. Hasil inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) dari sampel kuning telur yang
menunjukkan hasil positif AI dengan metode RT-PCR diperoleh isolat virus
Avian Influenza.
Penelusuran untuk mengetahui pola penularan AI dilakukan pengujian RTPCR pada sampel positif dan negatif pada organ paru-paru dan trakhea
menggunakan pasangan primer marik dan H5 dari Lee & Suarez (2004). Virus
Avian Influenza negatif pada organ trakhea dan paru-paru DOC dengan RT-PCR,
tetapi setelah dilakukan penelusuran pada sampel kuning telur menunjukkan hasil
yang dubius, positif lemah dan positif (37,5%). Sampel-sampel yang
menunjukkan positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru tetap
menunjukkan hasil yang positif (62,5%). Pooling sampel trakhea dan paru-paru
positif matrik setelah diinokulasikan pada TAB-SPF menunjukkan hasil negatif
(100%). Sebanyak 100% sampel kuning telur yang positif RT-PCR dengan
primer matrik dan H5 menunjukkan hasil positif setelah dilakukan inokulasi pada
TAB-SPF. Hasil inokulasi TAB-SPF pada pooling organ paru-paru dan trakhea
negatif karena jumlah virus dalam organ tersebut masih sedikit sehingga belum
mencapai 1 EID50 (jumlah virus minimal untuk dapat tumbuh pada TAB). Virus
AI pada kuning telur dapat tumbuh pada TAB-SPF karena jumlahnya lebih
banyak dari 1 EID50. Penelitian ini menunjukkan adanya fenomena bahwa virus
Avian Influenza dapat ditularkan secara vertikal.
Kata kunci: day old chick, influenza A, virus avian influenza, matriks, H5, primer.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009
Hak cipta ini dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC
yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta
: Mujiatun
: B 251064084
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Retno D Soejoedono MS
Ketua
Dr. drh. Sri Murtini, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr. drh. Denny Widaya Lukman, MSi.
Tanggal Ujian : 19 Januari 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.
Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Ekowati Handaryani, MSi
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kebumen - Jawa Tengah pada tanggal 1 November 1976,
merupakan anak pertama dari pasangan Bapak Darudin dan Ibu Sutinah. Penulis
menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar pada tahun 1989 di SDN Kaligubug, Prembun,
Kebumen dan pada tahun 1992 menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Pertama
di SMP Negeri 2 Prembun. Selanjutnya penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas
di SMAN Prembun dan lulus pada tahun 1995. Tahun 1995 penulis melanjutkan kuliah
di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan meraih gelar Dokter Hewan
pada tahun 2001.
Pada tahun 2001 sampai 2002 penulis bekerja di Klinik Santa sebagai Dokter
Hewan Praktek, tahun 2003 menjadi Dokter Hewan di sekolah berkuda Athena Stables,
tahun 2004 bekerja di Laboratorium Kesehatan Hewan Propinsi Banten, pada tahun
2005 Masuk di Badan Karantina Pertanian, Departemen Pertanian dan ditempatkan di
Stasiun Karantina Hewan Kelas II Samarinda, pada tahun 2006 penulis dipindahkan ke
Balai Besar Karantina Hewan Soekarno Hatta dan pada tahun 2007 sampai sekarang
bekerja di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Badan Karantina Pertanian,
Departemen Pertanian. Untuk meningkatkan kemampuan teknis dan wawasan tentang
laboratorium veteriner, penulis diberi kesempatan untuk mengikuti pelatihan antara lain
Training of Veterinary Laboratory di Veterinary Research Institute (VRI) Ipoh
Malaysia pada tahun 2006. Pada Tahun 2007 penulis mendapatkan beasiswa dari Badan
Karantina Pertanian untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang S-2 pada Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke-hadirat Allah Subhanahu Wata’ala yang telah
memberikan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta.
Penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Ir.
Syukur Iwantoro, MSi, MBA sebagai Kepala Badan Karantina Pertanian periode 20062008 dan Ir. Hari Priyono, MSi sebagai Sekretaris Badan Karantina Pertanian periode
2006-2008 beserta Jajarannya atas prakarsa dalam pengadaan beasiswa. Kepala Balai
Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) beserta staf dan Kepala Balai Besar
Karantina Hewan Soekarno Hatta (BBKHSH), Kepala Balai Besar Karantina Pertanian
Soekarno Hatta (BBKPSH) dan staf yang telah memfasilitasi penelitian ini. Prof. Dr.
drh. Retno D Soejoedono, MS sebagai Ketua Komisi Pembimbing dan Dr. drh. Sri
Murtini, MSi sebagai Anggota Komisi Pembimbing, atas segala dukungan, bimbingan,
dan arahan terhadap penulis selama penelitian dan penulisan tesis. Tak lupa pula penulis
sampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. drh. Denny W. Lukman, MSi., selaku Ketua
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian
Bogor; Drh. Sofia Setyawati, MP atas kerjasama dan bantuannya; Drh. Surachmi
Setyaningsih, MSc, PhD atas segala bantuannya; Drh. Chairul Basri atas segala
informasi dan bantuannya; Drh. Basir Nainggolan sebagai Kepala Balai Karantina
Hewan Tanjung Priok periode 2004-2008 beserta staf atas fasilitas transportasinya
selama penulis menjalankan kuliah di Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor;
Drh. Sri Yusnowati atas segala dukungannya; Pak Agus atas bantuannya. Rekan-rekan
satu angkatan Kelas Khusus Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor tahun 2007, atas kebersamaannya sehingga
program ini bisa kita selesaikan bersama-sama. Pak Surya Supir atas dedikasinya
mengantarkan kami kuliah.
Ucapan terima kasih yang dalam kepada Ibunda Sutinah, Ayahanda Darudin,
Adinda Juniyah, Suami Sapto Subroto, SE serta keluarga besar Bapak Samadi yang telah
memberikan dukungan moral dan material dalam menyelesaikan penulisan tesis ini.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua fihak yang tidak dapat kami
sebutkan satu-persatu, yang telah membantu dalam kelancaran studi dan penelitian ini.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan permohonan maaf yang sebesarbesarnya apabila terdapat kesalahan selama penelitian, pembimbingan dan penulisan
tesis. Atas segala kebaikan yang telah penulis terima semoga Allah SWT berkenan
melimpahkan rahmat dan ridha-Nya kepada kita semua. Harapan penulis semoga tulisan
ini dapat bermanfaat untuk meningkatkan ilmu pengetahuan kita semua. Amien.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL …………………………………………………………
xii
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………… xiii
PENDAHULUAN ………………………………………………………..... 1
TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………………...
Day Old Chick (DOC) ………………………………………………
Virus Avian Influenza ………………………………………………
Penyebaran dan Transmisi Virus Avian Influenza …………………..
Patogenesitas Virus AI ………………………………………….......
Pengendalian Avian Influenza ………………………………………
Diagnosa Laboratorium Virus Avian Influenza ……………………...
3
3
4
7
8
10
11
BAHAN DAN METODA …………………………………………………
Waktu dan Tempat Penelitian ……………………………………….
Rancangan Percobaan ………………………………………………..
Uji Serologi Antibody terhadap Antigen H5 ………………………...
Pembuatan RBC 1% …………………………………………...
Haemaglutination (HA) Test .....................................................
Pembuatan Suspensi Virus Standar .............................................
Haemaglutination Inhibition (HI) Test ……………………........
Identifikasi Virus Avian Influenza …………………………………..
Preparasi Sampel ……………………………………………...
Isolasi RNA Virus …………………………………………….
Runing pada Thermal Cycle …………………………………..
Elektroforesis Hasil RT-PCR pada Gel Agarose 1.5% .............
Isolasi Virus Avian Influenza ………………………………………..
13
13
13
14
14
15
16
16
16
17
17
18
19
20
HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………
Titer Antibodi AI …………………………………………………….
Pengujian RT-PCR untuk Pooling Organ …………………………...
Penelusuran Keberadaan Virus AI pada Kuning Telur ……………...
Hasil Isolasi Virus …………………………………………………...
Penelusuran Sumber Penularan Virus AI ……………………………
21
22
23
26
30
33
x
SIMPULAN ………………………………………………………………..
38
SARAN …………………………………………………………………….
39
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
41
LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 45
xi
DAFTAR TABEL
1
2
Halaman
Primer yang digunakan dalam pengujian RT-PCR ………………….. 18
Hasil sampel DOC yang di ambil di Instalasi Karantina Hewan
BBKP-SH dan gudang pemberangkatan dan kedatangan Bandara
Soekarno Hatta .....................................................................................
21
Data sampel positif matriks Influenza A pada sampel DOC dari
Bandara Soekarno Hatta .......................................................................
23
4
Penelusuran virus AI dengan berbagai primer pada kuning telur .........
27
5
Konfirmasi pengujian pada sampel kuning telur .................................. 29
6
Hasil inokulasi pada TAB-SPF dari sampel organ paru-paru dan
trakhea yang positif RT-PCR AI ……………………………………..
3
30
7
Hasil inokulasi (pasase-1) pada TAB-SPF dari sampel kuning telur
yang positif RT-PCR AI …………………………………………….. 31
8
Hasil inokulasi (pasase-2) pada TAB-SPF dari sampel kuning telur
yang positif RT-PCR AI ……………………………………………...
