Kloning Dan Ekspresi Gen Penyandi Asil Homoserin Lakton Laktonase Dari Bacillus Cereus Int1c Dan Bacillus Thuringiensis Sgt3g

KLONING DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ASIL
HOMOSERIN LAKTON LAKTONASE DARI
Bacillus cereus INT1c DAN Bacillus thuringiensis SGT3g

ANJA ASMARANY R.

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Kloning dan ekspresi
gen penyandi asil homoserin lakton laktonase dari Bacillus cereus INT1c dan
Bacillus thuringiensis SGT3g” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada

Institut Pertanian Bogor

Bogor, Januari 2015

Anja Asmarany R.
NIM G351120111

RINGKASAN
ANJA ASMARANY R. Kloning dan ekspresi gen penyandi asil homoserin lakton
laktonase dari Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g.
Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ARIS TRI WAHYUDI.
Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi di antara sel
bakteri yang diperantarai oleh molekul sinyal asil homoserin lakton (AHL) dan
mekanismenya bergantung pada kepadatan jumlah sel. Pada umumnya bakteri
fitopatogen menggunakan mekanisme QS untuk mengekspresikan gen virulensi
pada saat menginfeksi tanaman. Penghambatan ekspresi gen virulen tersebut dapat
dilakukan dengan mendegradasi senyawa AHL menggunakan AHL-laktonase.
AHL-laktonase merupakan kelompok enzim yang berfungsi untuk
menghidrolisis cincin lakton pada molekul AHL. Enzim ini umumnya ditemukan
pada kelompok Bacillus dan disandikan oleh gen aiiA. Isolasi bakteri dari sampel

tanah dan daun asal lahan pertanian di Jawa telah berhasil mendapatkan dua isolat
yang mampu menghasilkan AHL-laktonase dengan aktivitas yang tinggi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gene AHL-laktonase dari isolat
Bacillus cereus INT1c and Bacillus thuringiensis SGT3g.
Amplifikasi gen AHL-laktonase dari kedua isolat dengan menggunakan
primer aiiA telah berhasil mendapatkan fragmen amplikon DNA berukuran 800
bp. Kedua isolat mempunyai gen aiiA dengan sekuen lengkap pada orf 2 yang
menyandikan 250 asam amino. Analisis sekuen asam amino menggunakan
BLAST-X menunjukkan bahwa asam amino dari B.cereus INT1c mempunyai
homologi sebesar 98% dibandingkan dengan B.cereus (nomor akses
WP.000216573.1), sedangkan B.thuringiensis SGT3g mempunyai homologi
sebesar 99% dibandingkan dengan B.thuringiensis serovar aizawai (nomor akses
AEY70474.1).
Gen aiiA dari kedua isolat diekspresikan di dalam sel E.coli BL21(DE3).
Pemotongan plasmid rekombinan dengan menggunakan BamHI dan NdeI
menunjukkan adanya fragmen DNA berukuran 5708 bp (pET15b) dan 800 bp
(DNA sisipan) pada gel agarosa 1.5%. Hasil ini membuktikan bahwa plasmid
rekombinan telah diperbanyak di dalam sel transforman. Induksi ekspresi gen
dilakukan ketika fase eksponensial menggunakan IPTG. Penambahan 1 mM IPTG
ketika OD600 kultur mencapai 0.6 dapat menghasilkan protein AiiA dengan

aktivitas tinggi. Sementara itu rekombinan E.coli dengan OD600 0.8 tidak
menunjukkan adanya aktivitas degradasi. Hasil ini mengindikasikan bahwa
protein AiiA dari E.coli rekombinan dapat mendegradasi senyawa AHL dari
Chromobacterium violaceum sehingga jumlah AHL tidak mencapai quorum untuk
menginduksi ekspresi gen yang bertanggung jawab untuk produksi violacein.
Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein AiiA dari kedua isolat
mempuyai berat 28.77 kDa.
Kata kunci: Quorum sensing, AHL-Laktonase, Kloning, Bacillus thuringiensis,
Bacillus cereus

SUMMARY
ANJA ASMARANY R. Cloning and gene expression of acyl homoserine lactone
lactonase from Bacillus cereus INT1c and Bacillus thuringiensis SGT3g.
Supervised by IMAN RUSMANA and ARIS TRI WAHYUDI.
Quorum sensing is a mechanism of communication between bacterial cells
mediated by signal molecules acyl homoserine lactone (AHL) and the mechanism
depends on density of bacterial cells. Phytopathogenic bacteria use quorum
sensing mechanisms to express virulence genes when infecting the plants.
Inhibition of virulence genes expression can be done by degrading the AHL
compounds using AHL-lactonase.

AHL-lactonase is a group of enzymes that has function to hydrolisis the
lactone ring of AHL molecules. This enzyme is commonly found in Bacillus
group and it is enconded by aiiA gene. Isolation of bacteria producing AHLlactonase from soil samples and leaves of agricultural lands in Java were
succeeded to get two isolates that had ability to produce AHL-lactonase with high
activity. The aim of this study was to clone AHL-lactonase genes from Bacillus
cereus INT1c and Bacillus thuringiensis SGT3g.
AHL-lactonase gene amplification from the isolates using aiiA primer was
succeeded to get 800 bp of DNA amplicont fragment. Both of isolate had aiiA
gene with complete sequnces on orf 2 which encoding 250 amino acids. Amino
acid sequences analysis using BLAST-X indicated that B.cereus INT1c amino
acid had 98% of maximum identity similarity with B.cereus (access number
WP.000216573.1), while B.thuringiensis SGT3g had 99% maximum identity
similarity with B.thuringiensis serovar aizawai (access number AEY70474.1).
The aiiA genes from the two isolates were expressed in E.coli BL21(DE3)
pLysS cells. Recombinant plasmid digestion by BamHI and NdeI showed the
DNA fragment of 5708 bp (pET15b) and 800 bp (DNA inserts) size. These results
are evidence that the recombinant plasmid was propagated in the transformant
cells. Induction of the gene expression was done in the exponential growth phase
using IPTG. 1 mM IPTG addition when the culture OD600 reached 0.6 could
produce AiiA proteins with high activity. However, recombinant E.coli with 0.8

OD600 did not show AHL degradation activity. These results indicated that AiiA
protein from recombinant E.coli could degrade AHL compounds produced by
Chromobacterium violaceum so that the AHL amount did not reach a quorum to
induce expression of the genes that responsible in violacein production. The
results from SDS-PAGE analysis showed that AiiA proteins from both isolates
have a molecular weight 28.77 of kDa.
Keywords: Quorum sensing, AHL Lactonase, Cloning, Bacillus thuringiensis,
Bacillus cereus

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KLONING DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ASIL

HOMOSERIN LAKTON LAKTONASE DARI
Bacillus cereus INT1c DAN Bacillus thuringiensis SGT3g

ANJA ASMARANY R.

