14
BAB III BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar BPPBAT Bogor, Laboratorium
Mikrobiologi Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan kesehatan Masyarakat Veteriner
– Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Terpadu – Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dan Laboratorium Uji Balai Besar Pengolahan
Produk Perikanan dan Bioteknologi BBP3B Jakarta. Penelitian dilakukan pada bulan Desember 2012 - Juni 2013.
Ikan Uji
Ikan uji menggunakan ikan Gurame Osphronemus gouramy berukuran 25 - 30 g. Ikan yang digunakan harus memenuhi asumsi Spesifik Pathogen Free
SPF bebas dari karakteristik yang akan muncul ketika terinfeksi penyakit Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia, melewati masa aklimatisasi
selama 14 hari. Ikan uji yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 1.080 ekor, dengan rincian 150 ekor untuk uji tahap 1, 210 ekor untuk uji tahap 2 serta 720
ekor untuk uji tahap 3 dan 4.
Isolat Bakteri
Bakteri Mycobacterium
fortuitum dan
Aeromonas hydrophila
menggunakan isolat koleksi BPPBAT Kementerian Kelautan dan Perikanan, Bogor. A. hydrophila diinokulasi dalam media Tryptic Soy Agar TSA
menggunakan A. hydrophila isolat AHL0905-2 dan M. fortuitum diinokulasi dalam media Sauton Agar SA menggunakan M. fortuitum isolat 31.
Vaksin
Ada 2 sediaan vaksin monovalen yang di uji pada penelitian ini, yaitu vaksin monovalen sel utuh A. hydrophila Sugiani. 2012 dan vaksin monovalen
15
sel utuh M. fortuitum Purwaningsih et al. 2012 dan 3 sediaan vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila.
Alur Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam 4 tahapan penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Alur pelaksanaan penelitian vaksin koktail untuk pencegahan
penyakit Mycobacteriosis dan Motile Aeromonas Septicemia pada ikan Gurame O. gouramy.
Tahap 2 Kajian preparasi vaksin
M. fortuitum dan A. hydrophila
Sediaan vaksin
Komponen vaksin terdiri dari vaksin sel
utuh dan koktail
Fraksinasi protein melalui SDS-PAGE
Uji kualitas vaksin
Uji keamanan vaksin innocuity test, uji sterilitas vaksin sterility
test dan uji kadar formalin
Tahap 3 Efikasi vaksin koktail bakterin
M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame
Osphronemus gouramy
Melakukan analisis spesifik respon vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila secara in vivo pada ikan gurame
gambaran darah, patologi klinik darah, aktifitas Respiratory Burst, aktifitas komplemen dan titer antibodi
Tahap 1
Uji patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila
Gejala klinis, gambaran darah, patologi klinik darah, histopatologi dan
kematian ikan
Tahap 4 Proteksi silang vaksin koktail bakterin
M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame
Osphronemus gouramy
Melakukan analisis respon proteksi silang vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A. hydrophila terhadap mono infeksi dan ko-infeksi secara in vivo pada ikan
gurame RPS, gambaran darah, patologi klinik darah, aktifitas Respiratory Burst, aktifitas
komplemen dan titer antibodi
16
Tahap 1 Uji patogenitas ko-infeksi
M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame O. gouramy
Ko-infeksi adalah infeksi bersama dua atau lebih agen patogen yang dapat menyebabkan inang menjadi sakit. Uji patogenitas ko-infeksi M. fortuitum dan
A. hydrophila pada ikan gurame dilakukan dengan menginjeksikan secara intraperitoneal yaitu M. fortuitum 10
7
cfu dan A. hydrophila 10
8
cfu. Infeksi A. hydrophila dilakukan pada hari ke
– 21 pascainfeksi dengan M. fortuitum. Pengamatan dilakukan selama 28 hari untuk melihat dampak infeksi pada
ikan gurame. Parameter yang diamati antara lain patologi klinik darah, gambaran
darah, histopatologi
dan kematian
ikan uji.
