Kinetika Inhibisi Enzim Α-Glukosidase Secara In Vitro Oleh Ekstrak Daun Aquilaria Malaccensis Sebagai Antihiperglikemik
KINETIKA INHIBISI ENZIM α-GLUKOSIDASE SECARA IN
VITRO OLEH EKSTRAK DAUN Aquilaria malaccensis
SEBAGAI ANTIHIPERGLIKEMIK
AMIMA AQMARINA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kinetika Inhibisi Enzim
α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria malaccensis sebagai
Antihiperglikemik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015
Amima Aqmarina
NIM G44100112
2
ABSTRAK
AMIMA AQMARINA. Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh
Ekstrak Daun Aquilaria malaccensis sebagai Antihiperglikemik. Dibimbing oleh
HENNY PURWANINGSIH dan HILMAN AFFANDI.
Diabetes atau hiperglikemia merupakan penyakit disebabkan oleh
menurunnya fungsi insulin yang menyebabkan naiknya kadar gula dalam darah.
Naiknya gula dalam darah dapat dicegah dengan inhibitor enzim α-glukosidase
yang mengatalis pembentukan gula dalam tubuh. Daun Aquilaria malaccensis atau
yang dikenal dengan nama gaharu memiliki potensi sebagai antihiperglikemik.
Ekstrak tanaman ini diteliti daya inhibisinya terhadap aktivitas enzim α-glukosidase
dan kinetika inhibisinya secara in vitro. Penelitian dilakukan menggunakan ekstrak
yang dimaserasi dengan etanol PA 96% selama 8 jam dengan konsentrasi 5, 10, 20,
dan 25 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. malaccensis memiliki
potensi sebagai antihiperglikemik dengan nilai IC50 sebesar 16.86 ppm dengan
persentase inhibisi tertinggi sebesar 72.03% pada konsentrasi 25 ppm.
Kata Kunci: α-glukosidase, antihiperglikemik, Aquilaria malaccensis, inhibisi
ABSTRACT
AMIMA AQMARINA. Kinetic of α-Glukosidase Inhibition In Vitro by Leaf
Extract of Aquilaria malaccensis as Antihyperglycemic. Supervised by HENNY
PURWANINGSIH SUYUTI and HILMAN AFFANDI.
Diabetes is a disorder due to the deficiency or resistance of insulin causing
hyperglycemia or the increasing of glucose level in blood. Hyperglycemia can be
prevented by the α-glucosidase enzyme inhibitior. This enzyme act as catalyst in
glucose production. Aquilaria malaccensis leaf or usually called agarwood leaf has
a potential as antihyperglycemic. The aim of this research is to determine the
inhibition and kinetics of Aquilaria malaccensis toward α-glucosidase enzyme
activity. This research was done with the extracts which macerated with ethanol PA
96% for 8 hours with 5, 10, 20, and 25 ppm of concentration. The result showed
that the A. malaccensis extract has potential as antihypergycemic with 16.86 ppm
of IC50 and 72.03% as the highest percentage of inhibition on 25 ppm of
concentration.
Key word: α-glucosidase, antihyperglycemic, Aquilaria malaccensis, inhibition
3
KINETIKA INHIBISI ENZIM α-GLUKOSIDASE SECARA IN
VITRO OLEH EKSTRAK DAUN Aquilaria malaccensis
SEBAGAI ANTIHIPERGLIKEMIK
AMIMA AQMARINA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
2
3
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
yang berlimpah penulis dapat menyelesaikan laporan hasil penelitian yang berjudul
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun
(Aquilaria malaccensis) sebagai Antihiperglikemik sebagai salah satu syarat unutk
memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah
membantu penulis, baik secara langsung maupun tidak langsung dalam penulisan
laporan ini. Terima Kasih kepada Ibu Dr Henny Purwaningsih Suyuti, M Si, dan
Bapak Dr Hilman Affandi selaku pembimbing, dan Bapak Rojak selaku laboran
yang telah memberi bimbingan dan dukungan kepada penulis. Ucapan terima kasih
tak terhingga penulis sampaikan kedua orang tua, Bapak Mohammad Ali dan Ibu
Secha Afifah, dan sanak saudara Syarif Husein yang telah memberi dukungan moril,
semangat, doa, dan pengertiannya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Terima kasih juga kepada teman-teman kimia angkatan 47, khususnya Ibna Anggi
Meinar, Cempaka Mayang Nastiti, Nanda Adrian Yuditya, Ahmad Hawari Assufi,
dan M Sholehuddin Malik Ibrohim, atas semangat, kebersamaan, dan
persahabatannya.
Semoga laporan hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun
pembaca.
Bogor, Maret 2015
Amima Aqmarina
4
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
3
Bahan dan Alat
3
Metode Penelitian
3
Pembuatan Ekstrak Daun Gaharu
3
Preparasi Larutan Bahan Uji
3
Preparasi Larutan Sampel
3
Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro
4
Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Ekstrak Aquilaria malaccensis
5
Inhibisi Enzim α-Glukosidase
6
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
17
5
DAFTAR GAMBAR
1
Reaksi hidrolisis polisakarida (glikogen) menjadi glukosa oleh enzim
α-glukosidase
6
Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-glukosidase menjadi p-nitrofenol
dan glukosidase
6
3
Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak Aquilaria malaccensis
7
4
Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis (
dan hasil percobaan (
)
9
2
5
6
7
)
Plot Eadie-Hofstee analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase kontrol
() dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
10
Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase kontrol
() dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
10
Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
Kontrol () dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
11
DAFTAR LAMPIRAN
1
Diagram alir penelitian
14
2
Grafik penentuan panjang gelombang maksimum
14
3
Persentase daya inhibisi ekstrak A. malaccensis terhadap enzim αglukosidase
14
4
Data kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
15
5
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Lineweaver-Burk
15
6
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Hanes-Woolf
15
7
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Eadie-Hofstee
16
PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini, menurut International Diabetes Federation (2014),
diperkirakan sebanyak 387 juta orang di dunia menderita penyakit diabetes pada
tahun 2014 dan diramalkan akan meningkat sampai 592 juta orang pada tahun 2035
mendatang. Menurut Perkumpulan Endokrinologi Indonesia (2006), pada tahun
2003 di Indonesia terdapat sejumlah 8,2 juta orang di daerah urban dan 5,5 juta
orang di daerah rural yang menderita diabetes. Telah diramalkan juga pada tahun
2030 di Indonesia yang menderita diabetes sebesar 12 juta di daerah urban dan 8,1
juta di daerah rural.
Diabetes melitus merupakan penyakit gangguan metabolisme yang
menyebabkan kadar glukosa darah melebihi normal (Katzung et al. 2009). Pada
umumnya, diabetes melitus dibagi menjadi dua tipe, yaitu diabetes tipe 1 dan
diabetes tipe 2. Diabetes tipe 2 merupakan tipe yang lebih banyak diderita orang,
yaitu sekitar 80 sampai 90% dari seluruh kasus diabetes yang ada (Goldstein dan
Müller-Wieland 2008). Diabetes melitus tipe 2 adalah sindrom yang disebabkan
akibat kekurangan insulin atau adanya resistensi terhadap insulin pada tingkat sel
yang mengakibatkan munculnya hiperglikemia dan glikosuria (Satyanaryana dan
Chakrapani 2006).
Insulin adalah hormon peptida yang dihasilkan oleh sel-ß pada pankreas yang
berfungsi sebagai pengontrol kadar gula dalam darah (Lipson et al. 2006). Insulin
dapat digunakan sebagai agen hipoglikemik pada diabetes melitus tipe 2 (Hu et al.
2006). Resistensi atau gangguan insulin merupakan suatu kelainan metabolisme
dan memicu terjadinya hiperglikemia. Hal ini menyebabkan naiknya sekresi insulin
dari pankreas untuk menanggulangi gangguan insulin dari jaringan–jaringan
tersebut. Hiperinsulemia yang terjadi membuat fungsi sel-ß menjadi menurun dan
menyebabkan hiperglikemia atau yang biasa disebut diabetes melitus tipe 2
(Goldstein dan Muller-Weiland 2008). Pada diabetes melitus tipe 2, kadar glukosa
darah meningkat dan ketika konsentrasi lebih tinggi dari 180-200 mg dl/l, maka
gejala seperti haus dan lapar yang berlebihan, buang air kecil yang berlebihan, dan
penurunan berat badan terjadi. Diabetes dikaitkan dengan morbiditas dan kematian
dini akibat komplikasi sistem kardiovaskular termasuk stroke pembuluh darah
(Polikandrioti dan Dokoutsidou 2009). Diabetes melitus tipe 2 juga dapat
menyebabkan gangguan pada proses belajar, daya ingat, dan kognitif pada
penderita (Mehrdad et al. 2009).
Enzim α-glukosidase adalah enzim yang berperan sebagai katalis dalam
pemutusan ikatan glikosidik dalam proses pencernaan karbohidrat (Park et al.
2008). Enzim ini dihasilkan di usus kecil. Adanya inhibitor dari kerja enzim ini
dapat menghambat penyerapan glukosa ke dalam darah. Hal ini dapat mengurangi
kadar gula dalam darah (Cheng dan Josse 2004).
Pengobatan diabetes melitus dapat dilakukan dengan pengobatan oral
menggunakan obat sintetik maupun herbal. Agen antidiabetes yang telah
digunakan, seperti acarbose, voglibose, dan miglitol, menginhibisi enzim αglukosidase secara kompetitif di dalam usus halus sehingga menghambat hidrolisis
karbohidrat dan mengurangi terjadinya hiperglikemia. Bagaimanapun juga,
penggunaan agen ini secara terus menerus pada jangka panjang dapat menyebabkan
beberapa efek samping seperti diare, mual, kembung, dan hepatotoksisitas. Oleh
2
karena itu, obat diabetes masih dikembangkan lebih lanjut. Beberapa inhibitor kerja
enzim α-glukosidase sedang dikembangkan dan diteliti sebagai alternatif
pengobatan dari agen-agen tersebut (Liu et al. 2011).
Beberapa tanaman di Indonesia yang sudah diteliti sebagai obat diabetes yaitu
sambiloto (Andrographis paniculata) (Ahmad et al. 2006), brotowali (Tinospora
crispa) (Noor et al. 1989), dan daun kelor (Molinga oliefera) (Moussa et al. 2007).
Gaharu (Aquilaria malaccensis) memiliki potensi sebagai antihiperglikemik dan
antioksidan yang dapat digunakan sebagai obat diabetes melitus.