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir.I Made Artika,M.App.Sc

Judul Tesis
Nama

NIM

: Kloning dan Ekspresi Gen Penyandi Asil Homoserin Lakton
Laktonase dari Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis
SGT3g
: Anja Asmarany R.
: G351120111

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir. Iman Rusmana, MSi
Ketua

Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Anggota

Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Anja Meryandini, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Januari 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2013 sampai November 2014
ini ialah Kloning dan ekspresi gen penyandi asil homoserin lakton laktonase dari
Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi sebagai
ketua komisi pembimbing dan Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi sebagai anggota
komisi pembimbing, yang telah banyak memberikan nasehat, saran, motivasi,
waktu konsultasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis

selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain itu
penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc dan Prof. Dr. Anja Meryandini, MS selaku Ketua Program Studi
Mikrobiologi IPB, yang telah memberikan motivasi selama studi dan masukan
pada saat ujian sidang tesis. Penulis mengucapkan terima kasih kepada DIKTI
melalui Beasiswa Unggulan 2012/2013, terima kasih atas kepercayaannya untuk
memberikan beasiswa kuliah selama menempuh pendidikan pascasarjana di IPB
sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Heni dan Bapak Jaka
selaku staf Laboratorium Mikrobiologi IPB, Dina, Vita, Asrianto, Nezharia,
Wulan, Hari, Rahmi, Mahyar, Ayun, Asril, Sipriyadi, Ernin, Gege, Hamtini,
Randi, Antri, Mona, Mei, Yeni, Annisa, serta seluruh teman-teman di
Laboratorium Mikrobiologi IPB, atas dukungan, motivasi, dan bantuannya selama
penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga juga penulis ucapkan kepada
orang tua tercinta Ayah Rustamaji, Ibu Endang Sri Sulastri, dan ketiga adikku
tersayang Muhammad Ibrahim Annur, Ahmad Fauzi Ghouzts, Khosyi Larasati,
serta sahabat-sahabatku tersayang, atas doa, dukungan, kasih sayang, dan
semangat yang diberikan. Terima kasih untuk teman-teman seperjuangan di
Pascasarjana Mikrobiologi IPB angkatan 2012 serta seluruh pihak yang telah
memberikan doa dan dukungannya, penulis ucapkan terima kasih.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2015

Anja Asmarany R.

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Perumusan Masalah

2

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup Penelitian

2

TINJAUAN PUSTAKA
Quorum Sensing

3
3

Asil Homoserin Lakton (AHL)

4

AHL-Laktonase

5

Ekspresi Gen Pada Escherichia coli

6

METODE
Kerangka Penelitian

8
8

Waktu dan Tempat Penelitian

8

Isolasi DNA

9

Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase

9

Pembuatan Sel Kompeten

10

Subkloning Gen Penyandi AHL-Laktonase

10

Isolasi Plasmid Rekombinan

12

Restriksi Plasmid Rekombinan dengan EcoRI

12

Amplifikasi Plasmid Rekombinan

12

Analisis Sekuen Gen AHL-Laktonase Rekombinan

12

Ekspresi Gen AHL-Laktonase dan Bioesai

13

SDS-PAGE

13

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

15
15
23

SIMPULAN DAN SARAN

26

Simpulan

26

Saran

26

DAFTAR PUSTAKA

27

LAMPIRAN

33

RIWAYAT HIDUP

36

DAFTAR GAMBAR
1 Mekanisme quorum sensing pada bakteri
2 Sistem quorum sensing pada bakteri Gram negatif dan Gram positif
3 Struktur Asil Homosern Lakton (AHL)
4 Reaksi Biosintesis asil homoserin lakton (AHL)
5 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase
6 Peta dan daerah ekspresi pET15b (Novagen)
7 Diagram alur penelitian
8 Peta Plasmid pGEMT-Easy (Promega)
9 Sekuen multiple cloning site (MCS)
10 Diagram alur subkloning gen aiiA ke dalam sel E.coli DH5α
11 Diagram alur ekspresi gen aiiA ke dalam sel E.coli BL21(DE3)
12 Produk PCR gen aiiA pada gel agarosa 1.5%.
13 Restriksi Plasmid Rekombinan dengan EcoRI
14 Amplifikasi plasmid rekombinan dengan primer T7 dan SP6
15 Pohon filogenetik dari asam amino AHL-laktonase
yang dikonstruksi menggunakan metode neighbor-joining.
16 Hasil analisis Open Reading Frame (ORF)
17 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari bakteri
B.cereus INT1c dengan ORF finder
18 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari
bakteri B.thuringiensis SGT3g dengan ORF finder
19 Hasil analisis domain dari isolat B.thuringiensis SGT3g
20 Hasil analisis domain dari isolat B.cereus INT1c
21 Prediksi struktur 3 dimensi protein AHL-laktonase
22 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw)
AHL-laktonase dari bakteri B.thuringiensis SGT3g
23 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw)
AHL-laktonase dari bakteri B.cereus INT1c
24 Hasil restriksi plasmid rekombinan dalam E.coli BL21(DE3)
dengan enzim restriksi BamHI dan NdeI
25 Bioesai E.coli rekombinan dengan bakteri C.violaceum
sebagai biokontrol
26 Hasil analisis SDS-PAGE protein AiiA rekombinan

3
4
4
5
6
7
8
10
11
11
14
15
15
16
17
17
18
19
20
20
21
21
21
22
22
23

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8

Sekuen gen aiiA dari isolat B.cereus INT1c
Sekuen gen aiiA dari isolat B.thuringiensis SGT3g
Komposisi gel pemisah dan gel penahan
Metode pewarnaan dengan perak nitrat
Perhitungan nilai Rf marker
Kurva standar marker
Perhitungan berat molekul sampel
Pewarnaan Gram isolat B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g

33
33
34
34
35
35
36
36

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing merupakan mekanisme komunikasi diantara sel bakteri
secara interseluler, bergantung pada kepadatan jumlah sel dan berperan penting
dalam regulasi ekspresi gen. Bakteri memanfaatkan quorum sensing untuk
regulasi pembentukan biofilm, faktor virulen, sintesis antibiotik, sporulasi, dan
bioluminesen (Galloway et al. 2011). Quorum sensing diperantarai oleh suatu
molekul sinyal ekstraseluler yaitu autoinduser. Molekul autoinduser akan
dideteksi dan direspon oleh sel ketika konsentrasinya di lingkungan tinggi. Bakteri
menghasilkan autoinduser dengan jenis yang bervariasi. Bakteri Gram negatif
menghasilkan autoinduser yang disebut N-Acyl Homoserine Lactone (AHL)
(Hentzer et al. 2002).
Mekanisme quorum sensing digunakan oleh bakteri fitopatogen untuk
mengekspresikan gen virulen pada saat menginfeksi tanaman (Soto et al. 2006).
Strategi pengendalian bakteri fitopatogen pada umumnya dilakukan dengan
menggunakan pestisida maupun senyawa antimikrob. Namun penggunaan
senyawa tersebut secara terus-menerus akan menimbulkan sifat resisten pada
bakteri. Solusi alternatif yang dapat dilakukan untuk mengendalikan bakteri
fipatogen yaitu menggunakan quorum quenching. Hentzer dan Givskov (2003)
menyatakan bahwa aplikasi quorum quenching sangat menguntungkan karena
dapat mengurangi munculnya sifat resisten pada bakteri. Quorum quenching tidak
mempengaruhi kelangsungan hidup sel secara individual, tetapi lebih kepada sifat
virulen dari populasi secara keseluruhan. Konsentrasi molekul AHL merupakan
faktor utama yang mempengaruhi ekspresi gen virulen sehingga degradasi
molekul AHL menjadi sasaran utama dari quorum quenching. Enzim yang
mempunyai kemampuan untuk mendegradasi molekul AHL adalah AHLlaktonase (Molina et al. 2003).
Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase telah dilakukan
menggunakan sampel tanah dan daun asal lahan pertanian Jawa. Sebanyak 12
isolat dari 261 isolat yang diperoleh positif memiliki kemampuan untuk
mendegradasi AHL. Dua isolat dengan aktivitas AHL-laktonase terbaik yaitu B.
cereus INT1c dan B. thuringiensis SGT3g (Afiah 2011). Kedua isolat yang
diperoleh masih belum diketahui karakter gennya sehingga perlu diteliti lebih
lanjut dengan melakukan kloning.
Penelitian tentang kloning gen aiiA dari kelompok Bacillus telah banyak
dilaporkan. Kloning gen aiiA dari bakteri Bacillus sp. strain 240B1 dan B.
substilis BS-1 terbukti dapat melemahkan sifat virulen bakteri penyebab penyakit
busuk pada tanaman yaitu Erwinia carotovora. Gen aiiA tersebut menyandikan
enzim AHL-laktonase yang berfungsi untuk menghidrolisis cincin lakton pada
molekul AHL (Dong et al. 2000; Pan et al. 2007). Informasi mengenai karakter
gen dari kedua isolat akan sangat membantu untuk pemanfaatan serta pemahaman
mekanisme biokontrol dari AHL-laktonase.

