Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan Nila Gift Dalam Menghambat Pertumbuhan Microcystis Aeruginosa BT-02

PERANAN BAKTERI ASAL PENCERNAAN IKAN NILA GIFT

DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

Microcystis aeruginosa

BT-02

ANDRI TARUNA RACHMADI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

PERANAN BAKTERI ASAL PENCERNAAN IKAN NILA GIFT DALAM

MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

Microcystis aeruginosa

BT-02

ANDRI TARUNA RACHMADI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

Judul : Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT dalam Menghambat

Pertumbuhan Microcystis aeruginosa BT-02

Nama : Andri Taruna Rachmadi

NIM :

G34103072

Menyetujui,

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

NIP 132045531

Dra. Taruni Sri Prawasti

NIP 131284837

Mengetahui :

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim DEA.

NIP 131578806

ABSTRAK

ANDRI TARUNA RACHMADI. Peranan Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan

Nila GIFT dalam Menghambat Pertumbuhan Microcystis aeruginosa BT-02.

Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan TARUNI SRI PRAWASTI.

Penelitian ini bertujuan untuk menapis bakteri proteolitik yang berasal dari

saluran pencernaan ikan Nila GIFT yang memiliki kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan sianobakter Microcystis aeruginosa BT-02. M.

aeruginosa

merupakan sianobakter yang dapat menyebabkan blooming yang bersifat toksik

terutama pada ikan. Dipilih empat isolat proteolitik yang memiliki indeks protease

tertinggi, yaitu NU-2, NU-3, NU-4, dan NU-8. Kultur M. aeruginosa ditumbuhkan

pada dua macam media cair, yaitu BG-11 termodifikasi dan MLA. Metode

agar-agar blok lapis ganda (Double layer) digunakan untuk menapis M.

aeruginosa.

Isolat NU-4 dan NU-8 dapat mendegradasi koloni M.

aeruginosa

BT-02. Indeks

penghambatan sebesar 1.6 dihasilkan oleh NU-8 yang lebih besar daripada NU-4

dengan nilai 1.3. Ekstrak kasar protease yang dihasilkan kedua isolat tersebut tidak

dapat menghambat pertumbuhan M.

aeruginosa BT-02. Kedua isolat bakteri

tersebut termasuk bakteri Gram negatif dan NU-8 diidentifikasi sebagai Aeromonas

sp.

ABSTRACT:

ANDRI TARUNA RACHMADI. The Role of Bacteria Isolated from Tilapias

GIFT in Preventing The Growth of Microcystis aeruginosa BT-02. Under the

guidance of NISA RACHMANIA MUBARIK and TARUNI SRI PRAWASTI.

The objective of this research is to screen bacteria isolated from digestive

tract of tilapias and study about its role against M. aeruginosa BT-02.

M.

aeruginosa is cyanobacteria which cause toxic blooming, mainly for fish. Four

isolates which have high protease index have been chosen. Those are 2,

NU-3, NU-4, and NU-8. M. aeruginosa culture were cultivated in two kind of liquid

medium. Those are Modified BG-11 and MLA. Block agar method using double

layer agar were used for M. aeruginosa screening process. Inhibition index was

produced by NU-8 (1.6) which was higher than NU-4 (1.3). Protease crude extract

which were produced by both isolates could not prevent the growth of M.

aeruginosa. Both of bacteria were Gram negative and NU-8 has been identified as

Aeromonas sp.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 31 Oktober 1985 dari ayah Drs.

Bambang Rachmadi dan Ibu Boediningsih. Penulis merupakan anak pertama dari

dua bersaudara.

Pada tahun 2003 penulis lulus dari dari SMU Regina Pacis Surakarta dan

pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi

Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten pratikum

Biologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008 dan Mikrobiologi Dasar

pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008. Penulis juga pernah menjadi anggota

tim penyaji terbaik kedua dan penyaji poster terbaik ketiga pada ajang Pekan

Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional (PIMNAS) ke-20 pada tanggal 17-22 Juli

2007 di Universitas Lampung. Penulis juga pernah terlibat sebagai salah satu

penyaji di Internastional Conference of Basic and Applied Science

UNAIR-RUG-KNAW-ATM yang diadakan oleh Universitas Airlangga Surabaya pada tanggal

6-7 agustus 2006-7.

Penulis pernah melaksanakan Studi Lapang dengan judul Distribusi dan

Fluktuasi Harian Diatom di tepi danau TWA Situ Gunung pada bulan Agustus

2005. Praktik lapang di PT Mekar Unggul Sari dengan tema Koleksi dan Budidaya

Tanaman Salak ( Salacca Edulis Reinw.) di Taman Wisata Mekarsari dilakukan

pada bulan Juli-September tahun 2006.

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat, rahmat dan

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah

dengan judul Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT Dalam

Menghambat Pertumbuhan

Microcystis aeruginosa

BT-02

disusun berdasarkan

hasil penelitian dari bulan Februari sampai dengan Juni 2007. Sebagian dari

penelitian ini pernah disampaikan dalam presentasi lisan dalam International

Conference of Basic and Applied Science UNAIR-RUG-KNAW-ATM yang

diadakan di Universitas Airlangga Surabaya pada tanggal 6-7 Agustus 2007.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik,

M.Si. dan Dra. Taruni Sri Prawasti selaku pembimbing yang telah memberikan

arahan dan bimbingan. Ucapan terima kasih diucapkan kepada Alan E Wilson,

PhD dari Auburn University, USA atas kebaikannya memberikan kultur aksenik

dari

Microcystis aeruginosa dan segala saran, masukan, dan jurnal yang telah

diberikan. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr.Ir. Ahmad Farajallah,

M.Si. atas diskusi dan peranan beliau sebagai penguji dan wakil komisi pendidikan

dalam ujian skripsi.

Terima kasih kepada semua pihak yang membantu: Dr. Iman Rusmana, M.Si.

dan Dr. Yulin Lestari atas saran dan kritik yang membangun, para teknisi dan

laboran di Bagian Mikrobiologi: Pak Jaka, Mbak Heni, Pak Endang, Bu Kokoy,

dan Pak Husen atas bantuan yang telah diberikan. Terima kasih kepada Novan,

Irni, Kak Rika, Wahyu, Tri, Besti, Dona, Ryo, Ai, Ima, Sarah, Mute, Ika Supar,

Dendi dan semua teman-teman Biologi 40 yang telah memberikan informasi,

arahan, dan bantuan selama penelitian ini. Terima kasih juga kepada Tya, Anas,

Agnes, Christian, Sis, David, serta semua sahabat di KEMAKI dan PMK atas

segala bantuan, doa dan dukungannya selama ini.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak, Ibu dan adik tercinta serta

seluruh keluarga besar atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya tulis ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2008

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN... viii

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 1

Waktu dan Tempat ... 1

BAHAN DAN METODE ... 1

Biakan Bakteri dan Sianobakter... 1

Peremajaan dan Pemilihan Bakteri Uji ... 2

Pertumbuhan dan Peremajaan M. aeruginosa... 2

Penapisan Isolat Proteolitik yang Menghambat Pertumbuhan Microcystis

aeruginosa... 2

Metode Penapisan dengan Menggunakan Ekstrak Kasar Protease... 2

HASIL ... 2

PEMBAHASAN ... 3

SIMPULAN ... 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Sel M. aeruginosa BT-02 pada perbesaran mikroskop 1000 x... 3