Tumbuhan Aquilaria malaccensis banyak ditemukan di Sumatera
(Sibolangit, Bangka, Jambi, Riau, dan Sumatera Selatan), Kalimantan, Sulawesi,
Ambon, dan Papua. Tinggi tanaman yang memiliki sinonim Aquilaria agallocha
Roxb. ini bisa mencapai 20-40 m dengan diameter 60 cm dan memiliki ukuran lebar
daun sebesar 3.0-3.5 cm serta panjang 6-8 cm (Adelina 2004). Aquilaria
malaccensis yang tergolong ke dalam famili Thymelaeaceae dan kelas
Magnoliopsida banyak ditemui di Malaysia, Indonesia, Bangladesh, Bhutan, Iran,
Filipina, Singapura, Thailand, Myanmar, dan India (Akter et al. 2013; Khalil et al.
2013).
Menurut Adelina (2004), Aquilaria malaccensis mengandung lebih dari 12
komponen kimia yang dapat diekstrak dan secara luas digunakan dalam dunia
medis. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Khalil et al. (2013), ekstrak
metanol dari daun Aquilaria maleccensis memiliki beberapa kandungan senyawa
fitokimia, yaitu alkaloid, saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan
tanin). Senyawa fitokimia yang terkandung di dalamnya menjadikan tanaman ini
berpotensi terhadap kesehatan manusia. Adanya metabolit sekunder di dalam
ekstrak daun Aquilaria malaccensis dapat dimanfaatkan untuk menangani beberapa
masalah kesehatan (Khalil et al. 2013).
Penelitian yang telah dilakukan oleh Dash et al. (2008) menunjukkan bahwa
ekstrak metanol daun Aquilaria agallocha memiliki kandungan karbohidrat, asam
amino, alkaloid, tanin, glikosida, dan terpenoid. Ekstrak tersebut memiliki aktivitas
sebagai antibakteri berdasarkan pengujian yang dilakukan terhadap S. flexneri dan
P. aeruginosa. Ekstrak metanol dari daun menunjukkan efek inihibisi terhadap B.
subtilis. Keberadaan senyawa fitokimia di dalam Aquilaria agallocha
mengindikasikan bahwa tanaman tersebut berpotensi sebagai sumber obat-obatan
yang bermanfaat.
Aktivitas enzim memiliki beberapa parameter kinetika yang dapat diamati.
Kinetika inhibisi enzim dapat diukur dengan mereaksikan enzim dengan substrat
dengan beberapa konsentrasi substrat yang divariasikan. Analisis data untuk
memeroleh mekanisme inhibisi dapat dilakukan dengan menggunakan metode
Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf, dan beberapa plot lainnya
sehingga diperoleh konstanta Michaelis-Menten (Km) (Murray et al. 2009).
Potensi antihiperglikemik yang terdapat pada ekstrak daun Aquilaria
malaccensis diteliti secara in vitro melalui proses penghambatan enzim αglukosidase menjadi fokus pada penelitian ini. Penelitian ini bertujuan mengetahui
kinetika inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. malaccensis yang
memiliki potensi sebagai antihiperglikemik berdasarkan pengujian yang dilakukan
secara in vitro.
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak kasar daun A. malaccensis,
bufer fosfat pH 7.0 Merck, etanol PA 96%, n-heksana, etil asetat, bovine serum
albumin (BSA), α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (p-NPG), dan
natrium karbonat (Na2CO3). Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer
ultraviolet-tampak (UV-Vis) Beckman Coulter DU 530, rotary evaporator, dan
neraca analitik Mettler Toledo.
Metode Penelitian
Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu ekstraksi sampel, preparasi
larutan bahan uji, preparasi larutan ekstrak, pengujian aktivitas inhibisi terhadap
enzim α-glukosidase, dan analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase (Lampiran
1).
Pembuatan Ekstrak Daun Gaharu
Daun gaharu diambil setiap 5 helai daun dari subterminal atau pucuk. Daun
gaharu dikeringudarakan, dihaluskan, lalu ditimbang sebanyak 100 g. Daun gaharu
kering dimaserasi dengan pelarut etanol, etil asetat, dan n-heksana masing-masing
selama 1 jam, 4 jam, dan 8 jam, lalu disaring dengan penyaringan gravitasi. Ekstrak
dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak dikeringudarakan sampai kering.
Preparasi Larutan Bahan Uji
Larutan stok enzim α-glukosidase 0.6 U/mL dibuat dengan melarutkan enzim
α-glukosidase sebanyak 1 mg dalam 100 mL bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung
200 mg BSA. Selanjutnya enzim yang akan digunakan dalam pengujian diencerkan
terlebih dahulu dengan cara sebanyak 3,3 mL larutan stok enzim α-glukosidase
dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung 20 mg BSA
sehingga diperoleh larutan enzim α-glukosidase 0.2 U/mL.
Larutan p-NPG 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, dan 1.25 mM dibuat dengan cara
melarutkan serbuk p-NPG masing-masing sebanyak 1.6 mg, 2.4 mg, 3.2 mg, dan 4
mg dengan bufer fosfat (pH 7.0) ke dalam labu takar 10 ml. Larutan Na2CO3 0.2 M
dibuat dengan cara sebanyak 5.3 g serbuk Na2CO3 ditimbang dan dilarutkan dalam
250 mL akuades.
Preparasi Larutan Sampel
Ekstrak kasar daun A. malaccensis ditimbang sebanyak 250 mg dan
dilarutkan dalam 50 mL etanol sehingga diperoleh larutan stok ekstrak 5000 ppm.
Larutan stok ekstrak dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan dalam 10 mL bufer
fosfat pH 7.0 sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 500 ppm.
4
Larutan tersebut kemudian diencerkan kembali untuk memperoleh larutan sampel
uji dengan konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, dan 25 ppm.
Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro
(Modifikasi Metode Sancheti et al. 2009)
Aktivitas inhibisi α-glukosidase diuji dengan menggunakan metode Sancheti
et al. (2009) dengan sedikit modifikasi pada komposisi campuran dan berbagai
macam konsentrasi sampel. Sampel dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan
dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, kemudian
campuran diaduk hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 0.75 mL
larutan enzim α-glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 2 hari dengan suhu
kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3 0.2 M.
Selanjutnya absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi sampel (As).
Larutan blanko sampel dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL larutan
sampel, 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, dan 1 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) dan diaduk
hingga homogen. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3
0.2 M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi blanko (Ab1).
Kontrol dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL etanol PA 96%, 0.25 mL
p-NPG 0.75 mM, dan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga homogen. Setelah
itu, campuran ditambahkan 0.75 mL enzim dan diinkubasi selama 2 hari dengan
suhu kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3 0.2
M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi kontrol (Ac).
Larutan blanko kontrol dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL etanol PA
96%, 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, dan 1 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga
homogen. Setelah itu, masing-masing campuran diinkubasi selama 2 hari dengan
suhu kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2
M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi blanko (Ab2).
Penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ditentukan dengan rumus:
Inhibisi (%) =
� −�
Keterangan:
Ac
: Absorbansi kontrol
Ab1 : Absorbansi blanko kontrol
As
: Absorbansi sampel
Ab2 : Absorbansi blanko sampel
− ��−�
� −�
×
%
Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase (Mayur et al. 2010)
Pengujian kinetika inhibisi enzim α-glukosidase dilakukan dengan
menggunakan metode Mayur et al. (2010). Sampel dengan aktivitas inhibisi
5
tertinggi dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1
M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, kemudian campuran diaduk hingga homogen.
Setelah campuran homogen, sebanyak 0.5 mL larutan enzim α-glukosidase
ditambahkan. Campuran diinkubasi dengan suhu kamar. Reaksi kemudian
dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbans (V)
larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Pengujian dilakukan kembali
dengan menggunakan konsentrasi p-NPG [S] yang berbeda, yaitu 0.5 mM, 0.75
mM, 1 mM, dan 1.25 mM.
Data perolehan yang dikalkulasikan berdasarkan hasil terhadap kinetika
Michaelis-Menten dibuat menjadi tiga plot berbeda, yaitu plot Lineweaver-Burk
dengan 1/[S] sebagai sumbu x dan 1/V sebagai sumbu y, plot Hanes-Woolf dengan
[S] sebagai sumbu x dan [S]/V sebagai sumbu y, dan plot Eadie-Hofstee dengan
V/[S] sebagi sumbu x dan V sebagai sumbu y. Setelah itu, plot dengan nilai R 2
tertinggi digunakan untuk menentukan tipe inhibisi enzim.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Aquilaria malaccensis
Ekstrak sampel yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daun gaharu
jenis Aquilaria malaccensis yang didapat dari Laboratorium Natural Product
SEAMEO BIOTROP. Daun pertama-tama dikeringkan lalu dihaluskan, setelah itu
diekstrak menggunakan 3 pelarut berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya selama
1, 4, dan 8 jam. Pelarut yang digunakan yaitu n-heksana, etil asetat, dan etanol PA
96%. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Teknik ini digunakan
untuk mendapatkan senyaa yang tidak tahan panas. Setelah dimaserasi, ekstrak
diuapkan dengan rotary evaporator dan dikeringudarakan.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Khalil et al. (2013), ekstrak
metanol dari daun Aquilaria maleccensis memiliki beberapa kandungan senyawa
fitokimia, yaitu alkaloid, saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan
tanin). Berdasarkan beberapa penelitian, enzim α-glukosidase dapat dihambat oleh
beberapa senyawa fitokimia seperti alkaloid (Patel dan Mishra 2012), triterpene
(Lai et al. 2012), dan flavonoid (Wang et al. 2012). Senyawa fitokimia yang
terkandung di dalamnya menjadikan tanaman ini berpotensi terhadap kesehatan
manusia.
Berdasarkan penelitian Affandi et al. (2013), ekstrak Aquilaria malaccensis
yang menghasilkan daya antioksidan tertinggi adalah ekstrak dengan pelarut etanol
PA 96% selama 8 jam dengan nilai IC50 sebesar 10.6258 ppm. Dalam penelitian ini,
ekstrak etanol tersebut selanjutnya dilakukan pengujian antihiperglikemik dan
kinetika inhibisinya.
6
Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Enzim α-glukosidase adalah enzim yang menghidrolisis disakarida menjadi
glukosa dan monosakarida lainnya (Goldstein dan Muller-Weiland 2008). Enzim
α-glukosidase memecah disakarida pada cabang ikatan α-1,6-glikosidik
menghasilkan glukosa. Glukosa yang dihasilkan akan digunakan sebagai sumber
energi (Berg et al. 2002).
α-glukosidase
Gambar 1 Reaksi hidrolisis disakarida menjadi glukosa oleh enzim α-glukosidase
(Berg et al. 2002)
Inhibitor α-glukosidase merupakan sakarida yang berperan sebagai inhibitor
kompetitif yang dibutuhkan untuk mencerna karbohidrat. Inhibitor ini menginhibisi
enzim α-glukosidase yang berada di dalam usus halus (Venable dan Aschenbrenner
2005). Inhibitor α-glukosidase dapat berperan sebagai inhibitor kompetitif akibat
adanya afinitas yang tinggi terhadap α-glukosidase (Goldstein dan Muller-Weiland
2008).