Tabel 1 Perlakuan ko-infeksi LD
50
Perlakuan Tipe bakteri
Perbandingan volume bakteri Kode
1 2
3 4
Mf : Ah Mf : Ah
Mf : Ah PBS
75 : 25 50 : 50
25 : 75 -
A B
C D
Mf M. fortuitum ; Ah A. hydrophila ; PBS Phosphat Buffer Saline pH 7.2
Tahap 2 Kajian Preparasi vaksin
M. fortuitum dan A. hydrophila
1. Preparasi sediaan vaksin
Pembuatan vaksin koktail menggunakan cara kultur dengan modifikasi metode kultur terpisah menurut Silva et al. 2009. Proses inaktifasi vaksin
dilakukan dengan menambahkan neutral buffer formalin dalam sediaan kultur bakteri. Untuk membentuk vaksin koktail maka setiap sediaan vaksin
dicampurkan sesuai perbandingan komposisi yang telah ditentukan vv.
17
Vaksin yang akan dibuat pada penelitian ini adalah vaksin koktail yang berisi campuran dari sel utuh bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila. Prosedur
pembuatan vaksin yang akan dilakukan adalah sebagai berikut :
1.1 Sediaan vaksin sel utuh
Vaksin sel utuh bakteri M. fortuitum, dibuat dengan modifikasi metode
Purwaningsih et al. 2012, bakteri M. fortuitum diinokulasi kedalam media Sauton broth diinkubasi di inkubator dengan shaker selama 72 jam pada suhu
37
o
C. Hasil kultur ditambahkan neutral buffer formalin 3, kemudian dihomogenkan selama 24 jam. Hasil inaktifasi disentrifus pada 3000 g selama 30
menit, pelet sel bakteri dan supernatan dipisahkan, kemudian pelet diresuspensi dalam PBS pH 7,2 dengan rasio 1:10 vv.
Vaksin sel utuh A. hydrophila, dibuat dengan modifikasi metode Sugiani
2012. Bakteri A. hydrophila diinokulasi dalam media BHI, diinkubasi dalam inkubator dengan shaker selama 24 jam pada suhu 32
o
C. Kultur bakteri diinaktivasi dengan menambahkan neutral buffer formalin hingga konsentrasi
akhir formalin menjadi 3 vv selama 24 jam. Sel utuh bakteri Inaktif diperoleh dengan mensentrifus pada 3000 g selama 30 menit dan pelet endapan sel
diresuspensi dengan PBS pH 7,2 dengan rasio 1:10 vv. Masing-masing suspensi M. fortuitum dan A. hydrophila dicuci sebanyak
3 kali dengan mensentrifus suspensi bakteri pada 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4
o
C, kemudian diresuspensi dengan PBS pH 7,2. Suspensi bakteri yang telah dicuci dikombinasikan dengan perbandingan tertentu vv M. fortuitum : A.
hydrophila untuk membentuk vaksin koktail.
2. Uji kualitas vaksin koktail
2.1 Uji keamanan vaksin Innocuity test
Uji keamanan vaksin menggunakan metode Anderson et al. 1970 dengan menginokulasi bakterin dari sediaan vaksin pada ikan gurame O. gouramy
secara intra peritoneal IP dan sebagai kontrol ikan diinjeksi dengan PBS. Setelah 28 hari dilakukan reisolasi bakteri M. fortuitum dan A. hydrophila dari
ikan perlakuan untuk melihat koloni bakteri yang sama. Vaksin yang dikatakan
18
aman jika hasil dari reisolasi tidak diperoleh bakteri aktif yang sama dengan isolat vaksin.
2.2 Uji sterilitas vaksin Sterility test
Uji sterilisasi seperti yang dilakukan Aly 1981 dengan melakukan kultivasi sediaan vaksin dalam BHIA dan Sauton agar yang diinkubasi pada suhu
28°C selama 24 jam dan 37°C selama 72 jam untuk memastikan tidak ada bakteri yang tumbuh dari jenis A. hydrophila dan M. fortuitum yang sama seperti bakterin
sediaan vaksin.
2.3 Uji kadar formalin vaksin
Uji kuantitatif untuk melihat residu kadar formalin yang terkandung dalam sediaan vaksin setelah inaktifasi dilakukan dengan menggunakan metode AOAC
1990. Tahapan analisis dapat dilihat pada Lampiran 2. Penyerapan warna dilihat dengan alat spektrofotometer pada absorban 415 nm.
