Senyawa Metabolit Cendawan Endofit Sebagai Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi.
SENYAWA METABOLIT CENDAWAN ENDOFIT
SEBAGAI ALTERNATIF PENGENDALIAN EFEKTIF
CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH PADI
ARIFDA AYU SWASTINI WARUWU
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Senyawa Metabolit
Cendawan Endofit sebagai Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan
Patogen Terbawa Benih Padi adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Arifda A S Waruwu
NIM A352130101
RINGKASAN
ARIFDA AS WARUWU. Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai
Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi.
Dibimbing oleh BONNY PW SOEKARNO dan ABDUL MUNIF.
Prioritas utama bidang pertanian dalam rangka menjaga stabilitas pangan
nasional yaitu peningkatan produksi padi. Salah satu masalah dalam produksi padi
disebabkan karena infeksi hama dan penyakit tanaman. Infeksi cendawan patogen
terbawa benih pada tanaman padi di Indonesia menjadi masalah utama yang
berpengaruh terhadap produksi padi yang menurun dari waktu ke waktu.
Pemanfaatan cendawan endofit merupakan salah satu alternatif pengendalian yang
dapat digunakan untuk mengendalikan patogen terbawa benih. Perlu adanya
metode baru yang ramah lingkungan untuk mengendalikan patogen terbawa
benih. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi cendawan endofit potensial
asal tanaman padi yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen
terbawa benih padi dan memanfaatkan metabolit cendawan endofit untuk
menekan cendawan patogen benih terbawa benih padi.
Penelitian ini terdiri atas 7 tahapan, yaitu 1) isolasi cendawan endofit
dengan cara sterilisasi permukaan bagian tanaman padi dengan menggunakan
NaOCl 1% dan alkohol 70%, 2) uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih
padi varietas Ciherang yang telah disterilisasi permukaan, 3) isolasi cendawan
patogen terbawa benih padi asal varietas Ciherang dan Kukubalam dengan metode
blotter test, 4) uji antagonis isolat cendawan endofit terhadap cendawan patogen
terbawa benih dengan metode kultur ganda, 5) produksi dan analisis senyawa
metabolit cendawan endofit, 6) uji senyawa metabolit cendawan endofit secara in
vitro, dan 7) uji in vivo senyawa metabolit cendawan endofit dengan 3 media yaitu
agar air, kertas, dan lumpur.
Cendawan endofit yang berhasil diisolasi sebanyak 21 isolat dan isolat yang
digunakan pada uji senyawa metabolit sebanyak 3 isolat cendawan endofit
potensial sebagai agen biokontrol terhadap cendawan patogen terbawa benih
Fusarium sp.1. Tiga isolat cendawan endofit tersebut yaitu LA6, LA11, dan
LA14. Metabolit isolat LA11 menunjukkan persentase penghambatan tertinggi
terhadap Fusarium sp.1 yaitu 28.97% dan metabolit isolat LA14 dengan
persentase penghambatan 28.72%. Aplikasi metabolit cendawan endofit dengan
perendaman benih padi menunjukkan pengurangan infeksi cendawan patogen
terbawa benih padi. Hal ini ditunjukkan oleh isolat LA11 dan LA14 mampu
menghambat pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih secara potensial.
Cendawan endofit menghasilkan metabolit yang sebagian senyawa
metabolit bersifat antifungal. Senyawa antifungal yang dihasilkan cendawan
endofit dapat melindungi tanaman dari serangan mikroba patogen sehingga dapat
dimanfaatkan sebagai biokontrol. Metabolit cendawan endofit juga mampu
memperbaiki pertumbuhan tanaman dan sistem perakaran tanaman.
Kata kunci: metabolit sekunder, biokontrol, antifungal, Fusarium sp.
SUMMARY
ARIFDA AS WARUWU. Metabolites Compound of Endophytic Fungi as an
Alternative to Control Seed-borne Pathogen Fungi on Rice. Supervised by
BONNY PW SOEKARNO and ABDUL MUNIF.
The major priority of agriculture in order to maintain the stability of
national food is increasing of rice production. One problem in rice production is
due to the infection of plant pests and diseases. Seed-borne fungal pathogenic
infections on the rice crop in Indonesia, which effects the production of rice, is
subject to the most intense scientific scrutiny in recent years. Utilization of
endophytic fungi is one alternative that can be used to control seed-borne
pathogens. New eco-friendly methods are needed to control the effect of seedborne fungal pathogens. This study aimed to explore the origin of the rice plant
endophytic fungus capable of inhibiting the growth of seed-borne pathogens and
using metabolites of endophytic fungi to suppress seed-borne fungal pathogens of
rice seeds.
This study consisted of 7 stages, 1) the isolation of the endophytic fungi by
sterilize the surface of rice plant with 1% NaOCl and 70% alcohol, 2) the
pathogenicity test of isolated endophytic fungi against Ciherang rice seeds, 3) the
isolation of seed-borne pathogens by blotter test method, 4) the inhibition test of
isolated endophytic fungi against pathogenic fungi by dual culture method, 5) the
production and analysis of metabolites of endophytic fungi, 6) the inhibition test
of isolated endophytic fungi metabolites on seed-borne pathogenic fungi, and 7)
the in vivo test of metabolites of endophytic fungi with 3 media, that is water
agar, paper, and muds.
Endophytic fungi has been succeeded to isolate 21 isolates and 3 isolates
were potential as a biocontrol agent against Fusarium sp.1 as pathogenic fungi.
The three isolates of endophytic fungi namely LA6, LA11, and LA14. Metabolite
of LA11 isolate showed the highest inhibition percentage against the Fusarium
sp.1by 28.97% and LA14 isolate with inhibition percentage by 28.72%.
Metabolite of endophytic fungi which used to cover rice seed through soaked the
seed enabled to reduce seed-borne pathogen fungi. It showed that LA11 and LA14
isolate have an inhibition potential to reduce growth of seed-borne pathogen
fungi.
Endophytic fungi produce metabolite as antifungal. Antifungal compound
that produced by endophytic fungi can protect plant from pathogenic fungal acts,
so it can be a biocontrol. Metabolite of endophytic fungi also can repair the grow
of plant and the plant root system.
Keywords: secondary metabolite, biocontrol, antifungal, Fusarium sp.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
SENYAWA METABOLIT CENDAWAN ENDOFIT
SEBAGAI ALTERNATIF PENGENDALIAN EFEKTIF
CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH PADI
ARIFDA AYU SWASTINI WARUWU
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr Ir Titiek Siti Yuliani, SU
Judul Tesis : Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai Alternatif
Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Nama
: Arifda Ayu Swastini Waruwu
NIM
: A352130101
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Bonny PW Soekarno, MS
Ketua
Dr Ir Abdul Munif, MScAgr
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Fitopatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
28 Oktober 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 ini ialah
cendawan endofit, dengan judul Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai
Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Bonny PW Soekarno, MS dan
Dr Ir Abdul Munif, MSc Agr selaku komisi pembimbing, dan juga kepada Dr Ir
Titiek Siti Yuliani, SU selaku penguji luar komisi yang telah memberikan arahan,
saran, dan motivasi bagi penulis dalam proses penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktorat
Jenderal Pendidikan (Dikti) Kemdikbud yang telah memfasilitasi biaya
pendidikan melalui Beasiswa Unggulan (BU). Selain itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Kepala UPT. Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura
1 Medan yang telah memberi izin penggunaan Laboratorium pada proses isolasi
cendawan endofit dari tanaman padi asal Sumatera Utara. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada ayahanda Filizaro Waruwu, ibunda Nurdiana dan
seluruh keluarga untuk kasih sayang, segala doa dan dukungannya, serta kepada
para sahabat yang telah memberikan motivasi kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2015
Arifda AS Waruwu
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
vi
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi Padi
Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Cendawan Endofit dari Tanaman Padi
Metabolit Cendawan Endofit
4
4
4
5
7
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Alat
Isolasi Cendawan Endofit
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Uji Antagonis Isolat Cendawan Endofit terhadap Cendawan Patogen
Produksi dan Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Uji Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Uji In Vivo Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Cendawan Endofit Tanaman Padi
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Daya Hambat Isolat Cendawan Endofit terhadap Fusarium sp.1
Daya Hambat Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Pengaruh Senyawa Metabolit Cendawan Endofit secara In vivo
9
9
9
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
15
16
17
18
21
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
25
25
25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
30
RIWAYAT HIDUP
33
DAFTAR TABEL
1 Hasil isolasi cendawan endofit asal tanaman padi varietas Ciherang dan
varietas Kukubalam
2 Hasil uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih varietas
Ciherang
3 Tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih padi varietas Ciherang
dan Kukubalam dengan metode blotter test
4 Daya hambat cendawan endofit potensial terhadap pertumbuhan koloni
Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
5 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap pertumbuhan
koloni Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
6 Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit LA11 pada
pengujian Py-GC-MS
7 Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit LA14 pada
pengujian Py-GC-MS
8 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap tingkat infeksi
patogen terbawa benih padi dengan menggunakan metode blotter test
9 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap daya
kecambah benih padi dengan metode kertas gulung, media agar air, dan
lumpur
10 Tingkat infeksi dan penekanan tingkat infeksi cendawan patogen
Fusarium sp.1 pada media agar air dan lumpur
13
14
15
16
17
19
20
22
22
23
DAFTAR GAMBAR
1 Bagan alir penelitian senyawa metabolit cendawan endofit sebagai
alternatif pengendalian efektif cendawan patogen terbawa benih padi
2 Skema uji antagonis cendawan endofit (a) dan cendawan patogen (b)
pada media PDA secara in vitro
3 Uji patogenisitas cendawan endofit pada benih padi varietas Ciherang.
(A) gejala nekrotik pada kecambah kontrol, dan (B) tidak ada gejala
pada kecambah perlakuan endofit
4 Isolat patogen cendawan terbawa benih. (A) Fusarium sp.1, (B)
Fusarium sp.2, (C) Aspergillus niger, (D) Aspergillus flavus, dan (E)
Hifa steril
5 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap pertumbuhan
Fusarium sp.1
6 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap daya
berkecambah padi pada media agar air dengan perlakuan K(-), LA11,
LA14, dan K(+) pada hari ke-15
7 Pengaruh senyawa metabolit terhadap panjang akar dan tinggi kecambah
padi di media agar air dan lumpur pada hari ke-15
3
11
15
15
18
22
23
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil analisis senyawa metabolit LA11
2 Hasil analisis senyawa metabolit LA14
3 Beberapa isolat cendawan endofit yang diisolasi
30
31
32
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi adalah komoditas utama pertanian di Indonesia. Sebagian besar
penduduk Indonesia mengonsumsi beras sebagai makanan pokok. Konsumsi beras
di Indonesia yang tinggi menuntut tingkat produksi beras yang besar pula.
Berdasarkan data Badan Pusat Statistik (BPS 2015), produksi padi di Indonesia
pada tahun 2014 sebesar 70.83 juta ton gabah kering giling (GKG), mengalami
penurunan sebanyak 450.000 ton dari produksi tahun 2013 sebesar 71.28 juta ton
GKG. Salah satu penyebab penurunan produksi padi adalah gangguan dari hama
dan penyakit tumbuhan. Produksi padi yang meningkat tidak terlepas dari kualitas
benih. Ketersediaan benih bermutu menjadi faktor penentu produktivitas
komoditas pertanian. Benih padi yang bermutu dan tersertifikasi sangat penting
untuk mendapatkan produksi padi atau beras yang tinggi dan berkualitas. Mutu
benih dilihat dari empat aspek, yaitu mutu fisik, mutu genetik, mutu fisiologis,
dan kesehatan benih. Salah satu aspek penting dalam menentukan kualitas suatu
benih adalah kesehatan benih. Pada proses penyimpanan tidak sedikit dari benih
padi mengalami kerusakan baik dari segi tekstur, aroma, bahkan kandungannya.
Kerusakan pada benih biasanya terjadi akibat adanya serangan serangga, tungau,
burung, dan mikroorganisme patogen seperti cendawan dan bakteri (Agarwal dan
Sinclair 1997). Sebagian cendawan patogen penyebab penyakit pada padi dapat
terbawa benih.
Cendawan patogen terbawa benih padi antara lain Alternaria padwickii
(Ganguly) Ellis, Pyricularia oryzae Sacc., Fusarium solani (Mart.) Sacc., F.
moniliforme Sheld, Phoma sp., Helminthosporium oryzae Breda de Haan,
Chaetomium sp., Aspergillus spp., Curvularia sp., Cercospora oryzae Miyake,
dan Rhizoctonia solani Kuhn. Fusarium sp. merupakan cendawan patogen yang
terbawa benih dalam kisaran luas. Beberapa spesies di antara cendawan tersebut
dapat memproduksi mikotoksin dalam biji-bijian yang berbahaya bagi kesehatan
manusia dan hewan. Fusarium sp. juga dapat menyebabkan penyakit layu pada
tanaman dan bersifat sistemik. Kerugian yang ditimbulkan cendawan patogen
terbawa benih adalah pertumbuhan tanaman yang kurang baik dan tersedianya
sumber inokulum patogen sejak awal tanaman tumbuh di lapangan. Selain itu,
cendawan patogen terbawa benih juga dapat menurunkan kualitas benih seperti
menurunnya daya kecambah padi (Agarwal dan Sinclair 1997). Infeksi cendawan
patogen terbawa benih terhadap pertanaman padi di Indonesia berdampak
terhadap penurunan produksi hasil padi. Upaya untuk mengendalikan cendawan
patogen terbawa benih padi telah banyak dilakukan. Cara pengendalian cendawan
patogen terbawa benih yang sering dilakukan adalah pemakaian fungisida sintetis.