9
32
Hasil penelusuran sumber penularan virus AI ...................................... 34
xii
DAFTAR GAMBAR
1
Halaman
Anatomi Virus Influenza A (Subbarao & Joseph 2007)……………….. 5
2
Proporsi sampel positif Influenza A ......................................................
25
3
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer matrik: F-matrikAI; R-Matrik AI (Lee et al. 2001) pada 200 base pairs (bp) .................
26
4
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer matrik: M-Flu 1;
M-Flu 2 (Trani et al. 2006) pada 154-172 bp ………………………… 27
5
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer H5: FH5; RH5
(Lee & Suarez 2004) pada 55 bp ...........................................................
28
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari inokulasi pada TAB-SPF
(pasase ke-1) dengan primer matrik : FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
pada 55 bp ..............................................................................................
31
6
7
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari inokulasi pada TAB-SPF
(pasase ke-2) dengan primer matrik: FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
pada 55 bp .............................................................................................. 32
8
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari penelusuran sampel kuning
telur dengan primer matrik: FAI; RAI (Lee & Suarez 2004) pada 55
bp .........................................................................................................
9
35
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari penelusuran sampel kuning
35
telur dengan primer H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) pada 55 bp
xiii
1
PENDAHULUAN
Perdagangan hewan hidup antar negara, antar pulau maupun antar benua
sudah berlangsung sejak puluhan tahun. Perpindahan ternak dan hewan piaraan
dari satu negara/daerah ke negara/daerah lain sejalan dengan perpindahan
manusia. Perpindahan hewan tersebut selain memindahkan hewan, juga
berpotensi menyebarkan penyakit. Perpindahan hewan dapat terjadi dari satu
tempat ke tempat lain secara cepat maupun lambat tergantung sarana transportasi
yang digunakan.
Salah satu penyakit menular yang sangat mudah menyebar (transboundary
animal diseases) adalah Avian Influenza. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas penyakit AI. Sebagian besar daerah bebas tersebut tidak memiliki
peternakan pembibitan karena sentra industri peternakan unggas terletak di Pulau
Jawa yang merupakan daerah tertular. Beberapa ahli melihat adanya pola
penyebaran AI di Indonesia berbanding lurus dengan pola penyebaran dan
perdagangan DOC.
Anak ayam (DOC) komersial tidak lazim terinfeksi virus H5N1 saat
menetas. Telur yang telah terinfeksi secara vertikal dari induknya memiliki daya
tetas rendah. Anak ayam (DOC) dapat tertular virus AI akibat terkontaminasi dari
alat angkut (FAO (2008). Wibawan (2006) menyatakan kondisi virus AI saat ini
sudah berbentuk infeksi subklinik, yang berarti bahwa hewan terinfeksi namun
tidak menunjukkan gejala klinis sakit. Adanya penyakit yang tidak terdeteksi
dengan tepat menyebabkan meluasnya penyakit di lapangan.
Penyebaran penyakit AI sampai saat ini akibat perpindahan unggas
dewasa. Virus Avian Influenza dapat menyebar bersama perpindahan DOC. Peran
DOC sebagai media penyebar virus AI belum banyak diteliti dan diketahui oleh
para ahli. Karantina Hewan merupakan instansi yang bertugas mencegah masuk
2
dan menyebarnya penyakit hewan ke Wilayah Indonesia melalui tindakan
pengawasan lalu lintas hewan dan produk hewan. Salah satu penjabaran tugas
karantina sebagai instansi pencegah masuk dan menyebarnya penyakit hewan ke
Wilayah Indonesia adalah melalui kaji tindak deteksi dan diagnosa penyakit.
Diagnosa penyakit secara laboratorium menjadi dasar ilmiah dalam tindakan
karantina dan kebijakan lalu lintas hewan. Penelitian untuk mendeteksi adanya
penyakit AI subklinis pada DOC sangat penting dengan pengambilan sampel yang
benar sesuai dengan kaidah-kaidah virologi dan epidemiologi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Anak ayam umur sehari
(DOC) yang dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta diambil sampel
organ dan serumnya. Sampel serum diuji keberadaan antibodinya dengan uji
penghambatan haemaglutinasi.
Sampel organ (paru-paru dan trakhea) di
kumpulkan (pooling) dalam satu kelompok pengiriman berdasarkan perusahaan
produsen DOC. Pengujian untuk pooling sampel organ paru-paru dan trakhea
digunakan primer matrik: F-matrik-AI; R-matrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI
(Lee et.al 2001). Berdasarkan hasil pengujian RT-PCR, kemudian dilakukan
konfirmasi terhadap sampel yang menunjukan hasil uji negatif untuk menyatakan
bahwa hewan yang diperiksa benar-benar negatif. Konfirmasi dilakukan secara
individu dari masing masing sampel kuning telur. Pengujian dilakukan dengan 3
jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al. 2001), M-Flu 1;
M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004) dilanjutkan
dengan 2 jenis primer H5 yaitu: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan HA-1444;
H5-1735R (WHO 2002). Sampel dengan hasil uji RT-PCR positif dilakukan
penelusuran pada kuning telur secara individu menggunakan primer matrik: FAI;
RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004). Penelusuran dilakukan untuk
mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC. Berdasarkan hasil uji
penelusuran, sampel yang menunjukan hasil positif selanjutnya dilakukan isolasi
virus pada telur ayam berembrio.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Day Old Chick (DOC)
Anak ayam umur sehari atau Day old chick (DOC) adalah unggas yang
menetas pada umur 2 jam atau beberapa jam dan atau sebelum makan (Ministry
of Food, Agriculture and Cooperative Pakistan 1985). Anak ayam ini merupakan
bibit pada peternakan ayam baik peternakan final stock (FS) yang meliputi ayam
pedaging dan petelur maupun parent stock (PS). Beberapa negara produsen bibit
ayam pedaging diantaranya Amerika (Cobb, Arbor Arcres, Avian), Prancis (Isa
Vedette, Shaper Ross), Inggris (Ross) dan Belanda (Hybro, Hubbard). Negara
produsen bibit ayam pedaging di Asia, contohnya Thailand (Fadilah (2005).
Bibit ayam yang sehat merupakan salah satu kunci dalam keberhasilan
industri peternakan. Ciri-ciri DOC yang berkualitas baik adalah: bebas dari
penyakit terutama pulorum, omphalitis dan jamur, DOC terlihat aktif, kakinya
besar dan basah seperti berminyak, bulu cerah dan penuh, pantatnya tidak kotor
atau tidak terdapat pasta putih, beratnya tidak kurang dari 37 gram. Kualitas DOC
yang jelek memiliki ciri-ciri kaki kering, omphalitis, tubuh kerdil dan berat badan
tidak merata (Fadilah 2005).
Beberapa negara menerapkan standar pengiriman DOC, Pakistan
mensyaratkan DOC harus berasal dari telur yang beratnya tidak kurang dari 48
gram. Anak ayam tersebut juga harus berasal dari peternakan yang telah
disertifikasi bebas pulorum, negatif terhadap Salmonella sp dan Aspergillosis,
jumlah E. coli tidak lebih dari 10 CFU per gram, bebas dari cacat fisik dan luka,
hasil uji pulorum negatif, lincah dan sehat (Ministry of Food, Agriculture and
Cooperative Pakistan 1985).
Hasil penelitian yang telah dilakukan, DOC sehat ternyata masih
mengandung bakteri Staphylococcus spp, E. coli dan Proteus spp pada daerah
hidung dan kloaka. Pada kondisi stres dapat memicu bakteri-bakteri normal
tersebut di atas menjadi patogen dan menimbulkan gejala-gejala omphalitis dan
airsaculitis (Geidam et al. 2007).
4
Virus Avian Influenza
Virus Avian Influenza (AI) termasuk ke dalam anggota dari famili
Orthomixoviridae dan masuk dalam genus influenza virus A. Famili
Orthomixoviridae memiliki 3 genus yaitu virus Influenza A, B dan C berdasarkan
karakter antigenik protein M dalam envelope virus dan nukleoprotein. Virus
Influenza A memiliki 16 antigen hemaglutinin (H1-H16) dan 9 antigen
neuraminidase (N1-N9) dan jika dikombinasikan akan membentuk 144 subtipe.
Virus Influenza merupakan virus RNA untai tunggal segmen negatif (OIE 2005,
WHO 2002 dan Barrett and Inglis, 1985). Influenza A bersifat patogen terhadap
kuda, babi, cerpelai Amerika (mink), anjing laut, ikan paus, unggas dan manusia.
Influenza B hanya patogen pada manusia dan Influenza C menginfeksi manusia
dan babi tetapi jarang menyebabkan sakit yang serius (WHO 2002 dan Murphy et
al. 1999).
Orthomyxovirus virions berukuran 80-120 nm, bersifat pleomorphic,
sering berbentuk spherical tetapi predominan filamentous pada isolat segar.
Virion terdiri dari envelope dengan peplomer besar mengelilinginya berjumlah
delapan (genus Influenza A dan B), tujuh (genus Influenza C) dan enam (genus
Thogavirus) dengan segmen nucleocapsid berbentuk helically symmetrical yang
berbeda ukuran. Ada dua jenis glycoprotein peplomer: (1) homotrimers dari
protein hemaglutinin dan (2) homotetramers dari protein neuramidase. Virus
Influenza C hanya memiliki satu tipe glycoprotein peplomer, yang terdiri dari
molekul multifungsional hemagglutinin-esterase. Segmen genom memiliki satu
loop di ujung pertama dan terdiri dari molekul RNA virus yang diselubungi
capsid yang terdiri dari nucleoprotein berbentuk héliks. Tiga protein yang
membentuk viral RNA polymerase (PB1, PB2 dan PA), berasosiasi dengan RNA.