2 Koloni M. aeruginosa BT-02 pada media agar-agar lapis ganda. ... 3

3 Degradasi M. aeruginosa oleh isolat (a) NU-4 dan (b) NU-8... 3

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi Media BG-11 yang telah dimodifikasi (Vanderloeg et al. 2000) .. 8

2 Komposisi MLA (Bolch & Blackburn 1996) ... 9

3 Data Peremajaan 30 isolat proteolitik ... 10

4 Uji Patogenitas dari Isolat Terpilih ... 11

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ledakan populasi atau bloming koloni sianobakter dapat terjadi pada lingkungan laut maupun air tawar yang kaya nutrisi dan mengalami eutrofikasi (Paerl 1988). Eutrofikasi adalah penurunan kadar oksigen pada air. Lebih dari 80% blooming yang terjadi bersifat toksik (Sedmak & Kosi 1998). Spesies sianobakter Microcystis dapat menghasilkan metabolit sekunder berupa hepatotoksin (Carmicael 1992).Toksin yang diproduksi oleh genus Microcystis diberi nama mikrosistin yang merupakan senyawa siklopeptida (Christoffersen et al. 2002).

Microcystis termasuk dalam ordo

Chroococcales, mempunyai pigmen klorofil, bersifat gram negatif, berbentuk bulat berukuran 5-30 µm, biasanya membentuk koloni dan berlendir (Stainer & Bazire 1977; Balows et al. 1991; Hock et al. 1997).

Spesies Microcystis antara lain: M. botrys,

M. flos aque, M. ichthyoblabe, M. viridis, M. wesenbergii (Wilson et al. 2005). Saat

blooming terdapat keragaman dari spesies

Microcystis, namun yang telah banyak

dipelajari dan hampir semua galur atau varietasnya menghasilkan toksin ialah M. aeruginosa. Di alam Microcystis berperan sebagai salah satu fitoplankton yang merupakan sumber makanan bagi zooplankton (Stainer & Bazire 1977).

Konsentrasi mikrosistin lebih dari 10 µg/L (>1.8 x 108 sel) dapat menurunkan keragaman fitoplankton dari 30 spesies menjadi hanya 5 spesies saja (Sedmak & Kosi 1998). Mikrosistin merangsang perubahan subunit katalitik dari enzim-enzim pada hati dan ginjal serta merusak pankreas, ginjal, insang, dan saluran pencernaan pada ikan mas (Fisher & Dietrich 2000).

Hal yang menarik, spesies ikan tertentu dapat memanfaatkan blooming sianobakter sebagai pakan alaminya. Konsentrasi M. aeruginosa yang tinggi dapat meningkatkan pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) di Waduk Saguling Jawa Barat (Hadikusumah & Costa Pierce 1990). Diduga bahwa flora normal bakteri dalam saluran pencernaan ikan nila mempunyai kemampuan untuk mendegradasi sel dari M. aeruginosa dan juga mikrosistin yang dihasilkannya. Flora normal dapat berfungsi sebagai probiotik, karena dapat membantu proses metabolisme inang tanpa merusak jaringan inang. Bakteri probiotik

dapat menghasilkan enzim hidrolitik, seperi protease (Verschuere et al. 2000). Mikrosistin dapat didegradasi oleh bakteri penghasil protease alkalin Pseudomonas aeruginosa

(Takenaka & Watanabe 1997).

Sebanyak 30 isolat bakteri protease telah diisolasi pencernaan ikan Nila GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias) (Mubarik et al. 2006). Ikan nila GIFT merupakan spesies unggul diantara ikan nila lainnya karena pertumbuhannya lebih cepat, ukurannya lebih besar, dan mempunyai daya tahan tubuh yang lebih baik (Arie 2000).

Menurut Bourne et al. (1996), bakteri seperti Pseudomonas sp. dan Sphingomonas

sp. memiliki aktivitas mikrosistinase yang dapat menguraikan mikrosistin. Mikrosistinase ini masih termasuk golongan enzim protease (Bourne et al. 1996) Berdasarkan hal tersebut pada penelitian ini akan dlihat apakah bakteri yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dapat menghambat pertumbuhan M. aeruginosa. Sehingga dihasilkan bakteri yang mampu mengendalikan pertumbuhan sianobakter toksik dan dapat diaplikasikan bagi lingkungan.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menapis bakteri protease yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dan mempelajari peranan bakteri tersebut dalam menghambat pertumbuhan M. aeruginosa.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari 2007 sampai dengan bulan Oktober 2007 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA , IPB.

BAHAN DAN METODE

Biakan Bakteri dan Sianobakter

Tiga puluh isolat bakteri protease dari saluran pencernaan ikan nila GIFT didapat dari koleksi Bagian Mikrobiologi, FMIPA, IPB (Mubarik et al. 2006).

Isolat M. aeruginosa BT-02 yang berasal dari danau Swan, Michigan, USA (Wilson AE

2

Peremajaan dan Pemilihan Bakteri Uji

Peremajaan dilakukan dengan memindahkan masing-masing dari 30 isolat bakteri protease dalam gliserin cair ke media kaldu nutrien (NB) yang mengandung susu skim 0.5 %. Kemudian diinkubasi sambil digoyang pada 120 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, digores pada media agar-agar nutrien (NA) yang mengandung 0.5 % susu skim lalu diinkubasi 24 jam. Empat bakteri uji dipilih berdasarkan indeks protease tertinggi (Mubarik et al. 2006).

Pertumbuhan dan Peremajaan M. aeruginosa

Pertumbuhan dan peremajaan kultur M. aeruginosa dilakukan pada dua macam media cair yaitu media BG-11 yang dimodifikasi (Lampiran 1) (Vanderloeget al.2001). Media kedua ialah media MLA (Lampiran 2) (Bolch & Blackburn 1996).

Penapisan bakteri terhadap M. aeruginosa

dilakukan pada media padat. Media padat dibuat dengan menambahkan agar-agar bakto (Difco) pada kedua media di atas dengan kisaran konsentrasi antara 0.5-2 % (b/v). Larutan agar-agar dan mineral dibuat dan disterilisasi secara terpisah. Kedua larutan dicampur setelah suhunya mendekati 50 0C.

Pertumbuhan M. aeruginosa pada media padat menggunakan beberapa metode, yaitu cawan sebar, cawan gores, dan agar-agar lapis ganda (double layer). Pembuatan agar-agar lapis ganda dilakukan dengan menuangkan 5 ml kultur M. aeruginosa ke dalam 100 ml media. Konsentrasi agar-agar pada lapisan bawah bervariasi antara 1-2%, sedangkan untuk lapisan atas 0.5-1%. Penyimpanan kultur M. aeruginosa dilakukan pada suhu ruang dan diberi perlakuan terang dengan 4 lampu fluoresen 18 watt (Philips) yang menghasilkan +1000 lux cahaya.