Hasil uji yang didapatkan berupa absorbansi yang nilainya bergantung pada
penambahan ekstrak dan konsentrasi p-nitrofenol yang terbentuk dari reaksi.
Menurut Sugiwati et al. (2009), senyawa p-nitrofenol yang terbentuk memberikan
warna yang intensitasnya dapat diketahui dengan spektrofotometer dengan panjang
gelombang sekitar 400 nm.
α-glukosidase
Gambar 2 Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-glukosidase menjadi p-nitrofenol
dan glukosa (Sugiwati et al. 2009)
Panjang gelombang maksimum ditentukan terlebih dahulu menggunakan
larutan kontrol pada panjang gelombang 350-490 nm. Hasil panjang gelombang
dengan serapan terbesar yaitu pada 403 nm (Lampiran 2). Panjang gelombang ini
7
%inhibisi
selanjutnya digunakan untuk pengujian daya inhibisi ekstrak A. malaccensis
terhadap enzim.
Daya inhibisi dapat ditentukan dengan mengujikan substrat dan enzim dengan
ekstrak sampel yang konsentrasinya divariasikan dengan metode Sancheti et al.
(2009) yang dimodifikasi. Semakin besar konsentrasi ekstrak A. malaccensis
(inhibitor), semakin besar pula daya inhibisinya, namun semakin rendah absorbansi
yang dihasilkan.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 2.7118x + 4.2669
R² = 0.9557
0
5
10
15
20
25
30
Konsentrasi Ekstrak (ppm)
Gambar 3 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak Aquilaria malaccensis
Hasil persentase daya inhibisi yang didapat semakin besar seiring
bertambahnya konsentrasi ekstrak, sehingga daya inhibisi terbesar pada penelitian
ini terdapat pada konsentrasi ekstrak 25 ppm, yaitu 72.03%. Setelah daya inhibisi
dihitung, nilai IC50 ditentukan. Dari nilai IC50 yang didapat, aktivitas inhibitor yang
menginhibisi sebanyak 50%, terjadi pada konsentrasi inhibitor sebesar 16.86 ppm.
Nilai tersebut menunjukkan bahwa ekstrak A. malaccensis dapat berpotensi sebagai
antihiperglikemik karena masih berada di bawah 100 ppm (Dewiyanti et al. 2012)
dan daya inhibisi yang dimiliki sampel cukup baik karena dibutuhkan konsentrasi
16.86 ppm saja untuk menginhibisi enzim dalam proses pembentukan glukosa.
Tabel 1 Inhibisi enzim α-glukosidase oleh beberapa ekstrak tanaman
Sampel
IC50 (ppm)
a
Daun Aquilaria malaccensis
16.86
Daun Aquilaria filariab
26
c
Gracilaria edulis
46
Ulva lactucac
53
d
Daun Catharanthus roseus L. G. Don
36.08
Daun Basella albad
493.47
Daun Azadirachta Indica A. Jussd
21.94
Daun Tinospora crispa Miers.d
68.06
e
Kuersetin
10.20
Keterangan: aSampel yang digunakan; bSumber: Meinar (2015) cSumber: Kumar dan Sudha (2012);
Sumber: Mun’im et al. (2013); eSumber: Dewiyanti et al. (2012)
d
Bila dibandingkan dengan ekstrak daun gaharu jenis lain, yaitu Aquilaria
filaria yang telah diuji oleh Meinar (2015) (Tabel 1), nilai IC50 ekstrak Aquilaria
malaccensis lebih rendah. Beberapa ekstrak tanaman lain seperti yang telah diuji
oleh Kumar dan Sudha (2012) dan Mun’im et al. (2013) (Tabel 1), daun Aquilaria
8
malaccensis yang dijadikan sampel dalam penelitian memiliki nilai IC50 yang lebih
rendah. Hal ini menunjukkan kemampuan sampel dalam menginhibisi kerja enzim
α-glukosidase lebih baik dan diduga sampel memliki kandungan aktif
antihiperglikemik yang lebih tinggi dari tanaman-tanaman tersebut. Adanya
kandungan senyawa fitokimia dalam Aquilaria malaccensis, seperti alkaloid,
saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan tanin) (Khalil et al. 2013)
dapat menjadi salah satu faktor sampel berpotensi sebagai antihiperglikemik.
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Kinetika kimia adalah studi tentang reaksi kimia yang berkataliskan enzim.
Dengan mempelajari kinetika enzim, kita dapat menentukan mekanisme kerja
enzim dan perannya dalam proses metabolisme, mekanisme obat yang menghambat
enzim, dan bagaimana enzim bekerja. Parameter yang diujikan dalam kinetika
kimia ini adalah Km dan Vmaks. Penentuan parameter ini apat dilakukan dengan
membuat plot hubungan antara konsentrasi substrat [S] dengan laju reaksi enzim
(V). Laju reaksi enzim semakin naik secara linear terhadap konsentrasi substrat dan
mulai berhenti naik (menjadi konstan) dan mendekati maksimum pada konsentrasi
substrat tertentu. Kondisi saat laju reaksi enzim tidak dapat naik lagi disebut Vmaks.
Mekanisme Michaelis-Menten menghitung nilai Vmaks dimana enzim sudah
tidak bekerja terhadap substrat lagi karena enzim terjenuhkan oleh substrat. Berikut
adalah persamaan Michaelis-Menten:
��
�=
��
+
[�]
dimana Km adalah tetapan Michaelis, yaitu konsentrasi substrat pada laju reaksi
50% dari Vmaks (Atkins dan Paula 2006).
Percobaan ini dilakukan dengan mereaksikan enzim, p-NPG sebagai substrat,
dan ekstrak A. malaccensis sebagai inhibitor. Konsentrasi inhibitor yang digunakan
tetap, yaitu inhibitor dengan konsentrasi tertinggi (25 ppm). Konsentrasi yang
divariasikan adalah konsentrasi p-NPG, yaitu 0.5 mM, 0.75mM, 1 mM, dan 1.25
mM. Hasil yang didapat dibuat menjadi plot Michaelis-Menten.
7.0
6.0
5.0
V
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
-5.0
-1.0 0.0
-2.0
5.0
10.0
15.0
20.0
[S]
Gambar 4 Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis (
dan hasil percobaan (
)
)
9
Plot ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim α-glukosidase meningkat seiring
bertambahnya konsentrasi p-NPG (substrat) dan mencapai kecepatan maksimum
pada konsentrasi p-NPG tertentu. Setelah itu, pengujian dilakukan dengan membuat
plot Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf, dan Lineweaver-Burk menggunakan data
kinetika yang telah didapat (Lampiran 3). Plot yang menghasilkan nilai R2 tertinggi
(mendekati satu) digunakan untuk menentukan mekanisme kerja enzim. Nilai R2
pada plot Eadie-Hofstee sebesar 0.4940 untuk kontrol dan 0.8063 untuk ekstrak
(Gambar 5). Nilai R2 yang dihasilkan dari plot Hanes-Woolf sebesar 0.6625 untuk
kontrol dan 0.6376 untuk ekstrak (Gambar 6). Nilai R2 yang dihasilkan dari plot
Lineweaver-Burk sebesar 0.9418 untuk kontrol dan 0.9712 untuk ekstrak (Gambar
7). Dari hasil nilai R2 untuk setiap plot, nilai R2 tertinggi dihasilkan dari plot
Lineweaver-Burk, sehingga plot yang digunakan untuk menentukan mekanisme
inhibisi enzim tersebut adalah plot Lineweaver-Burk.
8.00
6.00
V
4.00
y = -1.3015x + 4.6711
R² = 0.4940
2.00
-1.00
0.00
0.00
1.00
y = 2.3407x - 2.2532
R² = 0.8063
2.00
3.00
4.00
5.00
-2.00
-4.00
V/S
Plot Eadie-Hofstee analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
Gambar 5
1.00
y = -0.2739x + 0.8900
R² = 0.6376
0.80
y = 0.1407x + 0.3428
R² = 0.6625
[S]/V
0.60
0.40
0.20
-3.00
-2.00
0.00
-1.00
0.00
-0.20
1.00
2.00
3.00
4.00
[S]
Gambar 6 Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
10
2
y = 0.8702x - 0.2496
R² = 0.9712
2
1/V
1
1
0
-2
-1
y = 0.2992x + 0.1934
R² = 0.9418
0
1
2
3
-1
-1
1/[S]
Gambar 7 Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
Plot Lineweaver-Burk menunjukkan nilai Km dan Vmaks pada aktivitas
inhibisi enzim. Nilai Km menunjukkan afinitas antara enzim dan substrat. Dari nilai
Km dan Vmaks yang didapat (Lampiran 5), dapat dilihat bahwa nilai terjadi penurunan
nilai Km dari 1.5470 menjadi -3.4863 dan Vmaks dari 5.1706 menjadi -4.0064 setelah
adanya penambahan ekstrak sampel 25 ppm dalam percobaan. Namun, hasil
penentuan nilai Km dan Vmaks yang bernilai negatif pada percobaan menggunakan
ekstrak sampel 25 ppm menunjukkan bahwa penentuan tipe inhibisi enzim tidak
dapat dilakukan dengan menggunakan plot Lineweaver-Burk. Nilai Km dan Vmaks
juga menunjukkan nilai yang negatif berdasarkan penghitungan menggunakan plot
Hanes-Woolf (Lampiran 6) dan Eadie-Hofstee (Lampiran 7) pada percobaaan
menggunakan sampel 25 ppm, sehingga penentuan tipe inhibisi tidak bisa
ditentukan pula menggunakan kedua plot tersebut. Hal ini disebabkan karena
ekstrak kasar mengandung lebih dari satu senyawa metabolit sekunder yang
berpotensi sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Pendekatan kajian kinetika
dengan menggunakan ketiga plot tersebut akan lebih tepat bila digunakan pada
pengujian menggunakan inhibitor berupa senyawa hasil isolasi atau senyawa murni
yang strukturnya menyerupai substrat atau dapat berikatan pada tapak aktif enzim,
seperti yang dilakukan oleh Dewiyanti et al. (2012) yang menggunakan kuersetin
sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Oleh karena itu, diperlukan pendekatan lain
untuk menentukan tipe inhibisi dari percobaan menggunakan ekstrak kasar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etanol Aquilaria malaccensis dapat berperan sebagai
antihiperglikemik yang cukup baik dengan nilai IC50 di bawah 100 ppm. Namun,
mekanisme inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak kasar sampel belum dapat
11
ditentukan menggunakan pendekatan plot Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf,
ataupun Eadie-Hofstee.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa spesifik
yang memengaruhi daya inhibisi terhadap aktivitas enzim α-glukosidase.