Meskipun demikian masih perlu dilakukan upaya untuk mengembangkan cara
pengendalian patogen terbawa benih yang efektif, berkelanjutan dan berwawasan
lingkungan.
Secara alamiah, pada suatu ekosistem terdapat simbiosis antara
mikroorganisme, tanaman dan lingkungannya. Mikroorganisme yang hidup dalam
tanaman inang ada yang bersifat merugikan dan menguntungkan. Mikroorganisme
yang tidak menimbulkan efek merugikan pada inang tanaman, diantaranya
2
2
organisme endofit yang dapat hidup dalam organ tanaman dan mampu
mengolonisasi di dalam jaringan tanaman tanpa menyebabkan kerusakan pada
inangnya. Cendawan endofit adalah cendawan yang semua atau sebagian dari
siklus hidupnya berada di dalam jaringan tanaman sehat dan tidak
memperlihatkan gejala penyakit (Schulz dan Boyle 2005). Banyak kelompok
cendawan endofit yang mampu memproduksi senyawa antibiotik yang aktif
menekan pertumbuhan bakteri maupun cendawan patogen (Petrini 1992).
Senyawa antimikroba yang dihasilkan beberapa cendawan endofit pada
tanaman mampu melindungi tanaman inang dari infeksi patogen penyebab
penyakit tanaman. Untuk itu, cendawan endofit dapat dimanfaatkan sebagai
alternatif cara pengendalian hayati penyakit pada tanaman (Schulz dan Boyle
2005). Telah banyak penelitian mengenai metabolit cendawan endofit mampu
mengendalikan pertumbuhan cendawan patogen.
Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit seperti alkaloid pada
tanaman rumput-rumputan mampu melindungi inang dari serangan invertebrata
herbivora, nematoda dan patogen. Cendawan endofit dapat memberi keuntungan
kepada tanaman yaitu meningkatkan ketahanan terhadap serangga dan mamalia
herbivora, meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit, memacu
pertumbuhan dan meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan dan suhu
tinggi (Lehtonen et al. 2005). Saat ini telah dikembangkan cara pengendalian
cendawan patogen terbawa benih dengan memanfaatkan senyawa yang dihasilkan
mikroba endofit. Sebagian senyawa metabolit mikrobaendofit telah terbukti
memiliki aktivitas antimikroba sehingga melindungi tanaman inang dari patogen
penyebab penyakit tanaman. Sebagai contoh, senyawa metabolit dari cendawan
endofit Phomopsis sp. bersifat antibakteri dan antifungal terhadap Bacillus
megaterium dan Microbotryum violaceum (Pers.) G. Deml & Oberw. (Hussain et
al. 2009). Kemampuan cendawan endofit memproduksi metabolit sekunder
merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi
senyawa dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut.
Perumusan Masalah
Cendawan patogen terbawa benih merupakan salah satu kendala dalam
usaha untuk meningkatkan produksi benih padi berkualitas. Upaya pengendalian
cendawan patogen umumnya masih menggunakan pestisida sintetik sebagai
metode pengendalian yang banyak digunakan. Namun, akibat dari penggunaan
pestisida secara berlebihan dan terus menerus dapat mengakibatkan dampak yang
negatif terhadap lingkungan. Untuk itu perlu dikembangkan cara pengendalian
cendawan patogen terbawa benih yang efektif dan ramah lingkungan. Salah satu
cara pengendalian tersebut adalah pemanfaatan cendawan endofit untuk menekan
pertumbuhan cendawan patogen. Selain itu, potensi metabolit cendawan endofit
dalam menekan pertumbuhan cendawan patogen benih juga belum banyak
dikembangkan.
3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi cendawan endofit potensial
asal tanaman padi yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen
terbawa benih padi dan memanfaatkan senyawa metabolit cendawan endofit untuk
menekan patogen terbawa benih padi.
Manfaat Penelitian
Penelitian diharapkan menemukan cara pengendalian yang tepat dengan
menggunakan metabolit dari cendawan endofit asal tanaman padi untuk
mengendalikan perkembangan patogen terbawa benih padi.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah isolasi cendawan endofit dari tanaman
padi, uji patogenisitas cendawan endofit, isolasi cendawan patogen terbawa benih
padi, uji antagonis isolat cendawan endofit terhadap cendawan patogen, produksi
dan analisis senyawa metabolit cendawan endofit, uji senyawa metabolit
cendawan endofit, dan uji in vivo senyawa metabolit cendawan endofit
(Gambar 1).
Isolasi cendawan
endofit
Isolasi cendawan patogen
terbawa benih padi
Uji patogenisitas
cendawan endofit
Karakterisasi
cendawan patogen
Uji antagonis
Produksi senyawa metabolit
cendawan endofit
Analisis senyawa
metabolit
Uji senyawa metabolit
cendawan endofit
Uji in vivo senyawa
metabolit cendawan endofit
Gambar 1 Bagan alir penelitian senyawa metabolit cendawan endofit sebagai
alternatif pengendalian efektif cendawan patogen terbawa benih padi
4
4
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi padi
Tanaman padi dalam taksonomi tumbuhan diklasifikasikan ke dalam divisio
Spermatophyta, subdivisio Angiospermae, kelas Monocotyledoneae, ordo adalah
Poales, famili adalah Graminae, genus adalah Oryza Linn, dan spesiesnya adalah
Oryza sativa L (Grist 1960). Padi merupakan tanaman yang tumbuh di atas tanah
yang digenangi air. Padi juga dapat tumbuh di tanah daratan atau tanah kering,
apabila curah hujan mampu mencukupi kebutuhan akan air. Padi termasuk
golongan Gramineae ditandai dengan batang yang tersususn dari beberapa ruas
(Siregar 1981). Tanaman padi merupakan tanaman pangan yang penting dan
makanan pokok bagi sebagian besar penduduk di Asia. Walaupun konsumsi beras
bervariasi antarnegara, namun sumbangan beras terhadap pemenuhan kebutuhan
kalori masyarakat relatif cukup tinggi. Sebagai contoh Laos dan Myanmar,
konsumsi beras per kapitanya masing-masing mencapai sekitar 179 kg dan 190 kg
per tahun (Suryana et al. 2009). Berdasarkan data rata-rata selama 5 tahun (20052008), tercatat bahwa Bangladesh merupakan negara dengan penyediaan beras per
kapita terbesar di dunia yakni mencapai 171.14kg/kapita/tahun, disusul Republik
Demokratik Laos dan Kamboja masing-masing sebesar 163.48 kg/kapita/tahun
dan 159.08 kg/kapita/tahun. Indonesia menduduki urutan keempat sebagai negara
dengan penyediaan beras terbesar di dunia dengan rata-rata sebesar 148.62
kg/kapita/tahun (Respati et al. 2014). Peningkatan jumlah penduduk mendorong
banyak negara di Asia untuk terus mengembangkan teknologi yang mampu
meningkatkan produktivitas padi.
Peningkatan dalam produksi padi masih merupakan prioritas utama
pembangunan di bidang pertanian guna menjaga stabilitas pangan secara nasional
dan untuk memenuhi kebutuhan masyarakat. Beberapa tahun terakhir, impor beras
dilakukan untuk memenuhi kebutuhan di dalam negeri. Konsumsi beras tahun
2014 diperkirakan sebesar 97.67 kg/kapita/tahun atau naik sebesar 0.27%
dibandingkan tahun 2013 (Respati et al. 2014). Kelangkaan beras terjadi antara
lain karena menyempitnya areal persawahan, kendala yang bersifat abiotik seperti
lingkungan dan biotik seperti serangan hama dan penyakit.
Penyakit padi yang disebabkan oleh mikroorganisme merupakan hambatan
dalam produksi padi. Ada sekitar 60 jenis penyakit pada tanaman padi yang
disebabkan virus, bakteri, cendawan, nematoda dan lainnya (Ou 1985). Akibat
aktifitas patogen tersebut, menyebabkan penurunan produksi padi baik kuantitas
maupun kualitas.
Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Cendawan merupakan kelompok patogen terbesar yang dapat tertular atau
terbawa pada benih. Cendawan patogen adalah kelompok mikroorganisme
terbesar penyebab penyakit pada tanaman. Persentase terbesar cendawan patogen
tanaman bersifat nekrotrof-saprofit yang mampu menggunakan nutrisi bebas dari
jaringan tanaman yang luka atau jaringan hidup yang terinfeksi. Beberapa
5
cendawan patogen masuk ke dalam jaringan tanaman dan benih melalui lubang
alami, seperti hidatoda, lentisel, mikrofil, dan pembukaan stomata, dan melalui
luka oleh hujan, pasir, hewan, serangga, manusia, dan mikroorganisme lainnya,
sedangkan cendawan patogen lain menggunakan tekanan mekanik, sekresi enzim
degradasi atau keduanya untuk mempenetrasi jaringan tanaman dan benih secara
langsung. Patogen pada benih dan jaringan inang menyebabkan adanya gejala atau
tanda penyakit pada tanaman. Namun, beberapa cendawan tidak menghasilkan
gejala selama siklus hidupnya di dalam jaringan tanaman inang (Agarwal dan
Sinclair 1997).
Cendawan patogen terbawa benih padi dapat dikelompokkan menjadi 3
yaitu, cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada daun padi,
cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada batang, pelepah dan
akar padi, dan cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada biji.
Penyakit paling penting yang disebabkan oleh cendawan patogen terbawa benih
yaitu blas, hawar pelepah, busuk akar, dan penyakit pada pembibitan karena
menghancurkan tanaman apabila lingkungan dan kondisi pertanaman sesuai bagi
perkembangan patogen (Agarwal dan Sinclair 1997).
Kerugian yang ditimbulkan oleh cendawan patogen terbawa benih antara
lain pertumbuhan tanaman yang kurang baik dan tersedianya sumber inokulum
patogen sejak awal tanaman tumbuh di lapangan. Cendawan patogen terbawa
benih juga dapat menurunkan kualitas benih seperti daya kecambah benih
menurun, bahkan beberapa cendawan patogen tertentu tidak hanya menurunkan
kualitas benih, juga menyebabkan benih yang terinfeksi menjadi sangat beracun
(Sutopo 1993).
Cendawan merupakan kelompok patogen yang dapat terbawa benih padi.
Menurut data UPT Balai Pengawasan dan Sertifikasi Benih Sumatera Utara
(BPSB SUMUT 2013), cendawan patogen yang sering menginfeksi benih padi
antara lain Aspergillus sp., Fusarium sp., Pyricularia oryzae, Alternaria
padwickii, Helminthosporium sp., dan Cercospora oryzae. A. padwickii
merupakan salah satu cendawan terbawa benih padi yang dilaporkan paling sering
dan paling banyak menginfeksi benih padi (Astuti et al. 2009). Tingkat infeksi
oleh A. padwickii pada tanaman padi mencapai 80-90% di daerah Tropis (Mew
dan Gonzales 2002).
Penyakit busuk batang oleh Sclerotium oryzae Catt. dapat menimbulkan
kehilangan hasil panen padi sebesar 10-80%. Rhizoctonia solani Kuhn penyebab
penyakit hawar pelepah daun menurunkan produksi padi hingga 20%, dan
penyakit bakanae yang disebabkan oleh F. moniliforme pernah dilaporkan tahun
1938 di daerah Cirebon juga menurunkan hasil panen padi. Kehilangan hasil padi
yang disebabkan Helminthosporium oryzae di Indonesia pernah mencapai 100%
pada pertanaman padi gogo. Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan
patogen P. oryzae merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman padi di
seluruh dunia dengan kehilangan hasil berkisar antara 50-90% (Utami et al. 2005).
Cendawan Endofit Tanaman Padi
Endofit merupakan mikroorganisme yang hidup di dalam jaringan
tumbuhan tanpa menimbulkan gejala penyakit pada tanaman inang (Strobel 2003).
6
6
Penggunaan istilah endofit sering digunakan untuk organisme yang menginfeksi
secara internal, dimana jaringan inang yang terinfeksi setidaknya tanpa gejala
untuk sementara, berlaku untuk prokariot dan eukariot. Endofitik mencakup
kumpulan mikroorganisme dengan strategi hidup yang berbeda yaitu mengikuti
fase pertumbuhan endofit, tumbuh saprofit pada jaringan yang mati atau gugur,
mikroorganisme avirulen, tetapi juga patogen laten dan patogen virulen pada
tahap awal infeksi. Interaksi parasit dapat bervariasi dari mutualistik sampai
komensalistik pada patogen laten dan eksploitatif (Schulz dan Boyle 2005).
Cendawan endofit adalah kelompok mikroorganisme sangat beragam dan
dapat berkembang dalam jaringan tanaman yang ada di atas tanah serta di bawah
tanah, termasuk batang, daun, dan akar tanpa menimbulkan gejala (Kusari et al.
