Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway

ISOLASI DAN KLONING GEN PENYANDI FITASE DARI
Bacillus subtilis AQ1 DENGAN TEKNOLOGI GATEWAY

RACHMAWATI NUR FITRIANA

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Kloning
Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Skripsi ini
disusun berdasarkan hasil penelitian di Badan Pengkajian dan Penerapan
Teknologi (BPPT) Serpong tahun 2014. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir

skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Rachmawati Nur Fitriana
NIM G84100041

ABSTRAK
RACHMAWATI NUR FITRIANA. Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari
Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway. Dibimbing oleh EDY
DJAUHARI PURWAKUSUMAH dan SISWA SETYAHADI.
Fitase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pemecahan asam
fitat untuk membebaskan fosfor dan nutrien yang terdapat dalam kompleks fitat
sehingga dapat mengurangi efek antinutrisi dari asam fitat. Enzim ini sangat
penting sebagai bahan tambahan pakan ternak monogastrik. Teknik rekayasa
genetika diperlukan untuk menghasilkan DNA rekombinan penyandi gen fitase
yang lebih stabil dengan produktivitas yang tinggi. Gen phy diisolasi dari bakteri
Bacillus subtilis AQ1 yang telah terbukti menghasilkan fitase. Penelitian ini
bertujuan menyisipkan gen penyandi fitase pada vektor donor dan vektor ekspresi
dengan teknik kloning Gateway. Gen phy hasil kloning ditransformasikan ke

dalam E.coli BL21-Star. Ekspresi fitase rekombinan dalam E.coli BL21-Star
dapat terlihat dari hasil uji aktivitas fitase pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24 yang
masing-masing memiliki aktivitas sebesar 1.989 U/mL, 2.988 U/mL, dan 3.331
U/mL. Hasil aktivitas ini menunjukkan bahwa gen fitase yang dikloning dengan
metode Gateway dapat terekspresi dalam E.coli BL21-Star.
Kata kunci: Fitase, asam fitat, Bacillus subtilis AQ1, kloning Gateway

ABSTRACT
RACHMAWATI NUR FITRIANA. Isolation and Cloning of Phytase Gene from
Bacillus subtilis AQ1 by Gateway Technology. Supervised by EDY DJAUHARI
PURWAKUSUMAH and SISWA SETYAHADI.
Phytase was an enzyme that could catalyze the breakdown of phytic acid to
release phosphorus and nutrients contained in the phytate complex, so it could
reduce the antinutritional effect of phytate. This enzyme was very important as an
feed additive in monogastric animals. The genetic engineering technique is
required to produce a recombinant DNA gene encoding phytase which more
stable with high productivity. Phy gene was isolated from Bacillus subtilis AQ1
that had been proven to produce phytase. The objectives of this research was to
insert the phytase encoding gene inside donor and expression vectors with
Gateway cloning technique. Phy gene then tansformed into E.coli BL21-Star. The

expression of phytase recombinant in E.coli BL21-Star could be seen from the
result of phytase activity after 6, 12, and 24 hours that each had activity of 1.989
U/mL, 2.988 U/mL, and 3.331 U/mL. The result of this activity indicated that the
phytase gene cloned by using Gateway method could be expressed in E.coli
BL21-Star.
Keywords: Phytase, phytic acid, Bacillus subtilis AQ1, Gateway cloning

ISOLASI DAN KLONING GEN PENYANDI FITASE DARI
Bacillus subtilis AQ1 DENGAN TEKNOLOGI GATEWAY

RACHMAWATI NUR FITRIANA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2015

Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1
dengan Teknologi Gateway
Nama
: Rachmawati Nur Fitriana
NIM
: G84100041

Disetujui oleh

Drs Edy Djauhari PK, MS
Pembimbing I

Dr Ir Siswa Setyahadi, MSc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika MAppSc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat,
hidayah, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
karya ilmiah ini. Tak lupa shalawat serta salam semoga tetap tercurahkan kepada
Nabi Muhammad SAW. Penelitian yang berjudul Isolasi dan Kloning Gen
Penyandi Fitase dari Bacillus subtilis AQ1 dengan Teknologi Gateway ini
dilaksanakan sejak bulan Maret sampai dengan Oktober 2014 di Laboratorium
Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Agroindustri dan
Biomedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT),
Serpong.
Ucapan terima kasih terutama penulis sampaikan kepada Drs Edy Djauhari
PK, MS dan Dr Ir Siswa Setyahadi, MSc atas bimbingan, arahan, kritik, saran,
dan motivasi yang telah diberikan selama penelitian, serta Kak Ruby Setiawan
yang telah banyak memberikan saran dan bantuan selama penelitian. Secara
khusus juga penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua penulis Alm.

Bapak Sugiyo dan Ibu Siti Asiyah atas doa dan dorongan semangat untuk
kesuksesan, kelancaran dan kemudahan jalan hidup bagi penulis. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada kakak dan kedua adik penulis serta kepada
keluarga besar Pinus merkusii dan teman-teman Biokimia 47 yang selalu
memberikan semangat dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian ini.
Penulis berharap karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan dan
kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.
Bogor, Januari 2015

Rachmawati Nur Fitriana

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x

DAFTAR GAMBAR

x

DAFTAR LAMPIRAN

x

PENDAHULUAN

1 

METODE PENELITIAN

2 

Bahan

2 

Alat

2 

Metode

3 

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN

7 
7 
10 
15 

Simpulan

15 

Saran

15 

DAFTAR PUSTAKA

15 

LAMPIRAN

18

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL
1 Urutan primer gen phy
2 Hasil pengukuran aktivitas fitase

7

10 

DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom Bacillus subtilis AQ1
2 Elektroforegram produk PCR attB-phyaq1
3 Produk entry clone pENTR-phyaq1 (A) Hasil transformasi pENTR
phyaq1, (B) Hasil konfirmasi pENTR-phyaq1 pada media yang
mengandung kloramfenikol
4 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pENTR-phyaq1
5 Hasil transformasi pEXP-phyaq1
6 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pEXP-phyaq1

7
8 
8 
9 
9 
10 

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5
6
7

Diagram alir penelitian
Kurva standar fosfat
Pengukuran aktivitas fitase
Peta marka seleksi vektor donor (pDONR221)
Peta marka seleksi vektor ekspresi (pDEST14)
Prediksi reaksi rekombinasi BP
Prediksi reaksi rekombinasi LR