Penentuan total fenol juga perlu dilakukan untuk lebih memastikan adanya gugus
fenolik di dalam ekstrak tersebut.
Pendekatan kinetika yang sesuai untuk menjelaskan mekanisme inhibisi
enzim α-glukosidase harus ditelaah kembali dan perlu ditelusur lebih lanjut
senyawa spesifik yang memengaruhi daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas enzim
α-glukosidase, serta tingkat keamanan penggunaan ekstrak. Selain itu, dapat pula
dilakukan uji lanjutan (in vivo) untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap
mekanisme absorpsi, metabolisme, dan ekskresi dalam tubuh.
DAFTAR PUSTAKA
[Perkumpulan Endokrinologi Indonesia]. 2006. Konsensus Pengelolaan dan
Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia. Jakarta (ID): PB. Perkeni.
Adelina N. 2004. Aquilaria malaccensis Lam. Di dalam: Fransiskus Harum, Lars
Schmidt, Dorthe Jøker, editor. Forest and Landscape Denmark, Seed Leaflet No.
103 [Terhubung Berkala] https://ign.ku.dk/english/employees/forest-naturebiomass/?pure=en%2Fpublications%2Faquilaria-malaccensis-lam(3a7d20c0a1be-11dd-b6ae-000ea68e967b)%2Fexport.html. (16 Januari 2015).
Affandi H, Arif N, Maya M, Rojak. 2013. Potensi Antioksidan dan Antidiabetes daun
gaharu (Aquilaria malaccensis) dengan variasi proses ekstraksi. [laporan akhir].
Bogor: SEAMEO Biotrop
Ahmad M, Razak A, Akowuah GA, Asmawi Z, Zhari I. 2007. HPLC profile and
antihyperglycemic effect of ethanol normal and streptozotocin-induced diabetic
rats. J Nat Med. 61:422-429.
Akter S, Md Tanvir I, Mohd Z, Sirajul IK. 2013. Agarwood production-a
multidisciplinary field to be explored in Bangladesh. Int J Pharm Life Sci.
2(1):22-32.
Atkins PW, Paula J. 2006. Physical Chemistry. Oxford (EN): Oxford University Press.
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. 2002. Biochemistry. Ed ke-5. New York (US): WH
Freeman.
Campbell MK, SO Farrell. 2009. Biochemistry. Ed ke-6. Pacific Grove (CA): Thomson
Brooks/ Cole.
Cheng AYY, Josse RG. 2004. Intestinal absorption inhibitors for type 2 diabetes
mellitus: prevention and treatment. Drug Discovery Today: Therapeutic
Strategies. 1(2):201–206.
Dash M, Jayanta KP, Prasanna PP. 2008. Phytochemical and antimicrobial screening
12
of extracts of Aquilaria agallocha Roxb. Afr J Biotech. 7(20):3531-3534.
Dewiyanti ID, Euis F, Megawati, Tri Y. 2012. The antidiabetic activity of ‘cocor bebek
leaves’ (Kalanchoe pinnata Lam.Pers.) ethanolic extract from various areas. J
Trop Life Science. 2(2):37-39.
Goldstein BJ, Muller-Weiland D. 2008. Diabetes: Principles and Practice Second
Edition. New York (US): Informa HealthCare.
[IDF] International Diabetes Federation. 2014. Diabetes: Facts and figures.
[Terhubung Berkala] http://www.idf.org/worlddiabetes day/toolkit/gp/factsfigures. (24 Maret 2015).
Katzung BG, Masters S, Trevor AJ. 2009. Basic and Clinical Pharmacology. New
York (US): McGraw-Hill Medical.
Khalil AS, Rahim AA, Taha KK, Abdallah KB. 2013. Characterization of methanolic
extracts of Agarwood leaves. J Appl Indust Sci. 1(3):78-88.
Kumar PS, S Sudha. 2012. Evaluation of alpha-amylase and alpha-glucosidase
inhibitory properties of selected seaweeds from gulf of mannar. Int Res J Pharm.
3(8):129-130.
Lai YC, Chen CK, Tsai SF, Lee SS. 2012. Triterpenes as α-glucosidase inhibitors from
Fagus hayatae. Phytochemistry. 74:206-211.
Mayur B, Sancheti S, S Shruti, Seo SY. 2010. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory
prpoperties of Carpesium abrotanoides L. J Med Plant Res. 4(15):1547-1553.
Meinar, IA. 2015. Kinetika inhibisi enzim α-glukosidase secara in vitro oleh ekstrak
daun Aquilaria filaria sebagai antihiperglikemik [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Mitra R, John O, Morley SM. 2007. Medicinal plants of Malaysia. APBN. 11(2):105110.
Moussa N et al. 2007. Effects of oral administration of Moringa oleifera Lam on
glucose tolerance in goto-kakizaki and wistar rats. J Clin Bioche Nutr. 40:229233.
Mun’im A, Katrin, Azizahwati, A Andriani, KF Mahmudah, M Mashita. 2013.
Screening of α-glucosidase inhibitory activity of some Indonesian medicinal
plants. J Med Arom Plants. 2(2):144-150.
Murray, Robert K, Daryl KG, Victor WR. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Brahm U,
penerjemah. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari :
Harper’s Biochemistry 27th.
Noor H, Hammonds P, Sutton R, Ashcroft SJH. 1989. The hyperglycemic and
insulinotropic activity of Tinospora crispa: studies with human and rat islets and
HIT-T15 B cells. Diabetologia. 32:354-359.
Patel MB, Mishra SM. 2012. Magnoflorine from Tinospora cordiofola stem inhibits αglycosidase and is antiglycemic in rats. J Funct foods. 4:79-86.
Sancheti S, Sandesh S, Sung YS. 2009. Chaenomeles sinensis: A potent α-and βglucosidase inhibitor. Am J Pharm Toxicol. 4 (1): 8-11.
Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009. Antihyperglycemic activity of mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa (Scheff.)Boerl.) leaf extracts as an alpha-glucosidase
13
inhibitor. Makara kesehatan. 13(2):74-78.
Venable SJ, Aschenbrenner DS. 2005. Drug Therapy in Nursing. Hagerstown:
Lippincott Williams & Wilkins.
Wang H, Du YJ, Song HC. 2010. Alpha-glycosidase and α-amylase inhibitory
activities of guava leaves. Food Chem. 123:6-13.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian
Ekstraksi Sampel
Preparasi Larutan Uji
Preparasi Larutan Ekstrak
Pengujian Inhibisi terhadap Aktivitas Enzim α-Glukosidase
Analisis Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Lampiran 2 Grafik penentuan panjang gelombang maksimum
0.40
Panjang gelombang
maksimum 403 nm
0.35
Absorbansi
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
300
320
340
360
380
400
Panjang Gelombang (nm)
420
440
460
14
Lampiran 3 Persentase daya inhibisi ekstrak A. malaccensis terhadap enzim αglukosidase
Konsentrasi ekstrak (ppm)
Absorbansi
0
2.049
5
1.711
10
1.211
15
1.087
20
0.971
25
0.573
Contoh perhitungan:
Ac As Ab
100%
Inhibisi (%) =
Ac
2.049-0.573
×100%
=
2.049
= 72.035%
y
= 2.7118x + 4.2669
50.
-4.2669
IC50 =
2.7118
= 16.8644 ppm
Inhibisi (%)
0.000
16.496
40.898
46.950
52.611
72.035
Lampiran 4 Data kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
[S]
1/[S]
V1
V2
1/V1
1/V2
S/V1
S/V2
V1/S
V2/S
0.5000 2.0000 1.3020 0.6850 0.7680 1.4599
0.3840
0.7299
2.6040
1.3700
0.7500 1.3333 1.5630 0.9880 0.6398 1.0121
0.4798
0.7591
2.0840
1.3173
1.0000 1.0000 1.9690 1.8660 0.5079 0.5359
0.5079
0.5359
1.9690
1.8660
1.2500 0.8000 2.5410 2.1700 0.3935 0.4608
0.4919
0.5760
2.0328
1.7360
Keterangan:
S : konsentrasi p-NPG (mM)
V1 : Absorbans kontrol
V2 : Absorbans A. malaccensis 25 ppm
Lampiran 5 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Lineweaver-Burk
Larutan
a
b
R2
Km
Vmax
Kontrol
0.2992
0.1934
0.9418 1.5470
5.1706
Dengan ekstrak 25 ppm
0.8702
-0.2496 0.9712 -3.4863
-4.0064
Contoh perhitungan:
1
�
=
=
+
��
�� ��
1
+
[�]
1
�� ��
15
0.1934 =
1
�� ��
Vmaks = 5.1706
0.2992 =
��
�� ��
Km = 0.2992 × 5.1706
Km = 1.5470
Lampiran 6 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Hanes-Woolf
Larutan
a
b
R2
Km
Kontrol
0.1407
0.3428
0.6625 2.4364
Dengan ekstrak 25 ppm -0.2739
0.89
0.6376 -3.2494
Contoh perhitungan:
=
[�]
�
=
+
1
�� ��
1
0.1407 =
[�] +
�� ��
Vmax
7.1073
-3.6510
��
�� ��
Vmaks = 7.1073
0.3428 =
��
�� ��
Km = 0.3428 × 7.1073
Km = 2.4364
Lampiran 7 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Eadie-Hofstee
Larutan
a
b
R2
Km
Kontrol
-1.3015
4.6711
0.4940 1.3015
Dengan ekstrak 25 ppm
2.3407
-2.2532 0.8063 -2.3407
Contoh perhitungan:
=
+
�
� = −�� [�] + �� ��
-1.3015 = -Km
Km = 1.3015
Vmaks = 4.6711
Vmax
4.6711
-2.2532
16
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 27 Maret 1992 dari ayah
Mohammad Ali dan ibu Secha Afifah. Penulis adalah putri kedua dari dua
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMPN 1 Bogor. Tahun 2010 penulis
lulus dari SMA Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi
masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur SNMPTN dan diterima di
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis bekerja sebagai guru piano di Yamaha
Bogor Musik dari tahun 2011. Pada bulan Juli sampai Agustus 2014 penulis
melaksanakan Praktik Lapangan di SEAMEO BIOTROP dengan judul Uji
Aktivitas Antioksidan 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) pada Ekstrak Aquilaria
malaccensis dengan Spektrofotometer.
18
VITRO OLEH EKSTRAK DAUN Aquilaria malaccensis
SEBAGAI ANTIHIPERGLIKEMIK
AMIMA AQMARINA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kinetika Inhibisi Enzim
α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun Aquilaria malaccensis sebagai
Antihiperglikemik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015
Amima Aqmarina
NIM G44100112
2
ABSTRAK
AMIMA AQMARINA. Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh
Ekstrak Daun Aquilaria malaccensis sebagai Antihiperglikemik. Dibimbing oleh
HENNY PURWANINGSIH dan HILMAN AFFANDI.