2012). Cendawan endofit adalah cendawan yang mampu hidup di dalam jaringan
tanaman. Cendawan endofit terdapat di semua bagian tanaman, terutama di bagian
daun. Pada jaringan tanaman sehat, cendawan endofit dapat berperan sebagai
epifit, endofit, atau patogen laten (Maheswari 2006). Cendawan endofit
bersimbiosis mutualisme pada inangnya untuk mendapatkan nutrisi dari hasil
metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman dari herbivora, serangga, atau
patogen, sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang
diperlukan selama hidupnya (Simarmata et al. 2007). Cendawan endofit dapat
ditemukan hampir di seluruh jenis tanaman, termasuk pada tanaman padi.
Beberapa contoh spesies cendawan endofit yang mendominasi tanaman padi
yaitu Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Paecilomyces sp.,
Gilmaniella sp., Arthrobotrys foliicola Matsush., Trichoderma sp., Trichocladium
sp., dan Nigrospora sp. (Zakaria et al. 2010; Manurung et al. 2014). Fusarium sp.
banyak membentuk populasi pada bagian daun sebesar 40.9% dan pada bagian
akar sebesar 56.9%. Nigrospora sp. diketahui sebagai cendawan patogen benih
pada tanaman padi, tetapi bukan termasuk patogen yang menimbulkan kerusakan
berarti pada padi. Terdapat hubungan simbiosis mutualisme antara cendawan
endofit dan tumbuhan inangnya yaitu hubungan yang saling menguntungkan.
Cendawan endofit dapat melindungi tumbuhan inang dari serangan patogen
dengan senyawa yang dikeluarkan oleh cendawan endofit. Senyawa yang
dikeluarkan cendawan endofit berupa senyawa metabolit sekunder yang
merupakan senyawa bioaktif dan dapat berguna dalam menghambat dan
mengendalian pertumbuhan cendawan patogen. Tumbuhan inang menyediakan
nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba endofit untuk melengkapi siklus hidupnya
(Sunarminingsih 2002).
Ketika cendawan endofit dapat berkembang dari tanaman yang terinfeksi
cendawan patogen, ketahanan tanaman terhadap serangan patogen bisa dipicu
oleh cendawan endofit. Pertahanan tanaman yang berhubungan dengan cendawan
endofit meningkat melalui peningkatan ketahanan dan produksi metabolit
sekunder (Gao et al. 2010).
Mekanisme cendawan endofit dalam melindungi tanaman terhadap serangan
patogen meliputi: (1) penghambatan pertumbuhan patogen secara langsung
melalui senyawa antibiotik dan enzim litik yang dihasilkan; (2) penghambatan
secara tidak langsung melalui induksi ketahanan tanaman oleh cendawan endofit
terhadap tanaman yang merangsang pembentukan metabolit sekunder seperti
asam salisilat, asam jasmonat, dan etilen yang berfungsi dalam meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap serangan patogen atau yang berfungsi sebagai
7
antimikroba seperti fitoaleksin; (3) perangsangan pertumbuhan tanaman sehingga
lebih tahan terhadap serangan patogen; (4) kolonisasi jaringan tanaman sehingga
patogen sulit penetrasi; dan (5) hiperparasit (Gao et al. 2010).
Penelitian pemanfaatan cendawan endofit semakin berkembang. Sebagai
contoh cendawan endofit Pestalotiopsis microspora (Speg.) diketahui berperan
sebagai obat antikanker yang mengolonisasi sejenis pohon cemara di Himalaya.
Beberapa spesies cendawan endofit lain diteliti sebagai sumber antikanker,
antidiabetes. Cendawan endofit juga mampu menghasilkan senyawa metabolit
yang berfungsi dalam pertahanan tanaman inang terhadap kondisi lingkungan
yang ekstrim, seperti Curvularia sp. pada tanaman di daerah gunung berapi di
Amerika Serikat (Maheswari 2006).
Beberapa cendawan telah diketahui mampu menekan infeksi penyakit pada
tanaman yang disebabkan oleh patogen Xylariaceae, Calocybe gambosa (Fr.)
Donk, Resinicium friabile Hjortstam & Melo,dan Aschersonia Endl. merupakan
cendawan endofit yang mampu menekan keparahan penyakit busuk buah alpukat
(Tondok et al. 2012). Fusarium solani (Mart.) Sacc., Acremonium zeae W. Gams
& D.R. Sumner, Verticillium sp., P. cassiae, Muscodor albus Worapong,
Periconia sp., Ampelomyces sp., Neotyphodium lolii (Latch, M.J. Chr. & Samuels)
adalah cendawan endofit yang telah dikembangkan sebagai pengendali hayati
terhadap hama dan penyakit pada tanaman (Gao et al. 2010). Hasil penelitian
Melliawati et al. (2006) menunjukkan bahwa cendawan endofit dapat
menghasilkan senyawa aktif yang berguna untuk memproteksi serangan mikroba
patogen tanaman, seperti Xanthomonas campestris, Pseudomonas solanacearum
A.C Hayward, Colletroticum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc, dan
F.oxysporum. Hasil analisis menunjukkan bahwa endofit ternyata mengandung
senyawa aktif steroid yang mampu menghambat pertumbuhan mikroba patogen.
Cendawan endofit Trichoderma spp. dilaporkan dapat meningkatkan
ketahanan terinduksi tanaman kedelai terhadap penyakit layu Fusarium, memacu
pertumbuhan tinggi tanaman kedelai, cendawan saprofit T. harzianum dan T.
hamtum memacu keluarnya bunga lebih awal, menambah polong isi dan bobot biji
kering kedelai per tanaman (Sudantha 2010). Cendawan endofit Taxomyces
andreanae D. Stierle & W.M. Hessyang mampu menghasilkan senyawa
antikanker, yaitu taxol. Senyawa ini ternyata juga dihasilkan oleh tumbuhan
inangnya yaitu Taxus brevifolia bark. Cendawan endofit mampu menghasilkan
senyawa yang sama dengan senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan inangnya,
namun hal ini jarang terjadi. Senyawa yang dihasilkan cendawan endofit
umumnya berbeda dengan senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan inangnya
(Strobel 2003).
Metabolit Cendawan Endofit
Metabolit sekunder yang dihasilkan cendawan endofit diduga sebagai akibat
koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke
dalam mikroba endofit. Apabila cendawan endofit yang diisolasi dari suatu
tanaman dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan
tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi (Radji 2005).
Metabolit sekunder tertentu hanya ditemukan pada organisme spesifik, atau
8
8
bahkan strain yang spesifik, dan hanya diproduksi pada kondisi-kondisi tertentu
(Dewick 1999). Mekanisme elisitor endofit menginduksi metabolit sekunder
adalah mirip dengan stimulasi ketahanan tanaman. Kolonisasi cendawan endofit
mensekresi enzim hidrolase dari sel tanaman untuk membatasi pertumbuhan
cendawan, dengan demikian fragmen endofit bertindak sebagai elisitor, yang
diproduksi dari hidrolisasi. Elisitor seperti lipopolisakarida, polisakarida dan
glikoprotein akan merangsang pertahanan tanaman dan metabolit sekunder
tanaman yang akan menekan pertumbuhan patogen (Gao et al. 2010).
Metabolit sekunder diduga merupakan produk samping (waste products)
dari proses metabolisme primer dan tidak dimanfaatkan oleh organisme yang
menghasilkan metabolit sekunder. Alasannya, sebagai waste product, metabolit
sekunder harus bersifat tidak dapat lagi dimanfaatkan oleh organisme
penghasilnya. Namun pada kenyataannya, beberapa alkaloid seperti asam-amino
non protein, glikosida sianogen (kesemuanya metabolit sekunder) masih dapat
mengalami biodegradasi dan dimanfaatkan pada masa germinasi dari spora
organisme penghasil metabolit. Eksplorasi metabolit sekunder secara ekstensif
dan intensif dilengkapi dengan pengembangannya ternyata tidak hanya
menghasilkan senyawa bersifat antibiotik saja tetapi juga sifat farmako-aktif
lainnya seperti: antifungal, antiviral, antitumor, sitotoksik, imunosupresif,
promotor pertumbuhan, antiparasitik, insektisida, herbisida (Sunarminingsih
2002).
Berbagai cendawan endofit telah diisolasi dari tanaman inangnya dan
berhasil dibiakkan dalam media pertumbuhan yang sesuai. Demikian pula
metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil
diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya. Mikroba
endofit yang menghasilkan antibiotik kriptokandin adalah antifungal yang
dihasilkan oleh cendawan endofit Cryptosporiopsis quercina Petr. yang berhasil
diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan bersifat sebagai antifungal
terhadap cendawan penyebab penyakit pada manusia yaitu Candida albicans
(Strobel et al. 1999). Cendawan endofit Pestalotiopsis micrispora menghasilkan
metabolit sekunder asam ambuik yang berkhasiat sebagai antifungal (Li et al.
2001). Phomopsichalasin merupakan metabolit yang diisolasi dari cendawan
endofit Phomopsis spp. Berdasarkan penelitian Silva et al. (2006), cendawan
endofit Phomopsis cassiae Sousa da Camara menghasilkan metabolit sekunder
yaitu etil 2,4-dihydroxy-5,6-dimethylbenzoate dan phomopsilactone. Metabolit
sekunder tersebut berperan sebagai antifungal terhadap cendawan patogen
Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de Vries dan C. Sphaerospermum Penz.
9
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2014 sampai dengan Juni 2015.
Tahap penelitian isolasi cendawan endofit dilakukan di Laboratorium Balai
Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura 1, Medan. Tahap uji in vitro dan in
vivo dilakukan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi
Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat cendawan endofit dari tanaman padi
dan benih padi varietas Ciherang (nasional) dan varietas Kukubalam (lokal)
Sumatera Utara, alkohol 70%, NaOCl 1%, akuades steril, kertas saring Whatman
no.1, media PDA (Potatoes Dextrose Agar), media GYP (Glucose Yeast Pepton)
dengan komposisi glukosa 10 g, yeast ekstrak 5 g, pepton 5 g, gliserol 10 g,
sodium klorida 5 g dilarutkan dalam 1 liter akuades, isolat cendawan patogen
terbawa benih padi, dan fungisida sintetik (bahan aktif mankozeb 80%). Alat yang
digunakan adalah shaker, sentrifus, inkubator, lampu Near Ultraviolet (NUV),
Laminar Air Flow (LAF), cork borer berdiameter 0.6 cm, Pyrolisis Gas
Chromatography Mass Spectrometry (Py-GC-MS), vorteks, autoklaf dan corong
pisah.
Isolasi Cendawan Endofit
Contoh akar, batang, daun padi dan benih tanaman padi yang sehat varietas
Ciherang dan varietas Kukubalam asal Sumatera Utara dicuci dengan air mengalir
untuk menghilangkan tanah dan kotoran yang menempel. Sampel ditiriskan di
dalam cawan petri steril, lalu dipotong-potong dengan pisau steril. Contoh bagian
tanaman tersebut disterilisasi permukaan dengan alkohol 70% selama 30 detik,
direndam dalam NaOCl 1% selama 2 menit, dan dibilas dengan akuades steril 3
kali, lalu dikeringanginkan. Potongan akar, batang, dan daun yang sudah
disterilkan tersebut ditanam pada media PDA dalam cawan petri steril dan
diinkubasi pada suhu ruang (25 oC) selama 7 hari (modifikasi metode Rodrigues
1994). Hasil isolasi cendawan endofit dimurnikan pada media PDA dalam cawan
petri dan disimpan pada suhu ruang.
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Uji patogenisitas menggunakan metode Wilia et al. (2012) yang telah
dimodifikasi. Benih padi varietas Ciherang disterilisasi permukaan dengan
alkohol 70% selama 30 detik, direndam dalam NaOCl 1% selama 2 menit, dan
dibilas dengan akuades steril 3 kali dan ditanam pada media PDA yang telah
ditumbuhi isolat murni cendawan endofit. Sebanyak 20 bulir benih padi ditanam
10
10
untuk setiap isolat cendawan endofit di dalam cawan petri dan diinkubasi selama
2 minggu. Pengamatan dilakukan pada hari ke-14 terhadap perkecambahan benih
padi yang sehat dan yang menunjukkan gejala nekrotik. Biakan cendawan endofit
yang tidak menginfeksi perkecambahan benih padi disimpan sebagai isolat
cendawan endofit untuk penelitian selanjutnya.
Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Blotter test merupakan suatu metode untuk mendeteksi cendawan patogen
terbawa benih. Pada pengujian blotter sebanyak 400 benih padi ditanam pada
media kertas saring lembab dalam cawan petri. Jumlah benih yang disemai
sebanyak 25 bulir benih untuk setiap cawan dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 7 hari di bawah sinar NUV 12 jam terang 12 jam gelap secara bergantian.