Penapisan Isolat Proteolitik yang Menghambat Pertumbuhan Microcystis aeruginosa

Pengujian dilakukan dengan metode agar-agar blok (Nedialkova & Naidenova 2005). Empat isolat bakteri uji terpilih yang telah ditumbuhkan pada NA yang mengandung 0.5% susu skim yang berumur 24 jam dibor dengan menggunakan cork bor berdiameter 1 cm dan dipindahkan ke dalam isolat M. aeruginosa pada media padat yang berumur satu minggu yang menampakkan pertumbuhan koloni yang tersebar dengan baik.

Metode Penapisan dengan Menggunakan Ekstrak Kasar Protease

Penapisan dilakukan dengan metode agar-agar difusi (Nedialkova & Naidenova 2005). Penapisan dilakukan dengan menuangkan 20 µl ekstrak kasar protease yang berasal dari suspensi bakteri uji ke dalam paper disk (cakram kertas) berdiameter 0.6 mm. Ekstrak kasar protease didapat dengan menyentrifuse suspensi bakteri dalam NB yang mengandung 0.5% susu skim berumur 24 jam pada 10.000 g selama 15 menit (Mubarik et al. 2006).

Paper disk kemudian diletakkan di atas koloni

M. aeruginosa di media padat yang berumur satu minggu. Aktivitas penghambatan diukur berdasarkan ukuran zona hambat yang terbentuk.

HASIL

Dari 30 isolat bakteri proteolitik yang diremajakan, sebanyak 20 isolat tumbuh dan menghasilkan zona bening di sekitar koloni (Lampiran 3). Zona bening menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut menghasilkan protease ekstraseluler. Kemudian dipilih empat isolat proteolitik yang memiliki indeks proteolitik terbesar (Fatimah 2005).

Kultur M. aeruginosa dapat tumbuh optimal pada media MLA maupun BG-11 (Gambar 2). Agar diperoleh pertumbuhan yang optimal, biakan ini diberi perlakuan cahaya +1000 lux (Shirai et al. 1989) dan diinkubasi pada suhu ruang 27◦C. Suhu 25-27 ◦C merupakan suhu optimal pertumbuhan

M. aeruginosa (Paerl 1998). Pertumbuhan dilakukan dalam tabung kultur dan erlenmeyer yang diisi dengan medium cair sebanyak sepertiga bagiannya agar aerasi tetap terjaga.

Koloni M. aeruginosa BT-02 tumbuh optimum pada agar-agar lapis ganda yang mengandung konsentrasi agar-agar 1% pada lapisan bawah dan 0.75% di lapisan atas (Gambar 3).

Setelah diperoleh pertumbuhan optimum dari isolat-isolat proteolitik terpilih dan diperoleh pertumbuhan M. aeruginosa yang optimum, selanjutnya dilakukan penapisan. Penapisan menggunakan metode agar-agar blok menunjukkan ada dua isolat yang menghambat pertumbuhan M. aeruginosa

PERANAN BAKTERI ASAL PENCERNAAN IKAN NILA GIFT

DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

Microcystis aeruginosa

BT-02

ANDRI TARUNA RACHMADI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

PERANAN BAKTERI ASAL PENCERNAAN IKAN NILA GIFT DALAM

MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

Microcystis aeruginosa

BT-02

ANDRI TARUNA RACHMADI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

Judul : Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT dalam Menghambat

Pertumbuhan Microcystis aeruginosa BT-02

Nama : Andri Taruna Rachmadi

NIM :

G34103072

Menyetujui,

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

NIP 132045531

Dra. Taruni Sri Prawasti

NIP 131284837

Mengetahui :

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim DEA.

NIP 131578806

ABSTRAK

ANDRI TARUNA RACHMADI. Peranan Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan

Nila GIFT dalam Menghambat Pertumbuhan Microcystis aeruginosa BT-02.

Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan TARUNI SRI PRAWASTI.

Penelitian ini bertujuan untuk menapis bakteri proteolitik yang berasal dari

saluran pencernaan ikan Nila GIFT yang memiliki kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan sianobakter Microcystis aeruginosa BT-02. M.

aeruginosa

merupakan sianobakter yang dapat menyebabkan blooming yang bersifat toksik

terutama pada ikan. Dipilih empat isolat proteolitik yang memiliki indeks protease

tertinggi, yaitu NU-2, NU-3, NU-4, dan NU-8. Kultur M. aeruginosa ditumbuhkan

pada dua macam media cair, yaitu BG-11 termodifikasi dan MLA. Metode

agar-agar blok lapis ganda (Double layer) digunakan untuk menapis M.

aeruginosa.

Isolat NU-4 dan NU-8 dapat mendegradasi koloni M.

aeruginosa

BT-02. Indeks

penghambatan sebesar 1.6 dihasilkan oleh NU-8 yang lebih besar daripada NU-4

dengan nilai 1.3. Ekstrak kasar protease yang dihasilkan kedua isolat tersebut tidak

dapat menghambat pertumbuhan M.

aeruginosa BT-02. Kedua isolat bakteri

tersebut termasuk bakteri Gram negatif dan NU-8 diidentifikasi sebagai Aeromonas

sp.

ABSTRACT:

ANDRI TARUNA RACHMADI. The Role of Bacteria Isolated from Tilapias

GIFT in Preventing The Growth of Microcystis aeruginosa BT-02. Under the

guidance of NISA RACHMANIA MUBARIK and TARUNI SRI PRAWASTI.

The objective of this research is to screen bacteria isolated from digestive

tract of tilapias and study about its role against M. aeruginosa BT-02.

M.

aeruginosa is cyanobacteria which cause toxic blooming, mainly for fish. Four

isolates which have high protease index have been chosen. Those are 2,

NU-3, NU-4, and NU-8. M. aeruginosa culture were cultivated in two kind of liquid

medium. Those are Modified BG-11 and MLA. Block agar method using double

layer agar were used for M. aeruginosa screening process. Inhibition index was

produced by NU-8 (1.6) which was higher than NU-4 (1.3). Protease crude extract

which were produced by both isolates could not prevent the growth of M.

aeruginosa. Both of bacteria were Gram negative and NU-8 has been identified as

Aeromonas sp.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 31 Oktober 1985 dari ayah Drs.

Bambang Rachmadi dan Ibu Boediningsih. Penulis merupakan anak pertama dari

dua bersaudara.

Pada tahun 2003 penulis lulus dari dari SMU Regina Pacis Surakarta dan

pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi

Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten pratikum

Biologi Dasar pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008 dan Mikrobiologi Dasar

pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008. Penulis juga pernah menjadi anggota

tim penyaji terbaik kedua dan penyaji poster terbaik ketiga pada ajang Pekan

Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional (PIMNAS) ke-20 pada tanggal 17-22 Juli

2007 di Universitas Lampung. Penulis juga pernah terlibat sebagai salah satu

penyaji di Internastional Conference of Basic and Applied Science

UNAIR-RUG-KNAW-ATM yang diadakan oleh Universitas Airlangga Surabaya pada tanggal

6-7 agustus 2006-7.