18
19 
19 
20 
20 
21 
22 

PENDAHULUAN
Fitase merupakan enzim yang mampu mengkatalisis hidrolisis asam fitat
menjadi mio-inositol mono-, di-, tri-, tetra-, dan pentafosfat, serta fosfat organik
(Baruah et al. 2004). Asam fitat (mio-inositol heksakisfosfat) merupakan bentuk
penyimpanan fosfor pada tanaman dan merupakan salah satu faktor tumbuh bagi
tanaman. Asam fitat mampu membentuk kompleks dengan mineral-mineral
bervalensi 2 atau 3, protein, karbohidrat, dan lipid, sehingga dapat mengurangi
penyerapan dari mineral dan makromolekul tersebut. Oleh karena itu, asam fitat
dianggap sebagai zat antinutrisi pada bahan pangan (Correa et al. 2014). Selain
membebaskan fosfor, fitase juga akan membebaskan nutrien lain yang mungkin
terikat dalam kompleks fitat (Ravindran 2000), sehingga dapat mengurangi efek
antinutrisi dari asam fitat.
Fitase merupakan enzim yang penting sebagai bahan pakan aditif pada hewan
monogastrik dan agastrik seperti unggas, babi, dan ikan. Selain meningkatkan
pemanfaatan fosfor, penambahan fitase pada pakan hewan monogastrik dan
agastrik juga dapat mengurangi penambahan unsur fosfat anorganik ke dalam
pakan. Hal ini tidak hanya akan mengurangi biaya pembuatan pakan, namun juga
akan mengurangi dampak negatif dari penambahan fosfat anorganik yang dapat
menyebabkan eutrofikasi akibat konsentrasi fosfat berlebih yang diekskresikan
ternak ke lingkungan (Siregar 2010; Khemakhem et al. 2012). Eutrofikasi adalah
pencemaran air yang diakibatkan adanya nutrien yang berlebihan di dalam
ekosistem air yang biasanya ditandai dengan fenomena alga bloom.
Fitase terdistribusi secara luas dalam jaringan tanaman dan hewan, serta
ditemukan pula dalam mikroorganisme seperti fungi, ragi, dan bakteri. Berbagai
jenis fungi, ragi, dan bakteri telah dikarakterisasi untuk produksi fitase. Fitase
dapat diklasifikasikan menjadi empat macam berdasarkan struktur dan mekanisme
katalitiknya, yaitu histidine acid phosphatases (HAPs), cysteine phytases, purple
acid phosphatases (PAPs), dan β-propeller phytases (BPPs) yang dikenal juga
sebagai alkalin fitase. Sebagian besar fitase yang digunakan dalam suplementasi
pakan komersial adalah HAPs yang merupakan turunan utama dari Aspergillus
niger, Peniophora lycii, dan Escherichia coli. Ketiganya memiliki aktivitas
katalitik yang tinggi pada pH 2.5-6, namun kelompok tersebut memiliki
termostabilitas yang rendah dan spesifisitas substrat yang rendah. Di sisi lain,
fitase jenis BPPs dikarakterisasi terutama dari genus Bacillus yang saat ini
dianggap sebagai alternatif terbaik karena karakteristiknya, antara lain memiliki
termostabilitas yang tinggi, spesifisitas substrat yang tinggi, optimum pada pH
netral, dan memiliki ketahanan terhadap proteolisis (Khemakhem et al. 2012).
Bakteri Bacillus subtilis AQ1 merupakan bakteri isolat lokal koleksi BPPT
yang berasal dari endapan di dasar akuarium. Bakteri ini sebelumnya telah diteliti
dan dikarakterisasi mengenai aktivitas fitasenya oleh Satriaji (2010) dan Hasriani
(2011). Hasil keduanya menunjukkan aktivitas fitase yang masih rendah. Produksi
enzim dengan cara fermentasi dari bakteri asli memiliki banyak kelemahan, antara
lain sulit diperoleh enzim yang bersifat stabil, aktivitasnya tinggi, dan dihasilkan
dalam jumlah banyak. Solusi yang dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan
tersebut adalah perlu dilakukannya perekayasaan secara genetik terhadap bakteri
tersebut untuk mendapatkan DNA rekombinan sehingga dapat dihasilkan strain

2
bakteri yang dapat menyandikan gen penghasil enzim yang diinginkan dengan
produktivitas yang tinggi.
Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi dan menyisipkan gen penyandi
fitase pada vektor donor dan vektor ekspresi dengan teknik kloning Gateway.
Hipotesis pada penelitian ini adalah gen penyandi fitase yang terdapat pada
bakteri B. subtilis AQ1 dapat diisolasi dan disisipkan dalam vektor donor dan
vektor ekspresi sehingga dapat diperbanyak dengan teknik kloning Gateway.
Kloning Gateway memberikan cara yang cepat dengan efisiensi tinggi untuk
memindahkan sekuen DNA ke dalam berbagai sistem vektor untuk analisis dan
ekspresi protein (Hartley et al. 2000). Cara ini diharapkan mampu menghasilkan
konstruk gen penyandi fitase dengan produktivitas yang tinggi.

METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Bacillus
subtilis AQ1, pepton, NaCl, ekstrak khamir, agar, akuades, NaOH 1M, alkohol 70
%, bufer TE pH 8, larutan lisozim, larutan Tris-HCl pH 8, larutan STEP (0.5 %
SDS + 50 mM Tris-HCl pH 7.5 + 0.4 M EDTA + Proteinase K), tris bufer fenol,
sodium asetat, etanol (100 %, 70 %), ddH2O steril, bubuk agarosa, bufer TAE 1X,
loading buffer, parafilm, etidium bromide (EtBr), 10X bufer DNA polimerase, 2
mM dNTPs, primer phyaq1F dan phyaq1R, primer adapter attB1 dan attB2, DNA
polimerase, marker 1 kb plus DNA ladder, vektor donor pDONR221, BP
Clonase, vektor ekspesi pDEST14, LR Clonase, kontrol positif pEXP7-tet,
kontrol positif pENTR-gus, proteinase K, sel kompeten E. coli DH5α, sel
kompeten E.coli BL21-Star, media SOC (Super Optimal broth with Catabolite
repression), kanamisin, ampisilin, kloramfenikol, GeneJET Plasmid Extraction
Kit, amonium heptamolibdat, amonium monovanadat, asam nitrat pekat, amonium
hidroksida, bufer asetat, bufer fosfat, natrium fitat, mercaptoethanol, IPTG, dan
KH2PO4.

Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH meter, neraca
analitik (RAD WAG WAS 220/C/2), autoklaf (Iwaki), laminar air flow (ESCO
Class II BSC), shaker incubator (Kuhner), cold sentrifuse (Hitachi CR-21G),
micro sentrifuse (Eppendorf Mini Spin), pipet mikro, tips, stopwatch,
thermomixer (Eppendorf), vortex, konsentrator (Eppendorf Consentrator 5301),
microwave (Sharp), perangkat elektroforesis (BioMetra), gel documentation,
thermal cycler PCR (Bio-Rad T100 Thermal Cycler), nanodrop (BioDrop), lemari
asam, hot plate, sonikator dan peralatan gelas.