Pada hari ke-2 inkubasi, cawan dipindahkan ke dalam freezer pada suhu -20 oC
selama 24 jam, selanjutnya cawan dipindahkan kembali ke dalam ruang inkubasi
selama 5 hari berikutnya. Pengamatan dilakukan pada hari ke-8 setelah perlakuan
benih. Cendawan patogen yang tumbuh di permukaan benih diidentifikasi di
bawah mikroskop stereo dan mikroskop compound. Identifikasi cendawan
patogen menggunakan kunci identifikasi Barnett dan Hunter (1998). Pengamatan
dilakukan terhadap karakteristik pertumbuhan cendawan pada benih yang telah
diinkubasi. Cendawan patogen diisolasi dengan menggunakan media PDA steril
(ISTA 2014).
Uji Antagonis Isolat Cendawan Endofit terhadap Cendawan Patogen
Uji antibiosis secara in vitro dilakukan terhadap semua cendawan endofit
yang tidak menyebabkan nekrotik dari hasil uji patogenisitas. Pengujian dilakukan
mengikuti metode Santoso dan Sumarni (2008) yang telah dimodifikasi.
Pengujian dengan menumbuhkan biakan murni cendawan patogendan masingmasing koloni isolat cendawan endofit padi umur 7 hari sebanyak satu cork borer
pada cawan petri yang telah berisi media PDA (Gambar 2). Perlakuan diulang
sebanyak 10 kali dan pengamatan dilakukan selama 7 hari. Pengaruh
penghambatan cendawan endofit terhadap cendawan patogen dihitung dengan
rumus persentase:
Daya Hambat =
R1-R2
R2
x 100%
Keterangan:
R1 = jari-jari koloni hifa patogen yang tumbuh menjauhi koloni endofit (cm)
R2 = jari-jari koloni hifa patogen yang tumbuh mendekati koloni endofit (cm)
11
a
3 cm
b
3 cm 3 cm
Gambar 2 Skema uji antagonis cendawan endofit (a) endofit dan (b) cendawan
patogen pada media PDA secara in vitro
Produksi dan Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Dipilih 3 isolat cendawan endofit dari hasil uji antibiosis yang mempunyai
daya hambat paling besar. Tiga isolat cendawan endofit terpilih selanjutnya
digunakan untuk pengujian senyawa metabolit. Pengujian dilakukan mengikuti
metode Margino (2008) yang telah dimodifikasi. Isolat murni cendawan endofit
ditumbuhkan di dalam 100 mL medium cair GYP dan di-shaker selama 7 hari
dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi cendawan endofit disaring secara bertahap
menggunakan kertas saring Whatman no.1. Selanjutnya suspensi disentrifugasi
pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit lalu disaring kembali. Metabolit yang
sudah disaring selanjutnya digunakan untuk pengujian daya hambat pada uji in
vitro dan analisis kualitatif senyawa metabolit dengan metode analisis Py-GC-MS.
Analisis senyawa metabolit cendawan endofit melalui Py-GC-MS dilakukan di
Litbang Hasil Hutan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Gunung
Batu, Bogor.
Uji Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Pengujian dilakukan mengikuti metode Ilyas et al. (2007) yang
dimodifikasi. Senyawa metabolit dari masing-masing cendawan endofit terpilih
ditambahkan pada media tumbuh PDA, sehingga terbentuk media tumbuh dengan
konsentrasi senyawa metabolit 20%, 10%, dan 5%. Cendawan patogen
ditumbuhkan pada media tumbuh PDA dengan masing-masing konsentrasi
senyawa metabolit. Cendawan patogen ditumbuhkan pada media PDA tanpa
penambahan senyawa metabolit cendawan endofit sebagai kontrol negatif dan
sebagai kontrol positif digunakan media tumbuh PDA yang ditambahkan
fungisida. Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan patogen pada masingmasing konsentrasi senyawa metabolit dan dibandingkan terhadap kontrol negatif.
Masing-masing perlakuan diulang 5 kali. Pengamatan dilakukan setiap hari
selama 7 hari dengan mengukur diameter koloni cendawan patogen, selanjutnya
dihitung daya hambat pada hari ke-7 dengan rumus berikut:
12
12
Daya Hambat = D1-D2 x 100%
D1
Keterangan:
D1
= diameter hifa cendawan patogen sebagai kontrol negatif (cm)
D2
= diameter hifa cendawan patogen sebagai perlakuan (cm)
Dari hasil uji in vitro dipilih 2 perlakuan senyawa metabolit dengan daya
hambat paling besar untuk digunakan dalam uji selanjutnya yaitu uji in vivo.
Uji In Vivo Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Dua senyawa metabolit cendawan endofit terpilih diuji secara in vivo untuk
perlakuan benih. Pengujian dilakukan mengikuti metode Ilyas et al. (2007) yang
dimodifikasi. Sebanyak 100 benih padi varietas Kukubalam direndam di dalam 10
ml suspensi senyawa metabolit cendawan endofit selama 24 jam, selanjutnya
benih dikeringanginkan. Benih padi yang sudah diberi perlakuan tersebut diuji
dengan menggunakan metode blotter test dan growing on test. Pengujian blotter
test dilakukan sama seperti pada pengujian untuk mendeteksi dan mengisolasi
cendawan patogen terbawa benih. Pengujian growing on test sebanyak 25 benih
padi ditanam pada media agar air, lumpur, dan pada kertas gulung dalam plastik
(UKDp). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 4 kali. Pada blotter test,
pengamatan dilakukan terhadap tingkat infeksi cendawan pada benih padi pada
hari ke-8. Pada growing on test, pengamatan dilakukan terhadap benih yang
berkecambah di media agar air, lumpur dan kertas gulung, sedangkan pengamatan
dilakukan terhadap tingkat infeksi patogen pada media agar air dan lumpur pada
hari ke-15. Tingkat infeksi dihitung dengan rumus berikut:
Tingkat infeksi =
Keterangan:
A
x 100%
B
A = jumlah tanaman terinfeksi
B = jumlah tanaman yang tumbuh
Analisis Data
Pengujian penghambatan pertumbuhan cendawan patogen dengan uji
metabolit menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan masing-masing
ulangan sebanyak 5 kali. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan
program Microsoft Office Excel 2007 dan Statistical Analisis System (SAS) for
Windows versi 9.1.3. Perlakuan yang menunjukkan beda nyata diuji lanjut dengan
uji selang berganda duncan pada taraf 5%.
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Cendawan Endofit Tanaman Padi
Sebanyak 30 isolat cendawan endofit berhasil diisolasi dari bagian akar,
batang, dan daun tanaman padi sehat varietas Ciherang dan Kukubalam asal
Sumatera Utara (Tabel 1). Isolat cendawan endofit terbanyak diisolasi dari
tanaman padi varietas Ciherang berasal dari daun sedangkan pada varietas
Kukubalam isolat cendawan endofit yang paling banyak berasal dari akar.
Cendawan endofit adalah cendawan yang hidup di dalam jaringan tanaman,
sehingga hidupnya tidak terlepas dari pengaruh metabolisme tanaman inang.
Cendawan endofit hidup dan menempati bagian-bagian organ tanaman seperti
akar, daun, batang, ranting, xilem, dan benih. Dominasi spesies cendawan endofit
yang mengolonisasi bagian tanaman inang dapat berbeda dari masing-masing
bagian tanaman maupun varietas tanaman. Keragaman cendawan endofit dalam
mengolonisasi tanaman inang dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya
perbedaan varietas tanaman inang, curah hujan, dan lokasi pengambilan sampel
(Petrini 1992).
Tabel 1 Hasil isolasi cendawan endofit asal tanaman padi varietas Ciherang dan
varietas Kukubalam
Asal Bagian
Tanaman
Akar
Batang
Daun
Benih
Jumlah
Varietas
Ciherang
2
6
7
1
16
Total
Kukubalam
10
2
1
1
14
12
8
8
2
30
Kelimpahan dan keragaman cendawan endofit dipengaruhi oleh faktor
biotik dan abiotik. Faktor biotik meliputi varietas dan spesies inang, sedangkan
faktor abiotik yang berpengaruh adalah faktor-faktor cuaca yaitu suhu,
kelembaban relatif dan kadar air tanah serta teknik budidaya (Lewis et al. 1997).
Clay (1988) menyatakan bahwa cendawan endofit terdapat di dalam sistem
jaringan tumbuhan seperti daun, bunga, ranting maupun akar tumbuhan.
Keberadaan cendawan ini di dalam tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan
mampu menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotik yang bermanfaat bagi
tumbuhan inang sehingga hubungan antara cendawan endofit dengan tanaman
inangnya bersifat mutualistik.
14
14
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Berdasarkan hasil uji patogenisitas terhadap 30 isolat cendawan endofit
yang telah diisolasi dari padi varietas Ciherang dan varietas Kukubalam sebanyak
21 isolat cendawan endofit bersifat tidak patogen, yaitu tidak menimbulkan
nekrotik pada kecambah padi sehingga digunakan untuk uji selanjutnya (Tabel 2
dan Gambar 3).
Tabel 2 Hasil uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih varietas Ciherang
Varietas
Ciherang
Kukubalam
Kode Isolat
CA1
CA2
CB1
CB2
CB4
CB5
CB6
CB7
CBn
CD2
CD3
CD4
CD5
CD6
CD7
CD8
Asal Bagian Tanaman
Akar
Akar
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
Benih
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Keterangan
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Patogen
Patogen
LA2
LA3
LA4
LA6
LA7
LA8
LA9
LA11
LA12
LA14
LB1
LB3
LBn
LD1
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Batang
Batang
Benih
Daun
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
15
A
B
Gambar 3 Uji patogenisitas cendawan endofit pada benih padi varietas
Ciherang. (A) gejala nekrotik pada kecambah kontrol, dan (B)
tidak ada gejala pada kecambah perlakuan endofit
Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Hasil pengujian dengan metode blotter cendawan patogen yang terdeteksi
pada benih padi varietas Kukubalam yaitu Fusarium sp.1, Fusarium sp.2, A.
flavus, A. niger, dan hifa steril pada varietas Kukubalam dengan tingkat infeksi
berturut-turut sebesar 22%, 5%, 1.5%, 1%, dan 0.5%, sedangkan pada benih
varietas Ciherang terdeteksi Fusarium sp.1 dengan tingkat infeksi sebesar 12.5%.
Fusarium sp.1 merupakan cendawan patogen yang paling dominan menginfeksi
benih padi varietas Ciherang (12.5%) dan benih padi Kukubalam Sumatera Utara
(22%) (Tabel 3 dan Gambar 4).
Tabel 3 Tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih padi varietas Ciherang
dan Kukubalam dengan metode blotter test
Isolat
Fusarium sp. 1
Fusarium sp. 2
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Hifa steril
Tingkat infeksi (%)
Var. Ciherang
Var. Kukubalam
12.5
22.0
0.0
5.0
0.0
1.5
0.0
1.0
0.0
0.5
Utobo et al. (2011) melaporkan cendawan patogen yang sering terbawa
benih padi dari lapangan antara lain Rhizopus oryzae Went &Prins. Geerl., F.
moniliforme, Aspergillus niger, Curvularia lunata (Wakker) Boedijn, Penicillium
sp, Alternaria padwickii, dan Pyricularia oryzae.
Gambar 4 Isolat patogen cendawan terbawa benih padi. (A) Fusarium sp.1, (B)
Fusarium sp.2, (C) Aspergillus niger, (D) Aspergillus flavus, dan (E)
Hifa steril
16
16
Daya Hambat Isolat Cendawan Endofit terhadap Fusarium sp.1
Hasil uji antagonis terhadap Fusarium sp.1 menunjukkan seluruh isolat
cendawan endofit mampu menghambat pertumbuhan koloni cendawan patogen
Fusarium sp.1 antara 35.7-67.1% pada hari ke-7. Sebanyak 11 isolat cendawan
endofit di antaranya mempunyai daya hambat lebih dari 50% (Tabel 4). Isolat
cendawan endofit LA6, LA11, dan LA14 merupakan cendawan endofit yang
sangat berpotensi menekan pertumbuhan cendawan patogen (Fusarium sp.1),
masing-masing dengan daya hambat 67.1%, 59.3%, dan 64.7%.
Interaksi antara cendawan endofit dan tanaman inangnya umumnya bersifat
simbiosis mutualisme. Cendawan endofit dapat berada di dalam tumbuhan sehat
pada jaringan tertentu dan mampu menghasilkan mikotoksin, enzim serta
antibiotik (Carrol 1988). Penghambatan dengan senyawa metabolit yang dimiliki
tiap isolat berbeda-beda karena kandungan metabolit yang berbeda tiap isolatnya.
Tabel 4 Daya hambat cendawan endofit potensial terhadap pertumbuhan koloni
Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
Varietas
Kode
Isolat
CA1
CB1
CB2
CB4
CB5
CB6
CB7
CD2
CD3
CD4
CD6
4
14.8
15.0
24.0
15.0
17.8
9.2
32.7
17.4
0.0
10.1
16.9
Kukubalam LA2
LA3
LA6
LA7
LA9
LA11
LA14
LB1
LB3
LD1
13.1
29.4
32.1
15.9
17.0
10.6
34.1
1.3
13.8
0.0
Ciherang
Daya hambat (%) hari ke5
6
29.4
39.0
36.8
44.0
41.8
50.3
26.9
3
SEBAGAI ALTERNATIF PENGENDALIAN EFEKTIF
CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH PADI
ARIFDA AYU SWASTINI WARUWU
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Senyawa Metabolit
Cendawan Endofit sebagai Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan
Patogen Terbawa Benih Padi adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Arifda A S Waruwu
NIM A352130101
RINGKASAN
ARIFDA AS WARUWU. Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai
Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi.