Hasil analisis dimasukkan ke dalam rumus: Kadar formalin ppm
Keterangan : Ca
: Mikrogram formalin dari kurva W
: berat contoh gram F
: faktor pengenceran 2.4
Analisa protein sel utuh menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate
– Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS
–PAGE
Preparasi sediaan lysate sel utuh dari M. fortuitum dan A. hydrophila diisolasi menggunakan metode pemurnian Encheva et al. 2006. Sebanyak 200
mg berat basah sel diresuspensi dalam 1 mL lysis buffer 0.2 SDS, 133 mm DTT, 17 mm MgCl2, 50 mm Tris yang berisi 375 U benzonase Sigma dan 350
U mutanolysin Sigma. Sel diinkubasi 24 jam pada 37
o
C kemudian dipindahkan ke dalam Lysing Matrix B tubes MP Biomedicals dan dihomogenkan selama 30
menit dalam FastPrep-24 MP Biomedicals dengan pendinginan setiap 2 menit diatas es.
19
Sel utuh disentrifus pada 16.000 g selama 30 menit pada suhu 4
o
C, dan supernatan dikumpulkan kemudian disimpan pada -80
o
C. Setiap isolat, berisi protein dalam 100
µL aliquot dipresipitasi menggunakan trichloroacetic acid acetone dan diresuspensi pada volume yang sama dengan PBS, untuk menguji
sterilitas dari protein dilakukan protein assays, di mana konsentrasi protein diuji menggunakan Micro BCA-Protein Assay Pierce.
Whole-cell lysates dari setiap isolat dianalisa dengan SDS –PAGE
LaFrentz et al., 2004. Protein 25 μg dipisahkan dalam 12 polyacrylamide
gel menggunakan Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad dan kemudian diwarnai dengan Bio-Safe Coomassie Bio-Rad. Precision Plus protein standards Bio-
Rad digunakan untuk menghitung masa molekul dari pita protein. Gel kemudian di foto menggunakan Densitometer Bio-Rad.
Tahap 3 Efikasi vaksin koktail bakterin
M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame
O. gouramy
Pengujian vaksin koktail bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan gurame uji dilakukan mengunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan
komponen perlakuan sebagai berikut : Tabel 2. Komponen perlakuan vaksin
Perlakuan Komponen vaksin
1 2
3 4
5 6
25 su Mf : 75su Ah 50 su Mf : 50su Ah
75 su Mf : 25su Ah su Ah
su Mf K
Mf Mycobacterium fortuitum, Ah Aeromonas hydrophila, su sel utuh, K kontrol
Kajian terhadap respon imun spesifik dan non spesifik dilakukan pengambilan sampel darah ikan gurame pada minggu ke -1, minggu ke -2 dan
minggu ke -3 pasca vaksinasi untuk pemeriksaan titer antibodi, aktifitas respiratory burst, komplemen, aktifitas fagositosis, patologi klinik darah dan
gambaran darah.
20
Tahap 4 Proteksi vaksin koktail
bakterin M. fortuitum dan A. hydrophila pada ikan
gurame O. gouramy
Kajian efektivitas vaksin koktail terhadap pengaruh mono infeksi dan ko- infeksi M. fortuitum dan A. hydrophila dilakukan pada hari ke
– 21 pasca vaksinasi dengan menginjeksikan pada masing
– masing perlakuan dengan mono infeksi M. fortuitum 10
7
cfu, A. hydrophila 10
8
cfu dan infeksi gabungan keduanya Tabel 3.