Penulis pernah melaksanakan Studi Lapang dengan judul Distribusi dan

Fluktuasi Harian Diatom di tepi danau TWA Situ Gunung pada bulan Agustus

2005. Praktik lapang di PT Mekar Unggul Sari dengan tema Koleksi dan Budidaya

Tanaman Salak ( Salacca Edulis Reinw.) di Taman Wisata Mekarsari dilakukan

pada bulan Juli-September tahun 2006.

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat, rahmat dan

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah

dengan judul Peranan Bakteri Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT Dalam

Menghambat Pertumbuhan

Microcystis aeruginosa

BT-02

disusun berdasarkan

hasil penelitian dari bulan Februari sampai dengan Juni 2007. Sebagian dari

penelitian ini pernah disampaikan dalam presentasi lisan dalam International

Conference of Basic and Applied Science UNAIR-RUG-KNAW-ATM yang

diadakan di Universitas Airlangga Surabaya pada tanggal 6-7 Agustus 2007.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik,

M.Si. dan Dra. Taruni Sri Prawasti selaku pembimbing yang telah memberikan

arahan dan bimbingan. Ucapan terima kasih diucapkan kepada Alan E Wilson,

PhD dari Auburn University, USA atas kebaikannya memberikan kultur aksenik

dari

Microcystis aeruginosa dan segala saran, masukan, dan jurnal yang telah

diberikan. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr.Ir. Ahmad Farajallah,

M.Si. atas diskusi dan peranan beliau sebagai penguji dan wakil komisi pendidikan

dalam ujian skripsi.

Terima kasih kepada semua pihak yang membantu: Dr. Iman Rusmana, M.Si.

dan Dr. Yulin Lestari atas saran dan kritik yang membangun, para teknisi dan

laboran di Bagian Mikrobiologi: Pak Jaka, Mbak Heni, Pak Endang, Bu Kokoy,

dan Pak Husen atas bantuan yang telah diberikan. Terima kasih kepada Novan,

Irni, Kak Rika, Wahyu, Tri, Besti, Dona, Ryo, Ai, Ima, Sarah, Mute, Ika Supar,

Dendi dan semua teman-teman Biologi 40 yang telah memberikan informasi,

arahan, dan bantuan selama penelitian ini. Terima kasih juga kepada Tya, Anas,

Agnes, Christian, Sis, David, serta semua sahabat di KEMAKI dan PMK atas

segala bantuan, doa dan dukungannya selama ini.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak, Ibu dan adik tercinta serta

seluruh keluarga besar atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya tulis ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2008

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN... viii

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 1

Waktu dan Tempat ... 1

BAHAN DAN METODE ... 1

Biakan Bakteri dan Sianobakter... 1

Peremajaan dan Pemilihan Bakteri Uji ... 2

Pertumbuhan dan Peremajaan M. aeruginosa... 2

Penapisan Isolat Proteolitik yang Menghambat Pertumbuhan Microcystis

aeruginosa... 2

Metode Penapisan dengan Menggunakan Ekstrak Kasar Protease... 2

HASIL ... 2

PEMBAHASAN ... 3

SIMPULAN ... 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Sel M. aeruginosa BT-02 pada perbesaran mikroskop 1000 x... 3

2 Koloni M. aeruginosa BT-02 pada media agar-agar lapis ganda. ... 3

3 Degradasi M. aeruginosa oleh isolat (a) NU-4 dan (b) NU-8... 3

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi Media BG-11 yang telah dimodifikasi (Vanderloeg et al. 2000) .. 8

2 Komposisi MLA (Bolch & Blackburn 1996) ... 9

3 Data Peremajaan 30 isolat proteolitik ... 10

4 Uji Patogenitas dari Isolat Terpilih ... 11

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ledakan populasi atau bloming koloni sianobakter dapat terjadi pada lingkungan laut maupun air tawar yang kaya nutrisi dan mengalami eutrofikasi (Paerl 1988). Eutrofikasi adalah penurunan kadar oksigen pada air. Lebih dari 80% blooming yang terjadi bersifat toksik (Sedmak & Kosi 1998). Spesies sianobakter Microcystis dapat menghasilkan metabolit sekunder berupa hepatotoksin (Carmicael 1992).Toksin yang diproduksi oleh genus Microcystis diberi nama mikrosistin yang merupakan senyawa siklopeptida (Christoffersen et al. 2002).

Microcystis termasuk dalam ordo

Chroococcales, mempunyai pigmen klorofil, bersifat gram negatif, berbentuk bulat berukuran 5-30 µm, biasanya membentuk koloni dan berlendir (Stainer & Bazire 1977; Balows et al. 1991; Hock et al. 1997).

Spesies Microcystis antara lain: M. botrys,

M. flos aque, M. ichthyoblabe, M. viridis, M. wesenbergii (Wilson et al. 2005). Saat

blooming terdapat keragaman dari spesies

Microcystis, namun yang telah banyak

dipelajari dan hampir semua galur atau varietasnya menghasilkan toksin ialah M. aeruginosa. Di alam Microcystis berperan sebagai salah satu fitoplankton yang merupakan sumber makanan bagi zooplankton (Stainer & Bazire 1977).

Konsentrasi mikrosistin lebih dari 10 µg/L (>1.8 x 108 sel) dapat menurunkan keragaman fitoplankton dari 30 spesies menjadi hanya 5 spesies saja (Sedmak & Kosi 1998). Mikrosistin merangsang perubahan subunit katalitik dari enzim-enzim pada hati dan ginjal serta merusak pankreas, ginjal, insang, dan saluran pencernaan pada ikan mas (Fisher & Dietrich 2000).

Hal yang menarik, spesies ikan tertentu dapat memanfaatkan blooming sianobakter sebagai pakan alaminya. Konsentrasi M. aeruginosa yang tinggi dapat meningkatkan pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) di Waduk Saguling Jawa Barat (Hadikusumah & Costa Pierce 1990). Diduga bahwa flora normal bakteri dalam saluran pencernaan ikan nila mempunyai kemampuan untuk mendegradasi sel dari M. aeruginosa dan juga mikrosistin yang dihasilkannya. Flora normal dapat berfungsi sebagai probiotik, karena dapat membantu proses metabolisme inang tanpa merusak jaringan inang. Bakteri probiotik

dapat menghasilkan enzim hidrolitik, seperi protease (Verschuere et al. 2000). Mikrosistin dapat didegradasi oleh bakteri penghasil protease alkalin Pseudomonas aeruginosa

(Takenaka & Watanabe 1997).

Sebanyak 30 isolat bakteri protease telah diisolasi pencernaan ikan Nila GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias) (Mubarik et al. 2006). Ikan nila GIFT merupakan spesies unggul diantara ikan nila lainnya karena pertumbuhannya lebih cepat, ukurannya lebih besar, dan mempunyai daya tahan tubuh yang lebih baik (Arie 2000).