Dibimbing oleh BONNY PW SOEKARNO dan ABDUL MUNIF.
Prioritas utama bidang pertanian dalam rangka menjaga stabilitas pangan
nasional yaitu peningkatan produksi padi. Salah satu masalah dalam produksi padi
disebabkan karena infeksi hama dan penyakit tanaman. Infeksi cendawan patogen
terbawa benih pada tanaman padi di Indonesia menjadi masalah utama yang
berpengaruh terhadap produksi padi yang menurun dari waktu ke waktu.
Pemanfaatan cendawan endofit merupakan salah satu alternatif pengendalian yang
dapat digunakan untuk mengendalikan patogen terbawa benih. Perlu adanya
metode baru yang ramah lingkungan untuk mengendalikan patogen terbawa
benih. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi cendawan endofit potensial
asal tanaman padi yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen
terbawa benih padi dan memanfaatkan metabolit cendawan endofit untuk
menekan cendawan patogen benih terbawa benih padi.
Penelitian ini terdiri atas 7 tahapan, yaitu 1) isolasi cendawan endofit
dengan cara sterilisasi permukaan bagian tanaman padi dengan menggunakan
NaOCl 1% dan alkohol 70%, 2) uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih
padi varietas Ciherang yang telah disterilisasi permukaan, 3) isolasi cendawan
patogen terbawa benih padi asal varietas Ciherang dan Kukubalam dengan metode
blotter test, 4) uji antagonis isolat cendawan endofit terhadap cendawan patogen
terbawa benih dengan metode kultur ganda, 5) produksi dan analisis senyawa
metabolit cendawan endofit, 6) uji senyawa metabolit cendawan endofit secara in
vitro, dan 7) uji in vivo senyawa metabolit cendawan endofit dengan 3 media yaitu
agar air, kertas, dan lumpur.
Cendawan endofit yang berhasil diisolasi sebanyak 21 isolat dan isolat yang
digunakan pada uji senyawa metabolit sebanyak 3 isolat cendawan endofit
potensial sebagai agen biokontrol terhadap cendawan patogen terbawa benih
Fusarium sp.1. Tiga isolat cendawan endofit tersebut yaitu LA6, LA11, dan
LA14. Metabolit isolat LA11 menunjukkan persentase penghambatan tertinggi
terhadap Fusarium sp.1 yaitu 28.97% dan metabolit isolat LA14 dengan
persentase penghambatan 28.72%. Aplikasi metabolit cendawan endofit dengan
perendaman benih padi menunjukkan pengurangan infeksi cendawan patogen
terbawa benih padi. Hal ini ditunjukkan oleh isolat LA11 dan LA14 mampu
menghambat pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih secara potensial.
Cendawan endofit menghasilkan metabolit yang sebagian senyawa
metabolit bersifat antifungal. Senyawa antifungal yang dihasilkan cendawan
endofit dapat melindungi tanaman dari serangan mikroba patogen sehingga dapat
dimanfaatkan sebagai biokontrol. Metabolit cendawan endofit juga mampu
memperbaiki pertumbuhan tanaman dan sistem perakaran tanaman.
Kata kunci: metabolit sekunder, biokontrol, antifungal, Fusarium sp.
SUMMARY
ARIFDA AS WARUWU. Metabolites Compound of Endophytic Fungi as an
Alternative to Control Seed-borne Pathogen Fungi on Rice. Supervised by
BONNY PW SOEKARNO and ABDUL MUNIF.
The major priority of agriculture in order to maintain the stability of
national food is increasing of rice production. One problem in rice production is
due to the infection of plant pests and diseases. Seed-borne fungal pathogenic
infections on the rice crop in Indonesia, which effects the production of rice, is
subject to the most intense scientific scrutiny in recent years. Utilization of
endophytic fungi is one alternative that can be used to control seed-borne
pathogens. New eco-friendly methods are needed to control the effect of seedborne fungal pathogens. This study aimed to explore the origin of the rice plant
endophytic fungus capable of inhibiting the growth of seed-borne pathogens and
using metabolites of endophytic fungi to suppress seed-borne fungal pathogens of
rice seeds.
This study consisted of 7 stages, 1) the isolation of the endophytic fungi by
sterilize the surface of rice plant with 1% NaOCl and 70% alcohol, 2) the
pathogenicity test of isolated endophytic fungi against Ciherang rice seeds, 3) the
isolation of seed-borne pathogens by blotter test method, 4) the inhibition test of
isolated endophytic fungi against pathogenic fungi by dual culture method, 5) the
production and analysis of metabolites of endophytic fungi, 6) the inhibition test
of isolated endophytic fungi metabolites on seed-borne pathogenic fungi, and 7)
the in vivo test of metabolites of endophytic fungi with 3 media, that is water
agar, paper, and muds.
Endophytic fungi has been succeeded to isolate 21 isolates and 3 isolates
were potential as a biocontrol agent against Fusarium sp.1 as pathogenic fungi.
The three isolates of endophytic fungi namely LA6, LA11, and LA14. Metabolite
of LA11 isolate showed the highest inhibition percentage against the Fusarium
sp.1by 28.97% and LA14 isolate with inhibition percentage by 28.72%.
Metabolite of endophytic fungi which used to cover rice seed through soaked the
seed enabled to reduce seed-borne pathogen fungi. It showed that LA11 and LA14
isolate have an inhibition potential to reduce growth of seed-borne pathogen
fungi.
Endophytic fungi produce metabolite as antifungal. Antifungal compound
that produced by endophytic fungi can protect plant from pathogenic fungal acts,
so it can be a biocontrol. Metabolite of endophytic fungi also can repair the grow
of plant and the plant root system.
Keywords: secondary metabolite, biocontrol, antifungal, Fusarium sp.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
SENYAWA METABOLIT CENDAWAN ENDOFIT
SEBAGAI ALTERNATIF PENGENDALIAN EFEKTIF
CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH PADI
ARIFDA AYU SWASTINI WARUWU
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr Ir Titiek Siti Yuliani, SU
Judul Tesis : Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai Alternatif
Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Nama
: Arifda Ayu Swastini Waruwu
NIM
: A352130101
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Bonny PW Soekarno, MS
Ketua
Dr Ir Abdul Munif, MScAgr
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Fitopatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
28 Oktober 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 ini ialah
cendawan endofit, dengan judul Senyawa Metabolit Cendawan Endofit sebagai
Alternatif Pengendalian Efektif Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Bonny PW Soekarno, MS dan
Dr Ir Abdul Munif, MSc Agr selaku komisi pembimbing, dan juga kepada Dr Ir
Titiek Siti Yuliani, SU selaku penguji luar komisi yang telah memberikan arahan,
saran, dan motivasi bagi penulis dalam proses penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktorat
Jenderal Pendidikan (Dikti) Kemdikbud yang telah memfasilitasi biaya
pendidikan melalui Beasiswa Unggulan (BU). Selain itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Kepala UPT. Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura
1 Medan yang telah memberi izin penggunaan Laboratorium pada proses isolasi
cendawan endofit dari tanaman padi asal Sumatera Utara. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada ayahanda Filizaro Waruwu, ibunda Nurdiana dan
seluruh keluarga untuk kasih sayang, segala doa dan dukungannya, serta kepada
para sahabat yang telah memberikan motivasi kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2015
Arifda AS Waruwu
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
vi
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
3
3
3
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi Padi
Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Cendawan Endofit dari Tanaman Padi
Metabolit Cendawan Endofit
4
4
4
5
7
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Alat
Isolasi Cendawan Endofit
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Uji Antagonis Isolat Cendawan Endofit terhadap Cendawan Patogen
Produksi dan Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Uji Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Uji In Vivo Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Cendawan Endofit Tanaman Padi
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Daya Hambat Isolat Cendawan Endofit terhadap Fusarium sp.1
Daya Hambat Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Pengaruh Senyawa Metabolit Cendawan Endofit secara In vivo
9
9
9
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
15
16
17
18
21
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
25
25
25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
30
RIWAYAT HIDUP
33
DAFTAR TABEL
1 Hasil isolasi cendawan endofit asal tanaman padi varietas Ciherang dan
varietas Kukubalam
2 Hasil uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih varietas
Ciherang
3 Tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih padi varietas Ciherang
dan Kukubalam dengan metode blotter test
4 Daya hambat cendawan endofit potensial terhadap pertumbuhan koloni
Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
5 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap pertumbuhan
koloni Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
6 Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit LA11 pada
pengujian Py-GC-MS
7 Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit LA14 pada
pengujian Py-GC-MS
8 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap tingkat infeksi
patogen terbawa benih padi dengan menggunakan metode blotter test
9 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap daya
kecambah benih padi dengan metode kertas gulung, media agar air, dan
lumpur
10 Tingkat infeksi dan penekanan tingkat infeksi cendawan patogen
Fusarium sp.1 pada media agar air dan lumpur
13
14
15
16
17
19
20
22
22
23
DAFTAR GAMBAR
1 Bagan alir penelitian senyawa metabolit cendawan endofit sebagai
alternatif pengendalian efektif cendawan patogen terbawa benih padi
2 Skema uji antagonis cendawan endofit (a) dan cendawan patogen (b)
pada media PDA secara in vitro
3 Uji patogenisitas cendawan endofit pada benih padi varietas Ciherang.
(A) gejala nekrotik pada kecambah kontrol, dan (B) tidak ada gejala
pada kecambah perlakuan endofit
4 Isolat patogen cendawan terbawa benih. (A) Fusarium sp.1, (B)
Fusarium sp.2, (C) Aspergillus niger, (D) Aspergillus flavus, dan (E)
Hifa steril
5 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap pertumbuhan
Fusarium sp.1
6 Pengaruh senyawa metabolit cendawan endofit terhadap daya
berkecambah padi pada media agar air dengan perlakuan K(-), LA11,
LA14, dan K(+) pada hari ke-15
7 Pengaruh senyawa metabolit terhadap panjang akar dan tinggi kecambah
padi di media agar air dan lumpur pada hari ke-15
3
11
15
15
18
22
23
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil analisis senyawa metabolit LA11
2 Hasil analisis senyawa metabolit LA14
3 Beberapa isolat cendawan endofit yang diisolasi
30
31
32
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi adalah komoditas utama pertanian di Indonesia. Sebagian besar
penduduk Indonesia mengonsumsi beras sebagai makanan pokok. Konsumsi beras
di Indonesia yang tinggi menuntut tingkat produksi beras yang besar pula.
Berdasarkan data Badan Pusat Statistik (BPS 2015), produksi padi di Indonesia
pada tahun 2014 sebesar 70.83 juta ton gabah kering giling (GKG), mengalami
penurunan sebanyak 450.000 ton dari produksi tahun 2013 sebesar 71.28 juta ton
GKG. Salah satu penyebab penurunan produksi padi adalah gangguan dari hama
dan penyakit tumbuhan. Produksi padi yang meningkat tidak terlepas dari kualitas
benih. Ketersediaan benih bermutu menjadi faktor penentu produktivitas
komoditas pertanian. Benih padi yang bermutu dan tersertifikasi sangat penting
untuk mendapatkan produksi padi atau beras yang tinggi dan berkualitas. Mutu
benih dilihat dari empat aspek, yaitu mutu fisik, mutu genetik, mutu fisiologis,
dan kesehatan benih. Salah satu aspek penting dalam menentukan kualitas suatu
benih adalah kesehatan benih. Pada proses penyimpanan tidak sedikit dari benih
padi mengalami kerusakan baik dari segi tekstur, aroma, bahkan kandungannya.
Kerusakan pada benih biasanya terjadi akibat adanya serangan serangga, tungau,
burung, dan mikroorganisme patogen seperti cendawan dan bakteri (Agarwal dan
Sinclair 1997). Sebagian cendawan patogen penyebab penyakit pada padi dapat
terbawa benih.
Cendawan patogen terbawa benih padi antara lain Alternaria padwickii
(Ganguly) Ellis, Pyricularia oryzae Sacc., Fusarium solani (Mart.) Sacc., F.
moniliforme Sheld, Phoma sp., Helminthosporium oryzae Breda de Haan,
Chaetomium sp., Aspergillus spp., Curvularia sp., Cercospora oryzae Miyake,
dan Rhizoctonia solani Kuhn. Fusarium sp. merupakan cendawan patogen yang
terbawa benih dalam kisaran luas. Beberapa spesies di antara cendawan tersebut
dapat memproduksi mikotoksin dalam biji-bijian yang berbahaya bagi kesehatan
manusia dan hewan. Fusarium sp. juga dapat menyebabkan penyakit layu pada
tanaman dan bersifat sistemik. Kerugian yang ditimbulkan cendawan patogen
terbawa benih adalah pertumbuhan tanaman yang kurang baik dan tersedianya
sumber inokulum patogen sejak awal tanaman tumbuh di lapangan. Selain itu,
cendawan patogen terbawa benih juga dapat menurunkan kualitas benih seperti
menurunnya daya kecambah padi (Agarwal dan Sinclair 1997). Infeksi cendawan
patogen terbawa benih terhadap pertanaman padi di Indonesia berdampak
terhadap penurunan produksi hasil padi. Upaya untuk mengendalikan cendawan
patogen terbawa benih padi telah banyak dilakukan. Cara pengendalian cendawan
patogen terbawa benih yang sering dilakukan adalah pemakaian fungisida sintetis.