2

Perumusan Masalah
1. Bakteri patogen menggunakan mekanisme QS untuk mengeskpresikan gen
virulen.
2. Penggunaan pestisida dapat menimbulkan sifat resisten pada bakteri
3. Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g penghasil enzim QQ
berhasil diisolasi dari tanah asal lahan pertanian Jawa.
4. Kedua isolat mempunyai aktivitas degradasi terhadap molekul sinyal AHL
sehingga berpotensi untuk dijadikan sebagai agens biokontrol.
5. Penelitian mengenai isolasi dan kloning gen penyadi AHL-laktonase masih
jarang dilakukan di Indonesia.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengklon gen penyandi AHL-laktonase dari
Bacillus cereus INT1c dan Bacillus thuringiensis SGT3g serta
mengekspresikannya ke dalam sel E.coli BL21(DE3).

Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini yaitu bakteri pendegradasi asil homoserin lakton
(AHL), diharapkan dapat digunakan sebagai agen biokontrol dalam pengendalian
bakteri patogen pada tanaman. Aplikasi bakteri pendegradasi AHL diharapkan
dapat menciptakan sistem pertanian organik dengan mengurangi penggunaan
pestisida yang dapat menimbulkan sifat resisten pada bakteri.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi isolasi DNA bakteri,
karakterisasi serta ekspresi gen penyandi AHL-laktonase. Karakterisasi gen
dilakukan melalui tahapan amplifikasi dengan primer aiiA, transformasi ke dalam
sel E.coli DH5α, isolasi dan pemotongan plasmid dengan enzim EcoRI, serta
amplifikasi menggunakan primer universal T7 dan SP6. Analisis ekspresi gen
meliputi beberapa tahapan yaitu transformasi gen aiiA ke dalam sel E.coli
BL21(DE3), restriksi dengan enzim BamHI dan NdeI, serta bioasai aktivitas
protein rekombinan dengan bakteri C.violaceum sebagai biokontrol.

3

TINJAUAN PUSTAKA
Quorum Sensing
Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi diantara sel
bakteri yang bergantung pada kepadatan populasi sel dan melibatkan sintesis serta
sekresi senyawa molekul sinyal yang disebut autoinduser (Galloway et al. 2011;
Waters dan Bassler 2005). Ngai (2001) menyatakan bahwa mekanisme QS pada
bakteri terjadi melalui beberapa tahapan utama diantaranya sebagai berikut
(Gambar 1):
a. Produksi autoinduser oleh sel bakteri, kemudian disekresikan ke
lingkungan
b. Pengenalan molekul sinyal melalui interaksi dengan protein regulator
c. Akumulasi sinyal seiring dengan peningkatan kepadatan populasi sel
bakteri
d. Respon populasi bakteri ketika autoinduser telah mencapai jumlah quorum

.

Gambar 1 Mekanisme quorum sensing pada bakteri
Konsentrasi autoinduser di lingkungan berkaitan dengan kepadatan populasi
sel bakteri (Federle dan Blasser 2003). Senyawa autoinduser ini disintesis secara
intraseluler oleh sel bakteri dan disekresikan ke lingkungan selama masa
pertumbuhannya. Hal ini menyebakan konsentrasi molekul sinyal di dalam sel dan
di lingkungan meningkat hingga jumlahnya mencapai ambang batas konsentrasi
(quorum). Pada saat senyawa autoinduser mencapai jumlah quorum, autoinduser
akan mengaktifkan ekspresi gen-gen tertentu dalam sel bakteri (Ryan dan Dow
2008; Weber dan Buceta 2013; Lade et al. 2014).
Sistem QS pada bakteri dibagi menjadi dua kelas yaitu tipe LuxI/LuxR pada
bakteri Gram negatif dan tipe sensor kinase pada bakteri Gram positif (Gambar 2).
Pada bakteri Gram negatif protein LuxI bertanggung jawab untuk memproduksi
senyawa AHL. Senyawa AHL tersebut akan berdifusi melalui membran sel dan
dideteksi serta berikatan dengan protein regulator LuxR. Protein LuxR yang telah
berikatan dengan autoinduser (AHL) akan mengikat promoter spesifik pada DNA
dan mengaktifkan transkripsi gen target (xyz). Sementara itu pada bakteri Gram

4

positif molekul sinyal berupa oligonukleotida yang merupakan modifikasi dari
asam amino tertentu. Autoinduser ini sering disebut sebagai autoinducing peptides
(AIP). Deteksi senyawa oligopeptida terjadi melalui dua komponen sinyal
tranduksi. AIP yang telah berikatan dengan sensor kinase akan menyebabkan
terjadinya autofosforilasi. Fosfat yang dihasilkan selanjutnya ditransfer pada
protein respon regulator dan mengaktifkan transkripsi gen target (xyz) (Federle
dan Bassler 2003).

Gambar 2 Sistem quorum sensing pada bakteri Gram negatif (a) dan positif (b)

Asil Homoserin Lakton (AHL)
Sebanyak lebih dari 70 genus bakteri Gram negatif dari kelompok
proteobakteria dilaporkan menghasilkan senyawa AHL sebagai sinyal untuk
berkomunikasi. Struktur AHL tersusun atas cincin homoserin lakton dan rantai
samping asil dengan panjang yang bervariasi yaitu antara 4 sampai 18 rantai
karbon (Gambar 3). AHL dengan rantai terpendek dan terpanjang yang dapat
ditemukan di alam yaitu C4-HSL dan C18-HSL. Karakteristik molekul AHL
dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya jumlah rantai asil dan jenis
gugus substitusi pada molekulnya. Rantai asil dari AHL dapat bersifat jenuh
maupun tak jenuh serta dapat mempunyai substitusi berupa gugus fungsional
hidroksil atau oxo pada atom C nomor 3 (Decho et al. 2011; Tang dan Zhang
2014). Beberapa penelitian juga telah melaporkan penemuan senyawa AHL
dengan struktur spesifik diantaranya isovaleryl-HSL, aryl-HSL (p-coumaroyl-HSL
dan cinnamoyl-HSL) dan N-carboxyl-acyl-HSL (Schaefer et al. 2008; Ahlgren et
al. 2011; Lindemann et al. 2011; Zhang et al. 2012).