Pengamatan terhadap uji tantang dengan monovalen A. hydrophila dilakukan selama 14 hari sedangkan uji tantang dengan monovalen M. fortuitum
dan ko-infeksi diamati selama 28 hari. Parameter uji yang diukur dalam tahap ini antara lain titer antibodi, aktifitas respiratory burst, komplemen, aktifitas
fagositosis, patologi klinik darah dan gambaran darah. Tabel 3 Perlakuan proteksi vaksin monovalen dan koktail M. fortuitum dan A.
hydrophila Perlakuan
Ulangan Komponen vaksin
Komponen uji tantang 1
2
3
4
5
6 1
2 3
1 2
3 1
2 3
1 2
3 1
2 3
1 2
3 25 su Mf : 75su Ah
25 su Mf : 75su Ah 25 su Mf : 75su Ah
50 su Mf : 50su Ah 50 su Mf : 50su Ah
50 su Mf : 50su Ah 75 su Mf : 25su Ah
75 su Mf : 25su Ah 75 su Mf : 25su Ah
su AH su AH
su AH su MF
su MF su MF
K K
K M. fortuitum
A.hydrophila Ko-infeksi
M. fortuitum A.hydrophila
Ko-infeksi M. fortuitum
A.hydrophila Ko-infeksi
M. fortuitum A.hydrophila
Ko-infeksi M. fortuitum
A.hydrophila Ko-infeksi
M. fortuitum A.hydrophila
Ko-infeksi
Mf Mycobacterium fortuitum,Ah Aeromonas hydrophila, su sel utuh, K kontrol
21
Parameter yang Diamati
Beberapa parameter uji yang diamati pada penelitian ini diantaranya adalah kematian ikan, gejala klinis dan gambaran sistem imun ikan.
Gejala klinis
Gejala klinis ikan diamati dengan melihat tingkah laku makan, berenang, respon terhadap kejutan dan perubahan anatomi bagian luar tubuh ikan maupun
organ dalam ikan.
Hematologi dan gambaran sistem imun
Pengamatan hematologi dan gambaran sistem imun dilakukan dengan mengamati sampel darah yang diambil dari ikan perlakuan kemudian diukur kadar
hemoglobin menurut metode Sahli Wedenmeyer Yasutake 1977. Kadar hematokrit menurut metode Anderson dan Siwicki 1995. Aktifitas fagositosis
meliputi indek fagositik dan persen fagositosis dievaluasi menggunakan metode Zhang et al. 2008.
Produksi oksigen radikal dari fagositosis dalam darah dapat dilihat dengan pewarnaan nitroblue tetrazolium NBT-Assay seperti yang dilakukan Anderson
dan Siwicki 1995. Aktifitas komplemen Complement consumption assay dilakukan menggunakan metode Vivas et al. 2005. Titer antibodi diukur dengan
menggunakan aglutinasi langsung direct aglutination terhadap antigen-antibodi perlakuan.
1 Gambaran hematologi
Darah diambil secara intra muscular dari caudal vein ikan menggunakan spuit yang telah diberi heparin sebagai antikoagulan, darah disimpan pada suhu
15
o
C. kemudian diukur kadar hemoglobin menurut metode Sahli dengan salinometer Wedenmeyer dan Yasutake 1977, kadar hematokrit menurut metode
Anderson dan Siwicki 1993.
2 Indek fagositosis
Aktifitas fagositosis dievaluasi menggunakan metode Zhang et al. 2008 dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 100 µ L suspensi Staphylococcus aureus
kepadatan 10
7
cfumL dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf, ditambahkan 200 µ L darah dengan heparin dan dihomogenkan menggunakan vortex, kemudian
22
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30
o
C. Sebanyak 1 mL salin ditambahkan ke dalam tabung dan dihomogenkan. Solusi homogenat disentrifus dengan 3.000 g
selama 5 menitl lalu 1 mL supernatan diambil kemudian dibuang dan sisa solusi dihomogenkan kembali. Diambil satu tetes homogenat, dibuat preparat ulas di atas
slide glass. Preparat difiksasi dengan metanol selama 2-3 menit, kemudian dicuci dengan akuades, preparat dikeringanginkan, tahap akhir preparasi diwarnai
dengan pewarna giemsa. Preparat diamati di bawah mikroskop. Persen Fagositosis PF dan Indek Fagositosis IF dihitung menggunakan rumus:
PF =N
1
100x100 IF = N
2
100 Keterangan :
N
1
: total jumlah fagosit yang memakan engulfing bakteri secara acak dari 100 fagosit yang terhitung.