Menurut Bourne et al. (1996), bakteri seperti Pseudomonas sp. dan Sphingomonas

sp. memiliki aktivitas mikrosistinase yang dapat menguraikan mikrosistin. Mikrosistinase ini masih termasuk golongan enzim protease (Bourne et al. 1996) Berdasarkan hal tersebut pada penelitian ini akan dlihat apakah bakteri yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dapat menghambat pertumbuhan M. aeruginosa. Sehingga dihasilkan bakteri yang mampu mengendalikan pertumbuhan sianobakter toksik dan dapat diaplikasikan bagi lingkungan.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk menapis bakteri protease yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dan mempelajari peranan bakteri tersebut dalam menghambat pertumbuhan M. aeruginosa.

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari 2007 sampai dengan bulan Oktober 2007 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA , IPB.

BAHAN DAN METODE

Biakan Bakteri dan Sianobakter

Tiga puluh isolat bakteri protease dari saluran pencernaan ikan nila GIFT didapat dari koleksi Bagian Mikrobiologi, FMIPA, IPB (Mubarik et al. 2006).

Isolat M. aeruginosa BT-02 yang berasal dari danau Swan, Michigan, USA (Wilson AE

2

Peremajaan dan Pemilihan Bakteri Uji

Peremajaan dilakukan dengan memindahkan masing-masing dari 30 isolat bakteri protease dalam gliserin cair ke media kaldu nutrien (NB) yang mengandung susu skim 0.5 %. Kemudian diinkubasi sambil digoyang pada 120 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, digores pada media agar-agar nutrien (NA) yang mengandung 0.5 % susu skim lalu diinkubasi 24 jam. Empat bakteri uji dipilih berdasarkan indeks protease tertinggi (Mubarik et al. 2006).

Pertumbuhan dan Peremajaan M. aeruginosa

Pertumbuhan dan peremajaan kultur M. aeruginosa dilakukan pada dua macam media cair yaitu media BG-11 yang dimodifikasi (Lampiran 1) (Vanderloeget al.2001). Media kedua ialah media MLA (Lampiran 2) (Bolch & Blackburn 1996).

Penapisan bakteri terhadap M. aeruginosa

dilakukan pada media padat. Media padat dibuat dengan menambahkan agar-agar bakto (Difco) pada kedua media di atas dengan kisaran konsentrasi antara 0.5-2 % (b/v). Larutan agar-agar dan mineral dibuat dan disterilisasi secara terpisah. Kedua larutan dicampur setelah suhunya mendekati 50 0C.

Pertumbuhan M. aeruginosa pada media padat menggunakan beberapa metode, yaitu cawan sebar, cawan gores, dan agar-agar lapis ganda (double layer). Pembuatan agar-agar lapis ganda dilakukan dengan menuangkan 5 ml kultur M. aeruginosa ke dalam 100 ml media. Konsentrasi agar-agar pada lapisan bawah bervariasi antara 1-2%, sedangkan untuk lapisan atas 0.5-1%. Penyimpanan kultur M. aeruginosa dilakukan pada suhu ruang dan diberi perlakuan terang dengan 4 lampu fluoresen 18 watt (Philips) yang menghasilkan +1000 lux cahaya.

Penapisan Isolat Proteolitik yang Menghambat Pertumbuhan Microcystis aeruginosa

Pengujian dilakukan dengan metode agar-agar blok (Nedialkova & Naidenova 2005). Empat isolat bakteri uji terpilih yang telah ditumbuhkan pada NA yang mengandung 0.5% susu skim yang berumur 24 jam dibor dengan menggunakan cork bor berdiameter 1 cm dan dipindahkan ke dalam isolat M. aeruginosa pada media padat yang berumur satu minggu yang menampakkan pertumbuhan koloni yang tersebar dengan baik.

Metode Penapisan dengan Menggunakan Ekstrak Kasar Protease

Penapisan dilakukan dengan metode agar-agar difusi (Nedialkova & Naidenova 2005). Penapisan dilakukan dengan menuangkan 20 µl ekstrak kasar protease yang berasal dari suspensi bakteri uji ke dalam paper disk (cakram kertas) berdiameter 0.6 mm. Ekstrak kasar protease didapat dengan menyentrifuse suspensi bakteri dalam NB yang mengandung 0.5% susu skim berumur 24 jam pada 10.000 g selama 15 menit (Mubarik et al. 2006).

Paper disk kemudian diletakkan di atas koloni

M. aeruginosa di media padat yang berumur satu minggu. Aktivitas penghambatan diukur berdasarkan ukuran zona hambat yang terbentuk.

HASIL

Dari 30 isolat bakteri proteolitik yang diremajakan, sebanyak 20 isolat tumbuh dan menghasilkan zona bening di sekitar koloni (Lampiran 3). Zona bening menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut menghasilkan protease ekstraseluler. Kemudian dipilih empat isolat proteolitik yang memiliki indeks proteolitik terbesar (Fatimah 2005).

Kultur M. aeruginosa dapat tumbuh optimal pada media MLA maupun BG-11 (Gambar 2). Agar diperoleh pertumbuhan yang optimal, biakan ini diberi perlakuan cahaya +1000 lux (Shirai et al. 1989) dan diinkubasi pada suhu ruang 27◦C. Suhu 25-27 ◦C merupakan suhu optimal pertumbuhan

M. aeruginosa (Paerl 1998). Pertumbuhan dilakukan dalam tabung kultur dan erlenmeyer yang diisi dengan medium cair sebanyak sepertiga bagiannya agar aerasi tetap terjaga.

Koloni M. aeruginosa BT-02 tumbuh optimum pada agar-agar lapis ganda yang mengandung konsentrasi agar-agar 1% pada lapisan bawah dan 0.75% di lapisan atas (Gambar 3).

Setelah diperoleh pertumbuhan optimum dari isolat-isolat proteolitik terpilih dan diperoleh pertumbuhan M. aeruginosa yang optimum, selanjutnya dilakukan penapisan. Penapisan menggunakan metode agar-agar blok menunjukkan ada dua isolat yang menghambat pertumbuhan M. aeruginosa

3

Tabel 1 Diameter zona bakteri dan indeks penghambatan M. aeruginosa oleh bakteri asal saluran pencernaan ikan Nila GIFT

No Isolat bakteri Gram Zona Hambat

(cm)

Diameter koloni (cm)

Indeks penghambatan

1 NU-2 positif Tidak ada 1 Tidak ada

2 NU-3 negatif Tidak ada 1 Tidak ada

3 NU-4 negatif 2.3 1 1.3

4 NU-8 negatif 2.6 1 1.6

Penapisan dengan menggunakan metode difusi dengan enzim ekstrak kasar protease dari kedua isolat ternyata tidak menghasilkan zona hambat sampai waktu inkubasi dua minggu. Hal ini membuktikan bahwa hanya bakterinya saja yang menghambat pertumbuhan M. aeruginosa

sedangkan enzim ekstrak kasar protease yang dihasilkannya tidak dapat menghambat.

Gambar 1 Sel M. aeruginosa BT-02 yang ditumbuhkan pada media BG-11 dengan perbesaran mikroskop 1000 x.

Gambar 2 Koloni M. aeruginosa BT-02 pada media agar-agar lapis ganda.

(a)

(b)

Gambar 3 Degradasi M. aeruginosa oleh isolat (a) NU-4 dan (b) NU-8.