3
Metode
Perancangan Primer
Kloning penyandi gen fitase dilakukan dengan amplifikasi PCR
menggunakan dua pasang primer. Primer pertama didesain secara manual
menggunakan tiga nukleotida penyandi gen fitase dari B. subtilis subsp. subtilis
strain 168 (AL009126.3), B. subtilis phyC (AJ584664.1), dan B. subtilis strain
E20 (FJ541287.1). Koleksi sekuen terpilih disejajarkan, dilihat konsensusnya
pada situs http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de. Sebanyak 24 basa dari kodon
awal (start codon) diambil sebagai primer forward dan 20 basa sampai kodon
akhir (stop codon) diambil sebagai primer reverse yang sebelumnya dilakukan
reverse complement ke situs http://basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html.
Kualitas hasil rancangan diuji dengan program oligoanalyzer pada situs
http://sg.idtdna.com. Kedua rancangan primer ditambahkan sebagian adaptor pada
masing-masing ujung 5’.
Peremajaan Bakteri
Stok bakteri B. subtilis AQ1 diambil sebanyak 0.5 mL, ditumbuhkan dalam
10 mL media LB (Luria Bertani) cair dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC
dan agitasi 150 rpm. Satu ose bakteri yang sudah ditumbuhkan sebelumnya,
digores ke dalam media LB agar untuk mendapatkan koloni tunggal. Sebanyak
satu koloni bakteri yang sudah ditumbuhkan sebelumnya, dimasukkan ke dalam
50 mL media LB cair, diinkubasi semalam pada suhu 37 oC dan agitasi 150 rpm
untuk diisolasi genomnya.
Isolasi DNA Genom Bakteri (Sambrook & Russel 2001)
Isolasi DNA genom bakteri dilakukan dengan metode modifikasi dari
metode Sambrook & Russel (2001). Sebanyak 50 mL kultur bakteri yang telah
ditumbuhkan selama semalam dalam media LB cair dipindahkan ke tabung falcon
50 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Setelah
itu supernatan dibuang, lalu pelet diresuspensi dengan 2.5 mL TE kemudian
dibekukan pada suhu -80 ºC. Sebanyak 0.25 mL larutan lisozim segar 10 mg/mL
yang dibuat dalam 0.25 M Tris-HCl pH 8.0 ditambahkan pada sel yang beku dan
dicairkan pada suhu ruang dengan diaduk. Setelah mencair, kemudian diinkubasi
dalam es selama 45 menit. Sebanyak 0.5 mL larutan STEP (0.5 % SDS + 50 mM
Tris HCl pH 7.5 + 0.4 M EDTA + Proteinase K) ditambahkan ke dalam sampel
dan dihomogenkan, kemudian dipanaskan pada suhu 50 ºC selama 1 jam dengan
sesekali dikocok perlahan. Sampel ditambahkan 3 mL bufer Tris fenol, dicampur
perlahan selama 5 menit tanpa divortex. Sampel disentrifugasi pada kecepatan
3000 rpm selama 15 menit sehingga membentuk tiga lapisan. Lapisan yang paling
atas dipindahkan ke dalam tabung baru yang steril, kemudian ditambahkan 3 M
Na-asetat sebanyak 0.1 dari volume, dan dicampur perlahan tanpa divortex.
Larutan kemudian ditambahkan etanol 2 kali dari volume dan dibolak balik,
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 20 menit. Supernatan
dibuang, pelet dicuci dengan etanol 70 %, dikocok perlahan, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang,
DNA dikeringkan menggunakan konsentrator selama 15 menit, kemudian
diresuspensi dengan ddH2O steril. DNA disimpan pada suhu -20 ºC.

4
Elektroforesis Gel Agarose (Sambrook & Russel 2001)
Pembuatan Gel Agarose 1 %. Sebanyak 0.25 gram agarose ditambah
dengan 25 mL TAE 1X, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut dengan
sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian dituang ke dalam
cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan sampai
gel tersebut benar-benar mengeras. Gel yang telah mengeras kemudian
dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1X.
Elektroforesis Gel Agarose. Sebanyak 1 L sampel DNA dicampurkan
dengan 1 L loading dye di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet
kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah elektroforesis
selesai, gel dicuci dengan ddH2O kemudian direndam dengan EtBr selama 10
menit, gel dicuci lagi dengan ddH2O, kemudian dilihat pita DNAnya dengan
bantuan sinar ultraviolet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan
dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation). Perangkat dokumentasi
gel adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal tempat penyinaran sinar UV
yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera digital tersebut terpasang pada
komputer atau laptop yang sudah terdapat software yang dapat menyimpan
fotografi dari hasil elektroforeis.
Amplifikasi Gen Penyandi Fitase (Savitri et al. 2013)
Amplifikasi gen penyandi fitase dilakukan dengan PCR menggunakan dua
set primer. Primer pertama adalah pasangan primer phyaq1F dan phyaq1R dan
primer kedua adalah pasangan primer adapter attB1 dan attB2. Komposisi reaksi
PCR pertama adalah 1 L 10x bufer KOD polimerase, 0.64 L MgSO4 25 mM, 1
L dNTP 2 mM, 1 L campuran primer phyaq1F dan phyaq1R 2 mM, 1 L
genom B. subtilis AQ1, 5.16 L ddH2O, 0.2 L KOD polimerase. Program PCR
diatur dengan kondisi denaturasi awal 94 ºC selama 2 menit, denaturasi 94 ºC
selama 15 detik, annealing 65 ºC selama 30 detik dan extension 68 ºC selama 1
menit 40 detik sebanyak 3 siklus, kemudian 3 siklus berikutnya dengan kondisi 94
ºC selama 15 detik dan 68 ºC selama 1 menit 40 detik.
Komposisi reaksi PCR kedua adalah 1 L 10x bufer KOD polimerase, 0.56
L MgSO4 25 mM, 1 L dNTP 2 mM, 1 L campuran primer attB1 dan attB2 4
mM, 1 L hasil PCR pertama, 4.24 L ddH2O, 0.2 KOD polimerase. Program
PCR diatur dengan kondisi denaturasi awal 94 ºC selama 2 menit, denaturasi 94
ºC selama 15 detik, annealing 58 ºC selama 30 detik dan extension 68 ºC selama 1
menit 40 detik sebanyak 5 siklus, kemudian 25 siklus berikutnya dengan kondisi
94 ºC selama 15 detik dan 68 ºC selama 1 menit 40 detik. Hasil PCR kemudian
dielektroforesis menggunakan gel agarose 1 %. Produk yang didapat diberi kode
attB-phyaq1.
Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Donor pDONR221 (Reaksi BP)
(Invitrogen 2003)
Reaksi rekombinasi BP dilakukan dengan membuat campuran reaksi yang
terdiri atas 1 L attB-phyaq1, 0.5 L vektor donor pDONR221, 3 L bufer TE,
dan 1 L campuran BP Clonase. Setelah itu campuran divortex dan diinkubasi
pada suhu 25 ºC selama 1 jam. Sebanyak 0.5 L larutan proteinase K dimasukkan
ke dalam campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit. Hasil
rekombinasi diberi kode pENTR-phyaq1 dan kemudian ditransformasikan ke