Gambar 3 Struktur Asil Homoserin Lakton (AHL) (Czajkowski dan Jafra 2009)

5
Kelarutan, kemampuan berdifusi, serta stabilitas dari senyawa AHL
bergantung pada panjang pendek dari rantai asil (Tang dan Zhang 2014). Molekul
AHL dengan rantai asil pendek dapat berdifusi secara bebas melalui membran sel,
sedangkan molekul AHL dengan rantai asil panjang berdifusi dengan
menggunakan mekanisme transpot aktif (Parsek dan Greenberg 2000; Khmel dan
Metlitskaya 2006). Senyawa 3OC6-HSL merupakan contoh senyawa AHL dengan
rantai asil pendek yang dihasilkan oleh bakteri Vibrio fischeri. Senyawa ini
mempunyai kelarutan dan kemampuan berdifusi yang tinggi sehingga dapat
berdifusi keluar dan keluar sel secara bebas. Sementara itu senyawa 3OC12-HSL
yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa masih memerlukan transport aktif
untuk berdifusi (Ng dan Bassler 2009). Modifikasi gugus substitusi pada atom C3
juga dapat meningkatkan kelarutan AHL. Selain itu karakteristik molekul AHL
juga dapat dipengaruhi oleh kondisi pH dan suhu di lingkungan. Perubahan pH
dan suhu di lingkungan akan mempengaruhi hidrolisis abiotik dari molekul AHL
(Yates et al. 2002).
Senyawa AHL dihasilkan oleh AHL sintase dengan S-adenosyl-Lmethionine (SAM) dan acyl-ACP sebagai substratnya (Watson et al. 2002).
Substrat SAM tersebut dibutuhkan untuk pembentukan cincin homoserin lakton,
sedangkan acyl-ACP berperan sebagai pembawa gugus asil (Khmel dan
Metlitskaya 2006). Kedua substrat tersebut akan berikatan dengan enzim AHL
sintase dan menyebabkan terjadinya reaksi asilasi dan laktonisasi yang
menghasilkan produk berupa AHL, holo-ACP serta 5- methylthioadenosine
(Gambar 4) (Watson et al. 2002).

Gambar 4. Reaksi Biosintesis asil homoserin lakton (AHL) (Watson et al. 2002).

AHL-Laktonase
AHL-laktonase merupakan enzim yang dapat memecah molekul AHL
dengan cara menghidrolisis ikatan ester pada cincin homoserin lakton sehingga
struktur cincin lakton menjadi terbuka (Gambar 5). Perubahan struktur cincin
lakton membuat molekul sinyal AHL tidak dapat berikatan dengan regulator
transkripsional (LuxR) sehingga mekanisme QS menjadi terhambat. Hidrolisis
cincin lakton dapat terjadi pada kondisi pH alkali dan bersifat reversibel melalui
asidifikasi (Lade et al. 2014). AHL-laktonase pertama kali diidentifikasi pada
bakteri Bacillus sp. 240B1 yang disandikan oleh gen aiiA (Dong et al. 2000).

6

AHL-laktonase juga dilaporkan dihasilkan oleh bakteri dari kelompok
Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter sp., Rhodococcus erythropolis, R.
Eutropha (Dong et al. 2002; Zhang et al. 2002; Park et al. 2006; Uroz et al.
2008).

Gambar 5 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase
(Czajkowski dan Jafra 2009)

Ekspresi Gen Pada Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri yang sering digunakan sebagai inang
untuk produksi protein rekombinan karena kemampuan tumbuhnya yang cepat,
mudah dimanipulasi secara genetik, serta banyaknya jumlah vektor kloning yang
tersedia (Marisch et al. 2013). Permasalahan yang sering dihadapi ketika
menggunakan E.coli sebagai inang ekspresi yaitu rendahnya ekspresi gen asing
yang diintroduksikan ke dalam sel dan kelarutan dari protein rekombinan yang
dihasilkan. Beberapa strategi yang dapat dilakukan untuk meningkatkan ekspresi
dan kelarutan protein yaitu mengganti vektor dan galur inang yang digunakan,
penambahan senyawa kimia selama proses induksi serta co-expression (Gopal dan
Kumar 2013).
Saat ini telah tersedia berbagai jenis inang E.coli yang telah dimodifikasi
secara genetik agar sesuai digunakan untuk ekspresi gen asing. Namun yang
paling sering digunakan sebagai inang adalah kelompok E.coli galur BL21, salah
satunya E.coli BL21(DE3). Bakteri E.coli BL21(DE3) mempunyai gen penyandi
T7 polimerase yang diintroduksikan ke dalam genomnya. Selain itu bakteri
tersebut telah dihilangkan kedua gen penyandi proteasenya yaitu lon dan Ompt
sehingga tidak dapat mendegradasi protein asing (Ratelade et al. 2009; Gopal dan
Kumar 2013).
Upaya penggantian vektor juga menjadi solusi alternatif dalam produksi
protein rekombinan. Penggantian vektor bertujuan untuk mengubah promoter dari
gen yang akan dikloning serta untuk mengubah ‘tag’ yang akan mempengaruhi
jumlah protein terlarut dalam sel (Gopal dan Kumar 2013). Vektor pET
merupakan vektor yang umum digunakan untuk produksi protein rekombinan
karena hasil proteinnya tinggi, harganya relatif murah dan prosedur purifikasinya
mudah (Chen et al. 2014). Vektor mempunyai gen lacI dan berada dibawah
kontrol promoter lacUV5 (Dubendorff dan Studier 1991). Vektor pET dengan 6Histidine tag (His-tag) merupakan salah satu vektor dengan tingkat ekspresi yang
tinggi karena adanya promoter kuat di dalamnya (Gopal dan Kumar 2013).

7

Gambar 6 Peta dan daerah ekspresi plasmid pET15b (Novagen)

8

METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian ini meliputi isolasi DNA dari B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis ST3g, subkloning gen aiiA ke dalam sel E.coli DH5α, ekspresi
gen di dalam sel E.coli BL21(DE3), serta analisis protein rekombinan dengan
SDS-PAGE (Gambar 7).
Isolasi DNA dengan Metode
CTAB
.
Amplifikasi Gen Penyandi
AHL-laktonase

Subkloning Gen Penyandi
AHL-laktonase

Isolasi Plasmid Rekombinan

Restriksi dengan Enzim
EcoR1

Amplifikasi Gen AHLLaktonase

Ekspresi Gen AHL-laktonase
dan Bioesai

Analisis Sekuen Gen AHLlaktonase Rekombinan

Gambar 7 Diagram alur penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013 sampai Oktober 2014
di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi,
FMIPA IPB.