Meskipun demikian masih perlu dilakukan upaya untuk mengembangkan cara
pengendalian patogen terbawa benih yang efektif, berkelanjutan dan berwawasan
lingkungan.
Secara alamiah, pada suatu ekosistem terdapat simbiosis antara
mikroorganisme, tanaman dan lingkungannya. Mikroorganisme yang hidup dalam
tanaman inang ada yang bersifat merugikan dan menguntungkan. Mikroorganisme
yang tidak menimbulkan efek merugikan pada inang tanaman, diantaranya
2
2
organisme endofit yang dapat hidup dalam organ tanaman dan mampu
mengolonisasi di dalam jaringan tanaman tanpa menyebabkan kerusakan pada
inangnya. Cendawan endofit adalah cendawan yang semua atau sebagian dari
siklus hidupnya berada di dalam jaringan tanaman sehat dan tidak
memperlihatkan gejala penyakit (Schulz dan Boyle 2005). Banyak kelompok
cendawan endofit yang mampu memproduksi senyawa antibiotik yang aktif
menekan pertumbuhan bakteri maupun cendawan patogen (Petrini 1992).
Senyawa antimikroba yang dihasilkan beberapa cendawan endofit pada
tanaman mampu melindungi tanaman inang dari infeksi patogen penyebab
penyakit tanaman. Untuk itu, cendawan endofit dapat dimanfaatkan sebagai
alternatif cara pengendalian hayati penyakit pada tanaman (Schulz dan Boyle
2005). Telah banyak penelitian mengenai metabolit cendawan endofit mampu
mengendalikan pertumbuhan cendawan patogen.
Senyawa metabolit yang dihasilkan cendawan endofit seperti alkaloid pada
tanaman rumput-rumputan mampu melindungi inang dari serangan invertebrata
herbivora, nematoda dan patogen. Cendawan endofit dapat memberi keuntungan
kepada tanaman yaitu meningkatkan ketahanan terhadap serangga dan mamalia
herbivora, meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit, memacu
pertumbuhan dan meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan dan suhu
tinggi (Lehtonen et al. 2005). Saat ini telah dikembangkan cara pengendalian
cendawan patogen terbawa benih dengan memanfaatkan senyawa yang dihasilkan
mikroba endofit. Sebagian senyawa metabolit mikrobaendofit telah terbukti
memiliki aktivitas antimikroba sehingga melindungi tanaman inang dari patogen
penyebab penyakit tanaman. Sebagai contoh, senyawa metabolit dari cendawan
endofit Phomopsis sp. bersifat antibakteri dan antifungal terhadap Bacillus
megaterium dan Microbotryum violaceum (Pers.) G. Deml & Oberw. (Hussain et
al. 2009). Kemampuan cendawan endofit memproduksi metabolit sekunder
merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi
senyawa dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut.
Perumusan Masalah
Cendawan patogen terbawa benih merupakan salah satu kendala dalam
usaha untuk meningkatkan produksi benih padi berkualitas. Upaya pengendalian
cendawan patogen umumnya masih menggunakan pestisida sintetik sebagai
metode pengendalian yang banyak digunakan. Namun, akibat dari penggunaan
pestisida secara berlebihan dan terus menerus dapat mengakibatkan dampak yang
negatif terhadap lingkungan. Untuk itu perlu dikembangkan cara pengendalian
cendawan patogen terbawa benih yang efektif dan ramah lingkungan. Salah satu
cara pengendalian tersebut adalah pemanfaatan cendawan endofit untuk menekan
pertumbuhan cendawan patogen. Selain itu, potensi metabolit cendawan endofit
dalam menekan pertumbuhan cendawan patogen benih juga belum banyak
dikembangkan.
3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi cendawan endofit potensial
asal tanaman padi yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen
terbawa benih padi dan memanfaatkan senyawa metabolit cendawan endofit untuk
menekan patogen terbawa benih padi.
Manfaat Penelitian
Penelitian diharapkan menemukan cara pengendalian yang tepat dengan
menggunakan metabolit dari cendawan endofit asal tanaman padi untuk
mengendalikan perkembangan patogen terbawa benih padi.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah isolasi cendawan endofit dari tanaman
padi, uji patogenisitas cendawan endofit, isolasi cendawan patogen terbawa benih
padi, uji antagonis isolat cendawan endofit terhadap cendawan patogen, produksi
dan analisis senyawa metabolit cendawan endofit, uji senyawa metabolit
cendawan endofit, dan uji in vivo senyawa metabolit cendawan endofit
(Gambar 1).
Isolasi cendawan
endofit
Isolasi cendawan patogen
terbawa benih padi
Uji patogenisitas
cendawan endofit
Karakterisasi
cendawan patogen
Uji antagonis
Produksi senyawa metabolit
cendawan endofit
Analisis senyawa
metabolit
Uji senyawa metabolit
cendawan endofit
Uji in vivo senyawa
metabolit cendawan endofit
Gambar 1 Bagan alir penelitian senyawa metabolit cendawan endofit sebagai
alternatif pengendalian efektif cendawan patogen terbawa benih padi
4
4
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi padi
Tanaman padi dalam taksonomi tumbuhan diklasifikasikan ke dalam divisio
Spermatophyta, subdivisio Angiospermae, kelas Monocotyledoneae, ordo adalah
Poales, famili adalah Graminae, genus adalah Oryza Linn, dan spesiesnya adalah
Oryza sativa L (Grist 1960). Padi merupakan tanaman yang tumbuh di atas tanah
yang digenangi air. Padi juga dapat tumbuh di tanah daratan atau tanah kering,
apabila curah hujan mampu mencukupi kebutuhan akan air. Padi termasuk
golongan Gramineae ditandai dengan batang yang tersususn dari beberapa ruas
(Siregar 1981). Tanaman padi merupakan tanaman pangan yang penting dan
makanan pokok bagi sebagian besar penduduk di Asia. Walaupun konsumsi beras
bervariasi antarnegara, namun sumbangan beras terhadap pemenuhan kebutuhan
kalori masyarakat relatif cukup tinggi. Sebagai contoh Laos dan Myanmar,
konsumsi beras per kapitanya masing-masing mencapai sekitar 179 kg dan 190 kg
per tahun (Suryana et al. 2009). Berdasarkan data rata-rata selama 5 tahun (20052008), tercatat bahwa Bangladesh merupakan negara dengan penyediaan beras per
kapita terbesar di dunia yakni mencapai 171.14kg/kapita/tahun, disusul Republik
Demokratik Laos dan Kamboja masing-masing sebesar 163.48 kg/kapita/tahun
dan 159.08 kg/kapita/tahun. Indonesia menduduki urutan keempat sebagai negara
dengan penyediaan beras terbesar di dunia dengan rata-rata sebesar 148.62
kg/kapita/tahun (Respati et al. 2014). Peningkatan jumlah penduduk mendorong
banyak negara di Asia untuk terus mengembangkan teknologi yang mampu
meningkatkan produktivitas padi.
Peningkatan dalam produksi padi masih merupakan prioritas utama
pembangunan di bidang pertanian guna menjaga stabilitas pangan secara nasional
dan untuk memenuhi kebutuhan masyarakat. Beberapa tahun terakhir, impor beras
dilakukan untuk memenuhi kebutuhan di dalam negeri. Konsumsi beras tahun
2014 diperkirakan sebesar 97.67 kg/kapita/tahun atau naik sebesar 0.27%
dibandingkan tahun 2013 (Respati et al. 2014). Kelangkaan beras terjadi antara
lain karena menyempitnya areal persawahan, kendala yang bersifat abiotik seperti
lingkungan dan biotik seperti serangan hama dan penyakit.
Penyakit padi yang disebabkan oleh mikroorganisme merupakan hambatan
dalam produksi padi. Ada sekitar 60 jenis penyakit pada tanaman padi yang
disebabkan virus, bakteri, cendawan, nematoda dan lainnya (Ou 1985). Akibat
aktifitas patogen tersebut, menyebabkan penurunan produksi padi baik kuantitas
maupun kualitas.
Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Cendawan merupakan kelompok patogen terbesar yang dapat tertular atau
terbawa pada benih. Cendawan patogen adalah kelompok mikroorganisme
terbesar penyebab penyakit pada tanaman. Persentase terbesar cendawan patogen
tanaman bersifat nekrotrof-saprofit yang mampu menggunakan nutrisi bebas dari
jaringan tanaman yang luka atau jaringan hidup yang terinfeksi. Beberapa
5
cendawan patogen masuk ke dalam jaringan tanaman dan benih melalui lubang
alami, seperti hidatoda, lentisel, mikrofil, dan pembukaan stomata, dan melalui
luka oleh hujan, pasir, hewan, serangga, manusia, dan mikroorganisme lainnya,
sedangkan cendawan patogen lain menggunakan tekanan mekanik, sekresi enzim
degradasi atau keduanya untuk mempenetrasi jaringan tanaman dan benih secara
langsung. Patogen pada benih dan jaringan inang menyebabkan adanya gejala atau
tanda penyakit pada tanaman. Namun, beberapa cendawan tidak menghasilkan
gejala selama siklus hidupnya di dalam jaringan tanaman inang (Agarwal dan
Sinclair 1997).
Cendawan patogen terbawa benih padi dapat dikelompokkan menjadi 3
yaitu, cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada daun padi,
cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada batang, pelepah dan
akar padi, dan cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit pada biji.
Penyakit paling penting yang disebabkan oleh cendawan patogen terbawa benih
yaitu blas, hawar pelepah, busuk akar, dan penyakit pada pembibitan karena
menghancurkan tanaman apabila lingkungan dan kondisi pertanaman sesuai bagi
perkembangan patogen (Agarwal dan Sinclair 1997).
Kerugian yang ditimbulkan oleh cendawan patogen terbawa benih antara
lain pertumbuhan tanaman yang kurang baik dan tersedianya sumber inokulum
patogen sejak awal tanaman tumbuh di lapangan. Cendawan patogen terbawa
benih juga dapat menurunkan kualitas benih seperti daya kecambah benih
menurun, bahkan beberapa cendawan patogen tertentu tidak hanya menurunkan
kualitas benih, juga menyebabkan benih yang terinfeksi menjadi sangat beracun
(Sutopo 1993).
Cendawan merupakan kelompok patogen yang dapat terbawa benih padi.
Menurut data UPT Balai Pengawasan dan Sertifikasi Benih Sumatera Utara
(BPSB SUMUT 2013), cendawan patogen yang sering menginfeksi benih padi
antara lain Aspergillus sp., Fusarium sp., Pyricularia oryzae, Alternaria
padwickii, Helminthosporium sp., dan Cercospora oryzae. A. padwickii
merupakan salah satu cendawan terbawa benih padi yang dilaporkan paling sering
dan paling banyak menginfeksi benih padi (Astuti et al. 2009). Tingkat infeksi
oleh A. padwickii pada tanaman padi mencapai 80-90% di daerah Tropis (Mew
dan Gonzales 2002).
Penyakit busuk batang oleh Sclerotium oryzae Catt. dapat menimbulkan
kehilangan hasil panen padi sebesar 10-80%. Rhizoctonia solani Kuhn penyebab
penyakit hawar pelepah daun menurunkan produksi padi hingga 20%, dan
penyakit bakanae yang disebabkan oleh F. moniliforme pernah dilaporkan tahun
1938 di daerah Cirebon juga menurunkan hasil panen padi. Kehilangan hasil padi
yang disebabkan Helminthosporium oryzae di Indonesia pernah mencapai 100%
pada pertanaman padi gogo. Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan
patogen P. oryzae merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman padi di
seluruh dunia dengan kehilangan hasil berkisar antara 50-90% (Utami et al. 2005).
Cendawan Endofit Tanaman Padi
Endofit merupakan mikroorganisme yang hidup di dalam jaringan
tumbuhan tanpa menimbulkan gejala penyakit pada tanaman inang (Strobel 2003).
6
6
Penggunaan istilah endofit sering digunakan untuk organisme yang menginfeksi
secara internal, dimana jaringan inang yang terinfeksi setidaknya tanpa gejala
untuk sementara, berlaku untuk prokariot dan eukariot. Endofitik mencakup
kumpulan mikroorganisme dengan strategi hidup yang berbeda yaitu mengikuti
fase pertumbuhan endofit, tumbuh saprofit pada jaringan yang mati atau gugur,
mikroorganisme avirulen, tetapi juga patogen laten dan patogen virulen pada
tahap awal infeksi. Interaksi parasit dapat bervariasi dari mutualistik sampai
komensalistik pada patogen laten dan eksploitatif (Schulz dan Boyle 2005).
Cendawan endofit adalah kelompok mikroorganisme sangat beragam dan
dapat berkembang dalam jaringan tanaman yang ada di atas tanah serta di bawah
tanah, termasuk batang, daun, dan akar tanpa menimbulkan gejala (Kusari et al.