5
dalam sel kompeten E.coli DH5α. Beberapa koloni hasil transformasi yang telah
tumbuh diduplikasi dan ditumbuhkan ke dalam media LB agar yang telah
mengandung 15 g/mL kloramfenikol. Hal ini dilakukan untuk mengkonfirmasi
keberadaan gen yang disisipkan (insert) di dalam plasmid.
Transformasi ke E.coli DH5α (Sambrook & Russel 2001)
Transformasi diawali dengan penambahan hasil reaksi BP (pENTR-phyaq1)
sebanyak 1 L ke dalam tabung yang berisi 50 L sel kompeten E. coli DH5α,
kemudian dihomogenkan dan diinkubasi di es selama 30 menit. Selanjutnya
dilakukan perlakuan kejut panas (heat shock) pada suhu 42 ºC selama 1 menit,
dan diinkubasi kembali di dalam es selama 2 menit. Sebanyak 250 L media SOC
ditambahkan ke dalam tabung kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada
suhu 37 ºC selama 1 jam dengan agitasi 150 rpm. Sebanyak 100 L dari biakan
hasil inkubasi disebarkan pada media LB agar yang mengandung 50 g/mL
kanamisin dan diinkubasi semalam pada suhu 37 ºC. Kemudian dipilih satu koloni
tunggal hasil transformasi dan ditumbuhkan pada media LB cair yang
mengandung 50 g/mL kanamisin selama semalam untuk diekstrak plasmidnya.
Ekstraksi Plasmid Rekombinan (Kit Thermo Scientific)
Ekstraksi plasmid dilakukan dengan menggunakan GeneJET Plasmid
Extraction Kit. Koloni transforman yang diduga positif mengandung gen penyandi
fitase ditumbuhkan dalam 5 mL media cair LB-kanamisin. Sebanyak 5 mL kultur
E. coli tersebut disentrifugasi pada 6000 rpm selama 5 menit pada suhu kamar.
Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensi dengan 250 L resuspension
solution yang sudah ditambah dengan RNAse A dan dimasukkan ke dalam tabung
mikro. Sebanyak 250 L lysis solution ditambahkan ke dalam campuran dan
tabung dibolak-balikkan sebanyak 4 - 6 kali diikuti dengan penambahan 350 L
neutralization solution dan tabung dibolak-balikkan sebanyak 4 - 6 kali. Setelah
itu campuran disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit, kemudian
supernatan dipindahkan ke dalam kolom GeneJET dan disentrifugasi selama 1
menit pada kecepatan 14000 rpm lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 500 L
wash solution ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi selama 1 menit
dengan kecepatan 14000 rpm lalu supernatan dibuang. Kolom dicuci kembali
dengan 500 L wash solution, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm
selama 1 menit dan supernatan dibuang diikuti dengan sentrifugasi lebih lanjut
selama 1 menit untuk memisahkan sisa wash solution. Setelah itu kolom GeneJET
dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan 50 L elution buffer
kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu kamar dan diikuti dengan
sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 14000 rpm. Supernatan yang didapat
merupakan plasmid yang dimurnikan.
Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Ekspresi pDEST14 (Reaksi LR)
(Invitrogen 2003)
Reaksi rekombinasi LR dilakukan dengan membuat campuran reaksi yang
terdiri atas 1 L entry clone pENTR-phyaq1, 0.5 L vektor ekspresi pDEST14, 3
L bufer TE, dan 1 L campuran LR Clonase. Setelah itu campuran divortex dan
diinkubasi pada suhu 25 ºC selama 1 jam. Sebanyak 0.5 L larutan proteinase K
dimasukkan ke dalam campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10

6
menit. Hasil rekombinasi kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E.
coli DH5α. Satu koloni yang yang tumbuh kemudian diambil dan ditumbuhkan ke
dalam media LB cair yang mengandung 100 g/mL ampisilin selama semalam
untuk diekstrak plasmidnya. Ekstraksi plasmid dilakukan menggunakan GeneJET
Plasmid Extraction Kit. Plasmid murni yang telah diekstrak diberi kode pEXPphyaq1. Plasmid ini kemudian ditansformasikan ke dalam sel kompeten E.coli
BL21-Star dengan metode kejut panas (heat shock). Koloni yang tumbuh akan
dijadikan isolat untuk produksi enzim fitase rekombinan.
Produksi dan Pemanenan Enzim (Setiawan 2014)
Satu koloni E. coli BL21-Star rekombinan diinokulasikan ke dalam 5 mL
media LB cair yang mengandung 100 g/mL ampisilin, kemudian diinkubasi pada
suhu 37 ºC hingga nilai OD600 mencapai 0.8. Sebanyak 2.5 mL kultur dimasukkan
ke dalam 25 mL media produksi yang mengandung 100 g/mL ampisilin dan 1
mM IPTG. Media kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC dengan agitasi 150 rpm
dan diambil sampel pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24. Kultur yang sudah diambil
kemudian disentrifugasi dalam keadaan dingin pada kecepatan 6000 rpm selama
15 menit. Supernatan dipisahkan dari pelet secara steril, dan peletnya dipakai
untuk uji aktivitas fitase. Pelet yang sudah didapat, ditambahkan campuran bufer
natrium fosfat 20 mM pH 7 dan 2-mercaptoethanol 1 mM sebanyak 1/10 dari
volume kultur. Pelet yang telah diresuspen dengan bufer kemudian disonikasi
selama 5 menit dalam keadaan dingin. Sonikasi ini bertujuan memecah dinding
sel dan mengeluarkan protein rekombinan yang terdapat di dalam sel. Pelet hasil
sonikasi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 ºC. Supernatan yang didapatkan kemudian diukur aktivitas fitasenya.
Uji Aktivitas Fitase (Sajidan 2002)
Pengujian aktivitas fitase dilakukan berdasarkan metode Sajidan (2002)
yang telah dimodifikasi. Sebanyak 50 L enzim rekombinan ditambahkan 150 L
larutan substrat natrium fitat, kemudian diinkubasi dalam thermomixer pada suhu
37 ºC selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan STOP untuk
menghentikan reaksinya. Larutan STOP terdiri atas campuran amonium
heptamolibdat, amonium monovanadat, HNO3 70 %, dan H2O dengan
perbandingan 1.5:1.5:1:2. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ºC. Larutan kemudian diencerkan 10 kali
dan diukur serapannya pada panjang gelombang ( ) 415 nm. Satu unit fitase
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 mol
fosfat dari asam fitat per menit. Aktivitas enzim dinyatakan dalam U/mL, yang
merupakan mol fosfat yang dilepaskan per menit per mL enzim (Widowati et al.
2001).

7

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Primer Spesifik Gen Phy
Primer spesifik gen phy didesain secara manual untuk mengisolasi gen fitase
dari DNA genom hasil isolasi dari B. subtilis AQ1. Primer forward terdiri atas 24
basa dengan Tm 70.3 ºC dan primer reverse terdiri atas 20 basa dengan Tm 71.5
ºC. Masing-masing ujung 5’ dari primer tersebut ditambahkan adaptor (diberi
garis bawah). Primer yang berhasil didesain ditampilkan dalam Tabel 1.
Tabel 1 Urutan primer gen phy
Phyaq1-F
Phyaq1-R

Sekuen
Tm
5’-AAA AAG CAG GCT CGA TGA AKS WTY CAA 70.3 ºC
AAA CAM TKY TG-3’
5’-AGA AAG CTG GGT ATC AGY TTY CTC GGR 71.5 ºC
TYW ACC-3’

Simbol K, S, W, Y, M, R dalam primer tersebut adalah simbol untuk primer
degenerate.
DNA Genom Bacillus subtilis AQ1 Hasil Isolasi
Hasil elektroforesis gel agarose 1 % menunjukkan fragmen DNA hasil
isolasi dari B. subtilis AQ1 berada di bagian atas dan berukuran lebih dari 10000
pb (Gambar 1). Fragmen DNA yang dihasilkan menunjukkan bahwa DNA yang
diisolasi merupakan DNA genom yang berukuran besar dan tidak terfragmentasi.