Diabetes atau hiperglikemia merupakan penyakit disebabkan oleh
menurunnya fungsi insulin yang menyebabkan naiknya kadar gula dalam darah.
Naiknya gula dalam darah dapat dicegah dengan inhibitor enzim α-glukosidase
yang mengatalis pembentukan gula dalam tubuh. Daun Aquilaria malaccensis atau
yang dikenal dengan nama gaharu memiliki potensi sebagai antihiperglikemik.
Ekstrak tanaman ini diteliti daya inhibisinya terhadap aktivitas enzim α-glukosidase
dan kinetika inhibisinya secara in vitro. Penelitian dilakukan menggunakan ekstrak
yang dimaserasi dengan etanol PA 96% selama 8 jam dengan konsentrasi 5, 10, 20,
dan 25 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. malaccensis memiliki
potensi sebagai antihiperglikemik dengan nilai IC50 sebesar 16.86 ppm dengan
persentase inhibisi tertinggi sebesar 72.03% pada konsentrasi 25 ppm.
Kata Kunci: α-glukosidase, antihiperglikemik, Aquilaria malaccensis, inhibisi
ABSTRACT
AMIMA AQMARINA. Kinetic of α-Glukosidase Inhibition In Vitro by Leaf
Extract of Aquilaria malaccensis as Antihyperglycemic. Supervised by HENNY
PURWANINGSIH SUYUTI and HILMAN AFFANDI.
Diabetes is a disorder due to the deficiency or resistance of insulin causing
hyperglycemia or the increasing of glucose level in blood. Hyperglycemia can be
prevented by the α-glucosidase enzyme inhibitior. This enzyme act as catalyst in
glucose production. Aquilaria malaccensis leaf or usually called agarwood leaf has
a potential as antihyperglycemic. The aim of this research is to determine the
inhibition and kinetics of Aquilaria malaccensis toward α-glucosidase enzyme
activity. This research was done with the extracts which macerated with ethanol PA
96% for 8 hours with 5, 10, 20, and 25 ppm of concentration. The result showed
that the A. malaccensis extract has potential as antihypergycemic with 16.86 ppm
of IC50 and 72.03% as the highest percentage of inhibition on 25 ppm of
concentration.
Key word: α-glucosidase, antihyperglycemic, Aquilaria malaccensis, inhibition
3
KINETIKA INHIBISI ENZIM α-GLUKOSIDASE SECARA IN
VITRO OLEH EKSTRAK DAUN Aquilaria malaccensis
SEBAGAI ANTIHIPERGLIKEMIK
AMIMA AQMARINA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
2
3
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
yang berlimpah penulis dapat menyelesaikan laporan hasil penelitian yang berjudul
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro oleh Ekstrak Daun
(Aquilaria malaccensis) sebagai Antihiperglikemik sebagai salah satu syarat unutk
memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah
membantu penulis, baik secara langsung maupun tidak langsung dalam penulisan
laporan ini. Terima Kasih kepada Ibu Dr Henny Purwaningsih Suyuti, M Si, dan
Bapak Dr Hilman Affandi selaku pembimbing, dan Bapak Rojak selaku laboran
yang telah memberi bimbingan dan dukungan kepada penulis. Ucapan terima kasih
tak terhingga penulis sampaikan kedua orang tua, Bapak Mohammad Ali dan Ibu
Secha Afifah, dan sanak saudara Syarif Husein yang telah memberi dukungan moril,
semangat, doa, dan pengertiannya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Terima kasih juga kepada teman-teman kimia angkatan 47, khususnya Ibna Anggi
Meinar, Cempaka Mayang Nastiti, Nanda Adrian Yuditya, Ahmad Hawari Assufi,
dan M Sholehuddin Malik Ibrohim, atas semangat, kebersamaan, dan
persahabatannya.
Semoga laporan hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun
pembaca.
Bogor, Maret 2015
Amima Aqmarina
4
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
3
Bahan dan Alat
3
Metode Penelitian
3
Pembuatan Ekstrak Daun Gaharu
3
Preparasi Larutan Bahan Uji
3
Preparasi Larutan Sampel
3
Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro
4
Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Ekstrak Aquilaria malaccensis
5
Inhibisi Enzim α-Glukosidase
6
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
17
5
DAFTAR GAMBAR
1
Reaksi hidrolisis polisakarida (glikogen) menjadi glukosa oleh enzim
α-glukosidase
6
Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-glukosidase menjadi p-nitrofenol
dan glukosidase
6
3
Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak Aquilaria malaccensis
7
4
Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis (
dan hasil percobaan (
)
9
2
5
6
7
)
Plot Eadie-Hofstee analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase kontrol
() dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
10
Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase kontrol
() dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
10
Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
Kontrol () dan dengan ekstrak A. malaccensis ()
11
DAFTAR LAMPIRAN
1
Diagram alir penelitian
14
2
Grafik penentuan panjang gelombang maksimum
14
3
Persentase daya inhibisi ekstrak A. malaccensis terhadap enzim αglukosidase
14
4
Data kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
15
5
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Lineweaver-Burk
15
6
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Hanes-Woolf
15
7
Data nilai Km dan Vmax berdasarkan plot Eadie-Hofstee
16
PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini, menurut International Diabetes Federation (2014),
diperkirakan sebanyak 387 juta orang di dunia menderita penyakit diabetes pada
tahun 2014 dan diramalkan akan meningkat sampai 592 juta orang pada tahun 2035
mendatang. Menurut Perkumpulan Endokrinologi Indonesia (2006), pada tahun
2003 di Indonesia terdapat sejumlah 8,2 juta orang di daerah urban dan 5,5 juta
orang di daerah rural yang menderita diabetes. Telah diramalkan juga pada tahun
2030 di Indonesia yang menderita diabetes sebesar 12 juta di daerah urban dan 8,1
juta di daerah rural.
Diabetes melitus merupakan penyakit gangguan metabolisme yang
menyebabkan kadar glukosa darah melebihi normal (Katzung et al. 2009). Pada
umumnya, diabetes melitus dibagi menjadi dua tipe, yaitu diabetes tipe 1 dan
diabetes tipe 2. Diabetes tipe 2 merupakan tipe yang lebih banyak diderita orang,
yaitu sekitar 80 sampai 90% dari seluruh kasus diabetes yang ada (Goldstein dan
Müller-Wieland 2008). Diabetes melitus tipe 2 adalah sindrom yang disebabkan
akibat kekurangan insulin atau adanya resistensi terhadap insulin pada tingkat sel
yang mengakibatkan munculnya hiperglikemia dan glikosuria (Satyanaryana dan
Chakrapani 2006).
Insulin adalah hormon peptida yang dihasilkan oleh sel-ß pada pankreas yang
berfungsi sebagai pengontrol kadar gula dalam darah (Lipson et al. 2006). Insulin
dapat digunakan sebagai agen hipoglikemik pada diabetes melitus tipe 2 (Hu et al.
2006). Resistensi atau gangguan insulin merupakan suatu kelainan metabolisme
dan memicu terjadinya hiperglikemia. Hal ini menyebabkan naiknya sekresi insulin
dari pankreas untuk menanggulangi gangguan insulin dari jaringan–jaringan
tersebut. Hiperinsulemia yang terjadi membuat fungsi sel-ß menjadi menurun dan
menyebabkan hiperglikemia atau yang biasa disebut diabetes melitus tipe 2
(Goldstein dan Muller-Weiland 2008). Pada diabetes melitus tipe 2, kadar glukosa
darah meningkat dan ketika konsentrasi lebih tinggi dari 180-200 mg dl/l, maka
gejala seperti haus dan lapar yang berlebihan, buang air kecil yang berlebihan, dan
penurunan berat badan terjadi. Diabetes dikaitkan dengan morbiditas dan kematian
dini akibat komplikasi sistem kardiovaskular termasuk stroke pembuluh darah
(Polikandrioti dan Dokoutsidou 2009). Diabetes melitus tipe 2 juga dapat
menyebabkan gangguan pada proses belajar, daya ingat, dan kognitif pada
penderita (Mehrdad et al. 2009).
Enzim α-glukosidase adalah enzim yang berperan sebagai katalis dalam
pemutusan ikatan glikosidik dalam proses pencernaan karbohidrat (Park et al.
2008). Enzim ini dihasilkan di usus kecil. Adanya inhibitor dari kerja enzim ini
dapat menghambat penyerapan glukosa ke dalam darah. Hal ini dapat mengurangi
kadar gula dalam darah (Cheng dan Josse 2004).
Pengobatan diabetes melitus dapat dilakukan dengan pengobatan oral
menggunakan obat sintetik maupun herbal. Agen antidiabetes yang telah
digunakan, seperti acarbose, voglibose, dan miglitol, menginhibisi enzim αglukosidase secara kompetitif di dalam usus halus sehingga menghambat hidrolisis
karbohidrat dan mengurangi terjadinya hiperglikemia. Bagaimanapun juga,
penggunaan agen ini secara terus menerus pada jangka panjang dapat menyebabkan
beberapa efek samping seperti diare, mual, kembung, dan hepatotoksisitas. Oleh
2
karena itu, obat diabetes masih dikembangkan lebih lanjut. Beberapa inhibitor kerja
enzim α-glukosidase sedang dikembangkan dan diteliti sebagai alternatif
pengobatan dari agen-agen tersebut (Liu et al. 2011).
Beberapa tanaman di Indonesia yang sudah diteliti sebagai obat diabetes yaitu
sambiloto (Andrographis paniculata) (Ahmad et al. 2006), brotowali (Tinospora
crispa) (Noor et al. 1989), dan daun kelor (Molinga oliefera) (Moussa et al. 2007).
Gaharu (Aquilaria malaccensis) memiliki potensi sebagai antihiperglikemik dan
antioksidan yang dapat digunakan sebagai obat diabetes melitus.
Tumbuhan Aquilaria malaccensis banyak ditemukan di Sumatera
(Sibolangit, Bangka, Jambi, Riau, dan Sumatera Selatan), Kalimantan, Sulawesi,
Ambon, dan Papua. Tinggi tanaman yang memiliki sinonim Aquilaria agallocha
Roxb. ini bisa mencapai 20-40 m dengan diameter 60 cm dan memiliki ukuran lebar
daun sebesar 3.0-3.5 cm serta panjang 6-8 cm (Adelina 2004). Aquilaria
malaccensis yang tergolong ke dalam famili Thymelaeaceae dan kelas
Magnoliopsida banyak ditemui di Malaysia, Indonesia, Bangladesh, Bhutan, Iran,
Filipina, Singapura, Thailand, Myanmar, dan India (Akter et al. 2013; Khalil et al.