PEMBAHASAN

Ikan nila GIFT merupakan spesies unggul dibandingkan ikan nila jenis lainnya. Ikan ini pertumbuhannya cepat, ukurannya lebih besar, dan daya tahan tubuhnya lebih baik daripada ikan nila lainnya. Oleh karena itu, bakteri yang berasal dari pencernaan ikan ini diduga mempunyai potensi sebagai probiotik. Dari 30 isolat bakteri proteolitik hasil penelitian sebelumnya (Fatimah 2005) sebanyak 20 isolat dapat tumbuh dengan baik pada agar-agar nutrien yang mengandung 0.5% susu skim (Lampiran 3). Kemudian dipilih empat isolat yang memiliki indeks protease terbesar (Fatimah 2005).

Microcystis aeruginosa adalah

sianobakter yang bersifat fotoautotrof. M.

aeruginosa dapat ditumbuhkan pada media yang mengandung mineral dan elemen mikro seperti media BG-11 dan MLA dengan cahaya yang cukup. Sumber cahaya yang digunakan ialah lampu fluoresen dengan intensitas cahaya melebihi 1000 lux meter (Shirai et al. 1989). Cahaya dipancarkan selama 24 jam pada tempat penyimpanan, sehingga pertumbuhan menjadi cepat. Peremajaan dilakukan ketika koloni M. aeruginosa sudah padat dan memenuhi media pertumbuhan.

Peremajaan dilakukan dengan memindahkan sedikit koloni M. aeruginosa

ke dalam media cair yang baru. Jika 20

µm

0.5 cm

0.5 c

m

4

ditumbuhkan pada media padat, faktor-faktor pertumbuhan seperti kelembapan, kandungan air dan agar-agar menentukan pertumbuhan optimum M. aeruginosa. Oleh karena itu, konsentrasi agar-agar dibuat pada kisaran (0.5-1%), tetapi dijaga agar dapat digunakan untuk cawan gores maupun cawan sebar. Selama proses seleksi dengan metode cawan gores dan cawan sebar dengan satu lapisan agar-agar, tidak menunjukkan hasil yang baik. Koloni tidak tumbuh optimal dan menjadi cepat kering selama satu minggu inkubasi.

Media padat dengan agar-agar lapis ganda tidak mudah kering dan tahan lama sehingga paling cocok untuk menumbuhkan

M. aeruginosa secara optimum. Lapisan atas agar-agar yang mengandung kultur dan lapisan bawah yang konsentrasi agar-agarnya lebih tinggi berfungsi sebagai penyimpan nutrisi. Metode agar-agar lapis ganda dengan konsentrasi 1% pada lapisan atas dan 0.75% pada lapisan bawah, baik untuk pertumbuhan koloni M. aeruginosa. Koloni M. aeruginosa dapat tumbuh selama sebulan pada agar-agar lapis ganda, sehingga proses penapisan bakteri dapat dilakukan tanpa resiko agar-agar mengering.

Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri proteolitik dan M. aeruginosa yang optimal maka dilakukan proses penapisan. Penapisan bakteri menggunakan metode agar-agar blok. Diperoleh dua isolat bakteri terpilih yang mempunyai kemampuan stabil dalam menghambat atau mendegradasi pertumbuhan dari koloni M. aeruginosa. Hal ini ditunjukkan dengan zona hambat yang berwarna kecoklatan di sekitar agar-agar bakteri. Diameter zona bakteri terbesar ditunjukkan oleh isolat NU-8 (2.6 cm) yang telah teridentifikasi sebagai spesies

Aeromonas sp. (Mubarik et al. 2006). Pengujian penghambatan M. aeruginosa

dengan menggunakan ekstrak kasar protease tidak menunjukkan adanya zona hambat. Hal ini menunjukkan bahwa hanya sel bakterinya saja yang berperan mendegradasi

M. aeruginosa sedangkan ekstrak kasar protease yang dihasilkannya tidak. Aktivitas protease tertrtinggi isolat NU-8 dihasilkan pada suhu pH 7 suhu 50º C dan pH 7 suhu 70 ºC (Mubarik et al. 2006). Aktivitas ini terjadi pada jam ke-24 dan memasuki fase stasioner (Mubarik et al. 2006). NU-4 diketahui berbentuk batang dan berantai, gram negatif namun belum diidentifikasi lebih lanjut. Protease yang dihasilkan NU-8 ialah tipe metaloprotease, yang artinya

aktivitas katalitiknya akan meningkat jika ditambahkan ion logam tertentu, dan untuk NU-8 aktivitas katalitiknya akan bertambah jika ditambahkan ion kalium (Mubarik et al.

2006).

Blooming sianobakter yang disebabkan oleh populasi M. aeruginosa dapat didegradasi oleh sejumlah mikroorganisme pada habitat alaminya di perairan (Christoffersen et al. 2002). Dalam skala laboratorium isolat bakteri NU-8 dan NU-4 terbukti dapat mendegradasi koloni M.

aeruginosa.

Aeromonas merupakan genus bakteri gram negatif, kebanyakan motil, berbentuk batang serta mempunyai habitat yang luas baik di daratan maupun perairan (Janda 1991). Aeromonas juga merupakan flora alami pada ikan. Aeromonas bersifat patogen oportunis, artinya bakteri ini akan dapat menjadi patogen sekunder jika kondisi inang sedang stress atau menurun (Janda 1991). Aeromonas menghasilkan hemolisin tipe alfa dan atau beta yang bersifat sitolitik dan enterotoksik sehingga dapat melisis sel darah (Janda 1991). Isolat NU-8 juga menghasilkan hemolisisin yang ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni bakteri pada media agar-agar darah (Lampiran 4).

Aeromonas menghasilkan enterotoksin dan sejumlah enzim ekstraseluler seperti protease, amilase, dan kitinase yang secara aktif dapat mendegradasi berbagai kompleks protein, polisakarida, mukopolisakarida dan juga molekul yang mengandung lemak (Janda 1991). Pavan et al. (2000) juga menemukan beberapa dari spesies

Aeromonas dapat menghasilkan enzim

pektinase yang dapat mengurai senyawa pektin. Hal yang menarik karena dinding sel dari Microcystis mengandung senyawa yang mirip dengan pektin dengan komposisi 83% merupakan asam galakturonat (Hoiczyk & Hansel 2000). Kemampuan Aeromonas

yang dapat menghasilkan enzim pektinase di samping senyawa ektraseluler seperti toksin dan enzim pengurai lainnya memungkinkan

Aeromonas dapat mendegradasi sel M. aeruginosa dengan cara melisis dinding selnya yang diikuti dengan kematian sel. Akan tetapi, hal ini harus diteliti lebih lanjut kebenarannya.

SIMPULAN

Dua isolat bakteri proteolitik asal saluran pencernaan ikan nila yaitu NU-4 dan

5

NU-8 terbukti dapat mendegradasi koloni sianobakter toksik Microcystis aeruginosa

BT-02. Indeks penghambatan dan zona hambat terbesar dihasilkan oleh isolat NU-8 masing-masing dengan nilai 1.6 dan 26 mm dengan menggunakan metode agar-agar blok. Sedangkan ekstrak kasar protease yang dihasilkan kedua isolat tersebut tidak dapat menghambat pertumbuhan M. aeruginosa

BT-02. Kedua isolat bakteri tersebut termasuk bakteri gram negatif, dan NU-8 diidentifikasi sebagai Aeromonas sp.