Amplop virus dilapisi oleh protein matrik (M1) dan dikelilingi sejumlah kecil ion
chanels yang tersusun dari tetramer protein matrik ke 2 (M2). Genom terdiri dari
delapan, tujuh atau enam segmen berbentuk linear negative-sense, RNA berutas
tunggal, 10-13.6 kilo basa (kb) secara keseluruhan (Murphy et al. 1999).
5
Gambar1. Anatomi Virus Influenza A (Subbarao & Joseph 2007)
Virus Influenza A yang menginfeksi unggas dapat dibagi ke dalam dua
kelompok berdasarkan kemampuan virus menyebabkan penyakit. Virus yang
sangat virulen disebut highly pathogenic Avian Influenza (HPAI), infeksinya
bersifat sistemik, dengan mortalitas pada flok pada beberapa spesies rentan dapat
mencapai 100% (Capua and Maragon 2007). Terminologi highly pathogenic
Avian Influenza dan fowl plague merupakan infeksi dari strain virulen influenza A
yang diisolasi dari unggas domestik. Isolat highly pathogenic Avian Influenza
diklasifikasikan ke dalam notifiable Avian Influenza (NAI). Isolat strain virulen
pada saat ini berasal dari subtipe H5 atau H7, namun sebagian besar H5 dan H7
memiliki virulensi rendah. Penyebab perubahan virulensi pada H5 dan H7 dapat
terjadi akibat mutasi pada induk semang unggas, sehingga semua subtipe H5 dan
H7 diklasifikasikan sebagai NAI virus (OIE 2005).
Subtipe H5 dan H7 yang bersifat patogen memiliki multibasic cleavage
site dengan prekursor pada molekul H. Virus HPAI infeksinya bersifat “dead-end”
pada unggas peliharaan (misalnya ayam dan kalkun) dan memiliki gejala klinis
yang bervariasi. Pada unggas air peliharaan dan unggas liar virus ini tidak
menyebabkan gejala klinis dan kematian (Capua and Maragon 2007). Diketahui
bahwa virus AI beredar secara terus menerus pada unggas air (Ito et. al. 1995).
6
Beberapa virus AI (H1-H16) yang memiliki multibasic cleavage site pada
gen H yang berada di alam hidup di dalam tubuh burung liar. Interaksi unggas liar
dengan unggas air di alam memungkinkan virus AI ditularkan diantara kedua
populasi unggas tersebut.
Unggas air merupakan inang alami yang menjadi
sumber penularan virus bagi hewan lain. Interaksi unggas liar dengan unggas
peliharaan menyebabkan virus ini menyebar dalam populasi unggas tersebut.
Penyebaran virus pada unggas peliharaan menimbulkan infeksi lokal, gejala sakit
ringan seperti gangguan pernafasan, depresi dan masalah produksi telur pada
unggas petelur. Teori yang berkembang saat ini menyatakan bahwa virus HPAI
berasal dari LPAI H5 dan H7 yang mengalami mutasi atau rekombinasi, yang
menyebabkan perubahan gen daerah cleavage site dari protein haemaglutinin
(HA) (Capua and Maragon 2007). Kejadian wabah HPAI di Chile dan Kanada
disebabkan oleh virus H7 yang bermutasi menjadi HPAI melalui rekombinasi
melibatkan nukleoprotein dan gen matrik. Kejadian ini merupakan laporan
pertama rekombinasi berasosiasi dengan kenaikan virulensi virus AI (Senne
2007). Introduksi pada populasi burung domestik, menyebabkan bentuk virus
menjadi low-pathogenic Avian Influenza (LPAI).
Mekanisme mutasi pada virus AI meliputi insersi asam amino dasar atau
substitusi asam amino nonbasic pada HA proteolitic cleavage site, kehilangan
glycosilasin site menghasilkan virus dengan cleavage site yang tidak terlindungi,
atau insersi sejumlah besar RNA. Berdasarkan studi filogenetik virus AI tampak
bahwa perubahan virulensi dari rendah ke tinggi mengindikasikan virus HPAI
memiliki pohon filogenik yang sama dengan virus LPAI dengan strain H7 yang
tidak virulen. Kejadian mutasi virus tidak terprediksi dan dapat berlangsung
singkat setelah virus menginfeksi unggas maupun setelah bersirkulasi dalam tubuh
unggas peliharaan. Dengan demikian peredaran LPAI subtipe H5 dan H7 juga
perlu diperhatikan karena virus LPAI tersebut merupakan prekursor HPAI (Capua
and Maragon 2007).
Sejak 100 tahun yang lalu telah teridentifikasi bahwa
manusia dapat terinfeksi subtipe H1, H2, H3, N1 dan N2 dan membentuk antibodi
terhadap virus tersebut. Kejadian pandemi influenza A H2N2 dan H3N2
kemungkinan berasal dari virus unggas yang mengalamai genetic reassortment
antara virus unggas dan manusia (Kawaoka et. al 1989).
7
Penyebaran dan Transmisi Virus Avian Influenza
Beberapa faktor yang berperan dalam transmisi virus AI antara lain
buruknya biosekuriti pada sistem peternakan, keluar masuknya unggas dan
produknya, perdagangan hewan hidup di pasar. Air di kolam atau genangan air
memungkinkan virus bertahan di luar induk semang, sehingga dapat menjadi
sumber penyebaran virus. Migrasi unggas liar pembawa virus low-pathogenic
Avian Influenza (LPAI) maupun highly pathogenic Avian Influenza (HPAI)
berperan dalam penyebaran virus ini (Goutard et al. 2007).
Populasi itik di Cina dan Vietnam sangat banyak mencapai 70% populasi
itik dunia. Sistem pemeliharaan dengan cara diumbar di kedua negara tersebut
menjadi masalah kritis dalam epidemiologi AI karena beberapa itik peliharaan
dapat membawa HPAI dalam waktu pendek dan tidak ada penerapan biosekuriti
dalam pemeliharaan tersebut. Hal ini berpotensi terjadi pertukaran virus antara itik
dengan unggas liar. Itik tersebut banyak yang dijual di pasar unggas hidup yang
bercampur dengan spesies unggas darat (Sims 2007). Para ahli biodiversiti
menyimpulkan bahwa perdagangan global burung sebagai hewan kesayangan
berperan dalam perpindahan virus secara besar-besaran. Jalur penularan AI antara
lain melalui migrasi burung liar, perdagangan unggas peliharaan dan unggas liar
(Kilpatrick et al. 2006 dalam Daszak and Chmura 2008).
Murphy et al. (2001) menyatakan adanya virus AI dapat diisolasi di
berbagai negara dari importasi burung. Jorgensen et al. (1998) menyatakan bahwa
virus AI subtipe H5N2 dapat diisolasi pada burung unta yang diimport dari
Zimbabwe ke Belanda dan Denmark pada tahun 1996. Tahun 2004 virus HPAI
H5N1 diisolasi dari burung elang yang diselundupkan dari Thailand yang
terdeteksi di Bandar Udara Brussel. Virus AI yang terisolasi tersebut secara
genetik mirip dengan virus
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta,
adalah karya saya sendiri, dengan bimbingan para Komisi Pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
NRP. B251064084
ABSTRACT
MUJIATUN. Detection of Avian Influenza Virus in Day Old Chick (DOC)
Transported in Soekarno Hatta Airport. Under direction of RETNO D.
SOEJOEDONO and SRI MURTINI.
The aims of this research was detecting and isolating AIV in DOC.
Samples were taken from DOC which transported through Soekarno Hatta Airport
Quarantine Station. The detect disease method with convenience sampling
methods was used with the estimation of prevalence at about 0.9%. The total
samples were 346 DOC. There were 58 pooled samples of tracheas and lungs,
which collected from 6 DOC per pooled. Afterwards, sera and egg yolks were
individually collected. Sera were tested with haemagglutinin inhibition (HI) test.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assays were
performed to the pooled tracheas and lungs. This RT-PCR were carried out to
prove the presence of Influenza virus A using a pair of matrix primers (F-MatrikAI; R-Matrik-AI). The samples which were positively AIV detected by RT-PCR
assays using matrix primers were tested using H5 primers (F-H5-AI; R-H5-AI).
The RT-PCR assays were also generated to the egg yolks. These assays were
performed to confirm the absence of AIV in the DOC which were negatively
detected by RT-PCR assays. In this detection, three pairs of matrix primers were
used (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI), (M-Flu 1; M-Flu 2) and (FAI; RAI). The
detected matrix protein of AIV in those samples were tested with H5 primers
(FH5; RH5) and (HA-1444; H5-1735R). Geometric mean titer (GMT) of the
samples were 11.7 while mean titer of the positive AIV were 32. It also identified
that 6 of 58 samples were positively detected by AIV matrix primers but negative
by H5 primers. Third teen samples negatively detected by matrix primers, 8
samples were positively identified in egg yolks by RT-PCR assays. Influenza
virus A were positively identified in those 8 samples using matrix primers (M-Flu
1; M-Flu 2), while 3 of 13 samples were positively detected using different matrix
primers (FAI; RAI) and one of them positive by H5 primers (FH5; RH5). The
differences between RT-PCR results, it can cause difference of genetic sequences
and also resulted from the different target of primer annealing. Also, this research
was verifying the possibility of AIV to be transmitted vertically to the DOC. This
verification were concluded from the high concentration of AIV detected in egg
yolk compared with AIV concentration in tracheas and lungs.