2013).
Menurut Adelina (2004), Aquilaria malaccensis mengandung lebih dari 12
komponen kimia yang dapat diekstrak dan secara luas digunakan dalam dunia
medis. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Khalil et al. (2013), ekstrak
metanol dari daun Aquilaria maleccensis memiliki beberapa kandungan senyawa
fitokimia, yaitu alkaloid, saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan
tanin). Senyawa fitokimia yang terkandung di dalamnya menjadikan tanaman ini
berpotensi terhadap kesehatan manusia. Adanya metabolit sekunder di dalam
ekstrak daun Aquilaria malaccensis dapat dimanfaatkan untuk menangani beberapa
masalah kesehatan (Khalil et al. 2013).
Penelitian yang telah dilakukan oleh Dash et al. (2008) menunjukkan bahwa
ekstrak metanol daun Aquilaria agallocha memiliki kandungan karbohidrat, asam
amino, alkaloid, tanin, glikosida, dan terpenoid. Ekstrak tersebut memiliki aktivitas
sebagai antibakteri berdasarkan pengujian yang dilakukan terhadap S. flexneri dan
P. aeruginosa. Ekstrak metanol dari daun menunjukkan efek inihibisi terhadap B.
subtilis. Keberadaan senyawa fitokimia di dalam Aquilaria agallocha
mengindikasikan bahwa tanaman tersebut berpotensi sebagai sumber obat-obatan
yang bermanfaat.
Aktivitas enzim memiliki beberapa parameter kinetika yang dapat diamati.
Kinetika inhibisi enzim dapat diukur dengan mereaksikan enzim dengan substrat
dengan beberapa konsentrasi substrat yang divariasikan. Analisis data untuk
memeroleh mekanisme inhibisi dapat dilakukan dengan menggunakan metode
Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf, dan beberapa plot lainnya
sehingga diperoleh konstanta Michaelis-Menten (Km) (Murray et al. 2009).
Potensi antihiperglikemik yang terdapat pada ekstrak daun Aquilaria
malaccensis diteliti secara in vitro melalui proses penghambatan enzim αglukosidase menjadi fokus pada penelitian ini. Penelitian ini bertujuan mengetahui
kinetika inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun A. malaccensis yang
memiliki potensi sebagai antihiperglikemik berdasarkan pengujian yang dilakukan
secara in vitro.
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak kasar daun A. malaccensis,
bufer fosfat pH 7.0 Merck, etanol PA 96%, n-heksana, etil asetat, bovine serum
albumin (BSA), α-glukosidase, p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (p-NPG), dan
natrium karbonat (Na2CO3). Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer
ultraviolet-tampak (UV-Vis) Beckman Coulter DU 530, rotary evaporator, dan
neraca analitik Mettler Toledo.
Metode Penelitian
Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu ekstraksi sampel, preparasi
larutan bahan uji, preparasi larutan ekstrak, pengujian aktivitas inhibisi terhadap
enzim α-glukosidase, dan analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase (Lampiran
1).
Pembuatan Ekstrak Daun Gaharu
Daun gaharu diambil setiap 5 helai daun dari subterminal atau pucuk. Daun
gaharu dikeringudarakan, dihaluskan, lalu ditimbang sebanyak 100 g. Daun gaharu
kering dimaserasi dengan pelarut etanol, etil asetat, dan n-heksana masing-masing
selama 1 jam, 4 jam, dan 8 jam, lalu disaring dengan penyaringan gravitasi. Ekstrak
dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak dikeringudarakan sampai kering.
Preparasi Larutan Bahan Uji
Larutan stok enzim α-glukosidase 0.6 U/mL dibuat dengan melarutkan enzim
α-glukosidase sebanyak 1 mg dalam 100 mL bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung
200 mg BSA. Selanjutnya enzim yang akan digunakan dalam pengujian diencerkan
terlebih dahulu dengan cara sebanyak 3,3 mL larutan stok enzim α-glukosidase
dilarutkan dalam 10 mL bufer fosfat pH 7.0 yang mengandung 20 mg BSA
sehingga diperoleh larutan enzim α-glukosidase 0.2 U/mL.
Larutan p-NPG 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, dan 1.25 mM dibuat dengan cara
melarutkan serbuk p-NPG masing-masing sebanyak 1.6 mg, 2.4 mg, 3.2 mg, dan 4
mg dengan bufer fosfat (pH 7.0) ke dalam labu takar 10 ml. Larutan Na2CO3 0.2 M
dibuat dengan cara sebanyak 5.3 g serbuk Na2CO3 ditimbang dan dilarutkan dalam
250 mL akuades.
Preparasi Larutan Sampel
Ekstrak kasar daun A. malaccensis ditimbang sebanyak 250 mg dan
dilarutkan dalam 50 mL etanol sehingga diperoleh larutan stok ekstrak 5000 ppm.
Larutan stok ekstrak dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan dalam 10 mL bufer
fosfat pH 7.0 sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 500 ppm.
4
Larutan tersebut kemudian diencerkan kembali untuk memperoleh larutan sampel
uji dengan konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, dan 25 ppm.
Pengujian Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro
(Modifikasi Metode Sancheti et al. 2009)
Aktivitas inhibisi α-glukosidase diuji dengan menggunakan metode Sancheti
et al. (2009) dengan sedikit modifikasi pada komposisi campuran dan berbagai
macam konsentrasi sampel. Sampel dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan
dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, kemudian
campuran diaduk hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 0.75 mL
larutan enzim α-glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 2 hari dengan suhu
kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3 0.2 M.
Selanjutnya absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi sampel (As).
Larutan blanko sampel dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL larutan
sampel, 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, dan 1 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) dan diaduk
hingga homogen. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3
0.2 M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi blanko (Ab1).
Kontrol dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL etanol PA 96%, 0.25 mL
p-NPG 0.75 mM, dan 0.5 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga homogen. Setelah
itu, campuran ditambahkan 0.75 mL enzim dan diinkubasi selama 2 hari dengan
suhu kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na 2CO3 0.2
M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi kontrol (Ac).
Larutan blanko kontrol dibuat dengan cara menyampurkan 0.1 mL etanol PA
96%, 0.25 mL p-NPG 0.75 mM, dan 1 mL bufer fosfat 0.1 M (pH 7.0) hingga
homogen. Setelah itu, masing-masing campuran diinkubasi selama 2 hari dengan
suhu kamar. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2
M. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi blanko (Ab2).
Penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ditentukan dengan rumus:
Inhibisi (%) =
� −�
Keterangan:
Ac
: Absorbansi kontrol
Ab1 : Absorbansi blanko kontrol
As
: Absorbansi sampel
Ab2 : Absorbansi blanko sampel
− ��−�
� −�
×
%
Evaluasi Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase (Mayur et al. 2010)
Pengujian kinetika inhibisi enzim α-glukosidase dilakukan dengan
menggunakan metode Mayur et al. (2010). Sampel dengan aktivitas inhibisi
5
tertinggi dipipet sebanyak 0.1 mL dan dicampurkan dengan 0.5 mL bufer fosfat 0.1
M (pH 7.0), 0.25 mL p-NPG 0.5 mM, kemudian campuran diaduk hingga homogen.
Setelah campuran homogen, sebanyak 0.5 mL larutan enzim α-glukosidase
ditambahkan. Campuran diinkubasi dengan suhu kamar. Reaksi kemudian
dihentikan dengan menambahkan 1 mL Na2CO3 0.2 M. Selanjutnya absorbans (V)
larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Pengujian dilakukan kembali
dengan menggunakan konsentrasi p-NPG [S] yang berbeda, yaitu 0.5 mM, 0.75
mM, 1 mM, dan 1.25 mM.
Data perolehan yang dikalkulasikan berdasarkan hasil terhadap kinetika
Michaelis-Menten dibuat menjadi tiga plot berbeda, yaitu plot Lineweaver-Burk
dengan 1/[S] sebagai sumbu x dan 1/V sebagai sumbu y, plot Hanes-Woolf dengan
[S] sebagai sumbu x dan [S]/V sebagai sumbu y, dan plot Eadie-Hofstee dengan
V/[S] sebagi sumbu x dan V sebagai sumbu y. Setelah itu, plot dengan nilai R 2
tertinggi digunakan untuk menentukan tipe inhibisi enzim.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Aquilaria malaccensis
Ekstrak sampel yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daun gaharu
jenis Aquilaria malaccensis yang didapat dari Laboratorium Natural Product
SEAMEO BIOTROP. Daun pertama-tama dikeringkan lalu dihaluskan, setelah itu
diekstrak menggunakan 3 pelarut berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya selama
1, 4, dan 8 jam. Pelarut yang digunakan yaitu n-heksana, etil asetat, dan etanol PA
96%. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Teknik ini digunakan
untuk mendapatkan senyaa yang tidak tahan panas. Setelah dimaserasi, ekstrak
diuapkan dengan rotary evaporator dan dikeringudarakan.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Khalil et al. (2013), ekstrak
metanol dari daun Aquilaria maleccensis memiliki beberapa kandungan senyawa
fitokimia, yaitu alkaloid, saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan
tanin). Berdasarkan beberapa penelitian, enzim α-glukosidase dapat dihambat oleh
beberapa senyawa fitokimia seperti alkaloid (Patel dan Mishra 2012), triterpene
(Lai et al. 2012), dan flavonoid (Wang et al. 2012). Senyawa fitokimia yang
terkandung di dalamnya menjadikan tanaman ini berpotensi terhadap kesehatan
manusia.
Berdasarkan penelitian Affandi et al. (2013), ekstrak Aquilaria malaccensis
yang menghasilkan daya antioksidan tertinggi adalah ekstrak dengan pelarut etanol
PA 96% selama 8 jam dengan nilai IC50 sebesar 10.6258 ppm. Dalam penelitian ini,
ekstrak etanol tersebut selanjutnya dilakukan pengujian antihiperglikemik dan
kinetika inhibisinya.
6
Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Enzim α-glukosidase adalah enzim yang menghidrolisis disakarida menjadi
glukosa dan monosakarida lainnya (Goldstein dan Muller-Weiland 2008). Enzim
α-glukosidase memecah disakarida pada cabang ikatan α-1,6-glikosidik
menghasilkan glukosa. Glukosa yang dihasilkan akan digunakan sebagai sumber
energi (Berg et al. 2002).
α-glukosidase
Gambar 1 Reaksi hidrolisis disakarida menjadi glukosa oleh enzim α-glukosidase
(Berg et al. 2002)
Inhibitor α-glukosidase merupakan sakarida yang berperan sebagai inhibitor
kompetitif yang dibutuhkan untuk mencerna karbohidrat. Inhibitor ini menginhibisi
enzim α-glukosidase yang berada di dalam usus halus (Venable dan Aschenbrenner
2005). Inhibitor α-glukosidase dapat berperan sebagai inhibitor kompetitif akibat
adanya afinitas yang tinggi terhadap α-glukosidase (Goldstein dan Muller-Weiland
2008).