2012). Cendawan endofit adalah cendawan yang mampu hidup di dalam jaringan
tanaman. Cendawan endofit terdapat di semua bagian tanaman, terutama di bagian
daun. Pada jaringan tanaman sehat, cendawan endofit dapat berperan sebagai
epifit, endofit, atau patogen laten (Maheswari 2006). Cendawan endofit
bersimbiosis mutualisme pada inangnya untuk mendapatkan nutrisi dari hasil
metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman dari herbivora, serangga, atau
patogen, sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang
diperlukan selama hidupnya (Simarmata et al. 2007). Cendawan endofit dapat
ditemukan hampir di seluruh jenis tanaman, termasuk pada tanaman padi.
Beberapa contoh spesies cendawan endofit yang mendominasi tanaman padi
yaitu Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Paecilomyces sp.,
Gilmaniella sp., Arthrobotrys foliicola Matsush., Trichoderma sp., Trichocladium
sp., dan Nigrospora sp. (Zakaria et al. 2010; Manurung et al. 2014). Fusarium sp.
banyak membentuk populasi pada bagian daun sebesar 40.9% dan pada bagian
akar sebesar 56.9%. Nigrospora sp. diketahui sebagai cendawan patogen benih
pada tanaman padi, tetapi bukan termasuk patogen yang menimbulkan kerusakan
berarti pada padi. Terdapat hubungan simbiosis mutualisme antara cendawan
endofit dan tumbuhan inangnya yaitu hubungan yang saling menguntungkan.
Cendawan endofit dapat melindungi tumbuhan inang dari serangan patogen
dengan senyawa yang dikeluarkan oleh cendawan endofit. Senyawa yang
dikeluarkan cendawan endofit berupa senyawa metabolit sekunder yang
merupakan senyawa bioaktif dan dapat berguna dalam menghambat dan
mengendalian pertumbuhan cendawan patogen. Tumbuhan inang menyediakan
nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba endofit untuk melengkapi siklus hidupnya
(Sunarminingsih 2002).
Ketika cendawan endofit dapat berkembang dari tanaman yang terinfeksi
cendawan patogen, ketahanan tanaman terhadap serangan patogen bisa dipicu
oleh cendawan endofit. Pertahanan tanaman yang berhubungan dengan cendawan
endofit meningkat melalui peningkatan ketahanan dan produksi metabolit
sekunder (Gao et al. 2010).
Mekanisme cendawan endofit dalam melindungi tanaman terhadap serangan
patogen meliputi: (1) penghambatan pertumbuhan patogen secara langsung
melalui senyawa antibiotik dan enzim litik yang dihasilkan; (2) penghambatan
secara tidak langsung melalui induksi ketahanan tanaman oleh cendawan endofit
terhadap tanaman yang merangsang pembentukan metabolit sekunder seperti
asam salisilat, asam jasmonat, dan etilen yang berfungsi dalam meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap serangan patogen atau yang berfungsi sebagai
7
antimikroba seperti fitoaleksin; (3) perangsangan pertumbuhan tanaman sehingga
lebih tahan terhadap serangan patogen; (4) kolonisasi jaringan tanaman sehingga
patogen sulit penetrasi; dan (5) hiperparasit (Gao et al. 2010).
Penelitian pemanfaatan cendawan endofit semakin berkembang. Sebagai
contoh cendawan endofit Pestalotiopsis microspora (Speg.) diketahui berperan
sebagai obat antikanker yang mengolonisasi sejenis pohon cemara di Himalaya.
Beberapa spesies cendawan endofit lain diteliti sebagai sumber antikanker,
antidiabetes. Cendawan endofit juga mampu menghasilkan senyawa metabolit
yang berfungsi dalam pertahanan tanaman inang terhadap kondisi lingkungan
yang ekstrim, seperti Curvularia sp. pada tanaman di daerah gunung berapi di
Amerika Serikat (Maheswari 2006).
Beberapa cendawan telah diketahui mampu menekan infeksi penyakit pada
tanaman yang disebabkan oleh patogen Xylariaceae, Calocybe gambosa (Fr.)
Donk, Resinicium friabile Hjortstam & Melo,dan Aschersonia Endl. merupakan
cendawan endofit yang mampu menekan keparahan penyakit busuk buah alpukat
(Tondok et al. 2012). Fusarium solani (Mart.) Sacc., Acremonium zeae W. Gams
& D.R. Sumner, Verticillium sp., P. cassiae, Muscodor albus Worapong,
Periconia sp., Ampelomyces sp., Neotyphodium lolii (Latch, M.J. Chr. & Samuels)
adalah cendawan endofit yang telah dikembangkan sebagai pengendali hayati
terhadap hama dan penyakit pada tanaman (Gao et al. 2010). Hasil penelitian
Melliawati et al. (2006) menunjukkan bahwa cendawan endofit dapat
menghasilkan senyawa aktif yang berguna untuk memproteksi serangan mikroba
patogen tanaman, seperti Xanthomonas campestris, Pseudomonas solanacearum
A.C Hayward, Colletroticum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc, dan
F.oxysporum. Hasil analisis menunjukkan bahwa endofit ternyata mengandung
senyawa aktif steroid yang mampu menghambat pertumbuhan mikroba patogen.
Cendawan endofit Trichoderma spp. dilaporkan dapat meningkatkan
ketahanan terinduksi tanaman kedelai terhadap penyakit layu Fusarium, memacu
pertumbuhan tinggi tanaman kedelai, cendawan saprofit T. harzianum dan T.
hamtum memacu keluarnya bunga lebih awal, menambah polong isi dan bobot biji
kering kedelai per tanaman (Sudantha 2010). Cendawan endofit Taxomyces
andreanae D. Stierle & W.M. Hessyang mampu menghasilkan senyawa
antikanker, yaitu taxol. Senyawa ini ternyata juga dihasilkan oleh tumbuhan
inangnya yaitu Taxus brevifolia bark. Cendawan endofit mampu menghasilkan
senyawa yang sama dengan senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan inangnya,
namun hal ini jarang terjadi. Senyawa yang dihasilkan cendawan endofit
umumnya berbeda dengan senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan inangnya
(Strobel 2003).
Metabolit Cendawan Endofit
Metabolit sekunder yang dihasilkan cendawan endofit diduga sebagai akibat
koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke
dalam mikroba endofit. Apabila cendawan endofit yang diisolasi dari suatu
tanaman dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan
tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi (Radji 2005).
Metabolit sekunder tertentu hanya ditemukan pada organisme spesifik, atau
8
8
bahkan strain yang spesifik, dan hanya diproduksi pada kondisi-kondisi tertentu
(Dewick 1999). Mekanisme elisitor endofit menginduksi metabolit sekunder
adalah mirip dengan stimulasi ketahanan tanaman. Kolonisasi cendawan endofit
mensekresi enzim hidrolase dari sel tanaman untuk membatasi pertumbuhan
cendawan, dengan demikian fragmen endofit bertindak sebagai elisitor, yang
diproduksi dari hidrolisasi. Elisitor seperti lipopolisakarida, polisakarida dan
glikoprotein akan merangsang pertahanan tanaman dan metabolit sekunder
tanaman yang akan menekan pertumbuhan patogen (Gao et al. 2010).
Metabolit sekunder diduga merupakan produk samping (waste products)
dari proses metabolisme primer dan tidak dimanfaatkan oleh organisme yang
menghasilkan metabolit sekunder. Alasannya, sebagai waste product, metabolit
sekunder harus bersifat tidak dapat lagi dimanfaatkan oleh organisme
penghasilnya. Namun pada kenyataannya, beberapa alkaloid seperti asam-amino
non protein, glikosida sianogen (kesemuanya metabolit sekunder) masih dapat
mengalami biodegradasi dan dimanfaatkan pada masa germinasi dari spora
organisme penghasil metabolit. Eksplorasi metabolit sekunder secara ekstensif
dan intensif dilengkapi dengan pengembangannya ternyata tidak hanya
menghasilkan senyawa bersifat antibiotik saja tetapi juga sifat farmako-aktif
lainnya seperti: antifungal, antiviral, antitumor, sitotoksik, imunosupresif,
promotor pertumbuhan, antiparasitik, insektisida, herbisida (Sunarminingsih
2002).
Berbagai cendawan endofit telah diisolasi dari tanaman inangnya dan
berhasil dibiakkan dalam media pertumbuhan yang sesuai. Demikian pula
metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil
diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya. Mikroba
endofit yang menghasilkan antibiotik kriptokandin adalah antifungal yang
dihasilkan oleh cendawan endofit Cryptosporiopsis quercina Petr. yang berhasil
diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan bersifat sebagai antifungal
terhadap cendawan penyebab penyakit pada manusia yaitu Candida albicans
(Strobel et al. 1999). Cendawan endofit Pestalotiopsis micrispora menghasilkan
metabolit sekunder asam ambuik yang berkhasiat sebagai antifungal (Li et al.
2001). Phomopsichalasin merupakan metabolit yang diisolasi dari cendawan
endofit Phomopsis spp. Berdasarkan penelitian Silva et al. (2006), cendawan
endofit Phomopsis cassiae Sousa da Camara menghasilkan metabolit sekunder
yaitu etil 2,4-dihydroxy-5,6-dimethylbenzoate dan phomopsilactone. Metabolit
sekunder tersebut berperan sebagai antifungal terhadap cendawan patogen
Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de Vries dan C. Sphaerospermum Penz.
9
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2014 sampai dengan Juni 2015.
Tahap penelitian isolasi cendawan endofit dilakukan di Laboratorium Balai
Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura 1, Medan. Tahap uji in vitro dan in
vivo dilakukan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi
Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat cendawan endofit dari tanaman padi
dan benih padi varietas Ciherang (nasional) dan varietas Kukubalam (lokal)
Sumatera Utara, alkohol 70%, NaOCl 1%, akuades steril, kertas saring Whatman
no.1, media PDA (Potatoes Dextrose Agar), media GYP (Glucose Yeast Pepton)
dengan komposisi glukosa 10 g, yeast ekstrak 5 g, pepton 5 g, gliserol 10 g,
sodium klorida 5 g dilarutkan dalam 1 liter akuades, isolat cendawan patogen
terbawa benih padi, dan fungisida sintetik (bahan aktif mankozeb 80%). Alat yang
digunakan adalah shaker, sentrifus, inkubator, lampu Near Ultraviolet (NUV),
Laminar Air Flow (LAF), cork borer berdiameter 0.6 cm, Pyrolisis Gas
Chromatography Mass Spectrometry (Py-GC-MS), vorteks, autoklaf dan corong
pisah.
Isolasi Cendawan Endofit
Contoh akar, batang, daun padi dan benih tanaman padi yang sehat varietas
Ciherang dan varietas Kukubalam asal Sumatera Utara dicuci dengan air mengalir
untuk menghilangkan tanah dan kotoran yang menempel. Sampel ditiriskan di
dalam cawan petri steril, lalu dipotong-potong dengan pisau steril. Contoh bagian
tanaman tersebut disterilisasi permukaan dengan alkohol 70% selama 30 detik,
direndam dalam NaOCl 1% selama 2 menit, dan dibilas dengan akuades steril 3
kali, lalu dikeringanginkan. Potongan akar, batang, dan daun yang sudah
disterilkan tersebut ditanam pada media PDA dalam cawan petri steril dan
diinkubasi pada suhu ruang (25 oC) selama 7 hari (modifikasi metode Rodrigues
1994). Hasil isolasi cendawan endofit dimurnikan pada media PDA dalam cawan
petri dan disimpan pada suhu ruang.
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Uji patogenisitas menggunakan metode Wilia et al. (2012) yang telah
dimodifikasi. Benih padi varietas Ciherang disterilisasi permukaan dengan
alkohol 70% selama 30 detik, direndam dalam NaOCl 1% selama 2 menit, dan
dibilas dengan akuades steril 3 kali dan ditanam pada media PDA yang telah
ditumbuhi isolat murni cendawan endofit. Sebanyak 20 bulir benih padi ditanam
10
10
untuk setiap isolat cendawan endofit di dalam cawan petri dan diinkubasi selama
2 minggu. Pengamatan dilakukan pada hari ke-14 terhadap perkecambahan benih
padi yang sehat dan yang menunjukkan gejala nekrotik. Biakan cendawan endofit
yang tidak menginfeksi perkecambahan benih padi disimpan sebagai isolat
cendawan endofit untuk penelitian selanjutnya.
Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Blotter test merupakan suatu metode untuk mendeteksi cendawan patogen
terbawa benih. Pada pengujian blotter sebanyak 400 benih padi ditanam pada
media kertas saring lembab dalam cawan petri. Jumlah benih yang disemai
sebanyak 25 bulir benih untuk setiap cawan dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 7 hari di bawah sinar NUV 12 jam terang 12 jam gelap secara bergantian.
Pada hari ke-2 inkubasi, cawan dipindahkan ke dalam freezer pada suhu -20 oC
selama 24 jam, selanjutnya cawan dipindahkan kembali ke dalam ruang inkubasi
selama 5 hari berikutnya. Pengamatan dilakukan pada hari ke-8 setelah perlakuan
benih. Cendawan patogen yang tumbuh di permukaan benih diidentifikasi di
bawah mikroskop stereo dan mikroskop compound. Identifikasi cendawan
patogen menggunakan kunci identifikasi Barnett dan Hunter (1998). Pengamatan
dilakukan terhadap karakteristik pertumbuhan cendawan pada benih yang telah
diinkubasi. Cendawan patogen diisolasi dengan menggunakan media PDA steril
(ISTA 2014).