Key words: day old chick, influenza A, avian influenza virus, matrix, H5, primer
RINGKASAN
MUJIATUN. Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang
Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta. Di bawah bimbingan RETNO
D. SOEJOEDONO dan SRI MURTINI.
Perpindahan hewan dari suatu daerah/negara ke daerah/negara lain
berpotensi menyebarkan penyakit. Salah satu penyakit penting yang bersifat
transboundary animal diseases adalah Avian Influenza (AI). Day Old Chick
(DOC) diduga berpotensi terinfeksi dan menyebarkan Virus Avian Influenza
(VAI) kepada unggas lain melalui importasi dari negara lain dan transportasi dari
Jawa ke pulau lain di Indonesia. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas yang tidak memiliki peternakan pembibitan karena sentra industri
peternakan unggas sebagian besar terletak di Pulau Jawa yang merupakan daerah
tertular. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan pendekatan metode Detect Diseases.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Pengujian untuk pooling
sampel organ paru-paru dan trakhea digunakan primer matrik: F-matrik-AI; Rmatrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI (Lee et.al 2001). Setelah diketahui proporsi
sampel DOC positif AI, kemudian dilakukan konfirmasi untuk meyakinkan bahwa
sampel yang negatif pada organ trakhea dan paru-paru dengan primer Lee et al.
(2001) benar-benar negatif. Pengujian dilakukan pada organ kuning telur secara
individu dengan 3 jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al.
2001), M-Flu 1; M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
dilanjutkan dengan 2 jenis primer H5 yaitu FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan
HA-1444; H5-1735R (WHO 2002). Beberapa sampel positif pada pooling organ
trakhea dan paru-paru dilakukan penelusuran pada kuning telur secara individu
menggunakan primer matrik: FAI; RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004).
Penelusuran dilakukan untuk mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC.
Sampel-sampel yang menunjukkan hasil positif AI dilakukan inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) untuk mendapatkan isolat
virus AI dari DOC.
Sebanyak 346 sampel DOC dan 172 serum diperoleh dari DOC hidup
yang dikirim ke luar pulau jawa (antar area). Trakhea dan paru-paru dikumpulkan
dalam pooling, setiap pooling terdiri dari 6 organ DOC dan diperoleh sejumlah 58
pooling. Pooling berdasarkan perusahan produsen/importir dan tanggal menetas.
Serum diuji dengan metode penghambatan haemaglutinasi atau haemaglutinasi
inhibition (HI) tes mengikuti standar OIE (2005). Supernatan suspensi organ dan
kuning telur diekstraksi dengan TRIzol-LS (Invitrogen).
Pengujian RT-PCR menggunakan enzim Superscript TM One-Step RT-PCR
with Platimum ® Taq (Invitrogen Cat. No. 10928-034) dengan total reaksi 25 µl
yang mengandung 12.5 µl 2x Reaction Mix, 3 µl RNA, 0.5 µl RT/Platinum® Taq
Mix, 0.5 µl (0.2 µM) primer forward, 0.5 µl (0.2 µM) primer reverse dan 17
ddH2O. Formulasi reaksi RT-PCR ini berlaku untuk semua jenis primer. Proses
amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycle Sprint Hybaid dan Gene Amp®.
Masing-masing reaksi dianalisis dengan menggunakan elektroforesis 135 volt
selama 35 menit (Mupid-x Japan) dan elektroforesis 100 volt, 400 mA selama 60
menit (Owl Model OSP-300) dengan konsentrasi agar rose 1.5 % (Invitrogen)
dengan pewarnaan ethidium bromida (Sigma), DNA marker 100 bp (Invitrogen
dan Fermentas) dan 50 bp (Invitrogen) selanjutnya hasil dibaca dengan UV
transilluminator. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil dubius, positif lemah
dan positif dilakukan inokulasi pada TAB-SPF mengikuti standar OIE (2005). Uji
korelasi Spearman digunakan untuk melihat korelasi antara maternal antibodi
dengan keberadaan virus AI pada sampel.
Rataan titer maternal antibodi pada sampel adalah 23.5 (11.7). Uji korelasi
Spearman antara titer maternal antibodi dengan primer matrik tidak signifikan
pada α = 0.05 artinya keberadaan virus Influenza A pada DOC tidak dipengaruhi
oleh adanya maternal antibodi. Penelitian ini juga menunjukkan rataan titer
antibodi AI dari sampel positif virus dengan uji RT-PCR sebesar 25 (32). Rataan
titer dari masing-masing sampel tesebut belum cukup untuk memproteksi unggas
terhadap infeksi dan eksresi (shedding) virus AI.
Sejumlah 58 pooling sampel yang diuji terdapat 6 sampel yang
menunjukkan positif Influenza A dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-MatrikAI) tetapi negatif pada pengujian dengan primer H5 (F-H5-AI; R-H5-A1). Jika
diasumsikan bahwa dalam 1 pooling organ terdapat sekurang-kurangnya 1 sampel
organ DOC mengandung virus Influenza A maka dapat dihitung angka prevalensi.
Total sampel 346, sebanyak 6 sampel positif Influenza A (1.73%). Sampel antar
area 174, sebanyak 3 sampel positif Influenza A (1.72%). Berdasarkan daerah asal
dapat diperoleh angka prevalensi untuk Cianjur yang menunjukkan 1 sampel
positif dari 48 sampel DOC (2.08%), Subang 1 sampel positif dari 66 sampel
DOC (1.51%) dan Tangerang 1 sampel positif dari 42 sampel DOC (2.38%),
sementara itu untuk sampel dari Bogor dan Sukabumi negatif terhadap AI. Sampel
kadaver DOC impor dari USA menunjukkan prevalensi virus Influenza A sebesar
3 sampel positif dari 172 sampel kadaver DOC (1.74%).
Penelusuran pengujian RT-PCR pada organ kuning telur dengan 3 macam
primer, dilakukan pada 13 sampel negatif AI pada paru-paru dan trakhea yang
telah diuji dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI). Kuning telur diuji
menggunakan primer matrix (M-Flu 1; M-Flu 2) menunjukkan 8 sampel positif
dan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan 3 sampel positif. Hasil positif
berbeda-beda pada setiap pasangan primer, hal ini dapat terjadi karena perbedaan
gen penyusun dari masing-masing virus dan perbedaan target annealing dari
masing-masing primer. Satu sampel positif matrik dengan primer matrik (FAI;
RAI) menunjukkan positif H5 dengan primer H5 (FH5; RH5).
Konfirmasi pengujian dilakukan pada sampel positif. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa sampel yang positif dengan primer matrik (F-Matrik-AI; RMatrik-AI) ketika dikonfirmasi dengan pasangan primer matrik (FAI; RAI) dan
H5 (FH5; RH5) menunjukkan hasil yang tetap positif. Berdasarkan penelitian ini
ditemukan bahwa DOC mengandung virus AI subtipe H5, namun tidak menutup
kemungkinan adanya subtipe virus Influenza A lain. Hasil inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) dari sampel kuning telur yang
menunjukkan hasil positif AI dengan metode RT-PCR diperoleh isolat virus
Avian Influenza.
Penelusuran untuk mengetahui pola penularan AI dilakukan pengujian RTPCR pada sampel positif dan negatif pada organ paru-paru dan trakhea
menggunakan pasangan primer marik dan H5 dari Lee & Suarez (2004). Virus
Avian Influenza negatif pada organ trakhea dan paru-paru DOC dengan RT-PCR,
tetapi setelah dilakukan penelusuran pada sampel kuning telur menunjukkan hasil
yang dubius, positif lemah dan positif (37,5%). Sampel-sampel yang
menunjukkan positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru tetap
menunjukkan hasil yang positif (62,5%). Pooling sampel trakhea dan paru-paru
positif matrik setelah diinokulasikan pada TAB-SPF menunjukkan hasil negatif
(100%). Sebanyak 100% sampel kuning telur yang positif RT-PCR dengan
primer matrik dan H5 menunjukkan hasil positif setelah dilakukan inokulasi pada
TAB-SPF. Hasil inokulasi TAB-SPF pada pooling organ paru-paru dan trakhea
negatif karena jumlah virus dalam organ tersebut masih sedikit sehingga belum
mencapai 1 EID50 (jumlah virus minimal untuk dapat tumbuh pada TAB). Virus
AI pada kuning telur dapat tumbuh pada TAB-SPF karena jumlahnya lebih
banyak dari 1 EID50. Penelitian ini menunjukkan adanya fenomena bahwa virus
Avian Influenza dapat ditularkan secara vertikal.
Kata kunci: day old chick, influenza A, virus avian influenza, matriks, H5, primer.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009
Hak cipta ini dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC
yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta
: Mujiatun
: B 251064084
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Retno D Soejoedono MS
Ketua
Dr. drh. Sri Murtini, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr. drh. Denny Widaya Lukman, MSi.
Tanggal Ujian : 19 Januari 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.
Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Ekowati Handaryani, MSi
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta,
adalah karya saya sendiri, dengan bimbingan para Komisi Pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
NRP. B251064084
ABSTRACT
MUJIATUN. Detection of Avian Influenza Virus in Day Old Chick (DOC)
Transported in Soekarno Hatta Airport. Under direction of RETNO D.
SOEJOEDONO and SRI MURTINI.
The aims of this research was detecting and isolating AIV in DOC.
Samples were taken from DOC which transported through Soekarno Hatta Airport
Quarantine Station. The detect disease method with convenience sampling
methods was used with the estimation of prevalence at about 0.9%. The total
samples were 346 DOC. There were 58 pooled samples of tracheas and lungs,
which collected from 6 DOC per pooled. Afterwards, sera and egg yolks were
individually collected. Sera were tested with haemagglutinin inhibition (HI) test.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assays were
performed to the pooled tracheas and lungs. This RT-PCR were carried out to
prove the presence of Influenza virus A using a pair of matrix primers (F-MatrikAI; R-Matrik-AI). The samples which were positively AIV detected by RT-PCR
assays using matrix primers were tested using H5 primers (F-H5-AI; R-H5-AI).
The RT-PCR assays were also generated to the egg yolks. These assays were
performed to confirm the absence of AIV in the DOC which were negatively
detected by RT-PCR assays. In this detection, three pairs of matrix primers were
used (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI), (M-Flu 1; M-Flu 2) and (FAI; RAI). The
detected matrix protein of AIV in those samples were tested with H5 primers
(FH5; RH5) and (HA-1444; H5-1735R). Geometric mean titer (GMT) of the
samples were 11.7 while mean titer of the positive AIV were 32. It also identified
that 6 of 58 samples were positively detected by AIV matrix primers but negative
by H5 primers. Third teen samples negatively detected by matrix primers, 8
samples were positively identified in egg yolks by RT-PCR assays. Influenza
virus A were positively identified in those 8 samples using matrix primers (M-Flu
1; M-Flu 2), while 3 of 13 samples were positively detected using different matrix
primers (FAI; RAI) and one of them positive by H5 primers (FH5; RH5). The
differences between RT-PCR results, it can cause difference of genetic sequences
and also resulted from the different target of primer annealing. Also, this research
was verifying the possibility of AIV to be transmitted vertically to the DOC. This
verification were concluded from the high concentration of AIV detected in egg
yolk compared with AIV concentration in tracheas and lungs.
Key words: day old chick, influenza A, avian influenza virus, matrix, H5, primer
RINGKASAN
MUJIATUN. Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC yang
Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta. Di bawah bimbingan RETNO
D. SOEJOEDONO dan SRI MURTINI.
Perpindahan hewan dari suatu daerah/negara ke daerah/negara lain
berpotensi menyebarkan penyakit. Salah satu penyakit penting yang bersifat
transboundary animal diseases adalah Avian Influenza (AI). Day Old Chick
(DOC) diduga berpotensi terinfeksi dan menyebarkan Virus Avian Influenza
(VAI) kepada unggas lain melalui importasi dari negara lain dan transportasi dari
Jawa ke pulau lain di Indonesia. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas yang tidak memiliki peternakan pembibitan karena sentra industri
peternakan unggas sebagian besar terletak di Pulau Jawa yang merupakan daerah
tertular. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan pendekatan metode Detect Diseases.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Pengujian untuk pooling
sampel organ paru-paru dan trakhea digunakan primer matrik: F-matrik-AI; Rmatrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI (Lee et.al 2001). Setelah diketahui proporsi
sampel DOC positif AI, kemudian dilakukan konfirmasi untuk meyakinkan bahwa
sampel yang negatif pada organ trakhea dan paru-paru dengan primer Lee et al.
(2001) benar-benar negatif. Pengujian dilakukan pada organ kuning telur secara
individu dengan 3 jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al.
2001), M-Flu 1; M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
dilanjutkan dengan 2 jenis primer H5 yaitu FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan
HA-1444; H5-1735R (WHO 2002). Beberapa sampel positif pada pooling organ
trakhea dan paru-paru dilakukan penelusuran pada kuning telur secara individu
menggunakan primer matrik: FAI; RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004).
Penelusuran dilakukan untuk mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC.
Sampel-sampel yang menunjukkan hasil positif AI dilakukan inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) untuk mendapatkan isolat
virus AI dari DOC.
Sebanyak 346 sampel DOC dan 172 serum diperoleh dari DOC hidup
yang dikirim ke luar pulau jawa (antar area). Trakhea dan paru-paru dikumpulkan
dalam pooling, setiap pooling terdiri dari 6 organ DOC dan diperoleh sejumlah 58
pooling. Pooling berdasarkan perusahan produsen/importir dan tanggal menetas.
Serum diuji dengan metode penghambatan haemaglutinasi atau haemaglutinasi
inhibition (HI) tes mengikuti standar OIE (2005). Supernatan suspensi organ dan
kuning telur diekstraksi dengan TRIzol-LS (Invitrogen).
Pengujian RT-PCR menggunakan enzim Superscript TM One-Step RT-PCR
with Platimum ® Taq (Invitrogen Cat. No. 10928-034) dengan total reaksi 25 µl
yang mengandung 12.5 µl 2x Reaction Mix, 3 µl RNA, 0.5 µl RT/Platinum® Taq
Mix, 0.5 µl (0.2 µM) primer forward, 0.5 µl (0.2 µM) primer reverse dan 17
ddH2O. Formulasi reaksi RT-PCR ini berlaku untuk semua jenis primer. Proses
amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycle Sprint Hybaid dan Gene Amp®.
Masing-masing reaksi dianalisis dengan menggunakan elektroforesis 135 volt
selama 35 menit (Mupid-x Japan) dan elektroforesis 100 volt, 400 mA selama 60
menit (Owl Model OSP-300) dengan konsentrasi agar rose 1.5 % (Invitrogen)
dengan pewarnaan ethidium bromida (Sigma), DNA marker 100 bp (Invitrogen
dan Fermentas) dan 50 bp (Invitrogen) selanjutnya hasil dibaca dengan UV
transilluminator. Sampel-sampel yang menunjukkan hasil dubius, positif lemah
dan positif dilakukan inokulasi pada TAB-SPF mengikuti standar OIE (2005). Uji
korelasi Spearman digunakan untuk melihat korelasi antara maternal antibodi
dengan keberadaan virus AI pada sampel.
Rataan titer maternal antibodi pada sampel adalah 23.5 (11.7). Uji korelasi
Spearman antara titer maternal antibodi dengan primer matrik tidak signifikan
pada α = 0.05 artinya keberadaan virus Influenza A pada DOC tidak dipengaruhi
oleh adanya maternal antibodi. Penelitian ini juga menunjukkan rataan titer
antibodi AI dari sampel positif virus dengan uji RT-PCR sebesar 25 (32). Rataan
titer dari masing-masing sampel tesebut belum cukup untuk memproteksi unggas
terhadap infeksi dan eksresi (shedding) virus AI.
Sejumlah 58 pooling sampel yang diuji terdapat 6 sampel yang
menunjukkan positif Influenza A dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-MatrikAI) tetapi negatif pada pengujian dengan primer H5 (F-H5-AI; R-H5-A1). Jika
diasumsikan bahwa dalam 1 pooling organ terdapat sekurang-kurangnya 1 sampel
organ DOC mengandung virus Influenza A maka dapat dihitung angka prevalensi.
Total sampel 346, sebanyak 6 sampel positif Influenza A (1.73%). Sampel antar
area 174, sebanyak 3 sampel positif Influenza A (1.72%). Berdasarkan daerah asal
dapat diperoleh angka prevalensi untuk Cianjur yang menunjukkan 1 sampel
positif dari 48 sampel DOC (2.08%), Subang 1 sampel positif dari 66 sampel
DOC (1.51%) dan Tangerang 1 sampel positif dari 42 sampel DOC (2.38%),
sementara itu untuk sampel dari Bogor dan Sukabumi negatif terhadap AI. Sampel
kadaver DOC impor dari USA menunjukkan prevalensi virus Influenza A sebesar
3 sampel positif dari 172 sampel kadaver DOC (1.74%).
Penelusuran pengujian RT-PCR pada organ kuning telur dengan 3 macam
primer, dilakukan pada 13 sampel negatif AI pada paru-paru dan trakhea yang
telah diuji dengan primer matrik (F-Matrik-AI; R-Matrik-AI). Kuning telur diuji
menggunakan primer matrix (M-Flu 1; M-Flu 2) menunjukkan 8 sampel positif
dan primer matrik (FAI; RAI) menunjukkan 3 sampel positif. Hasil positif
berbeda-beda pada setiap pasangan primer, hal ini dapat terjadi karena perbedaan
gen penyusun dari masing-masing virus dan perbedaan target annealing dari
masing-masing primer. Satu sampel positif matrik dengan primer matrik (FAI;
RAI) menunjukkan positif H5 dengan primer H5 (FH5; RH5).
Konfirmasi pengujian dilakukan pada sampel positif. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa sampel yang positif dengan primer matrik (F-Matrik-AI; RMatrik-AI) ketika dikonfirmasi dengan pasangan primer matrik (FAI; RAI) dan
H5 (FH5; RH5) menunjukkan hasil yang tetap positif. Berdasarkan penelitian ini
ditemukan bahwa DOC mengandung virus AI subtipe H5, namun tidak menutup
kemungkinan adanya subtipe virus Influenza A lain. Hasil inokulasi pada telur
ayam berembrio-specific pathogen free (TAB-SPF) dari sampel kuning telur yang
menunjukkan hasil positif AI dengan metode RT-PCR diperoleh isolat virus
Avian Influenza.