9
Isolasi DNA
Isolasi DNA bakteri dilakukan mengikuti metode standar (Sambrook dan
Russel 2001). Isolasi DNA dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu tahap
pencucian sel, lisis, purifikasi, dan pengendapan DNA. Isolat bakteri ditumbuhkan
pada 25 mL LB dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 °C. Sebanyak 1.5 mL
kultur bakteri disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya pelet
dicuci dua kali dengan 760 uL bufer TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA, pH 8.0)
dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Tahap lisis sel diawali
dengan penambahan 200 µL bufer TE dan 45 µL lisozim pada pelet, kemudian
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55 °C. Selanjutnya sampel ditambah dengan
100 µL larutan sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% dan 50 µL proteinase K,
diinkubasi pada suhu 55 °C selama 1 jam. Sampel ditambahkan 100 µL cetyl
trimetyl amonium bromide (CATB) dan 100 µL larutan 5 M NaCl, kemudian
diinkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit. Setelah sel mengalami lisis maka
dilakukan tahapan purifikasi dan pengendapan DNA.
Tahap purifikasi dilakukan dengan penambahan 600 µL larutan
fenol:kloroform:isoamil alkohol (24:24:1). Selanjutnya sampel disentrifugasi pada
12000 rpm selama 10 menit sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan atas
dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 600 µL kloroform:isoamil alkohol
(24:1). Sampel disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit. Lapisan
atas dipindahkan ke tabung mikro baru, kemudian dilakukan proses pengendapan
DNA. Tahap pengendapan DNA dilakukan dengan penambahan 0.6 kali volume
etanol absolut. Sampel diinkubasi selama semalam pada suhu 37 °C, kemudian
disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet DNA dicuci dengan 1 mL
etanol 70% dan disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet
dikeringanginkan dan ditambah 50 µL ddH2O. Kontaminasi RNA dibersihkan
dengan penambahan 0.1 kali volume RNase dan diinkubasi selama 1 jam pada
suhu 37 C.

Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase
Amplifikasi gen aiiA dilakukan dengan menggunakan primer aiiAF (5’GGG GGA CAT ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT TTC G-3’) dan aiiAR
(5’-GGG GGA TCC TCA ACA AGA TAC TCC TAA TGA TGT-3’) (Dong et
al. 2000) (huruf yang digaris bawah merupakan situs restriksi NdeI dan BamH).
Komponen reaksi PCR terdiri dari 1 µL primer (aiiAF dan aiiAR), 1 µL template
DNA (100 ng), 8.5 µL ddH2O dan 12.5 µL Go Taq Green Ready Mix (Promega).
Tahapan PCR yang dilakukan yaitu pre-denaturasi 94 C selama 2 menit,
denaturasi 95 C selama 30 detik, annealing 55 C selama 15 detik, elongasi 72C
selama 30 detik, dan elongasi akhir 72 C selama 5 menit. Proses amplifikasi
dilakukan sebanyak 30 siklus.

10

Pembuatan Sel Kompeten
Sebanyak 2 mL biakan E.coli DH5α umur 24 jam disubkultur ke dalam 50
mL media LB. Kultur diinkubasi selama 2-3 jam pada suhu 37 C sampai nilai
Optical Density (OD600) mencapai 0.45-0.5. Selanjutnya kultur diambil sebanyak
1,5 mL dan disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Pelet
diresuspensi dengan 1 mL bufer transformasi. Sampel diinkubasi di dalam es
selama 15 sampai 30 menit, kemudian disentrifugasi pada 5000 rpm selama 5
menit dengan suhu 4 C. Pelet diresuspensi kembali dengan 250 µL bufer
transformasi (Sambrook dan Russel 2001).

Subkloning Gen AHL-laktonase
Subkloning dilakukan dengan menggunakan vektor pGEMT-Easy (Gambar
8). Subkloning dimulai dengan meligasikan DNA hasil amplifikasi pada plasmid
pGEMT-Easy di daerah MCS (Gambar 9). Reaksi ligasi terdiri dari 2.5 µL
fragmen DNA (15 ng/ µL), 1 µL vektor pGEMT-Easy (50 ng), 5 µL bufer ligasi,
1 µL T4 DNA ligase dan 0.5 µL ddH2O. Proses ligasi dilakukan dengan inkubasi
sampel pada suhu 10 C selama 16 jam. DNA rekombinan hasil ligasi
ditransformasikan ke dalam suspensi sel kompeten (E.coli DH5α) (Gambar 10).
Sampel diinkubasi dalam es selama 45 menit dan setiap 15 menit dijentik secara
perlahan. Selanjutnya sampel diberi perlakuan renjatan panas pada suhu 42 C
selama 45 detik, kemudian diinkubasi dalam es selama 15 menit.
Sampel diresuspensi dengan 250 µL media LB dan diinkubasi selama 1 jam
pada suhu 37 C. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 5
menit, kemudian diresuspensi dengan 100 µL media LB dan ditumbuhkan pada
media LA. Media LA yang digunakan mengandung 50 mg/mL ampisilin, 40
µg/mL IPTG, dan 40 µg/mL X-Gal. Biakan diinkubasi pada suhu 37 C selama
24 jam (Sambrook dan Russel 2001).

Gambar 8 Peta plasmid pGEMT-Easy (Promega)

11

Gambar 9 Sekuen multiple cloning site (MCS) dari plasmid pGEMT-Easy

Gambar 10 Diagram alur subkloning gen aiiA ke dalam sel E.coli DH5α

12

Isolasi Plasmid Rekombinan
Isolasi plasmid rekombinan dilakukan mengikuti prosedur High Speed
Plasmid Mini Kit (Geneaid). Koloni E.coli DH5α rekombinan ditumbuhkan dalam
2 mL media LB yang mengandung 50 mg/mL ampisilin dan diinkubasi pada suhu
37 C selama semalam. Sebanyak 1.5 mL kultur disentrifugasi dengan kecepatan
13.000 selama 1 menit. Pelet ditambahkan 200 µL bufer PD1, kemudian
diresuspensi dengan 200 µL bufer PD2. Selanjutnya sampel dibolak balik 10 kali
dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Sampel ditambah 300 µL bufer
PD3 dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Cairan jernih
dibagian atas dipindahkan ke dalam tabung kolom dan disentrifugasi pada 13.000
rpm selama 30 detik. Setelah itu ditambahkan 400 µL bufer W1 dan disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 30 detik. Larutan bagian bawah dibuang dan kolom
dicuci dengan 600 µL bufer pencuci. Sampel disentrifugasi pada 13.000 rpm
selama 30 detik, kemudian larutan bagian bawah dibuang. Kolom dikeringkan
dengan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Selanjutnya DNA dielusi
dengan 50 µL bufer elusi dan diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang,
kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit.

Pemotongan Plasmid Rekombinan dengan EcoRI
Konfirmasi DNA sisipan dalam plasmid pGEMT-Easy dilakukan
menggunakan enzim EcoRI. Plasmid dipotong dengan mereaksikan 5 µL DNA
plasmid, 1 µL 10x bufer enzim restriksi, 1 µL enzim restriksi dan 3 µL ddH2O.
Sampel diinkubasi pada suhu 37 C selama semalam. Fragmen DNA yang telah
dipotong dengan enzim dianalisis melalui elektroforesis pada gel agarosa 1.5 %.

Amplifikasi Plasmid Rekombinan
Konfirmasi hasil transformasi juga dilakukan dengan amplifikasi plasmid
rekombinan menggunakan primer T7 dan SP6. Reaksi PCR terdiri dari 2 µL
template DNA, 1.25 µL primer T7, 1.25 µL primer SP6, 12.5 µL Go Taq Green
Ready Mix (Promega), dan 8 µL ddH2O. Tahapan PCR yang digunakan yaitu predenaturasi 94 C selama 2 menit, denaturasi 94 C selama 30 detik, annealing 50
C selama 30 detik, elongasi 72 C selama 1 menit, dan elongasi akhir 72 C
selama 10 menit. Siklus PCR berlangsung sebanyak 30 siklus.