M 1
10000 pb

>10000 pb
DNA genom

Gambar 1 Elektroforegram DNA genom B. subtilis AQ1. (M) marker 1 kb DNA
ladder, (1) DNA genom
Gen Penyandi Fitase Hasil Amplifikasi
Gen penyandi fitase diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom B. subtilis
AQ1. Amplifikasi dilakukan dengan primer phyaq1 yang telah didesain
sebelumnya dan primer adapter attB. Berdasarkan hasil elektroforesis gel agarose

8
1 %, pita DNA yang diduga merupakan produk PCR attB-phyaq1 yang berhasil
teramplifikasi memiliki ukuran sekitar 1200 pb (Gambar 2).

M

1

1500 pb
1000 pb

±1200 pb
Amplikon gen phy

Gambar 2 Elektroforegram produk PCR attB-phyaq1. (M) marker 1 kb DNA
ladder, (1) amplikon gen phy
Produk Entry Clone pENTR-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi BP
Produk PCR attB-phyaq1 direkombinasi dengan vektor donor pDONR221
dengan bantuan campuran BP Clonase untuk menghasilkan entry clone pENTRphyaq1. Hasil transformasi entry clone pENTR-phyaq1 ke dalam sel E. coli DH5α
tumbuh pada media LB agar yang mengandung kanamisin (Gambar 3A). Semua
koloni yang ditumbuhkan pada media yang mengandung kloramfenikol tidak
tumbuh (Gambar 3B), hal tersebut menyatakan bahwa telah terjadi rekombinasi
antara situs attB pada produk PCR dengan situs attP pada vektor donor
pDONR221.
A

B

Gambar 3 Produk entry clone pENTR-phyaq1 (A) Hasil transformasi pENTRphyaq1, (B) Hasil konfirmasi pENTR-phyaq1 pada media yang
mengandung kloramfenikol
Hasil Ekstraksi Plasmid pENTR-phyaq1
Koloni yang diduga positif mengandung entry clone pENTR-phyaq1
kemudian ditumbuhkan pada media cair yang telah mengandung ampisilin untuk
diekstrak plasmidnya, dan didapatkan plasmid dengan ukuran sekitar 3700 pb
(Gambar 4).

9

M

1

4000 pb
3500 pb

±3700 pb
Plasmid pENTR-phyaq1

Gambar 4 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pENTR-phyaq1. (M) marker 1
kb DNA ladder, (1) DNA plasmid yang mengandung gen phy
Produk Expression Clone pEXP-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi LR
Expression clone dibuat dengan cara merekombinasikan entry clone
pENTR-phyaq1 ke dalam vektor ekspresi pDEST14. Hasil transformasi
expression clone pEXP-phyaq1 ke dalam sel E. coli DH5α tumbuh pada media
LB agar yang mengandung ampisilin (Gambar 5). Koloni yang tumbuh
merupakan koloni yang diduga membawa ekspresi gen penyandi fitase.

Gambar 5 Hasil transformasi pEXP-phyaq1
Hasil Ekstraksi Plasmid pEXP-phyaq1
Koloni yang diduga positif membawa ekspresi gen penyandi fitase
kemudian ditumbuhkan ke dalam media LB yang mengandung 100 g/mL
ampisilin untuk diekstrak plasmidnya, dan didapatkan plasmid dengan ukuran
sekitar 5800 pb (Gambar 6).

10

M 1

2

6000 pb
±5800 pb
Plasmid pEXP-phyaq1

5000 pb

Gambar 6 Elektroforegram hasil ekstraksi plasmid pEXP-phyaq1. (M) marker 1
kb DNA ladder, (1-2) DNA plasmid yang mengandung gen phy
Aktivitas Fitase
Ekspresi plasmid pEXP-phyaq1 dibuktikan dengan pengukuran uji aktivitas.
Satu unit fitase dapat didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
melepaskan 1 mol fosfat dari asam fitat per menit. Hasil uji aktivitas fitase
ditampilkan dalam Tabel 2.
Tabel 2 Hasil pengukuran aktivitas fitase
Sampel
Jam ke-6
Jam ke-12
Jam ke-24

Aktivitas (U/mL)
1.989
2.988
3.331

Pembahasan
Primer Spesifik Gen Phy
Primer merupakan oligonukleotida yang umumnya berukuran 20-30 basa
yang berfungsi mengawali proses pembentukan utas DNA. Desain primer yang
tepat merupakan salah satu faktor terpenting yang menentukan keberhasilan
amplifikasi DNA. Desain primer dilakukan sebelum isolasi dan amplifikasi.
Primer spesifik gen phy dirancang secara manual. Primer forward terdiri atas 24
basa dan primer reverse terdiri atas 20 basa yang sudah dilakukan reverse
complement terlebih dahulu yang masing-masing ujung 5’ nya telah ditambahkan
sebagian adaptor (Tabel 1) agar dapat melekat pada primer adapter attB1 dan
attB2 saat proses amplifikasi. Simbol K, S, W, Y, M, R dalam primer spesifik gen
phy (Tabel 1) adalah simbol untuk primer degenerate.
Sekuen attB1 dengan arah sekuen dari 5’ ke 3’ adalah G GGG ACA AGT
TTG TAC AAA AAA GCA GGC T, sedangkan sekuen attB2 dari arah sekuen 5’
ke 3’ adalah GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT. Situs attB
ini akan mengarahkan gen pada saat amplifikasi sehingga arah penempelan primer
akan benar. Sekuen GGGG pada situs attB berfungsi untuk efisiensi saat