Penelusuran untuk mengetahui pola penularan AI dilakukan pengujian RTPCR pada sampel positif dan negatif pada organ paru-paru dan trakhea
menggunakan pasangan primer marik dan H5 dari Lee & Suarez (2004). Virus
Avian Influenza negatif pada organ trakhea dan paru-paru DOC dengan RT-PCR,
tetapi setelah dilakukan penelusuran pada sampel kuning telur menunjukkan hasil
yang dubius, positif lemah dan positif (37,5%). Sampel-sampel yang
menunjukkan positif pada pooling organ trakhea dan paru-paru tetap
menunjukkan hasil yang positif (62,5%). Pooling sampel trakhea dan paru-paru
positif matrik setelah diinokulasikan pada TAB-SPF menunjukkan hasil negatif
(100%). Sebanyak 100% sampel kuning telur yang positif RT-PCR dengan
primer matrik dan H5 menunjukkan hasil positif setelah dilakukan inokulasi pada
TAB-SPF. Hasil inokulasi TAB-SPF pada pooling organ paru-paru dan trakhea
negatif karena jumlah virus dalam organ tersebut masih sedikit sehingga belum
mencapai 1 EID50 (jumlah virus minimal untuk dapat tumbuh pada TAB). Virus
AI pada kuning telur dapat tumbuh pada TAB-SPF karena jumlahnya lebih
banyak dari 1 EID50. Penelitian ini menunjukkan adanya fenomena bahwa virus
Avian Influenza dapat ditularkan secara vertikal.
Kata kunci: day old chick, influenza A, virus avian influenza, matriks, H5, primer.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009
Hak cipta ini dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.
DETEKSI KEBERADAAN VIRUS AVIAN
INFLUENZA PADA DOC YANG DILALULINTASKAN
MELALUI BANDARA SOEKARNO HATTA
MUJIATUN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Deteksi Keberadaan Virus Avian Influenza pada DOC
yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta
: Mujiatun
: B 251064084
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Retno D Soejoedono MS
Ketua
Dr. drh. Sri Murtini, MSi
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr. drh. Denny Widaya Lukman, MSi.
Tanggal Ujian : 19 Januari 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS.
Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Ekowati Handaryani, MSi
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kebumen - Jawa Tengah pada tanggal 1 November 1976,
merupakan anak pertama dari pasangan Bapak Darudin dan Ibu Sutinah. Penulis
menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar pada tahun 1989 di SDN Kaligubug, Prembun,
Kebumen dan pada tahun 1992 menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Pertama
di SMP Negeri 2 Prembun. Selanjutnya penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas
di SMAN Prembun dan lulus pada tahun 1995. Tahun 1995 penulis melanjutkan kuliah
di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan meraih gelar Dokter Hewan
pada tahun 2001.
Pada tahun 2001 sampai 2002 penulis bekerja di Klinik Santa sebagai Dokter
Hewan Praktek, tahun 2003 menjadi Dokter Hewan di sekolah berkuda Athena Stables,
tahun 2004 bekerja di Laboratorium Kesehatan Hewan Propinsi Banten, pada tahun
2005 Masuk di Badan Karantina Pertanian, Departemen Pertanian dan ditempatkan di
Stasiun Karantina Hewan Kelas II Samarinda, pada tahun 2006 penulis dipindahkan ke
Balai Besar Karantina Hewan Soekarno Hatta dan pada tahun 2007 sampai sekarang
bekerja di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Badan Karantina Pertanian,
Departemen Pertanian. Untuk meningkatkan kemampuan teknis dan wawasan tentang
laboratorium veteriner, penulis diberi kesempatan untuk mengikuti pelatihan antara lain
Training of Veterinary Laboratory di Veterinary Research Institute (VRI) Ipoh
Malaysia pada tahun 2006. Pada Tahun 2007 penulis mendapatkan beasiswa dari Badan
Karantina Pertanian untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang S-2 pada Program Studi
Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke-hadirat Allah Subhanahu Wata’ala yang telah
memberikan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah Deteksi Keberadaan Virus Avian
Influenza pada DOC yang Dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta.
Penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Ir.
Syukur Iwantoro, MSi, MBA sebagai Kepala Badan Karantina Pertanian periode 20062008 dan Ir. Hari Priyono, MSi sebagai Sekretaris Badan Karantina Pertanian periode
2006-2008 beserta Jajarannya atas prakarsa dalam pengadaan beasiswa. Kepala Balai
Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) beserta staf dan Kepala Balai Besar
Karantina Hewan Soekarno Hatta (BBKHSH), Kepala Balai Besar Karantina Pertanian
Soekarno Hatta (BBKPSH) dan staf yang telah memfasilitasi penelitian ini. Prof. Dr.
drh. Retno D Soejoedono, MS sebagai Ketua Komisi Pembimbing dan Dr. drh. Sri
Murtini, MSi sebagai Anggota Komisi Pembimbing, atas segala dukungan, bimbingan,
dan arahan terhadap penulis selama penelitian dan penulisan tesis. Tak lupa pula penulis
sampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. drh. Denny W. Lukman, MSi., selaku Ketua
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian
Bogor; Drh. Sofia Setyawati, MP atas kerjasama dan bantuannya; Drh. Surachmi
Setyaningsih, MSc, PhD atas segala bantuannya; Drh. Chairul Basri atas segala
informasi dan bantuannya; Drh. Basir Nainggolan sebagai Kepala Balai Karantina
Hewan Tanjung Priok periode 2004-2008 beserta staf atas fasilitas transportasinya
selama penulis menjalankan kuliah di Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor;
Drh. Sri Yusnowati atas segala dukungannya; Pak Agus atas bantuannya. Rekan-rekan
satu angkatan Kelas Khusus Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor tahun 2007, atas kebersamaannya sehingga
program ini bisa kita selesaikan bersama-sama. Pak Surya Supir atas dedikasinya
mengantarkan kami kuliah.
Ucapan terima kasih yang dalam kepada Ibunda Sutinah, Ayahanda Darudin,
Adinda Juniyah, Suami Sapto Subroto, SE serta keluarga besar Bapak Samadi yang telah
memberikan dukungan moral dan material dalam menyelesaikan penulisan tesis ini.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua fihak yang tidak dapat kami
sebutkan satu-persatu, yang telah membantu dalam kelancaran studi dan penelitian ini.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan permohonan maaf yang sebesarbesarnya apabila terdapat kesalahan selama penelitian, pembimbingan dan penulisan
tesis. Atas segala kebaikan yang telah penulis terima semoga Allah SWT berkenan
melimpahkan rahmat dan ridha-Nya kepada kita semua. Harapan penulis semoga tulisan
ini dapat bermanfaat untuk meningkatkan ilmu pengetahuan kita semua. Amien.
Bogor, Januari 2009
Mujiatun
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL …………………………………………………………
xii
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………… xiii
PENDAHULUAN ………………………………………………………..... 1
TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………………...
Day Old Chick (DOC) ………………………………………………
Virus Avian Influenza ………………………………………………
Penyebaran dan Transmisi Virus Avian Influenza …………………..
Patogenesitas Virus AI ………………………………………….......
Pengendalian Avian Influenza ………………………………………
Diagnosa Laboratorium Virus Avian Influenza ……………………...
3
3
4
7
8
10
11
BAHAN DAN METODA …………………………………………………
Waktu dan Tempat Penelitian ……………………………………….
Rancangan Percobaan ………………………………………………..
Uji Serologi Antibody terhadap Antigen H5 ………………………...
Pembuatan RBC 1% …………………………………………...
Haemaglutination (HA) Test .....................................................
Pembuatan Suspensi Virus Standar .............................................
Haemaglutination Inhibition (HI) Test ……………………........
Identifikasi Virus Avian Influenza …………………………………..
Preparasi Sampel ……………………………………………...
Isolasi RNA Virus …………………………………………….
Runing pada Thermal Cycle …………………………………..
Elektroforesis Hasil RT-PCR pada Gel Agarose 1.5% .............
Isolasi Virus Avian Influenza ………………………………………..
13
13
13
14
14
15
16
16
16
17
17
18
19
20
HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………
Titer Antibodi AI …………………………………………………….
Pengujian RT-PCR untuk Pooling Organ …………………………...
Penelusuran Keberadaan Virus AI pada Kuning Telur ……………...
Hasil Isolasi Virus …………………………………………………...
Penelusuran Sumber Penularan Virus AI ……………………………
21
22
23
26
30
33
x
SIMPULAN ………………………………………………………………..
38
SARAN …………………………………………………………………….
39
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………...
41
LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 45
xi
DAFTAR TABEL
1
2
Halaman
Primer yang digunakan dalam pengujian RT-PCR ………………….. 18
Hasil sampel DOC yang di ambil di Instalasi Karantina Hewan
BBKP-SH dan gudang pemberangkatan dan kedatangan Bandara
Soekarno Hatta .....................................................................................
21
Data sampel positif matriks Influenza A pada sampel DOC dari
Bandara Soekarno Hatta .......................................................................