Analisis Sekuen Gen AHL-laktonase Rekombinan
Fragmen DNA hasil amplifikasi disekuensing dan hasilnya diedit
menggunakan Bioedit software sebelum dilakukan konstruksi pohon filogenetik
menggunakan MEGA 5.0 software (Tamura et al. 2011). Analisis asam amino
dilakukan menggunakan program BLAST-X dan analisis Open Reading Frame
(ORF) menggunakan ORF finder di situs NCBI. Sekuen asam amino yang
diperoleh selanjutnya dianalisis domain (http://prosite.expasy.org) dan struktur

13
tiga dimensi di situs prosite (http://protein model portal.org). Analisis nilai titik
isoelektrik dan berat molekul juga dilakukan pada sekuen asam amino
(http://web.expasy.org/compute_pi/).

Ekspresi Gen AHL-laktonase dan Bioesai
Plasmid rekombinan yang telah subkloning dipotong menggunakan enzim
restriksi BamHI dan NdeI, kemudian diligasikan dalam plasmid pET15b. Plasmid
rekombinan ditransformasikan ke dalam bakteri E.coli BL21(DE3) (Gambar 11).
Sel transforman ditumbuhkan di media LB yang mengandung 50 mg/mL
ampisilin. Kultur diinkubasi selama 2-3 jam pada suhu 37C. Ekpresi gen
diinduksi dengan penambahan 0.1 mM IPTG ketika OD600 kultur mencapai 0.6,
kemudian diinkubasi selama 2-3 jam pada suhu 37C. Kultur E.coli BL21(DE3)
dan E.coli BL21(DE3) rekombinan tanpa penambahan IPTG digunakan sebagai
kontrol.
Bioesai aktivitas AHL-laktonase dilakukan secara kualitatif dengan
menggunakan bakteri C.violaceum sebagai biokontrol. Sebanyak 120 μL kultur
E.coli rekombinan diteteskan pada kertas cakram, kemudian diletakkan di atas
media luria agar semi padat yang telah mengandung 1% C.violaceum. Biakan
diinkubasi selama 24 sampai 48 jam pada suhu ruang. Ekspresi gen penyandi
AHL-laktonase ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat disekitar kertas
cakram.

SDS-PAGE
Sebanyak 500 µL kultur E.coli BL21(DE3) dilisis menggunakan sonikator.
Sonikasi dilakukan pada frekuensi 13.000 Hz selama 1 menit dengan jeda 10
detik. Sel yang telah lisis diambil 100 µL dan dicampur dengan 30 µL 5x larutan
bufer sampel. Selanjutnya sampel divortek dan direbus pada suhu 100 C selama
5 menit. Sampel yang telah terdenaturasi dielektroforesis pada 12% gel
poliakrilamida selama 4 jam dengan tegangan 60 V dan arus 22 mA (Lampiran 3).
Gel hasil elektroforesis diwarnai menggunakan Silver Staining (Lampiran 4).
Berat molekul AHL-laktonase dihitung dengan menggunakan persamaan linear
berdasarkan nilai Rf (mobilitas relatif) marker dan log BM (berat molekul)
(Lampiran 5). Nilai Rf dihitung dengan menggunakan rumus:
Jarak migrasi pita protein
Rf =
Jarak migrasi CBB

14

Gambar 11 Diagram alur ekspresi gen aiiA ke dalam sel E.coli BL21(DE3)

15

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Amplifikasi Gen aiiA dan Konfirmasi E.coli DH5α Rekombinan
Isolasi DNA dengan metode CTAB berhasil mendapatkan DNA dengan
konsentrasi dan nilai kemurnian yang baik. Konsentrasi DNA dari B.thuringiensis
SGT3g yaitu 361.9 ng/µL dengan nilai kemurnian pada A260/280 sebesar 2.02.
Sementarai itu B.cereus INT1c mempunyai konsentrasi DNA sebesar 280.9 ng/µL
dengan nilai kemurnian 1.99. Deteksi gen penyandi AHL-laktonase dari kedua
isolat dengan primer aiiA berhasil mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 800
bp (Gambar 12). Jumlah amplikon dari isolat B.cereus INT1c sebanyak 918 bp
(Lampiran 1) dan B.thuringiensis SGT3g sebanyak 903 bp (Lampiran 2).
Konfirmasi plasmid rekombinan dalam sel E.coli DH5α melalui
pemotongan dengan EcoRI menghasilkan 2 fragmen DNA berukuran 3015 bp dan
800 bp (Gambar 13). Enzim EcoRI tersebut memisahkan DNA sisipan berukuran
800 bp dari plasmid pGEMT-Easy.

Gambar 12 Produk PCR gen aiiA pada gel agarosa 1.5%. Sumur dari kiri: (M)
marker 1 kb, (1) B.cereus INT1c, (2) B.thuringiensis SGT3g.

Gambar 13 Hasil pemotongan plasmid rekombinan dengan EcoRI. Sumur dari
kiri: (M) marker 1 kb, (1) B.cereus INT1c, (2) B.thuringiensis SGT3g.

16

Konfirmasi dengan primer T7 dan SP6 juga berhasil mengamplifikasi DNA
sisipan dalam plasmid pGEMT-Easy berukuran 1000 bp. Fragmen tersebut
merupakan hasil amplifikasi DNA sisipan dan sekuen situs restriksi di MCS
(Gambar 14).

M

b

Gambar 14 Hasil amplifikasi plasmid rekombinan. Sumur dari kiri: (M) marker
1kb, (1) B.cereus INT1c, (2) B.thuringiensis SGT3g.

Sekuen Asam Amino dan Filogenetik AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
Bakteri B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g mempunyai sekuen
penyandi AHL-laktonase yang mirip setelah disejajarkan dengan MEGA5
software. Analisis sekuen dengan program BLAST-X menunjukkan bahwa asam
amino dari B.cereus INT1c memiliki homologi 98% dengan B.cereus nomor akses
WP.000216573.1, sedangkan B.thuringiensis SGT3g memiliki homologi 99%
dengan B.thuringiensis serovar aizawai nomor akses AEY70474.1 (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil BLAST-X dari sekuen gen aiiA
Isolat

Deskripsi

B.cereus INT1c

AHL-laktonase
[B. cereus]

B.thuringiensis
SGT3g

AHL-laktonase
[B.thuringiensis
serovar aizawai]

Query E Value
Cover
81% 4e-180

84%

0.0

Identitas

No. Akses

98%

WP.00021
6573.1

99%

AEY7047
4.1

Analisis jarak evolusioner kedua isolat dengan pohon filogenetik
menghasilkan distribusi homologi gen aiiA yang beragam dengan kelompok
Bacillus yang lain (Gambar 15). Kedua isolat memiliki kekerabatan dekat dengan
B.amyloliquefaciens, B.weihenstephanensis, dan B.thuringiensis serovar kim.

17
Bakteri Pseudomonas aeruginosa (nomor akses WP023464371.1) dipilih sebagai
outer group yang merupakan bakteri Gram negatif penghasil AHL-asilase.

Gambar 15 Pohon filogenetik dari asam amino AHL-laktonase yang dikonstruksi
menggunakan metode neighbor-joining.

Open Reading Frame (ORF) Gen AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
Hasil analisis dengan ORF Finder menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri
mempunyai 1 ORF yang diduga dapat mengekspresikan AHL-laktonase yaitu
pada orf2 (Gambar 16). Kedua isolat mempunyai orf2 yang sama yang dimulai
dari basa ke-14 dan diakhiri pada basa ke 766. Orf2 terdiri atas 752 bp yang
menyadikan 250 asam amino. Sekuen gen aiiA dari kedua isolat telah lengkap
karena mempunyai start kodon (ATG) dan stop kodon (TAG) (Gambar 17 dan
18).