Hasil uji yang didapatkan berupa absorbansi yang nilainya bergantung pada
penambahan ekstrak dan konsentrasi p-nitrofenol yang terbentuk dari reaksi.
Menurut Sugiwati et al. (2009), senyawa p-nitrofenol yang terbentuk memberikan
warna yang intensitasnya dapat diketahui dengan spektrofotometer dengan panjang
gelombang sekitar 400 nm.
α-glukosidase
Gambar 2 Reaksi hidrolisis p-NPG oleh enzim α-glukosidase menjadi p-nitrofenol
dan glukosa (Sugiwati et al. 2009)
Panjang gelombang maksimum ditentukan terlebih dahulu menggunakan
larutan kontrol pada panjang gelombang 350-490 nm. Hasil panjang gelombang
dengan serapan terbesar yaitu pada 403 nm (Lampiran 2). Panjang gelombang ini
7
%inhibisi
selanjutnya digunakan untuk pengujian daya inhibisi ekstrak A. malaccensis
terhadap enzim.
Daya inhibisi dapat ditentukan dengan mengujikan substrat dan enzim dengan
ekstrak sampel yang konsentrasinya divariasikan dengan metode Sancheti et al.
(2009) yang dimodifikasi. Semakin besar konsentrasi ekstrak A. malaccensis
(inhibitor), semakin besar pula daya inhibisinya, namun semakin rendah absorbansi
yang dihasilkan.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 2.7118x + 4.2669
R² = 0.9557
0
5
10
15
20
25
30
Konsentrasi Ekstrak (ppm)
Gambar 3 Daya inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak Aquilaria malaccensis
Hasil persentase daya inhibisi yang didapat semakin besar seiring
bertambahnya konsentrasi ekstrak, sehingga daya inhibisi terbesar pada penelitian
ini terdapat pada konsentrasi ekstrak 25 ppm, yaitu 72.03%. Setelah daya inhibisi
dihitung, nilai IC50 ditentukan. Dari nilai IC50 yang didapat, aktivitas inhibitor yang
menginhibisi sebanyak 50%, terjadi pada konsentrasi inhibitor sebesar 16.86 ppm.
Nilai tersebut menunjukkan bahwa ekstrak A. malaccensis dapat berpotensi sebagai
antihiperglikemik karena masih berada di bawah 100 ppm (Dewiyanti et al. 2012)
dan daya inhibisi yang dimiliki sampel cukup baik karena dibutuhkan konsentrasi
16.86 ppm saja untuk menginhibisi enzim dalam proses pembentukan glukosa.
Tabel 1 Inhibisi enzim α-glukosidase oleh beberapa ekstrak tanaman
Sampel
IC50 (ppm)
a
Daun Aquilaria malaccensis
16.86
Daun Aquilaria filariab
26
c
Gracilaria edulis
46
Ulva lactucac
53
d
Daun Catharanthus roseus L. G. Don
36.08
Daun Basella albad
493.47
Daun Azadirachta Indica A. Jussd
21.94
Daun Tinospora crispa Miers.d
68.06
e
Kuersetin
10.20
Keterangan: aSampel yang digunakan; bSumber: Meinar (2015) cSumber: Kumar dan Sudha (2012);
Sumber: Mun’im et al. (2013); eSumber: Dewiyanti et al. (2012)
d
Bila dibandingkan dengan ekstrak daun gaharu jenis lain, yaitu Aquilaria
filaria yang telah diuji oleh Meinar (2015) (Tabel 1), nilai IC50 ekstrak Aquilaria
malaccensis lebih rendah. Beberapa ekstrak tanaman lain seperti yang telah diuji
oleh Kumar dan Sudha (2012) dan Mun’im et al. (2013) (Tabel 1), daun Aquilaria
8
malaccensis yang dijadikan sampel dalam penelitian memiliki nilai IC50 yang lebih
rendah. Hal ini menunjukkan kemampuan sampel dalam menginhibisi kerja enzim
α-glukosidase lebih baik dan diduga sampel memliki kandungan aktif
antihiperglikemik yang lebih tinggi dari tanaman-tanaman tersebut. Adanya
kandungan senyawa fitokimia dalam Aquilaria malaccensis, seperti alkaloid,
saponin, dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid, dan tanin) (Khalil et al. 2013)
dapat menjadi salah satu faktor sampel berpotensi sebagai antihiperglikemik.
Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Kinetika kimia adalah studi tentang reaksi kimia yang berkataliskan enzim.
Dengan mempelajari kinetika enzim, kita dapat menentukan mekanisme kerja
enzim dan perannya dalam proses metabolisme, mekanisme obat yang menghambat
enzim, dan bagaimana enzim bekerja. Parameter yang diujikan dalam kinetika
kimia ini adalah Km dan Vmaks. Penentuan parameter ini apat dilakukan dengan
membuat plot hubungan antara konsentrasi substrat [S] dengan laju reaksi enzim
(V). Laju reaksi enzim semakin naik secara linear terhadap konsentrasi substrat dan
mulai berhenti naik (menjadi konstan) dan mendekati maksimum pada konsentrasi
substrat tertentu. Kondisi saat laju reaksi enzim tidak dapat naik lagi disebut Vmaks.
Mekanisme Michaelis-Menten menghitung nilai Vmaks dimana enzim sudah
tidak bekerja terhadap substrat lagi karena enzim terjenuhkan oleh substrat. Berikut
adalah persamaan Michaelis-Menten:
��
�=
��
+
[�]
dimana Km adalah tetapan Michaelis, yaitu konsentrasi substrat pada laju reaksi
50% dari Vmaks (Atkins dan Paula 2006).
Percobaan ini dilakukan dengan mereaksikan enzim, p-NPG sebagai substrat,
dan ekstrak A. malaccensis sebagai inhibitor. Konsentrasi inhibitor yang digunakan
tetap, yaitu inhibitor dengan konsentrasi tertinggi (25 ppm). Konsentrasi yang
divariasikan adalah konsentrasi p-NPG, yaitu 0.5 mM, 0.75mM, 1 mM, dan 1.25
mM. Hasil yang didapat dibuat menjadi plot Michaelis-Menten.
7.0
6.0
5.0
V
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
-5.0
-1.0 0.0
-2.0
5.0
10.0
15.0
20.0
[S]
Gambar 4 Plot Michaelis-Menten larutan kontrol berdasarkan teoritis (
dan hasil percobaan (
)
)
9
Plot ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim α-glukosidase meningkat seiring
bertambahnya konsentrasi p-NPG (substrat) dan mencapai kecepatan maksimum
pada konsentrasi p-NPG tertentu. Setelah itu, pengujian dilakukan dengan membuat
plot Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf, dan Lineweaver-Burk menggunakan data
kinetika yang telah didapat (Lampiran 3). Plot yang menghasilkan nilai R2 tertinggi
(mendekati satu) digunakan untuk menentukan mekanisme kerja enzim. Nilai R2
pada plot Eadie-Hofstee sebesar 0.4940 untuk kontrol dan 0.8063 untuk ekstrak
(Gambar 5). Nilai R2 yang dihasilkan dari plot Hanes-Woolf sebesar 0.6625 untuk
kontrol dan 0.6376 untuk ekstrak (Gambar 6). Nilai R2 yang dihasilkan dari plot
Lineweaver-Burk sebesar 0.9418 untuk kontrol dan 0.9712 untuk ekstrak (Gambar
7). Dari hasil nilai R2 untuk setiap plot, nilai R2 tertinggi dihasilkan dari plot
Lineweaver-Burk, sehingga plot yang digunakan untuk menentukan mekanisme
inhibisi enzim tersebut adalah plot Lineweaver-Burk.
8.00
6.00
V
4.00
y = -1.3015x + 4.6711
R² = 0.4940
2.00
-1.00
0.00
0.00
1.00
y = 2.3407x - 2.2532
R² = 0.8063
2.00
3.00
4.00
5.00
-2.00
-4.00
V/S
Plot Eadie-Hofstee analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
Gambar 5
1.00
y = -0.2739x + 0.8900
R² = 0.6376
0.80
y = 0.1407x + 0.3428
R² = 0.6625
[S]/V
0.60
0.40
0.20
-3.00
-2.00
0.00
-1.00
0.00
-0.20
1.00
2.00
3.00
4.00
[S]
Gambar 6 Plot Hanes-Woolf analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
10
2
y = 0.8702x - 0.2496
R² = 0.9712
2
1/V
1
1
0
-2
-1
y = 0.2992x + 0.1934
R² = 0.9418
0
1
2
3
-1
-1
1/[S]
Gambar 7 Plot Lineweaver-Burk analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
kontrol (●) dan dengan ekstrak A. malaccensis (■)
Plot Lineweaver-Burk menunjukkan nilai Km dan Vmaks pada aktivitas
inhibisi enzim. Nilai Km menunjukkan afinitas antara enzim dan substrat. Dari nilai
Km dan Vmaks yang didapat (Lampiran 5), dapat dilihat bahwa nilai terjadi penurunan
nilai Km dari 1.5470 menjadi -3.4863 dan Vmaks dari 5.1706 menjadi -4.0064 setelah
adanya penambahan ekstrak sampel 25 ppm dalam percobaan. Namun, hasil
penentuan nilai Km dan Vmaks yang bernilai negatif pada percobaan menggunakan
ekstrak sampel 25 ppm menunjukkan bahwa penentuan tipe inhibisi enzim tidak
dapat dilakukan dengan menggunakan plot Lineweaver-Burk. Nilai Km dan Vmaks
juga menunjukkan nilai yang negatif berdasarkan penghitungan menggunakan plot
Hanes-Woolf (Lampiran 6) dan Eadie-Hofstee (Lampiran 7) pada percobaaan
menggunakan sampel 25 ppm, sehingga penentuan tipe inhibisi tidak bisa
ditentukan pula menggunakan kedua plot tersebut. Hal ini disebabkan karena
ekstrak kasar mengandung lebih dari satu senyawa metabolit sekunder yang
berpotensi sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Pendekatan kajian kinetika
dengan menggunakan ketiga plot tersebut akan lebih tepat bila digunakan pada
pengujian menggunakan inhibitor berupa senyawa hasil isolasi atau senyawa murni
yang strukturnya menyerupai substrat atau dapat berikatan pada tapak aktif enzim,
seperti yang dilakukan oleh Dewiyanti et al. (2012) yang menggunakan kuersetin
sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Oleh karena itu, diperlukan pendekatan lain
untuk menentukan tipe inhibisi dari percobaan menggunakan ekstrak kasar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etanol Aquilaria malaccensis dapat berperan sebagai
antihiperglikemik yang cukup baik dengan nilai IC50 di bawah 100 ppm. Namun,
mekanisme inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak kasar sampel belum dapat
11
ditentukan menggunakan pendekatan plot Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf,
ataupun Eadie-Hofstee.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa spesifik
yang memengaruhi daya inhibisi terhadap aktivitas enzim α-glukosidase.