23
4
Penelusuran virus AI dengan berbagai primer pada kuning telur .........
27
5
Konfirmasi pengujian pada sampel kuning telur .................................. 29
6
Hasil inokulasi pada TAB-SPF dari sampel organ paru-paru dan
trakhea yang positif RT-PCR AI ……………………………………..
3
30
7
Hasil inokulasi (pasase-1) pada TAB-SPF dari sampel kuning telur
yang positif RT-PCR AI …………………………………………….. 31
8
Hasil inokulasi (pasase-2) pada TAB-SPF dari sampel kuning telur
yang positif RT-PCR AI ……………………………………………...
9
32
Hasil penelusuran sumber penularan virus AI ...................................... 34
xii
DAFTAR GAMBAR
1
Halaman
Anatomi Virus Influenza A (Subbarao & Joseph 2007)……………….. 5
2
Proporsi sampel positif Influenza A ......................................................
25
3
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer matrik: F-matrikAI; R-Matrik AI (Lee et al. 2001) pada 200 base pairs (bp) .................
26
4
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer matrik: M-Flu 1;
M-Flu 2 (Trani et al. 2006) pada 154-172 bp ………………………… 27
5
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dengan primer H5: FH5; RH5
(Lee & Suarez 2004) pada 55 bp ...........................................................
28
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari inokulasi pada TAB-SPF
(pasase ke-1) dengan primer matrik : FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
pada 55 bp ..............................................................................................
31
6
7
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari inokulasi pada TAB-SPF
(pasase ke-2) dengan primer matrik: FAI; RAI (Lee & Suarez 2004)
pada 55 bp .............................................................................................. 32
8
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari penelusuran sampel kuning
telur dengan primer matrik: FAI; RAI (Lee & Suarez 2004) pada 55
bp .........................................................................................................
9
35
Hasil elektroforesis produk RT-PCR dari penelusuran sampel kuning
35
telur dengan primer H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) pada 55 bp
xiii
1
PENDAHULUAN
Perdagangan hewan hidup antar negara, antar pulau maupun antar benua
sudah berlangsung sejak puluhan tahun. Perpindahan ternak dan hewan piaraan
dari satu negara/daerah ke negara/daerah lain sejalan dengan perpindahan
manusia. Perpindahan hewan tersebut selain memindahkan hewan, juga
berpotensi menyebarkan penyakit. Perpindahan hewan dapat terjadi dari satu
tempat ke tempat lain secara cepat maupun lambat tergantung sarana transportasi
yang digunakan.
Salah satu penyakit menular yang sangat mudah menyebar (transboundary
animal diseases) adalah Avian Influenza. Peraturan pemerintah yang mengatur
pengendalian penyakit AI dituangkan dalam Peraturan Dirjen Peternakan nomor:
46/PD.640/F/08.05. Peraturan tersebut menyatakan bahwa lalu lintas anak ayam
umur 1 hari (DOC), anak itik umur 1 hari (DOD), telur dan pakan ternak dari
daerah tertular ke daerah bebas dapat diizinkan dengan persyaratan tertentu.
Peraturan ini dibuat dengan pertimbangan untuk memenuhi kebutuhan konsumen
di daerah bebas penyakit AI. Sebagian besar daerah bebas tersebut tidak memiliki
peternakan pembibitan karena sentra industri peternakan unggas terletak di Pulau
Jawa yang merupakan daerah tertular. Beberapa ahli melihat adanya pola
penyebaran AI di Indonesia berbanding lurus dengan pola penyebaran dan
perdagangan DOC.
Anak ayam (DOC) komersial tidak lazim terinfeksi virus H5N1 saat
menetas. Telur yang telah terinfeksi secara vertikal dari induknya memiliki daya
tetas rendah. Anak ayam (DOC) dapat tertular virus AI akibat terkontaminasi dari
alat angkut (FAO (2008). Wibawan (2006) menyatakan kondisi virus AI saat ini
sudah berbentuk infeksi subklinik, yang berarti bahwa hewan terinfeksi namun
tidak menunjukkan gejala klinis sakit. Adanya penyakit yang tidak terdeteksi
dengan tepat menyebabkan meluasnya penyakit di lapangan.
Penyebaran penyakit AI sampai saat ini akibat perpindahan unggas
dewasa. Virus Avian Influenza dapat menyebar bersama perpindahan DOC. Peran
DOC sebagai media penyebar virus AI belum banyak diteliti dan diketahui oleh
para ahli. Karantina Hewan merupakan instansi yang bertugas mencegah masuk
2
dan menyebarnya penyakit hewan ke Wilayah Indonesia melalui tindakan
pengawasan lalu lintas hewan dan produk hewan. Salah satu penjabaran tugas
karantina sebagai instansi pencegah masuk dan menyebarnya penyakit hewan ke
Wilayah Indonesia adalah melalui kaji tindak deteksi dan diagnosa penyakit.
Diagnosa penyakit secara laboratorium menjadi dasar ilmiah dalam tindakan
karantina dan kebijakan lalu lintas hewan. Penelitian untuk mendeteksi adanya
penyakit AI subklinis pada DOC sangat penting dengan pengambilan sampel yang
benar sesuai dengan kaidah-kaidah virologi dan epidemiologi.
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengisolasi adanya infeksi
virus AI pada DOC yang berpotensi menyebarkan virus dari satu daerah/negara ke
daerah/negara yang lain. Deteksi keberadaan virus AI dilakukan dengan reverse
transcriptase-polymerase chains reaction (RT-PCR). Anak ayam umur sehari
(DOC) yang dilalulintaskan melalui Bandara Soekarno Hatta diambil sampel
organ dan serumnya. Sampel serum diuji keberadaan antibodinya dengan uji
penghambatan haemaglutinasi.
Sampel organ (paru-paru dan trakhea) di
kumpulkan (pooling) dalam satu kelompok pengiriman berdasarkan perusahaan
produsen DOC. Pengujian untuk pooling sampel organ paru-paru dan trakhea
digunakan primer matrik: F-matrik-AI; R-matrik-AI dan H5: F-H5-AI; R-H5-AI
(Lee et.al 2001). Berdasarkan hasil pengujian RT-PCR, kemudian dilakukan
konfirmasi terhadap sampel yang menunjukan hasil uji negatif untuk menyatakan
bahwa hewan yang diperiksa benar-benar negatif. Konfirmasi dilakukan secara
individu dari masing masing sampel kuning telur. Pengujian dilakukan dengan 3
jenis primer matrik yaitu: F-Matrik-AI; R-Matrik-AI (Lee et al. 2001), M-Flu 1;
M-Flu 2 (Trani et al. 2006) dan FAI; RAI (Lee & Suarez 2004) dilanjutkan
dengan 2 jenis primer H5 yaitu: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004) dan HA-1444;
H5-1735R (WHO 2002). Sampel dengan hasil uji RT-PCR positif dilakukan
penelusuran pada kuning telur secara individu menggunakan primer matrik: FAI;
RAI dan H5: FH5; RH5 (Lee & Suarez 2004). Penelusuran dilakukan untuk
mengetahui sumber penularan virus AI pada DOC. Berdasarkan hasil uji
penelusuran, sampel yang menunjukan hasil positif selanjutnya dilakukan isolasi
virus pada telur ayam berembrio.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Day Old Chick (DOC)
Anak ayam umur sehari atau Day old chick (DOC) adalah unggas yang
menetas pada umur 2 jam atau beberapa jam dan atau sebelum makan (Ministry
of Food, Agriculture and Cooperative Pakistan 1985). Anak ayam ini merupakan
bibit pada peternakan ayam baik peternakan final stock (FS) yang meliputi ayam
pedaging dan petelur maupun parent stock (PS). Beberapa negara produsen bibit
ayam pedaging diantaranya Amerika (Cobb, Arbor Arcres, Avian), Prancis (Isa
Vedette, Shaper Ross), Inggris (Ross) dan Belanda (Hybro, Hubbard). Negara
produsen bibit ayam pedaging di Asia, contohnya Thailand (Fadilah (2005).
Bibit ayam yang sehat merupakan salah satu kunci dalam keberhasilan
industri peternakan. Ciri-ciri DOC yang berkualitas baik adalah: bebas dari
penyakit terutama pulorum, omphalitis dan jamur, DOC terlihat aktif, kakinya
besar dan basah seperti berminyak, bulu cerah dan penuh, pantatnya tidak kotor
atau tidak terdapat pasta putih, beratnya tidak kurang dari 37 gram. Kualitas DOC
yang jelek memiliki ciri-ciri kaki kering, omphalitis, tubuh kerdil dan berat badan
tidak merata (Fadilah 2005).
Beberapa negara menerapkan standar pengiriman DOC, Pakistan
mensyaratkan DOC harus berasal dari telur yang beratnya tidak kurang dari 48
gram. Anak ayam tersebut juga harus berasal dari peternakan yang telah
disertifikasi bebas pulorum, negatif terhadap Salmonella sp dan Aspergillosis,
jumlah E. coli tidak lebih dari 10 CFU per gram, bebas dari cacat fisik dan luka,
hasil uji pulorum negatif, lincah dan sehat (Ministry of Food, Agriculture and
Cooperative Pakistan 1985).