Gambar 16 Hasil analisis Open Reading Frame (ORF) dari bakteri B.thuringiensis
SGT3g (kiri) dan B.cereus INT1c (kanan).

18

14 atgacagtaaagaagctttatttcgtcccagcaggtcgttgtatg
M T V K K L Y F V P A G R C M
59 ttagatcattcttctgttaatagtacactcgcgccggggaattta
L D H S S V N S T L A P G N L
104 ttgaacttacctgtatggtgttatcttttggagacagaagagggg
L N L P V W C Y L L E T E E G
149 cctattttagtagatacaggtatgccagaaagtgcagttaataat
P

I

L

V

D

T

G

M

P

E

S

A

V

N

N

194 gaagggatttttaacggtacatttgttgaaggacagattttaccg
E G I F N G T F V E G Q I L P
239 aaaatgactgaagaagatagaatcgtgaatatattaaagcgtgta
K

M

T

E

E

D

R

I

V

N

I

L

K

R

V

284 gggtatgagccggacgaccttttatatattattagttctcactta
G Y E P D D L L Y I I S S H L
329 cattttgatcatgcaggaggaaacggtgcttttacaaatacaccg
H F D H A G G N G A F T N T P
374 attattgtgcagcgagcggaatatgaggcagcacttcatagagaa
I

I

V

Q

R

A

E

Y

E

A

A

L

H

R

E

419 gaatatatgaaagaatgtatattaccgcatttgaactacaaaatt
E Y M K E C I L P H L N Y K I
464 attgaaggggattatgaagtggtaccaggtgttcaattattgtat
I E G D Y E V V P G V Q L L Y
509 acgccaggtcattctccaggccatcagtcgttattcattgagacg
T P G H S P G H Q S L F I E T
554 gagcaatccggttcagttttattaacaattgatgcatcgtacacg
E

Q

S

G

S

V

L

L

T

I

D

A

S

Y

T

599 aaagagaattttgaagatgaagtgccgttcgcaggatttgatcca
K E N F E D E V P F A G F D P
644 gaattagctttatcttcaatcaaacgcttaaaagaagttgtgaca
E L A L S S I K R L K E V V T
689 aaagagaaatcgattgttttctttggtcatgatatagagcaggaa
K E K S I V F F G H D I E Q E
734 aagggttgtagagtgttcccggagtatatatag 766
K

G

C

R

V

F

P

E

Y

I

*

Gambar 17 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari bakteri B.cereus
INT1c dengan ORF finder.

19
14 atgacagtaaagaagctttatttcgtcccagcaggtcgttgtatg
M T V K K L Y F V P A G R C M
59 ttagatcattcttctgttaatggtacactcgcgccggggaattta
L D H S S V N G T L A P G N L
104 ttgaacttacctgtatggtgttatcttttggagacagaagagggg
L N L P V W C Y L L E T E E G
149 cctattttagtagatacaggtatgccagaaagtgcagttaataat
P

I

L

V

D

T

G

M

P

E

S

A

V

N

N

194 gaagggctttttaacggtacatttgttgaaggacagattttaccg
E G L F N G T F V E G Q I L P
239 aaaatgactgaagaagatagaatcgtgaatatattaaagcgtgta
K

M

T

E

E

D

R

I

V

N

I

L

K

R

V

284 gggtatgagccggacgaccttttatatattattagttctcactta
G Y E P D D L L Y I I S S H L
329 cattttgatcatgcaggaggaaacggtgcttttacaaatacaccg
H F D H A G G N G A F T N T P
374 attattgtgcagcgaacggaatatgaggcagcacttcatagagaa
I

I

V

Q

R

T

E

Y

E

A

A

L

H

R

E

419 gaatatatgaaagaatgtatattaccgcatttgaactacaaaatt
E Y M K E C I L P H L N Y K I
464 attgaaggggattatgaagtggtaccaggtgttcaattattgtat
I E G D Y E V V P G V Q L L Y
509 acgccaggtcattctccaggccatcagtcgctattcattgagacg
T P G H S P G H Q S L F I E T
554 gagcaatccggctcagttttattaacaattgatgcatcgtacacg
E

Q

S

G

S

V

L

L

T

I

D

A

S

Y

T

599 aaagagaattttgaagatgaagtgccgttcgcaggatttgatcca
K E N F E D E V P F A G F D P
644 gaattagctttatcttcaattaaacgtttaaaaggagttgtggcg
E L A L S S I K R L K G V V A
689 aaagagaaaccaattgttttctttggtcatgatatagagcaggaa
K E K P I V F F G H D I E Q E
734 aagggttgtagagtgttccctgagtatatatag 766
K

G

C

R

V

F

P

E

Y

I

*

Gambar 18 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari bakteri
B.thuringiensis SGT3g dengan ORF finder.

20

Domain dan Struktur Model Protein AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
AHL-laktonase dari kedua isolat termasuk dalam domain metallo-βlactamase superfamily. Perbedaan domain kedua isolat terletak pada situs
fosforilasi kasein kinase II. Bakteri B.cereus INT1c tidak mempunyai residu
treonin nomor 126. Situs aktif pada domain terletak pada urutan asam amino
nomor 149-153. Daerah tersebut merupakan situs forsforilasi tirosin kinase
(Gambar 19 dan 20).

MTVKKLYFVPAGRCMLDHSSVNGTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPE
SAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHA
GGNGAFTNTPIIVQRTEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLY
TPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRL
KGVVAKEKPIVFFGHDIEQEKGCRVFPEYI
Gambar 19 Hasil analisis domain dari isolat B.thuringiensis SGT3g. Daerah
berwarna biru: situs fosforilasi kasein kinase II, dan daerah berwarna
kuning: merupakan situs aktif yaitu situs forsforilasi tirosin kinase.

MTVKKLYFVPAGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPE
SAVNNEGIFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHA
GGNGAFTNTPIIVQRAEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLY
TPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRL
KEVVTKEKSIVFFGHDIEQEKGCRVFPEYI
Gambar 20 Hasil analisis domain dari isolat B.cereus INT1c. Daerah berwarna
biru: situs fosforilasi kasein kinase II, dan daerah berwarna kuning:
merupakan situs aktif yaitu situs forsforilasi tirosin kinase.
Analisis struktur 3 dimensi menunjukkan bahwa protein AHL-laktonase
dari kedua isolat mempunyai struktur yang tersusun atas lipatan αβ/βα. Pada salah
satu ujung lipatan protein terdapat situs aktif yang ditandai dengan keberadaan ion
Zn2+. Ion Zn2+ ini dikoordinasikan oleh beberapa ligan histidin dan aspartat dan
mempunyai motif HXHXDH (Gambar 21).