DAFTAR PUSTAKA

Arie U. 2000. Pembenihan dan Pembesaran Ikan Nila GIFT. Jakarta : Penebar Swadaya.

Balows et al. 1991. The Procaryotes. Ed ke- 2. New York : Springer-Verlag New York Inc.

Bolch CJS, Blackburn SI. 1996. Isolation and purification of Australian isolates of the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa Kutz. J Appl Phycol 8 : 5-13. Bourne D et al. 2002. Enzymatic pathway

for the bacterial degradation of the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR. Appl Environ Microbiol 62 : 4086-4094.

Carmichael WW. 1992. Cyanobacteria secondary metabolites-the cyanotoxins. J Appl Bacteriol 72: 445-459.

Christoffersen K, Lyck S, Winding A.2002. Microbial activity and bacterial community structure during degradation of microcystin. Aquol Microb Ecol 27: 125-136.

Fatimah I. 2005. Isolasi bakteri proteolitik dari saluran pencernaan ikan nila galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Treawavas) dan karakterisasi protease ekstraselulernya. [Skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor.

Fisher WJ, Dietrich DR. 2000. Pathological and biochemical characterization of microcystin induced hepatopancreas and kidney damaged in carp (Cyprinus carpio). Toxicol Appl Pharmacol 164: 73-81.

Hadikusumah H, Costa B.1990. Research on cage aquaculture systems in the Saguling reservoir, West Java, Indonesia.

ICLARM Tech : 112-217.

Hitzfeld CB, Hoger JS, Dietrich RD. 2002. Cyanobacterial toxins: removal during drinking water treatment, and human risk

assessment. Environ Health Perspect.

108 : 113-122.

Hoek , Mann DG, Jahns HM. 1997. Algae : an Introduction to Phycology. London : Cambridge University Press.

Hoiczyk E, Hansel A. Minireview : cyanobacterial cell walls: news from an unusual prokaryotic envelope. J Bacteriol 182: 1191-1199.

Janda JM. 1991. Recent advances in the study of the taxonomy, pathogenicity, and Infectious syndromes associated with the genus Aeromonas. J Clin Microbiol 4: 397-410.

Mubarik NR, Fatimah I, Wahjuningrum. 2006. Isolation of proteolytic bacteria from digestive tract of tilapias strain GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) and characterization of its extracellular protease. Proceding of Symposium Enzimes L: Industrial and Medical Prospect; Surabaya, 6-7 Feb 2006, hlm1-6.

Nedialkova D, Naidenova M. 2005. Screening the antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from antartica. J Culture Collect 4: 29-35. Pavan ME, Abbott SL, Zorzopulos J, Janda

JM. 2000. Aeromonas salmonicida

subsp. pectinolytica subs. nov., a new pectinase-positive subspecies isolated from a heavily polluted river. Int J Syst Evol Microbiol 50: 1119-1124.

Paerl H W. 1988. Nuisance phytoplankton blooms in coastal, estuarine, and inland waters. Limnol Ocean 33: 823-847. Sedmak B, Kosi G. 1998. The role of

microcystins in heavy cyanobacterial bloom formation. J Plankton Res 20 : 691-708.

Shirai M, et al. 1989. Development of solid medium for growth and isolation of axenic Microcystis strains (cyanobacteria). Appl Environ Microbiol 55: 2569-2571.

Stainer, Bazire-Cohen. 1977. Cyanobacteria.

Annu Rev Microbiol 31 : 225-274.

Takenaka S & Watanabe MF. 1997. Microcystin-LR degradation by

Pseudomonas aeruginosa alkaline

protease. Chem 34 : 749-757.

Vanderloeg et al.2001. Zebra mussel

(Dreissena polymorpha) selective

filtration promoted toxic Microcystis

blooms in Saginaw bay (lake huron) and lake erie. Can J Fish Aquat Sci 58: 1208-1221.

6

Verschuere L, Rombaut G, Sorgelos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture.

Microb Mol Biol Rev : 655-671.

Wilson AE et al. 2005. Genetic variation of the bloom-forming cyanobacterium

Microcystis aeruginosa within and among lakes: implications for harmful algal blooms. Appl Environ Microbiol 71: 6126-6133.

8

Lampiran 1 Komposisi Media BG-11 yang telah dimodifikasi (Vanderloeg et al. 2000) Larutan Stok Medium BG-11

Bahan Per Liter

Citric acid 6 g

NaNO3 170 g

MgSO4.7H2O 73.94 g

K2HPO4 41 g

CaCl2.2H2O 36.76 g

Na2CO3 20 g

Ferric ammonium citrate 6 g

Garam disodium EDTA 1 g

NaHCO3 84 g

Trace metal mix 1 ml

Penyiapan : Masing-masing 1 ml larutan stok dan 10 ml NaHCO3 kemudian dicampurkan ke botol Schott-Duran berisi aquabides atau air bebas ion sehingga volume totalnya 1 L. Aduk sampai rata menggunakan magnetic stirer, sesuaikan pHnya sampai 7.4 dengan HCl 1 N atau NaHCO3 1M.

Komposisi Larutan Trace metal mix

Bahan Per Liter

H3BO3 0.079 g

MnCl2.4H2O 1.81 g

Na2MoO4. 2H2O 0.39 g

ZnSO4.7H2O 0.222 g

CuSO4.5H2O 0.079 g

CO(NO3)2SO4.6H2O 0.049 g

Penyiapan : Setiap bahan ditambahkan ke dalam air suling. Air suling ditambahkan sampai dengan volume yang diinginkan. Aduk rata. Larutan disterilkan dengan cara filtrasi, kemudian disimpan ke dalam botol yang sudah disterilkan.

9

Lampiran 2 Komposisi MLA (Bolch & Blackburn 1996)

Larutan Stok inti MLA Komposisi Larutan Mikronutrient

Bahan Per Liter

H3BO3 2.47 g

NaNO3 85 g

MgSO4.7H2O 49.4 g

K2HPO4 6.96 g

CaCl2.2H2O 29.4 g

H2SeO3 1.29 mg

NaHCO3 84 g

Bahan Per 800 ml

Na2MoO4. 2H2O 0.6 g

ZnSO4.7H2O 2.2 g

CuSO4.5H2O 1 g

COCl2.6H2O 1 g

Larutan stok 2 MLA

Bahan Per 10 ml

Garam disodium EDTA 4.36 g

FeCl3.6H2O 1.58 g

MnCl2.4H2O 0.36 g

NaHCO3 16.9 g

Pertama, kita membuat larutan MLA konsentrasi 40 X dengan cara mencampur :