11
amplifikasi gen agar primer dapat melekat kuat pada gen target. Kedua pasang
primer juga berfungsi untuk membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi.
Segmen yang diamplifikasi dalam PCR adalah daerah yang berada di antara kedua
primer termasuk daerah tempat primer tersebut menempel (Saraswati 2010).
DNA Genom Bacillus subtilis AQ1 Hasil Isolasi
Isolasi DNA genom dilakukan untuk mendapatkan genom bakteri Bacillus
subtilis AQ1 yang akan dijadikan sebagai DNA cetakan dalam proses amplifikasi
gen fitase. Isolasi DNA genom dari B. subtilis AQ1 diawali dengan
menumbuhkan satu koloni tunggal ke dalam media LB cair selama 14 jam pada
suhu 37 ºC dan agitasi 120 rpm. Media LB adalah media kompleks yang terdiri
atas pepton, ekstrak khamir, dan NaCl. Pepton menyediakan sumber asam amino
dan peptida, sedangkan ekstrak khamir menyediakan kebutuhan nitrogen, gula,
dan nutrien organik serta anorganik bagi bakteri. Agitasi berfungsi untuk
meratakan nutrisi dan oksigen yang diperlukan dalam pertumbuhan bakteri.
Pemanenan kultur bakteri dilakukan dengan teknik sentrifugasi untuk
memisahkan sel bakteri dari media pertumbuhannya (Brown 2010).
Isolasi DNA genom dilakukan secara kimiawi dengan senyawa yang dapat
merusak dinding sel dan membran sel karena sel bakteri tertutup dalam membran
sitoplasma dan dinding sel yang kuat. Penambahan larutan lisozim pada tahapan
isolasi berfungsi memotong peptidoglikan yang merupakan komponen utama dari
dinding sel. Selain lisozim, ditambahkan juga larutan STEP yang merupakan
campuran dari SDS, Tris-HCl, EDTA, dan Proteinase K. Molekul lipid penyusun
dinding sel dihilangkan dengan penambahan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).
EDTA berfungsi sebagai agen pengkelat ion magnesium yang penting untuk
mempertahankan struktur selubung sel dan menghambat enzim-enzim selular
yang dapat merusak DNA (Clark & Pazdernik 2009; Brown 2010).
Selain DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA yang
merupakan kontaminan yang harus dihilangkan untuk mendapatkan DNA yang
murni. Protein dihilangkan dengan penambahan fenol. Sebelum diendapkan
dengan fenol, terlebih dahulu ditambahkan proteinase K untuk memecah
polipeptida menjadi unit yang lebih kecil sehingga lebih mudah dihilangkan
dengan fenol. Setelah disentrifugasi, larutan akan membentuk tiga lapisan. DNA
akan berada pada lapisan paling atas yang berwarna bening, lapisan tengah adalah
protein, dan lapisan paling bawah adalah fenol, karena fenol tidak larut air.
Beberapa molekul RNA akan hilang dengan pemberian fenol (Brown 2010). Uji
kuantitas DNA murni yang dihasilkan dilakukan dengan spektrofotometer
nanodrop, sedangkan uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis gel
agarosa 1 %. Hasil elektroforesis gel agarose memperlihatkan ukuran DNA
genom hasil isolasi diatas 10.000 pb (Gambar 1).
Gen Penyandi Fitase Hasil Amplifikasi
Amplifikasi gen penyandi fitase dengan teknik PCR (Polimerase Chain
Reaction) dilakukan untuk menggandakan gen tersebut secara in vitro.
Amplifikasi ini dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer, yaitu primer
spesifik gen phy (phyaq1) yang telah ditambahkan sebagian adaptor pada masingmasing ujung 5’ dan primer adapter Gateway. Reaksi PCR dilakukan sebanyak
dua kali. Reaksi PCR pertama menggunakan pasangan primer phyaq1 sebanyak

12
tiga siklus dengan DNA genom hasil ekstraksi sebagai DNA cetakan. Hasil reaksi
PCR pertama ini dijadikan DNA cetakan untuk reaksi PCR kedua menggunakan
pasangan primer attB untuk mendapatkan produk attB-phyaq1.
Etidium bromide (EtBr) yang digunakan untuk merendam gel agarosa
setelah elektroforesis akan membentuk kompleks dengan utas DNA sehingga
DNA akan berfluoresensi dan dapat dilihat di bawah sinar UV dengan panjang
gelombang 254 nm atau 366 nm (Sambrook & Russel 2001). Pita DNA yang
diduga merupakan amplikon dari gen penyandi fitase berukuran sekitar 1200 pb
(Gambar 2). Hasil ini menunjukkan bahwa perancangan primer yang dilakukan
sudah benar karena terdapat hasil amplifikasinya dan ukuran ampikon juga sesuai
dengan prediksi. Selanjutnya produk PCR ini diberikan kode attB-phyaq1.
Produk Entry Clone pENTR-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi BP
Produk PCR attB-phyaq1 selanjutnya disisipkan ke dalam vektor donor
pDONR221 dengan reaksi BP. Proses rekombinasi gen fitase dengan vektor donor
ini dikatalisis oleh campuran BP Clonase yang terdiri atas lamda bakteriofage
Integrase (Int) dan protein IHF (integration host factor) (Karimi et al. 2007). Gen
fitase memiliki situs attB1 dan attB2 yang ditambahkan pada saat proses
amplifikasi, sedangkan vektor donor pDONR221 memiliki situs attP1 dan attP2
yang merupakan tempat untuk rekombinasi dengan situs attB1 dan attB2. Adanya
situs rekombinasi ini menyebabkan tidak adanya kemungkinan kesalahan orientasi
gen saat proses rekombinasi berlangsung. BP Clonase bekerja optimum pada suhu
25 ºC selama satu jam, kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan
proteinase K. Enzim ini akan memecah enzim dan protein yang ada dalam
campuran BP Clonase. Setelah proses rekombinasi yang mempertemukan dua
situs attB dan attP, gen fitase akan menyisip ke ke dalam vektor donor, yang
menghasilkan entry clone pENTR-phyaq1 yang mengandung situs attL.
Entry clone pENTR-phyaq1 hasil reaksi rekombinasi BP kemudian
ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5α dengan metode kejut
panas (heat shock). Prinsip utama metode ini adalah adanya lonjakan suhu dari 0
ºC menjadi 42 ºC yang menyebabkan membran sel kompeten menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing sehingga memudahkan plasmid rekombinan
masuk ke dalam sel inang (Tarigan 2008). Sel kemudian dikultur ke dalam media
SOC selama satu jam dengan agitasi 150 rpm dan suhu 37 ºC untuk
memperbanyak jumlah sel. Setelah itu sel disebar pada media LB agar yang telah
mengandung antibiotik kanamisin 50 g/mL. Hasil rekombinasi terseleksi dengan
adanya gen resisten kanamisin dan gen ccdB (seleksi negatif) yang terdapat dalam
vektor donor pDONR221, yang akan menghambat pertumbuhan sel inang
(Magnani et al. 2006). Gen ccdB adalah sebuah gen yang mengkode protein yang
bertanggungjawab atas kematian sel E. coli sehingga menghambat pertumbuhan
sel inang E. coli DH5α. Target dari gen ccdB adalah DNA girase. DNA girase
dikenal juga sebagai topoisomerase II yang dapat menyebabkan terbentuknya
konformasi pilinan negatif. Enzim ini menghilangkan pilinan positif di depan
garpu replikasi dan memastikan keberlangsungan proses repliksi (Jonge et al.
2009). Saat proses rekombinasi berlangsung, gen ccdB akan bertukar dengan gen
target, sehingga sel inang yang dimasuki vektor yang tidak tersisipi gen target
akan mati karena terekspresinya protein ccdB. Sel inang yang tidak dimasuki
vektor juga akan mati karena adanya antibiotik pada media tumbuh, sedangkan sel