Uji Antagonis Isolat Cendawan Endofit terhadap Cendawan Patogen
Uji antibiosis secara in vitro dilakukan terhadap semua cendawan endofit
yang tidak menyebabkan nekrotik dari hasil uji patogenisitas. Pengujian dilakukan
mengikuti metode Santoso dan Sumarni (2008) yang telah dimodifikasi.
Pengujian dengan menumbuhkan biakan murni cendawan patogendan masingmasing koloni isolat cendawan endofit padi umur 7 hari sebanyak satu cork borer
pada cawan petri yang telah berisi media PDA (Gambar 2). Perlakuan diulang
sebanyak 10 kali dan pengamatan dilakukan selama 7 hari. Pengaruh
penghambatan cendawan endofit terhadap cendawan patogen dihitung dengan
rumus persentase:
Daya Hambat =
R1-R2
R2
x 100%
Keterangan:
R1 = jari-jari koloni hifa patogen yang tumbuh menjauhi koloni endofit (cm)
R2 = jari-jari koloni hifa patogen yang tumbuh mendekati koloni endofit (cm)
11
a
3 cm
b
3 cm 3 cm
Gambar 2 Skema uji antagonis cendawan endofit (a) endofit dan (b) cendawan
patogen pada media PDA secara in vitro
Produksi dan Analisis Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Dipilih 3 isolat cendawan endofit dari hasil uji antibiosis yang mempunyai
daya hambat paling besar. Tiga isolat cendawan endofit terpilih selanjutnya
digunakan untuk pengujian senyawa metabolit. Pengujian dilakukan mengikuti
metode Margino (2008) yang telah dimodifikasi. Isolat murni cendawan endofit
ditumbuhkan di dalam 100 mL medium cair GYP dan di-shaker selama 7 hari
dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi cendawan endofit disaring secara bertahap
menggunakan kertas saring Whatman no.1. Selanjutnya suspensi disentrifugasi
pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit lalu disaring kembali. Metabolit yang
sudah disaring selanjutnya digunakan untuk pengujian daya hambat pada uji in
vitro dan analisis kualitatif senyawa metabolit dengan metode analisis Py-GC-MS.
Analisis senyawa metabolit cendawan endofit melalui Py-GC-MS dilakukan di
Litbang Hasil Hutan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Gunung
Batu, Bogor.
Uji Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Pengujian dilakukan mengikuti metode Ilyas et al. (2007) yang
dimodifikasi. Senyawa metabolit dari masing-masing cendawan endofit terpilih
ditambahkan pada media tumbuh PDA, sehingga terbentuk media tumbuh dengan
konsentrasi senyawa metabolit 20%, 10%, dan 5%. Cendawan patogen
ditumbuhkan pada media tumbuh PDA dengan masing-masing konsentrasi
senyawa metabolit. Cendawan patogen ditumbuhkan pada media PDA tanpa
penambahan senyawa metabolit cendawan endofit sebagai kontrol negatif dan
sebagai kontrol positif digunakan media tumbuh PDA yang ditambahkan
fungisida. Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan patogen pada masingmasing konsentrasi senyawa metabolit dan dibandingkan terhadap kontrol negatif.
Masing-masing perlakuan diulang 5 kali. Pengamatan dilakukan setiap hari
selama 7 hari dengan mengukur diameter koloni cendawan patogen, selanjutnya
dihitung daya hambat pada hari ke-7 dengan rumus berikut:
12
12
Daya Hambat = D1-D2 x 100%
D1
Keterangan:
D1
= diameter hifa cendawan patogen sebagai kontrol negatif (cm)
D2
= diameter hifa cendawan patogen sebagai perlakuan (cm)
Dari hasil uji in vitro dipilih 2 perlakuan senyawa metabolit dengan daya
hambat paling besar untuk digunakan dalam uji selanjutnya yaitu uji in vivo.
Uji In Vivo Senyawa Metabolit Cendawan Endofit
Dua senyawa metabolit cendawan endofit terpilih diuji secara in vivo untuk
perlakuan benih. Pengujian dilakukan mengikuti metode Ilyas et al. (2007) yang
dimodifikasi. Sebanyak 100 benih padi varietas Kukubalam direndam di dalam 10
ml suspensi senyawa metabolit cendawan endofit selama 24 jam, selanjutnya
benih dikeringanginkan. Benih padi yang sudah diberi perlakuan tersebut diuji
dengan menggunakan metode blotter test dan growing on test. Pengujian blotter
test dilakukan sama seperti pada pengujian untuk mendeteksi dan mengisolasi
cendawan patogen terbawa benih. Pengujian growing on test sebanyak 25 benih
padi ditanam pada media agar air, lumpur, dan pada kertas gulung dalam plastik
(UKDp). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 4 kali. Pada blotter test,
pengamatan dilakukan terhadap tingkat infeksi cendawan pada benih padi pada
hari ke-8. Pada growing on test, pengamatan dilakukan terhadap benih yang
berkecambah di media agar air, lumpur dan kertas gulung, sedangkan pengamatan
dilakukan terhadap tingkat infeksi patogen pada media agar air dan lumpur pada
hari ke-15. Tingkat infeksi dihitung dengan rumus berikut:
Tingkat infeksi =
Keterangan:
A
x 100%
B
A = jumlah tanaman terinfeksi
B = jumlah tanaman yang tumbuh
Analisis Data
Pengujian penghambatan pertumbuhan cendawan patogen dengan uji
metabolit menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan masing-masing
ulangan sebanyak 5 kali. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan
program Microsoft Office Excel 2007 dan Statistical Analisis System (SAS) for
Windows versi 9.1.3. Perlakuan yang menunjukkan beda nyata diuji lanjut dengan
uji selang berganda duncan pada taraf 5%.
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Cendawan Endofit Tanaman Padi
Sebanyak 30 isolat cendawan endofit berhasil diisolasi dari bagian akar,
batang, dan daun tanaman padi sehat varietas Ciherang dan Kukubalam asal
Sumatera Utara (Tabel 1). Isolat cendawan endofit terbanyak diisolasi dari
tanaman padi varietas Ciherang berasal dari daun sedangkan pada varietas
Kukubalam isolat cendawan endofit yang paling banyak berasal dari akar.
Cendawan endofit adalah cendawan yang hidup di dalam jaringan tanaman,
sehingga hidupnya tidak terlepas dari pengaruh metabolisme tanaman inang.
Cendawan endofit hidup dan menempati bagian-bagian organ tanaman seperti
akar, daun, batang, ranting, xilem, dan benih. Dominasi spesies cendawan endofit
yang mengolonisasi bagian tanaman inang dapat berbeda dari masing-masing
bagian tanaman maupun varietas tanaman. Keragaman cendawan endofit dalam
mengolonisasi tanaman inang dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya
perbedaan varietas tanaman inang, curah hujan, dan lokasi pengambilan sampel
(Petrini 1992).
Tabel 1 Hasil isolasi cendawan endofit asal tanaman padi varietas Ciherang dan
varietas Kukubalam
Asal Bagian
Tanaman
Akar
Batang
Daun
Benih
Jumlah
Varietas
Ciherang
2
6
7
1
16
Total
Kukubalam
10
2
1
1
14
12
8
8
2
30
Kelimpahan dan keragaman cendawan endofit dipengaruhi oleh faktor
biotik dan abiotik. Faktor biotik meliputi varietas dan spesies inang, sedangkan
faktor abiotik yang berpengaruh adalah faktor-faktor cuaca yaitu suhu,
kelembaban relatif dan kadar air tanah serta teknik budidaya (Lewis et al. 1997).
Clay (1988) menyatakan bahwa cendawan endofit terdapat di dalam sistem
jaringan tumbuhan seperti daun, bunga, ranting maupun akar tumbuhan.
Keberadaan cendawan ini di dalam tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan
mampu menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotik yang bermanfaat bagi
tumbuhan inang sehingga hubungan antara cendawan endofit dengan tanaman
inangnya bersifat mutualistik.
14
14
Uji Patogenisitas Cendawan Endofit
Berdasarkan hasil uji patogenisitas terhadap 30 isolat cendawan endofit
yang telah diisolasi dari padi varietas Ciherang dan varietas Kukubalam sebanyak
21 isolat cendawan endofit bersifat tidak patogen, yaitu tidak menimbulkan
nekrotik pada kecambah padi sehingga digunakan untuk uji selanjutnya (Tabel 2
dan Gambar 3).
Tabel 2 Hasil uji patogenisitas cendawan endofit terhadap benih varietas Ciherang
Varietas
Ciherang
Kukubalam
Kode Isolat
CA1
CA2
CB1
CB2
CB4
CB5
CB6
CB7
CBn
CD2
CD3
CD4
CD5
CD6
CD7
CD8
Asal Bagian Tanaman
Akar
Akar
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
Benih
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Daun
Keterangan
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Patogen
Patogen
LA2
LA3
LA4
LA6
LA7
LA8
LA9
LA11
LA12
LA14
LB1
LB3
LBn
LD1
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Akar
Batang
Batang
Benih
Daun
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Nonpatogen
Patogen
Nonpatogen
15
A
B
Gambar 3 Uji patogenisitas cendawan endofit pada benih padi varietas
Ciherang. (A) gejala nekrotik pada kecambah kontrol, dan (B)
tidak ada gejala pada kecambah perlakuan endofit
Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Padi
Hasil pengujian dengan metode blotter cendawan patogen yang terdeteksi
pada benih padi varietas Kukubalam yaitu Fusarium sp.1, Fusarium sp.2, A.
flavus, A. niger, dan hifa steril pada varietas Kukubalam dengan tingkat infeksi
berturut-turut sebesar 22%, 5%, 1.5%, 1%, dan 0.5%, sedangkan pada benih
varietas Ciherang terdeteksi Fusarium sp.1 dengan tingkat infeksi sebesar 12.5%.
Fusarium sp.1 merupakan cendawan patogen yang paling dominan menginfeksi
benih padi varietas Ciherang (12.5%) dan benih padi Kukubalam Sumatera Utara
(22%) (Tabel 3 dan Gambar 4).
Tabel 3 Tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih padi varietas Ciherang
dan Kukubalam dengan metode blotter test
Isolat
Fusarium sp. 1
Fusarium sp. 2
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Hifa steril
Tingkat infeksi (%)
Var. Ciherang
Var. Kukubalam
12.5
22.0
0.0
5.0
0.0
1.5
0.0
1.0
0.0
0.5
Utobo et al. (2011) melaporkan cendawan patogen yang sering terbawa
benih padi dari lapangan antara lain Rhizopus oryzae Went &Prins. Geerl., F.
moniliforme, Aspergillus niger, Curvularia lunata (Wakker) Boedijn, Penicillium
sp, Alternaria padwickii, dan Pyricularia oryzae.
Gambar 4 Isolat patogen cendawan terbawa benih padi. (A) Fusarium sp.1, (B)
Fusarium sp.2, (C) Aspergillus niger, (D) Aspergillus flavus, dan (E)
Hifa steril
16
16
Daya Hambat Isolat Cendawan Endofit terhadap Fusarium sp.1
Hasil uji antagonis terhadap Fusarium sp.1 menunjukkan seluruh isolat
cendawan endofit mampu menghambat pertumbuhan koloni cendawan patogen
Fusarium sp.1 antara 35.7-67.1% pada hari ke-7. Sebanyak 11 isolat cendawan
endofit di antaranya mempunyai daya hambat lebih dari 50% (Tabel 4). Isolat
cendawan endofit LA6, LA11, dan LA14 merupakan cendawan endofit yang
sangat berpotensi menekan pertumbuhan cendawan patogen (Fusarium sp.1),
masing-masing dengan daya hambat 67.1%, 59.3%, dan 64.7%.
Interaksi antara cendawan endofit dan tanaman inangnya umumnya bersifat
simbiosis mutualisme. Cendawan endofit dapat berada di dalam tumbuhan sehat
pada jaringan tertentu dan mampu menghasilkan mikotoksin, enzim serta
antibiotik (Carrol 1988). Penghambatan dengan senyawa metabolit yang dimiliki
tiap isolat berbeda-beda karena kandungan metabolit yang berbeda tiap isolatnya.
Tabel 4 Daya hambat cendawan endofit potensial terhadap pertumbuhan koloni
Fusarium sp.1 pada media tumbuh PDA
Varietas
Kode
Isolat
CA1
CB1
CB2
CB4
CB5
CB6
CB7
CD2
CD3
CD4
CD6
4
14.8
15.0
24.0
15.0
17.8
9.2
32.7
17.4
0.0
10.1
16.9
Kukubalam LA2
LA3
LA6
LA7
LA9
LA11
LA14
LB1
LB3
LD1
13.1
29.4
32.1
15.9
17.0
10.6
34.1
1.3
13.8
0.0
Ciherang
Daya hambat (%) hari ke5
6
29.4
39.0
36.8
44.0
41.8
50.3
26.9
3