Hasil penelitian yang telah dilakukan, DOC sehat ternyata masih
mengandung bakteri Staphylococcus spp, E. coli dan Proteus spp pada daerah
hidung dan kloaka. Pada kondisi stres dapat memicu bakteri-bakteri normal
tersebut di atas menjadi patogen dan menimbulkan gejala-gejala omphalitis dan
airsaculitis (Geidam et al. 2007).
4
Virus Avian Influenza
Virus Avian Influenza (AI) termasuk ke dalam anggota dari famili
Orthomixoviridae dan masuk dalam genus influenza virus A. Famili
Orthomixoviridae memiliki 3 genus yaitu virus Influenza A, B dan C berdasarkan
karakter antigenik protein M dalam envelope virus dan nukleoprotein. Virus
Influenza A memiliki 16 antigen hemaglutinin (H1-H16) dan 9 antigen
neuraminidase (N1-N9) dan jika dikombinasikan akan membentuk 144 subtipe.
Virus Influenza merupakan virus RNA untai tunggal segmen negatif (OIE 2005,
WHO 2002 dan Barrett and Inglis, 1985). Influenza A bersifat patogen terhadap
kuda, babi, cerpelai Amerika (mink), anjing laut, ikan paus, unggas dan manusia.
Influenza B hanya patogen pada manusia dan Influenza C menginfeksi manusia
dan babi tetapi jarang menyebabkan sakit yang serius (WHO 2002 dan Murphy et
al. 1999).
Orthomyxovirus virions berukuran 80-120 nm, bersifat pleomorphic,
sering berbentuk spherical tetapi predominan filamentous pada isolat segar.
Virion terdiri dari envelope dengan peplomer besar mengelilinginya berjumlah
delapan (genus Influenza A dan B), tujuh (genus Influenza C) dan enam (genus
Thogavirus) dengan segmen nucleocapsid berbentuk helically symmetrical yang
berbeda ukuran. Ada dua jenis glycoprotein peplomer: (1) homotrimers dari
protein hemaglutinin dan (2) homotetramers dari protein neuramidase. Virus
Influenza C hanya memiliki satu tipe glycoprotein peplomer, yang terdiri dari
molekul multifungsional hemagglutinin-esterase. Segmen genom memiliki satu
loop di ujung pertama dan terdiri dari molekul RNA virus yang diselubungi
capsid yang terdiri dari nucleoprotein berbentuk héliks. Tiga protein yang
membentuk viral RNA polymerase (PB1, PB2 dan PA), berasosiasi dengan RNA.
Amplop virus dilapisi oleh protein matrik (M1) dan dikelilingi sejumlah kecil ion
chanels yang tersusun dari tetramer protein matrik ke 2 (M2). Genom terdiri dari
delapan, tujuh atau enam segmen berbentuk linear negative-sense, RNA berutas
tunggal, 10-13.6 kilo basa (kb) secara keseluruhan (Murphy et al. 1999).
5
Gambar1. Anatomi Virus Influenza A (Subbarao & Joseph 2007)
Virus Influenza A yang menginfeksi unggas dapat dibagi ke dalam dua
kelompok berdasarkan kemampuan virus menyebabkan penyakit. Virus yang
sangat virulen disebut highly pathogenic Avian Influenza (HPAI), infeksinya
bersifat sistemik, dengan mortalitas pada flok pada beberapa spesies rentan dapat
mencapai 100% (Capua and Maragon 2007). Terminologi highly pathogenic
Avian Influenza dan fowl plague merupakan infeksi dari strain virulen influenza A
yang diisolasi dari unggas domestik. Isolat highly pathogenic Avian Influenza
diklasifikasikan ke dalam notifiable Avian Influenza (NAI). Isolat strain virulen
pada saat ini berasal dari subtipe H5 atau H7, namun sebagian besar H5 dan H7
memiliki virulensi rendah. Penyebab perubahan virulensi pada H5 dan H7 dapat
terjadi akibat mutasi pada induk semang unggas, sehingga semua subtipe H5 dan
H7 diklasifikasikan sebagai NAI virus (OIE 2005).
Subtipe H5 dan H7 yang bersifat patogen memiliki multibasic cleavage
site dengan prekursor pada molekul H. Virus HPAI infeksinya bersifat “dead-end”
pada unggas peliharaan (misalnya ayam dan kalkun) dan memiliki gejala klinis
yang bervariasi. Pada unggas air peliharaan dan unggas liar virus ini tidak
menyebabkan gejala klinis dan kematian (Capua and Maragon 2007). Diketahui
bahwa virus AI beredar secara terus menerus pada unggas air (Ito et. al. 1995).
6
Beberapa virus AI (H1-H16) yang memiliki multibasic cleavage site pada
gen H yang berada di alam hidup di dalam tubuh burung liar. Interaksi unggas liar
dengan unggas air di alam memungkinkan virus AI ditularkan diantara kedua
populasi unggas tersebut.
Unggas air merupakan inang alami yang menjadi
sumber penularan virus bagi hewan lain. Interaksi unggas liar dengan unggas
peliharaan menyebabkan virus ini menyebar dalam populasi unggas tersebut.
Penyebaran virus pada unggas peliharaan menimbulkan infeksi lokal, gejala sakit
ringan seperti gangguan pernafasan, depresi dan masalah produksi telur pada
unggas petelur. Teori yang berkembang saat ini menyatakan bahwa virus HPAI
berasal dari LPAI H5 dan H7 yang mengalami mutasi atau rekombinasi, yang
menyebabkan perubahan gen daerah cleavage site dari protein haemaglutinin
(HA) (Capua and Maragon 2007). Kejadian wabah HPAI di Chile dan Kanada
disebabkan oleh virus H7 yang bermutasi menjadi HPAI melalui rekombinasi
melibatkan nukleoprotein dan gen matrik. Kejadian ini merupakan laporan
pertama rekombinasi berasosiasi dengan kenaikan virulensi virus AI (Senne
2007). Introduksi pada populasi burung domestik, menyebabkan bentuk virus
menjadi low-pathogenic Avian Influenza (LPAI).
Mekanisme mutasi pada virus AI meliputi insersi asam amino dasar atau
substitusi asam amino nonbasic pada HA proteolitic cleavage site, kehilangan
glycosilasin site menghasilkan virus dengan cleavage site yang tidak terlindungi,
atau insersi sejumlah besar RNA. Berdasarkan studi filogenetik virus AI tampak
bahwa perubahan virulensi dari rendah ke tinggi mengindikasikan virus HPAI
memiliki pohon filogenik yang sama dengan virus LPAI dengan strain H7 yang
tidak virulen. Kejadian mutasi virus tidak terprediksi dan dapat berlangsung
singkat setelah virus menginfeksi unggas maupun setelah bersirkulasi dalam tubuh
unggas peliharaan. Dengan demikian peredaran LPAI subtipe H5 dan H7 juga
perlu diperhatikan karena virus LPAI tersebut merupakan prekursor HPAI (Capua
and Maragon 2007).
Sejak 100 tahun yang lalu telah teridentifikasi bahwa
manusia dapat terinfeksi subtipe H1, H2, H3, N1 dan N2 dan membentuk antibodi
terhadap virus tersebut. Kejadian pandemi influenza A H2N2 dan H3N2
kemungkinan berasal dari virus unggas yang mengalamai genetic reassortment
antara virus unggas dan manusia (Kawaoka et. al 1989).
7
Penyebaran dan Transmisi Virus Avian Influenza
Beberapa faktor yang berperan dalam transmisi virus AI antara lain
buruknya biosekuriti pada sistem peternakan, keluar masuknya unggas dan
produknya, perdagangan hewan hidup di pasar. Air di kolam atau genangan air
memungkinkan virus bertahan di luar induk semang, sehingga dapat menjadi
sumber penyebaran virus. Migrasi unggas liar pembawa virus low-pathogenic
Avian Influenza (LPAI) maupun highly pathogenic Avian Influenza (HPAI)
berperan dalam penyebaran virus ini (Goutard et al. 2007).
Populasi itik di Cina dan Vietnam sangat banyak mencapai 70% populasi
itik dunia. Sistem pemeliharaan dengan cara diumbar di kedua negara tersebut
menjadi masalah kritis dalam epidemiologi AI karena beberapa itik peliharaan
dapat membawa HPAI dalam waktu pendek dan tidak ada penerapan biosekuriti
dalam pemeliharaan tersebut. Hal ini berpotensi terjadi pertukaran virus antara itik
dengan unggas liar. Itik tersebut banyak yang dijual di pasar unggas hidup yang
bercampur dengan spesies unggas darat (Sims 2007). Para ahli biodiversiti
menyimpulkan bahwa perdagangan global burung sebagai hewan kesayangan
berperan dalam perpindahan virus secara besar-besaran. Jalur penularan AI antara
lain melalui migrasi burung liar, perdagangan unggas peliharaan dan unggas liar
(Kilpatrick et al. 2006 dalam Daszak and Chmura 2008).
Murphy et al. (2001) menyatakan adanya virus AI dapat diisolasi di
berbagai negara dari importasi burung. Jorgensen et al. (1998) menyatakan bahwa
virus AI subtipe H5N2 dapat diisolasi pada burung unta yang diimport dari
Zimbabwe ke Belanda dan Denmark pada tahun 1996. Tahun 2004 virus HPAI
H5N1 diisolasi dari burung elang yang diselundupkan dari Thailand yang
terdeteksi di Bandar Udara Brussel. Virus AI yang terisolasi tersebut secara
genetik mirip dengan virus