Tabel 7 Hasil uji validitas dan reliabilitas kuesioner penelitian n=9 Peubah
Cronbachs Alpha Based on
Standardized Items Reliabilitas
α-Cronbach Keterangan
Pengetahuan responden 0.710
0.724 valid dan reliabel
Sikap responden 0.779
0.765 valid dan reliabel
Perilaku responden 0.776
0.791 valid dan reliabel
hasil uji validitas dan realibilitas instrument penelitian nyata pada α 0.01
2. Pengambilan Sampel
Untuk kebutuhan penelitian mikrobiologik, sampel diambil pada pukul 08.00- 10.00. Sampel yang dikoleksi terdiri atas MT-P, mikroba dari tangan ibu, mikroba dari
tempat minum, dan air minum matang yang digunakan untuk preparasi MT-P. Untuk melihat kebenaran cara responden merebus air minum dan melarutkan MT-P, diambil air
minum mentah dan MT-P yang digunakan responden dan di laboratorium dibuat perlakuan sebagai kontrol yang terdiri atas: 1 air minum matang, yaitu dengan
memanaskan air mentah asal responden sampai suhu 100ºC selama 2 menit, didinginkan sampai suhu 70ºC, dan 2 MT-P siap konsumsi yaitu dengan melarutkan MT-P asal
responden dengan air matang kontrol sesuai dengan petunjuk pada kemasan secara aseptis. Selanjutnya air minum mentah, air minum matang kontrol dan larutan MT-P
kontrol diuji kandungan mikrobanya.
a. Makanan Tambahan Pemulihan MT-P
MT-P yang dikoleksi adalah produk yang dibagikan oleh Puskesmas pada Program Perbaikan Gizi bagi Balita Penderita Gizi Buruk, yang telah diterima oleh
responden. Sampel MT-P yang diambil, berasal dari: 1
Dalam kemasan yang masih tertutup, diambil sebanyak 50 gram. 2
Dalam kemasan yang sudah dibuka, diambil sebanyak 50 gram. Pengambilan dilakukan berulang dalam selang 2 hari sampai MT-P habis.
3 MT-P yang sudah dilarutkan oleh ibu dengan volume minimal 100 ml.
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi, sewaktu mengambil sampel digunakan sarung tangan dan sebelum membuka kemasan bagian luarnya disemprot terlebih dahulu
dengan alkohol 70. Sampel kering dimasukkan ke dalam kantong plastik steril, sedangkan sampel terlarut dipindahkan ke dalam botol steril yang berpenutup. Sampel
terlarut dibawa dalam kontainer es, dan segera dianalisis setelah sampai di laboratorium.
b. Mikroba dari Tangan Ibu Sveum et al. 1992
Sampel mikroba dikoleksi dari tangan ibu sebelum menyiapkan MT-P dengan metoda usap. Kapas usap steril yang telah dilembabkan dengan BPW 0.1 steril
digulirkan di permukaan telapak tangan ibu seluas 20 cm
2
sebanyak 3 kali. Kapas usap kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 10 ml BPW steril. Usapan dilakukan
pada tangan kanan dan kiri. Seluruh sampel dibawa dalam kontainer es dan segera dianalisis setelah sampai di laboratorium.
c. Mikroba dari Tempat minum MT-P Harrigan 1998
Sampel mikroba dikoleksi dari tempat minum, yang sehari-hari digunakan oleh balita untuk minum MT-P. Sampel diambil sebelum tempat minum digunakan untuk
melarutkan MT-P. Sampel dikoleksi dengan metoda bilas, yaitu 20 ml BPW 0.1 steril digulingkan keseluruh permukaan tempat minum sebanyak 10 kali dengan jeda 5 menit
diantara 5 kali gulingan. Seluruh sampel dibawa dalam kontainer es dan segera dianalisis setelah sampai di laboratorium.
d. Air minum Harrigan 1998
Sampel air minum diambil dari air yang digunakan untuk membuat MT-P, baik yang mentah dan matang masing-masing sebanyak 250 ml ditempatkan dalam kantong
plastik steril. Seluruh sampel dibawa dalam kontainer es dan segera dianalisis setelah sampai di laboratorium.
Tahap II. Pengukuran Mutu Mikrobiologik 1.
Penyiapan Sampel
Sampel MT-P kering dan terlarut, larutan swab, bilasan tempat minum dan air minum ditimbang atau diukur sebanyak 20 gram atau ml dicampur dengan 180 ml
peptone-saline 0.1 peptone dan 0.85 NaCl, dihomogenkan selama 2 menit larutan 10
-1
, selanjutnya diikuti dengan pengeceran seri Messer et al. 1992. 2.
Analisis Sampel a.
Penghitungan Jumlah Mikroba Aerob dengan Metoda Tuang Swanson et al. 1992
Satu ml hasil pengenceran seri dituang ke dalam cawan steril, ditambahkan 12-15 ml PCA cair suhu 45ºC. Selanjutnya sampel dan agar dicampur dengan cara
menggerakkan petri membentuk angka delapan di atas permukaan yang rata. Agar
dibiarkan membeku, lalu dimasukkan secara terbalik ke dalam inkubator. Seluruh lempeng diinkubasi pada kondisi aerob pada suhu 35°C selama 20-24 jam. Lempeng
agar dengan jumlah koloni antara 25-250 dihitung Gambar 7. Rata-rata jumlah koloni yang dihitung diekspresikan dalam coloni forming unit CFU. Pengujian dilakukan
secara duplo.