21

Gambar 21 Prediksi struktur 3 dimensi protein AHL-laktonase, kiri: lipatan αβ/βα
dan kanan: motif HXHXDH pada AHL-laktonase.
Titik isoelektrik merupakan pH ketika muatan suatu molekul protein
bernilai nol. Bakteri B.thuringiensis SGT3g diprediksi mempunyai titik isoelektrik
sebesar 4.81, sedangkan B.cereus INT1c mempunyai titik isoelektrik 4.7. Kedua
isolat juga diprediksi mempunyai berat molekul yang sama (Gambar 22 dan 23).
10

20

30

40

50

60

IGSMTVKKLY
70
VNNEGLFNGT
130
NTPIIVQRTE
190
IETEQSGSVL
250
EQEKGCRVFP

FVPAGRCMLD
80
FVEGQILPKM
140
YEAALHREEY
200
LTIDASYTKE

HSSVNGTLAP
90
TEEDRIVNIL
150
MKECILPHLN
210
NFEDEVPFAG

GNLLNLPVWC
100
KRVGYEPDDL
160
YKIIEGDYEV
220
FDPELALSSI

YLLETEEGPI
110
LYIISSHLHF
170
VPGVQLLYTP
230
KRLKGVVAKE

LVDTGMPESA
120
DHAGGNGAFT
180
GHSPGHQSLF
240
KPIVFFGHDI

EYI

pI/Mw: 4.81 / 28.24617

Gambar 22 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw) AHL-laktonase
dari bakteri B.thuringiensis SGT3g.
10
MTVKKLYFVP
70
EGIFNGTFVE
130
IIVQRAEYEA
190
EQSGSVLLTI
250
KGCRVFPEYI

20
AGRCMLDHSS
80
GQILPKMTEE
140
ALHREEYMKE
200
DASYTKENFE

30
VNSTLAPGNL
90
DRIVNILKRV
150
CILPHLNYKI
210
DEVPFAGFDP

40
LNLPVWCYLL
100
GYEPDDLLYI
160
IEGDYEVVPG
220
ELALSSIKRL

50
ETEEGPILVD
110
ISSHLHFDHA
170
VQLLYTPGHS
230
KEVVTKEKSI

60
TGMPESAVNN
120
GGNGAFTNTP
180
PGHQSLFIET
240
VFFGHDIEQE

pI/Mw: 4.77 / 28.08093

Gambar 23 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw) AHL-laktonase
dari bakteri B.cereus INT1c.

Ekspresi Gen aiiA dan Akvifitas AHL-laktonase Hasil Kloning
Pemotongan plasmid rekombinan E.coli BL21(DE3) dengan BamHI dan
NdeI menghasilkan dua fragmen DNA berukuran 5708 bp dan 800 bp (Gambar
24). Hasil ini membuktikan bahwa plasmid pET15b yang terdapat dalam E.coli

22

BL21(DE3) telah terligasi dengan fragmen gen aiiA dari B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g. Penambahan 1 mM IPTG dapat menginduksi ekspresi gen
aiiA dibawah kontrol T7 lac promoter. Penambahan 1 mM IPTG ketika OD600
kultur mencapai 0.6 menghasilkan protein AiiA dengan aktivitas lebih tinggi
dibandingkan saat OD600 0.8. Bakteri E.coli rekombinan dengan nilai OD600 0.6
mempunyai aktivitas penghambatan terhadap bakteri C.violaceum. Hal ini
ditunjukkan dengan terbentuknya zona berwarna opaque disekitar kertas cakram.
Sementara itu bakteri E.coli rekombinan dengan nilai OD600 0.8 tidak
menunjukkan aktivitas degradasi terhadap senyawa AHL. Sementara itu pada
E.coli BL21(DE3) non rekombinan dan E.coli BL21(DE3) tanpa perlakuan IPTG
tidak menunjukkan adanya aktivitas AHL-laktonase (Gambar 25).

Gambar 24 Hasil restriksi plasmid rekombinan dalam E.coli BL21(DE3) dengan
enzim restriksi BamHI dan NdeI.

Gambar 25 Bioesai E.coli BL21(DE3) rekombinan dengan bakteri C.violaceum
sebagai biokontrol. A. E.coli BL21(DE3) non rekombinan, B dan C.
E.coli BL21(DE3) rekombinan tanpa induksi IPTG, D dan E. E.coli
rekombinan diinduksi IPTG, B, D, dan F. E.coli rekombinan dengan
gen aiiA dari B.cereus INT1c, C, E dan G. E.coli rekombinan dengan
gen aiiA dari B.thuringiensis SGT3g.

23
Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa overexpression gen aiiA dari
kedua isolat berhasil dilakukan dalam sel E.coli BL21(DE3) rekombinan dengan
induksi IPTG. Hasil ini ditandai dengan terbentuknya pita yang lebih tebal pada
sampel protein kedua isolat dibandingkan dengan pita kontrol dan pita E.coli
BL21(DE3) rekombinan tanpa perlakuan IPTG. Protein AiiA dari kedua isolat
mempunyai berat molekul yang sama dan diprediksi berukuran sekitar 28.77 kDa
(Gambar 26).

Gambar 26 Hasil analisis SDS-PAGE protein AiiA rekombinan. Sumur dari kiri
ke kanan: (M) Marker, (1) E.coli BL21(DE3) non rekombinan, (2 dan
4) E.coli BL21(DE3) rekombinan yang tidak diinduksi dengan IPTG,
(3 dan 5) E.coli BL21(DE3) rekombinan yang diinduksi dengan IPTG,
(2 dan 3) E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.cereus INT1c, (4
dan 5) E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.thuringiensis
SGT3g.

Pembahasan
Enzim pendegradasi AHL dilaporkan banyak terdapat pada kelompok
proteobakteria dan disandikan oleh berbagai macam gen seperti aiiA, aiiB, attM,
ah1D, dan aiiD (Carlier et al. 2003; Dong et al. 2000; Lin et al. 2003; Park et al.
2003). Isolat B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g terdeteksi mempunyai
aktivitas degradasi AHL yang tinggi dari hasil uji kualitatif dengan C.violaceum
sebagai biokontrol. Beberapa hasil penelitian juga melaporkan bahwa AHLlaktonase dengan spektrum degradasi substrat yang luas telah banyak ditemukan
pada bakteri B.cereus dan B.thuringiensis (Dong et al. 2002; Lee et al. 2002;
Flores et al. 2014). Aktivitas degradasi substrat dengan kisaran luas berkaitan
dengan mekanisme hidrolisis AHL-laktonase yang tidak dipengaruhi oleh panjang
rantai asil dari AHL (Cao et al. 2012; Chen et al. 2013; Lade et al. 2014).
Isolat B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g terdeteksi mempunyai
AHL-laktonase yang disandikan oleh gen aiiA, dibuktikan dengan adanya
fragmen DNA berukuran 800 bp. AHL-laktonase yang dihasilkan oleh bakteri dari
genus Bacillus telah banyak dilaporkan disandikan oleh gen aiiA (Chan et al.

24

2007; Anzhou et al. 2013; Dong et al. 2002; Lee et al. 2002). Fragmen berukuran
800 bp tersebut setelah dianalisis dengan ORF Finder hanya 752 bp yang
diprediksi dapat mengekspresikan protein AiiA. Penelitian sebelumnya juga
melaporkan bahwa sekuen gen aiiA dari genus Bacillus berukuran sekitar 750 bp
yaitu Bacillus sp. 240B1 (750 bp), B.subtilis BS-1 dan Bacillus sp. B546 (753 bp)
serta B. thuringiensis 147-11516 (754 bp) (Dong et al. 2002; Pan et al. 2008;
Chen et al. 2010; Flores et al. 2014). Eksplorasi gen aiiA dari bakteri kelompok
Bacillus akan sangat membantu untuk pengemb