Penentuan total fenol juga perlu dilakukan untuk lebih memastikan adanya gugus
fenolik di dalam ekstrak tersebut.
Pendekatan kinetika yang sesuai untuk menjelaskan mekanisme inhibisi
enzim α-glukosidase harus ditelaah kembali dan perlu ditelusur lebih lanjut
senyawa spesifik yang memengaruhi daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas enzim
α-glukosidase, serta tingkat keamanan penggunaan ekstrak. Selain itu, dapat pula
dilakukan uji lanjutan (in vivo) untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap
mekanisme absorpsi, metabolisme, dan ekskresi dalam tubuh.
DAFTAR PUSTAKA
[Perkumpulan Endokrinologi Indonesia]. 2006. Konsensus Pengelolaan dan
Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia. Jakarta (ID): PB. Perkeni.
Adelina N. 2004. Aquilaria malaccensis Lam. Di dalam: Fransiskus Harum, Lars
Schmidt, Dorthe Jøker, editor. Forest and Landscape Denmark, Seed Leaflet No.
103 [Terhubung Berkala] https://ign.ku.dk/english/employees/forest-naturebiomass/?pure=en%2Fpublications%2Faquilaria-malaccensis-lam(3a7d20c0a1be-11dd-b6ae-000ea68e967b)%2Fexport.html. (16 Januari 2015).
Affandi H, Arif N, Maya M, Rojak. 2013. Potensi Antioksidan dan Antidiabetes daun
gaharu (Aquilaria malaccensis) dengan variasi proses ekstraksi. [laporan akhir].
Bogor: SEAMEO Biotrop
Ahmad M, Razak A, Akowuah GA, Asmawi Z, Zhari I. 2007. HPLC profile and
antihyperglycemic effect of ethanol normal and streptozotocin-induced diabetic
rats. J Nat Med. 61:422-429.
Akter S, Md Tanvir I, Mohd Z, Sirajul IK. 2013. Agarwood production-a
multidisciplinary field to be explored in Bangladesh. Int J Pharm Life Sci.
2(1):22-32.
Atkins PW, Paula J. 2006. Physical Chemistry. Oxford (EN): Oxford University Press.
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. 2002. Biochemistry. Ed ke-5. New York (US): WH
Freeman.
Campbell MK, SO Farrell. 2009. Biochemistry. Ed ke-6. Pacific Grove (CA): Thomson
Brooks/ Cole.
Cheng AYY, Josse RG. 2004. Intestinal absorption inhibitors for type 2 diabetes
mellitus: prevention and treatment. Drug Discovery Today: Therapeutic
Strategies. 1(2):201–206.
Dash M, Jayanta KP, Prasanna PP. 2008. Phytochemical and antimicrobial screening
12
of extracts of Aquilaria agallocha Roxb. Afr J Biotech. 7(20):3531-3534.
Dewiyanti ID, Euis F, Megawati, Tri Y. 2012. The antidiabetic activity of ‘cocor bebek
leaves’ (Kalanchoe pinnata Lam.Pers.) ethanolic extract from various areas. J
Trop Life Science. 2(2):37-39.
Goldstein BJ, Muller-Weiland D. 2008. Diabetes: Principles and Practice Second
Edition. New York (US): Informa HealthCare.
[IDF] International Diabetes Federation. 2014. Diabetes: Facts and figures.
[Terhubung Berkala] http://www.idf.org/worlddiabetes day/toolkit/gp/factsfigures. (24 Maret 2015).
Katzung BG, Masters S, Trevor AJ. 2009. Basic and Clinical Pharmacology. New
York (US): McGraw-Hill Medical.
Khalil AS, Rahim AA, Taha KK, Abdallah KB. 2013. Characterization of methanolic
extracts of Agarwood leaves. J Appl Indust Sci. 1(3):78-88.
Kumar PS, S Sudha. 2012. Evaluation of alpha-amylase and alpha-glucosidase
inhibitory properties of selected seaweeds from gulf of mannar. Int Res J Pharm.
3(8):129-130.
Lai YC, Chen CK, Tsai SF, Lee SS. 2012. Triterpenes as α-glucosidase inhibitors from
Fagus hayatae. Phytochemistry. 74:206-211.
Mayur B, Sancheti S, S Shruti, Seo SY. 2010. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory
prpoperties of Carpesium abrotanoides L. J Med Plant Res. 4(15):1547-1553.
Meinar, IA. 2015. Kinetika inhibisi enzim α-glukosidase secara in vitro oleh ekstrak
daun Aquilaria filaria sebagai antihiperglikemik [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Mitra R, John O, Morley SM. 2007. Medicinal plants of Malaysia. APBN. 11(2):105110.
Moussa N et al. 2007. Effects of oral administration of Moringa oleifera Lam on
glucose tolerance in goto-kakizaki and wistar rats. J Clin Bioche Nutr. 40:229233.
Mun’im A, Katrin, Azizahwati, A Andriani, KF Mahmudah, M Mashita. 2013.
Screening of α-glucosidase inhibitory activity of some Indonesian medicinal
plants. J Med Arom Plants. 2(2):144-150.
Murray, Robert K, Daryl KG, Victor WR. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Brahm U,
penerjemah. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari :
Harper’s Biochemistry 27th.
Noor H, Hammonds P, Sutton R, Ashcroft SJH. 1989. The hyperglycemic and
insulinotropic activity of Tinospora crispa: studies with human and rat islets and
HIT-T15 B cells. Diabetologia. 32:354-359.
Patel MB, Mishra SM. 2012. Magnoflorine from Tinospora cordiofola stem inhibits αglycosidase and is antiglycemic in rats. J Funct foods. 4:79-86.
Sancheti S, Sandesh S, Sung YS. 2009. Chaenomeles sinensis: A potent α-and βglucosidase inhibitor. Am J Pharm Toxicol. 4 (1): 8-11.
Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009. Antihyperglycemic activity of mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa (Scheff.)Boerl.) leaf extracts as an alpha-glucosidase
13
inhibitor. Makara kesehatan. 13(2):74-78.
Venable SJ, Aschenbrenner DS. 2005. Drug Therapy in Nursing. Hagerstown:
Lippincott Williams & Wilkins.
Wang H, Du YJ, Song HC. 2010. Alpha-glycosidase and α-amylase inhibitory
activities of guava leaves. Food Chem. 123:6-13.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian
Ekstraksi Sampel
Preparasi Larutan Uji
Preparasi Larutan Ekstrak
Pengujian Inhibisi terhadap Aktivitas Enzim α-Glukosidase
Analisis Kinetika Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Lampiran 2 Grafik penentuan panjang gelombang maksimum
0.40
Panjang gelombang
maksimum 403 nm
0.35
Absorbansi
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
300
320
340
360
380
400
Panjang Gelombang (nm)
420
440
460
14
Lampiran 3 Persentase daya inhibisi ekstrak A. malaccensis terhadap enzim αglukosidase
Konsentrasi ekstrak (ppm)
Absorbansi
0
2.049
5
1.711
10
1.211
15
1.087
20
0.971
25
0.573
Contoh perhitungan:
Ac As Ab
100%
Inhibisi (%) =
Ac
2.049-0.573
×100%
=
2.049
= 72.035%
y
= 2.7118x + 4.2669
50.
-4.2669
IC50 =
2.7118
= 16.8644 ppm
Inhibisi (%)
0.000
16.496
40.898
46.950
52.611
72.035
Lampiran 4 Data kinetika inhibisi enzim α-glukosidase
[S]
1/[S]
V1
V2
1/V1
1/V2
S/V1
S/V2
V1/S
V2/S
0.5000 2.0000 1.3020 0.6850 0.7680 1.4599
0.3840
0.7299
2.6040
1.3700
0.7500 1.3333 1.5630 0.9880 0.6398 1.0121
0.4798
0.7591
2.0840
1.3173
1.0000 1.0000 1.9690 1.8660 0.5079 0.5359
0.5079
0.5359
1.9690
1.8660
1.2500 0.8000 2.5410 2.1700 0.3935 0.4608
0.4919
0.5760
2.0328
1.7360
Keterangan:
S : konsentrasi p-NPG (mM)
V1 : Absorbans kontrol
V2 : Absorbans A. malaccensis 25 ppm
Lampiran 5 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Lineweaver-Burk
Larutan
a
b
R2
Km
Vmax
Kontrol
0.2992
0.1934
0.9418 1.5470
5.1706
Dengan ekstrak 25 ppm
0.8702
-0.2496 0.9712 -3.4863
-4.0064
Contoh perhitungan:
1
�
=
=
+
��
�� ��
1
+
[�]
1
�� ��
15
0.1934 =
1
�� ��
Vmaks = 5.1706
0.2992 =
��
�� ��
Km = 0.2992 × 5.1706
Km = 1.5470
Lampiran 6 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Hanes-Woolf
Larutan
a
b
R2
Km
Kontrol
0.1407
0.3428
0.6625 2.4364
Dengan ekstrak 25 ppm -0.2739
0.89
0.6376 -3.2494
Contoh perhitungan:
=
[�]
�
=
+
1
�� ��
1
0.1407 =
[�] +
�� ��
Vmax
7.1073
-3.6510
��
�� ��
Vmaks = 7.1073
0.3428 =
��
�� ��
Km = 0.3428 × 7.1073
Km = 2.4364
Lampiran 7 Data nilai Km dan Vmaks berdasarkan plot Eadie-Hofstee
Larutan
a
b
R2
Km
Kontrol
-1.3015
4.6711
0.4940 1.3015
Dengan ekstrak 25 ppm
2.3407
-2.2532 0.8063 -2.3407
Contoh perhitungan:
=
+
�
� = −�� [�] + �� ��
-1.3015 = -Km
Km = 1.3015
Vmaks = 4.6711
Vmax
4.6711
-2.2532
16
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 27 Maret 1992 dari ayah
Mohammad Ali dan ibu Secha Afifah. Penulis adalah putri kedua dari dua
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMPN 1 Bogor. Tahun 2010 penulis
lulus dari SMA Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi
masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur SNMPTN dan diterima di
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis bekerja sebagai guru piano di Yamaha
Bogor Musik dari tahun 2011. Pada bulan Juli sampai Agustus 2014 penulis
melaksanakan Praktik Lapangan di SEAMEO BIOTROP dengan judul Uji
Aktivitas Antioksidan 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) pada Ekstrak Aquilaria
malaccensis dengan Spektrofotometer.
18