N
2
: total jumlah bakteri yang dimakan oleh fagosit dari 100 fagosit yang terhitung.
3 Uji Respiratory burst NBT-assay
Produksi oksigen radikal dari fagositosis dalam darah dapat dilihat dengan pewarnaan nitroblue tetrazolium NBT. Sebanyak 50
µl sampel darah dengan heparin diletakkan pada sumur microplate well
“U” diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
ºC kemudian dicuci dengan PBS dan ditambahkan 50µl 0.2 NBT, suspensi NBT - sel darah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 25°C. Setelah itu
lakukan fiksasi dengan metanol 100 selama 2 – 3 menit dilanjutkan dengan
metanol 30 sebanyak 3 kali. Kemudian dikeringanginkan, selanjutnya tambahkan 60
µl kalium hydroxide dan 70 µl larutan dimethylsulfoxide. Analisa produksi radikal oksigen dengan menggunakan NBT nitroblue tetrazolium
dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm Anderson and Siwicki, 1995.
4 Aktifitas komplemen
Aktifitas komplemen Complement consumption assay dilakukan
menggunakan metode Vivas et al. 2005 yang dimodifikasi. Sebanyak 200 µ L serum ikan dan 200 µL suspensi bakteri A. hydrophila 10
8
cfumL dicampurkan
23
dengan PBS steril dalam 1,5 mL tabung Eppendorf. Sebanyak 200 µ L serum ikan dan 200 µ L suspensi bakteri M. fortuitum 10
8
cfumL dicampurkan dengan PBS steril dalam 1,5 mL tabung Eppendorf. Sebanyak 200 µ L serum ikan dan 100 µL
suspensi bakteri A. hydrophila dan 100 µ L suspensi bakteri M. fortuitum dicampurkan dengan PBS steril dalam 1,5 mL tabung eppendorf, untuk kontrol
tabung eppendorf hanya diisi dengan PBS. Tabung diinkubasi selama 1,5 jam pada suhu 16
o
C. Ditambahkan 400 µ L PBS ke dalam setiap tabung dan suspensi difilter menggunakan filter 0,22 µm.
Larutan hasil filtrasi dimasukkan ke dalam mikrotiter 25 µ L, ditambahkan secara serial serial two-fold dilutions 2 suspensi rabbit red blood cells
RaRBC dalam PBS yang kemudian diinkubasi selama 1,5 jam pada 16
o
C. Tahap selanjutnya ditambahkan 100 µ L 0,9 salin dingin ice-cold, dan sel
diendapkan dengan cara disentrifus 1.400 g, 5 menit, 4
o
C. Absorban supernatan dilihat dengan 405 nm. 100 hemolisis diperoleh dengan menambahkan 25 µ L
RaRBC dan 175 µL akuades sedangkan aktifitas lisis spontaneous lysis diperoleh dengan menambahkan 25 µL RaRBC dan 50 µ L PBS, setelah 1 jam
diinkubasi ditambahkan 100 µ L 0,9 salin. Aktifitas komplemen dihitung dengan melihat hemolisis pada RaRBC, hasil dimasukkan dalam rumus berikut :
Percent haemolysis = {A405sampel
–A405spontaneous lysisA405 100 haemolysis- A405spontaneous lysis
} x 100
5 Titer Antibodi
Pengamatan titer antibodi dilakukan untuk mengamati antibodi yang dihasilkan oleh ikan setelah diberi perlakuan. Pengamatan dilakukan terhadap
beberapa ekor sampel ikan uji. Pengukuran titer antibodi dilakukan sebelum dilakukan vaksinasi, minggu ke tiga pada masa induksi vaksin dan minggu ke 4
setelah uji tantang. Serum darah ikan uji diperoleh dengan cara darah diambil menggunakan jarum suntik, kemudian dimasukkan ke dalam microtube 1.5 ml.
Agar serum yang didapat benar-benar bersih dan terpisah dari sel darah, maka darah disentrifus, serum yang diambil bisa diambil dari supernatan. Kemudian
dilakukan uji aglutinasi dalam microplate. Keberadaan antibodi dapat dideteksi
Kategori