Gambar 7 Pertumbuhan mikroba aerob dalam PCA Cara penghitungan jumlah mikroba aerob dalam sampel:
Rumus : N = C[1 x n
1
+ 0.1 x n
2
] x d
Keterangan : N = jumlah koloni per ml atau g sampel
C = jumlah total koloni yang tumbuh dalam seluruh cawan yang memenuhi kriteria n
1
= jumlah cawan pengenceran pertama yang dihitung n
2
= jumlah cawan pengenceran kedua yang dihitung d = pengenceran yang pertama kali dapat dihitung
b. Jumlah B. cereus dan C. perfringens
1 B. cereus Harmon et al. 1992
Khusus untuk susu bubuk, 10 ml dari larutan 10
-1
sampel diberi heat shock dalam penangas air 75°C, 15 menit, lalu segera didinginkan dalam air dingin, kemudian
dibuat pengenceran seri Gambar 8. Selanjutnya sebanyak 0.1 ml homogenat dari setiap sampel ditanam di atas lempeng agar MYP dengan bantuan hockey stick yang berbeda.
Inokulum didiamkan sampai memadat lalu diinkubasi pada suhu 30ºC selama 20-24 jam. Koloni dengan zona presipitasi memproduksi lesitinase warna eosin merah jambu-
lavender dihitung 15-150 koloni.
Gambar 8 Skema pengujian sampel terhadap B. Cereus
Minimum 5 koloni diambil sebagai subyek konfirmasi, ditransfer ke nutrient agar miring. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30ºC. Selanjutnya koloni dibuat preparat ulas,
diwarnai dengan pewarna Gram dan diamati di bawah mikroskop. B. cereus nampak sebagai batang besar Gram positif rantai pendek sampai panjang, spora elipsoidal,
letaknya sentral sampai subterminal, dengan sporangium yang tidak membengkak Gambar 9.
Dengan menggunakan ose, dipindahkan satu ose penuh kultur ke dalam 0.5 ml BPW 0.1 steril dan dikocok dengan Vortex mixer. Larutan selanjutnya diinokulasi ke
dalam media konfirmasi berikut:
Sampel
Bubuk kering Larutan
Dibuat pengenceran seri
Koloni merah jambu, lesitinase positif
Ditanam 0,1 ml pada MYP agar diinkubasi pada suhu
30°C, 24 jam Dilarutkan,
heat shock 70°C, 15 menit
Uji konfirmasi: Glukosa anaerob, reduksi nitrat menjadi
nitrit, reaksi Voges-Proskauer Presumtif
Gambar 9 B. cereus dalam pewarnaan Gram pembesaran 1000 x
a Broth glukosa merah phenol Satu ose larutan kultur ditambahkan ke dalam 3 ml broth. Diinkubasi secara anaerob
selama 24 jam pada suhu 35ºC dalam jar anaerob. Adanya pertumbuhan diperlihatkan dengan meningkatnya turbiditas dan perubahan warna dari merah ke kuning Gambar 10,
yang mengindikasikan terbentuknya asam dalam suasana anaerob.
Gambar 10 Perubahan warna broth glukosa merah phenol setelah diinokulasi isolat B. cereus dan diinkubasi secara anaerob
b Broth nitrat Diinokulasi 5 ml broth dengan 1 ose penuh kultur. Inkubasi tabung selama 24 jam pada
suhu 35ºC. Tambahkan masing-masing 0.25 ml reagen A dan C reagen deteksi nitrat ke dalam tiap tabung kultur. Terbentuknya warna jingga Gambar 11 dalam 10 menit,
mengindikasikan bahwa nitrat telah direduksi menjadi nitrit.
Keterangan: tabung kiri positif, ada fermentasi tabung kanan negatif, tidak ada fermentasi
Keterangan: tabung kiri positif, terbentuk asetilmetilkarbinol tabung kanan negatif, tidak terbentuk asetilmetilkarbinol
Gambar 11 Perubahan warna broth nitrat setelah direduksi menjadi nitrit oleh isolat B. cereus
c Medium Voges-Proskauer termodifikasi Diinokulasi 5 ml medium dengan 1 ose penuh kultur dan diinkubasi selama 48 ± 2 jam
pada suhu 35ºC. Kedalam 1 ml kultur ditambahkan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml
40 kalium hidroksida. Dikocok, ditambahkan beberapa kristal kreatin, didiamkan selama 1 jam pada suhu ruangan. Reaksi positif terjadi, jika terbentuk warna merah
jambu atau violet Gambar 12, akibat diproduksinya asetilmetilkarbinol.
Gambar 12 Perubahan warna medium Voges-Prokauer setelah diproduksinya asetilmetilkarbinol oleh isolat B. cereus
d Medium motilitas Medium motilitas ditusuk dengan jarum yang telah dicelupkan ke dalam kultur isolat.
Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 30ºC dan diamati tipe pertumbuhan disepanjang
Keterangan: tabung kiri positif, nitrat tereduksi menjadi nitrit tabung kanan negatif, nitrat tidak tereduksi
garis tusukan. Mikroba yang motil akan tumbuh secara difus menjauhi garis tusukan Gambar 13.
Gambar 13 Tipe pertumbuhan pada medium motilitas setelah diinokulasi dengan isolat B. cereus
Jumlah CFU B. cereus per gram sampel dihitung berdasarkan persentase koloni yang diuji yang dikonfirmasi sebagai B. cereus. Pengujian dilakukan secara duplo.
2 C. perfringens Labbe dan Harmon 1992
Khusus untuk susu bubuk 20 gram sampel dilarutkan dalam 180 ml FTG medium. Seluruh homogenat dari sampel diberi heat shock dalam penangas air 75°C, 15 menit
kemudian dibuat pengenceran seri Gambar 14. Sebelumnya, disiapkan lapisan pertama TSC agar, dengan cara ke dalam cawan petri dituang 6-7 ml larutan TSC dengan kuning
telur 50, didiamkan sampai padat. Setelah padat dituang 0.1 ml larutan homogenat ke tengah lempeng, diratakan dengan hockey stick sampai kering. Kemudian dituang 15 ml
TSC tanpa kuning telur, diratakan dan dibiarkan memadat. Selanjutnya, diinkubasi anaerob pada suhu 35°C, 20-24 jam. Dihitung lempeng yang mengandung 20-200 koloni
hitam.
Keterangan: tabung kiri pertumbuhan motil, ada pertumbuhan yang difus di permukaan tabung
tabung kanan pertumbuhan tidak motil, ada pertumbuhan disepanjang garis tusukan
Gambar 14 Skema pengujian sampel terhadap C. Perfringens
Minimum 5 koloni diambil sebagai subyek konfirmasi, ditransfer kedalam FTG broth, diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35ºC. Setiap kultur dibuat preparat ulas,
diwarnai dengan pewarnaan Gram dan diamati di bawah mikroskop. C. perfringens bereaksi positif terhadap pewarnaan Gram, sel vegetatifnya berbentuk batang, tebal, dan
pendek Gambar 15.
Gambar 15 C. perfringens dalam pewarnaan Gram pembesaran 1000 x
Sampel
Bubuk kering Larutan
Dibuat pengenceran seri
Koloni hitam, lesitinase positif
Ditanam 0,1 ml EY-TSC agar, overlay dengan TSC diinkubasi pada suhu 37°C,
anaerob, 24 jam Ditambahkan larutan
thioglycollate 1:10, dihomogenkan selama 2 menit
Uji konfirmasi: Motilitas, reduksi nitrat menjadi nitrit,
fermentasi laktosa, dan gelatin Heat shock 75°C, 15 menit
Presumtif
Keterangan: tabung atas negatif, gelatin tetap membeku setelah 48 jam
tabung bawah positif, gelatin mencair
Larutan selanjutnya diinokulasi ke dalam media konfirmasi berikut: a Media laktose gelatin
Media laktose gelatin ditusuk dengan ose yang telah dicelupkan ke dalam larutan kultur. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC dalam jar anaerob. Diamati terhadap produksi
gas dan perubahan warna dari merah ke kuning yang menandakan terbentuknya asam. Kemudian tabung didinginkan selama 1 jam pada suhu 5ºC untuk melihat adanya
pencairan gelatin Gambar 16. Jika medium membeku, diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 35ºC dan diamati kembali terhadap pencairan gelatin.
Gambar 16 Reaksi pencairan gelatin pada medium laktose gelatin yang diinokulasi dengan isolat C. perfringens
b Media motilitas-nitrat buffer Media motilitas-nitrat ditusuk dengan ose yang telah dicelupkan ke dalam larutan kultur.
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC dalam jar anaerob. Diamati terhadap tipe pertumbuhan disepanjang garis tusukan. Mikroba yang tidak motil tumbuh disepanjang
garis tusukan. Selanjutnya ke dalam tabung ditambahkan 0.5 ml reagen A dan 0.2 ml reagen B reagen deteksi nitrat. Warna violet Gambar 17 akan muncul dalam 5 menit,
yang mengindikasikan adanya nitrit. Jika warna tidak terbentuk, ditambahkan beberapa bubuk metal seng dan dibiarkan beberapa menit. Reaksi negatif tidak berwarna setelah
ditambahkan bubuk seng mengindikasikan bahwa nitrat telah direduksi. Reaksi positif berwarna violet mengindikasikan bahwa mikroba tidak mampu mereduksi nitrat.
Gambar 17 Reaksi reduksi nitrat menjadi nitrit pada medium yang diinokulasi dengan isolat C. perfringens
Jumlah CFU C. perfringens per gram sampel dihitung berdasarkan persentase koloni yang diuji yang dikonfirmasi sebagai C. perfringens. Pengujian dilakukan secara
duplo.
3. Deteksi Enterotoksin Oxoid 1998