Bahan Per 250 ml

H3BO3 10 ml

NaNO3 20 ml

MgSO4.7H2O 10 ml

K2HPO4 50 ml

Mikronutrien 10 ml

H2SeO3 10 ml

Terakhir, untuk membuat media MLA steril

Bahan Per 1 L

MLA 40 X 25 ml

Air bebas ion / aquabides 964 ml

CaCl2.2H2O 1 ml

NaHCO3 10 ml

10

Lampiran 3 Data Peremajaan 30 isolat proteolitik

Isolat

Pertumbuhan pada

media NA Indeks Proteolitik *

NL-1 + 1.64

NL-2 + 1

NL-3 + 1.27

NL-4 + 1.75

NL-5 - 2.71

NL-6 + 0.67

NL-7 + 0.86

NL-8 + 1.2

NL-9 + 0.67

NL-10 + 1.86

NL-11 + 0.16

NL-12 - 0.27

NL-13 + 0.25

NL-14 + 0.4

NL-15 - 0.33

NL-16 - 3.4

NL-17 + 0.12

NL-18 + 0.11

NU-1 + 1.75

NU-2 + 1.89

NU-3 + 2.71

NU-4 + 2.71

NU-5 + 4.5

NU-6 - 0.78

NU-7 - 0.69

NU-8 + 1.1

NU-9 - 0.5

NU-10 - 1.44

NU-11 - 0.75

NU-12 - 0.75

NU-13 + 1.55

Ket :

+ Tumbuh setelah 24 kam inkubasi pada suhu kamar - Tidak tumbuh setelah 24 kam inkubasi pada suhu kamar * Data diambil dari Fatimah (2005)

11

Lampiran 4 Uji Patogenitas dari Isolat Terpilih

Isolat bakteri yang menghasilkan zona bakteri pada koloni Microcystis aeruginosa

kemudian diuji patogenitasnya. Uji patogenitas dilakukan dengan cara menggores isolat terpilih pada agar darah kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Patogenitas terlihat dari zona bening yang terjadi pada agar darah yang menandakan bahwa darah telah terlisis.

Uji patogenitas dengan menggunakan agar-agar darah menunjukkan hasil bahwa semua isolat bakteri asal ikan nila dapat melisis sel darah yang dapat dilihat dari adanya zona bening di sekitar koloni bakteri.

c a

d b

Ket: a. NU-4 b. NU-2 c. NU-8 d. NU-3

Verschuere L, Rombaut G, Sorgelos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microb Mol Biol Rev : 655-671.

Wilson AE et al. 2005. Genetic variation of the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa within and among lakes: implications for harmful algal blooms. Appl Environ Microbiol 71: 6126-6133.

Lampiran 1 Komposisi Media BG-11 yang telah dimodifikasi (Vanderloeg et al. 2000) Larutan Stok Medium BG-11

Bahan Per Liter

Citric acid 6 g

NaNO3 170 g

MgSO4.7H2O 73.94 g

K2HPO4 41 g

CaCl2.2H2O 36.76 g

Na2CO3 20 g

Ferric ammonium citrate 6 g Garam disodium EDTA 1 g NaHCO3 84 g

Trace metal mix 1 ml

Penyiapan : Masing-masing 1 ml larutan stok dan 10 ml NaHCO3 kemudian dicampurkan ke

botol Schott-Duran berisi aquabides atau air bebas ion sehingga volume totalnya 1 L. Aduk sampai rata menggunakan magnetic stirer, sesuaikan pHnya sampai 7.4 dengan HCl 1 N atau NaHCO3 1M.

Komposisi Larutan Trace metal mix

Bahan Per Liter H3BO3 0.079 g

MnCl2.4H2O 1.81 g

Na2MoO4. 2H2O 0.39 g

ZnSO4.7H2O 0.222 g

CuSO4.5H2O 0.079 g

CO(NO3)2SO4.6H2O 0.049 g

Penyiapan : Setiap bahan ditambahkan ke dalam air suling. Air suling ditambahkan sampai dengan volume yang diinginkan. Aduk rata. Larutan disterilkan dengan cara filtrasi, kemudian disimpan ke dalam botol yang sudah disterilkan.

Lampiran 2 Komposisi MLA (Bolch & Blackburn 1996)

Larutan Stok inti MLA Komposisi Larutan Mikronutrient Bahan Per Liter

H3BO3 2.47 g

NaNO3 85 g

MgSO4.7H2O 49.4 g

K2HPO4 6.96 g

CaCl2.2H2O 29.4 g

H2SeO3 1.29 mg

NaHCO3 84 g

Bahan Per 800 ml Na2MoO4. 2H2O 0.6 g

ZnSO4.7H2O 2.2 g

CuSO4.5H2O 1 g

COCl2.6H2O 1 g

Larutan stok 2 MLA

Bahan Per 10 ml Garam disodium EDTA 4.36 g

FeCl3.6H2O 1.58 g

MnCl2.4H2O 0.36 g

NaHCO3 16.9 g

Pertama, kita membuat larutan MLA konsentrasi 40 X dengan cara mencampur : Bahan Per 250 ml

H3BO3 10 ml

NaNO3 20 ml

MgSO4.7H2O 10 ml

K2HPO4 50 ml

Mikronutrien 10 ml H2SeO3 10 ml

Terakhir, untuk membuat media MLA steril

Bahan Per 1 L MLA 40 X 25 ml

Air bebas ion / aquabides 964 ml CaCl2.2H2O 1 ml

NaHCO3 10 ml

Lampiran 3 Data Peremajaan 30 isolat proteolitik

Isolat

Pertumbuhan pada

media NA Indeks Proteolitik *

NL-1 + 1.64

NL-2 + 1

NL-3 + 1.27

NL-4 + 1.75

NL-5 - 2.71

NL-6 + 0.67

NL-7 + 0.86

NL-8 + 1.2

NL-9 + 0.67

NL-10 + 1.86

NL-11 + 0.16

NL-12 - 0.27

NL-13 + 0.25

NL-14 + 0.4

NL-15 - 0.33

NL-16 - 3.4

NL-17 + 0.12

NL-18 + 0.11

NU-1 + 1.75

NU-2 + 1.89

NU-3 + 2.71

NU-4 + 2.71

NU-5 + 4.5

NU-6 - 0.78

NU-7 - 0.69

NU-8 + 1.1

NU-9 - 0.5

NU-10 - 1.44

NU-11 - 0.75

NU-12 - 0.75

NU-13 + 1.55

Ket :

+ Tumbuh setelah 24 kam inkubasi pada suhu kamar - Tidak tumbuh setelah 24 kam inkubasi pada suhu kamar * Data diambil dari Fatimah (2005)

Lampiran 4 Uji Patogenitas dari Isolat Terpilih

Isolat bakteri yang menghasilkan zona bakteri pada koloni Microcystis aeruginosa kemudian diuji patogenitasnya. Uji patogenitas dilakukan dengan cara menggores isolat terpilih pada agar darah kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Patogenitas terlihat dari zona bening yang terjadi pada agar darah yang menandakan bahwa darah telah terlisis.

Uji patogenitas dengan menggunakan agar-agar darah menunjukkan hasil bahwa semua isolat bakteri asal ikan nila dapat melisis sel darah yang dapat dilihat dari adanya zona bening di sekitar koloni bakteri.

c a

d b

Ket: a. NU-4 b. NU-2 c. NU-8 d. NU-3