13
inang yang dimasuki entry clone akan tumbuh karena memiliki gen resisten
antibiotik kanamisin dan tersisipi gen target.
Beberapa koloni hasil transformasi yang tumbuh kemudian diambil dan
ditumbuhkan ke dalam media LB agar yang telah mengandung 15 g/mL
kloramfenikol untuk memastikan gen target telah masuk ke dalam vektor. Selain
memiliki gen ccdB, daerah rekombinasi vektor donor pDONR221 juga memiliki
gen resisten terhadap kloramfenikol. Jika telah terjadi rekombinasi, gen resisten
kloramfenikol ini akan bertukar tempat dengan gen target, sehingga sel inang
yang telah dimasuki entry clone tidak akan tumbuh jika ditumbuhkan dalam
media yang mengandung antibiotik kloramfenikol. Koloni pENTR-phyaq1
kemudian diambil dan ditumbuhkan dalam media LB cair yang telah mengandung
50 g/mL kanamisin untuk ekstraksi plasmid dan didapatkan plasmid dengan
ukuran sekitar 3700 pb (Gambar 4) sesuai dengan prediksi (Lampiran 6). Plasmid
pENTR-phyaq1 ini yang akan direkombinasikan dengan vektor ekspresi
pDEST14 untuk menghasilkan expression clone.
Produk Expression Clone pEXP-phyaq1 dengan Reaksi Rekombinasi LR
Entry clone pENTR-phyaq1 hasil reaksi BP merupakan substrat kunci reaksi
LR untuk menghasilkan expression clone. Reaksi rekombinasi LR dikatalisis oleh
campuran LR Clonase yang terdiri atas lamda bakteriofage Integrase (Int), protein
Excisionase (Xis), dan protein IHF (integration host factor) (Karimi et al. 2007).
Enzim ini akan membantu proses rekombinasi antara situs attL1 dan attL2 pada
entry clone dengan situs attR1 dan attR2 yang terdapat pada vektor ekspresi
pDEST14. Proses rekombinasi ini menghasilkan expression clone pEXP-phyaq1
yang membawa gen resisten ampisilin dan produk samping pDONR221 yang
membawa gen resisten kanamisin dan gen ccdB (Invitrogen 2003).
Hasil rekombinasi ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α dengan metode
heat shock (kejut panas). Seleksi transforman pada tahap ini juga dilakukan
dengan gen ccdB dan antibiotik. Transforman ditumbuhkan pada media LB padat
yang mengandung 100 g/mL ampisilin. Koloni yang tumbuh merupakan E. coli
pEXP-phyaq1. Satu koloni E. coli pEXP-phyaq1 diambil dan ditumbuhkan pada
media LB cair yang telah mengandung 100 g/mL ampisilin untuk ekstraksi
plasmid. Plasmid yang berhasil diekstrak berukuran sekitar 5800 pb (Gambar 6)
sesuai dengan prediksi (Lampiran 7). Plasmid pEXP-phyaq1 kemudian
ditransformasi lagi ke dalam sel kompeten E. coli BL21-Star. Transformasi ke
dalam E. coli BL21-Star ini ditujukan melihat ekspresi gen penyandi fitase yang
telah dikloning. Sel E. coli BL21-Star diketahui tidak mengandung lon protease
dan mengalami defisiensi pada bagian outer membrane protease (ompT).
Defisiensi tersebut dapat mengurangi terjadinya degradasi protein rekombinan
yang diekspresikan di dalam sel inang sehingga dapat menghasilkan protein
rekombinan dalam jumlah banyak.
Ekspresi Fitase Rekombinan
Produksi enzim dilakukan dalam media produksi yang mengandung pepton,
ekstrak khamir, dan NaCl. Bahan-bahan tersebut menyediakan nutrisi bagi
pertumbuhan bakteri seperti sumber karbon dan sumber nitrogen. Sumber karbon
diperlukan untuk menyediakan kebutuhan energi bagi pertumbuhan bakteri,
sedangkan sumber nitrogen berfungsi untuk menyediakan protein dan asam amino

14
bagi pertumbuhan bakteri (Riadi 2007). Produksi enzim dilakukan pada suhu 37
ºC dengan agitasi 150 rpm selama 24 jam. Agitasi ini diperlukan untuk meratakan
nutrisi dan oksigen dalam media produksi sehingga membentuk suspensi enzim
yang seragam. Selain itu, dalam media produksi juga ditambahkan ampisilin dan
isopropil tiogalaktosida (IPTG). Penambahan ampisilin dilakukan karena vektor
ekspresi yang digunakan (pDEST14) memiliki marka seleksi resisten terhadap
antibiotik tersebut, sedangkan IPTG yang ditambahkan ke dalam media produksi
berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen.
Ekspresi gen merupakan proses transkripsi DNA menjadi RNA yang
selanjutnya menjadi polipeptida spesifik (Madigan et al. 2009). Pengaturan
ekspresi gen pada sel prokariot dinamakan konsep operon. Sistem ekspresi yang
dibawa plasmid pDEST14 menggunakan regulasi T7 promotor. Promotor adalah
sekuen DNA spesifik yang dapat dikenali oleh RNA polimerase sehingga proses
transkripsi dapat berjalan. Salah satu konsep operon yang digunakan untuk
mengekspresikan gen asing sehingga dapat mengekspresikan suatu protein
rekombinan adalah sistem operon lac (operon laktosa). Ekspresi gen phy dalam
E.coli BL21-Star dilakukan melalui induksi isopropil tiogalaktosida (IPTG) yang
merupakan senyawa dengan struktur mirip laktosa dan berfungsi sebagai
penginduksi ekspresi gen di bawah kontrol promotor lac. Proses yang terjadi
ketika IPTG ditambahkan ke dalam media adalah terjadinya ikatan antara IPTG
dengan lac represor. Ikatan tersebut mencegah lac represor menekan transkripsi
T7 RNA polimerase. Keberadaan T7 RNA polimerase ini menyebabkan gen target
dapat ditranskripsikan yang selanjutnya akan ditranslasi menjadi protein yang
diinginkan. Apabila tidak terdapat IPTG, lacI promoter akan menghasilkan lac
represor yang dihasilkan oleh gen lacI yang akan menekan sintesis T7 RNA
polimerase. Tidak adanya T7 RNA polimerase ini menyebabkan ekspresi gen
target yang transkripsinya di bawah kontrol promotor T7 tidak akan terbentuk
(Fairbanks & Andersen 1999; Glick et al. 2010).
Pemanenan enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Supernatan
dipisahkan dari peletnya, kemudian pelet diresuspensi dengan campuran bufer
fosfat dan mercaptoethanol. Pengeluaran enzim rekombinan dilakukan dengan
cara memecahkan dinding sel bakteri secara mekanik dengan sonikator selama 5
menit. Sonikasi merupakan metode pemecahan sel dengan menggunakan
gelombang suara frekuensi tinggi untuk menghancurkan sel. Di dalam sonikator
terdapat vibrating probe yang dapat menghasilkan gelombang suara. Gelombang
suara dihantarkan melalui vibrating probe yang dapat dibenamkan ke dalam
suspensi sel. Energi mekanik dari probe tersebut akan menginisiasi terbentuknya
gelembung uap air mikroskopik sementara dan kemudian pecah. Hal tersebut
menyebabkan terjadinya kejutan gelombang (waves shocks) yang memancar
melewati sel pada seluruh sampel sehingga menyebabkan sel lisis. Selama proses
sonikasi, suspensi sel harus diletakkan dalam wadah berisi es untuk mencegah
kelebihan panas, karena suhu tinggi dapat mendenaturasi sebagian besar enzim
(Thermo scientific 2009; Bintang 2010).
Pengukuran aktivitas fitase dilakukan berdasarkan metode Sajidan (2002)
yang telah dimodifikasi. Reaksi berlangsung selama 30 menit pada suhu 37 ºC.
Reaksi dihentikan dengan penambahan larutan STOP yang terdiri atas campuran
amonium heptamolibdat, amonium monovanadat, asam nitrat, dan akuades.
Produk fosfat yang terbentuk dari hasil reaksi antara fitase dan substrat natrium

15
fitat akan berikatan dengan asam molibdat dan asam vanadat sehingga terbentuk
kompleks asam vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange. Warna yang
terbentuk diukur serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 415 nm. Absorban tersebut selanjutnya harus dikonversi ke dalam
kurva standar fosfat untuk mengetahui konsentrasi produk hasil reaksi enzim.
Ekspresi fitase rekombinan pada E. coli BL21-Star dapat dilihat dari hasil
uji aktivitas yang dilakukan pada jam ke-6, ke-12, dan ke-24 selama masa
produksi. Aktivitas fitase yang terukur pada jam tersebut masing-masing adalah
1.989 U/mL, 2.988 U/mL, dan 3.331 U/mL. Hasil tersebut menunjukkan bahwa
gen penyandi fitase yang diisolasi dari B. subtilis AQ1 dan dikloning dengan
teknik kloning Gateway sudah dapat terekspresi pada E. coli BL21-Star.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen penyandi fitase yang diisolasi dari bakteri Bacillus subtilis AQ1
berukuran 1200 pb dan telah berhasil disisipkan ke dalam vektor donor dan vektor
ekspresi dengan teknologi Gateway. Hal tersebut dibuktikan dengan
terekspresinya gen fitase dalam E. coli BL21-Star yang ditandai dengan adanya
aktivitas fitase dalam mendegradasi substrat natrium fitat pada jam ke-6, ke-12,
dan ke-24 yang masing-masing memiliki aktivitas sebesar 1.989 U/mL, 2.988
U/mL, dan 3.331 U/mL.

Saran
Diperlukan analisis lanjutan seperti karakterisasi dan purifikasi enzim
rekombinan yang telah dihasilkan serta optimasi agar dapat menghasilkan enzim
dengan produktivitas yang maksimal.

DAFTAR PUSTAKA
Baruah K, Sahu NP, Pal AK, Debnath D. 2004. Dietary phytase: an ideal
approach for a cost effective and low-polluting aqua feed. NAGA. 27 (3&4):
15-19.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.
Brown T A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6th ed. John
West Sussex: Wiley & Sons Ltd.
Clark DP, Pazdernik NJ. 2009. Biotechnology: Applying the Genetic Revolution.
Elsevier Academic Pr.

16
Correa TLR, Queiroz MV, Araujo EF. 2014. Cloning, recombinant expressio, and
characterization of a new phytase from Penicillium chrysogenum.
Microbiological Research. doi: 10.1016/j.micres.2014.06.005.
Fairbanks DJ, Andersen WR. 1999. Genetics: The continuity of life. Toronto: Cole
Publishing Company.
Glick BR, Pasternak JJ, Patten CL. 2010. Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Pr.
Hartley JL, Temple GF, and Brasch MA. 2000. DNA Cloning Using in vitro SiteSpecific Recombination. Genome Research 10: 1788-1795.
Hasriani F. 2011. Pemurnian dan karakterisasi fitase dari Bacillus subtilis AQ1
[skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Negeri Jakarta.
Invitrogen. 2003. Gateway® Technology: a universal technology to clone DNA
sequences for functional analysis and expression in multiple system. California:
Life Technologies.
Jonge ND, Pino AG, Buts L, Haesaerts S, Charlier D, Zangger K, Wyns L, Greve
HD, Loris R. 2009. Rejuvenation of CcdB-Poisined Gyrase by an Intrinsically
Disordered Protein Domain. J.Molecular Cell 35: 154-163.
Karimi et al. 2007. Recombinational cloning with plant Gateway vectors. Plant
Physiology. 145: 1144-1154.
Khemakhem AF, Ali MB, Boukhris I, Khemakhem B, Maguin E, Bejar S,
Chouayekh H. 2012. Crucial role of pro 257 in the thermostability of Bacillus
phytases: Biochemical and srtuctural investigation. International Journal of
Biological Macromolecules. 54: 9-15. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.11.020.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock: Biology of
microorganism. San Francisco: Pearson Benjamin Cummungs publishing Inc.
Ravindran V. 2000. Effect of Natuphos Phytase on the bioavailability of protein
and amino acids. Palmerston: Massey University.
Riadi, L. 2007. Teknologi Fermentasi. Yogyakarta : Graha Ilmu.
Sajidan. 2002. Molekulare Characterisierung einer Phytase (Myo-inositol
Hexakifosfate Hydrolase) und von Fosfatasen aus Bakterieisolaten
Indoneschicher Reisfelder (Klebsiella pneumoniae) [Dissertation]. Deutschland
(GE): Humboldt Universitat zu Berlin.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed.
New York, United State of America: Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
Saraswati O. 2010. Kloning dan karakterisasi gen penyandi α-amilase (amyA)
Aspergillus niger serta konstruksi ekspresi dengan teknologi Gateway [skripsi].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Satriaji KP. 2010. Optimasi produksi fitase oleh Bacillus subtilis AQ1
menggunakan Response Surface Methodology [skripsi]. Jakarta (ID):
Universitas Negeri Jakarta.
Savitri SM, AA Prasetyo, C Onuma, S Ishikawa, A Malik, N Ogasawara. 2013.
Efficient Expression of Recombinant Soluble Apoptin in Escherichia coli and
Bacillus subtilis. IJCEBS 1(1): 207-210.
Setiawan R. 2014. Kloning dan ekspresi Endo-β-1,4-Glukanase dari isolat lokal
BPPTCC-RK2 [tesis]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Siregar RY. 2010. Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil enzim fitase dari
sumber air panas Rimbo Panti Pasaman [skripsi]. Padang (ID): Universitas
Andalas.

17
Tarigan D. 2008. Isolasi dan kloning fragmen gen penyandi aminocyclopropane
carboxylic synthase (ACS) dari daun tanaman karet (Hevea brasiliensis)
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Thermo scientific. 2009. Cell lysis technical handbook. United States: Thermo
Fisher Scientific Inc.
Widowati S, Andriani D, Riyanti EI, Raharto P, Sukarno L. 2001. Karakterisasi
Fitase dari Bacillus coagulans. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman
Pangan.

18
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
 

Perancangan Primer 

Pembuatan media dan peremajaan bakteri 

Isolasi DNA genom Bacillus subtilis AQ1 

Amplifikasi gen penyandi fitase 

Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Donor pDONR 
221 

Ekstraksi plasmid rekombinan 

Pengklonan Fragmen DNA pada Vektor Ekspresi pDEST 
14 

Ekstraksi plasmid dan transformasi ke sel kompeten 
E.coli BL21‐Star

Produksi dan panen enzim rekombinan 

Uji aktivitas fitase 

19
Lampiran 2 Kurva standar fosfat

Lampiran 3 Pengukuran aktivitas fitase
Sampel
Kontrol
6 jam
12 jam
24 jam

1
0.330
0.448
0.463
0.507

Absorbansi
2
0.317
0.435
0.515
0.519

3
0.311
0.4