The Effect of Application Probiotic Lactobacillus brevis and prebiotics Oligosaccharides for immune response and resistance Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) Infected by Aeromonas hydrophila.

Pengaruh Pemberian Probiotik Lactobacillus brevis dan Prebiotik Oligosakarida terhadap Respon Imun dan Resistensi Benih Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus) yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila

YUKE ELIYANI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Pengaruh pemberian probiotik Lactobacillus brevis dan prebiotik oligosakarida terhadap respon imun dan resistensi benih patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) yang diinfeksi Aeromonas hydrophila” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2013 Yuke Eliyani C151110081

RINGKASAN

YUKE ELIYANI. Pengaruh pemberian probiotik Lactobacillus brevis dan prebiotik oligosakarida terhadap respon imun dan resistensi benih patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) yang diinfeksi Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh WIDANARNI dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) merupakan salah satu jenis patin yang banyak dibudidayakan di Indonesia, serta memiliki nilai ekonomis yang tinggi. Salah satu penyakit pada budidaya patin adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila dan dikenal dengan motile aeromonad septicaemia (MAS). Tindak pencegahan dan penanggulangan telah dilakukan untuk mengatasi penyakit ini, salah satunya adalah penggunaan antibiotika, namun seringkali dalam penggunaannya tidak sesuai dosis dan waktu penggunaan, sehingga menimbulkan resistensi patogen. Berkenaan dengan hal tersebut, maka dicari berbagai langkah alternatif, diantaranya adalah pemanfaatan probiotik, prebiotik, serta gabungan probiotik dan prebiotik (sinbiotik). Probiotik merupakan mikroorganisma hidup, yang mempunyai pengaruh menguntungkan pada kesehatan inang dengan memperbaiki keseimbangan mikrobiota intestinal. Bakteri yang dapat digunakan sebagai probiotik diantaranya adalah dari golongan Lactobacillus. Prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dicerna oleh inang, mampu secara selektif menstimulasi pertumbuhan bakteri pencernaan seperti Bifodobacteria dan bakteri asam laktat, dan biasanya berasal dari golongan oligosakarida, diantaranya adalah fructooligosaccharide (FOS), dan galactooligosaccharide (GOS).

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh pemberian probiotik Lactobacillus brevis, prebiotik oligosakarida dan gabungannya terhadap jumlah bakteri Lactobacillus sp. dan total bakteri dalam usus, respon imun, kelangsungan hidup dan pertumbuhan benih patin siam yang diinfeksi Aeromonas hydrophila.

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Oktober sampai dengan Desember 2012 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Institut Pertanian Bogor; Sekolah Tinggi Perikanan Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor; dan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar Sukabumi. Kegiatan penelitian meliputi persiapan bakteri probiotik dan A.hydrophila, analisis prebiotik (oligosakarida), uji in vitro, dan uji in vivo. Parameter uji yang diamati selama penelitian adalah jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri pada usus, total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total leukosit, diferensial leukosit, kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan FCR benih ikan patin siam serta kualitas air. Penelitian terdiri dari lima perlakuan dengan masing-masing tiga ulangan, yaitu kontrol (+), kontrol (-), pemberian probiotik (Pro), pemberian prebiotik (Pre), pemberian probiotik ditambah prebiotik (Sin). Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor. Data dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan 95%. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan maka analisis data dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program Xl-stat.

Hasil karakterisasi bakteri menunjukkan bahwa jenis probiotik dan patogen masing–masing adalah Lactobacillus brevis dan Aeromonas hydrophila. Bakteri Lactobacillus sp. ditemukan di usus pada perlakuan probiotik dan sinbiotik dengan kisaran jumlah 101 sampai 106 (CFU/gram). Total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total leukosit, diferensial leukosit, aktivitas fagositik perlakuan, berbeda nyata (p<0.05) dengan kontrol pada beberapa waktu pengamatan. Tingkat kelangsungan hidup perlakuan Sin, Pre, Pro serta K(-) menunjukkan nilai sebesar 100%, sedangkan K(+) sebesar 43,33 ± 11,55. Laju pertumbuhan harian terbaik dicapai pada perlakuan pemberian sinbiotik sebesar 3,370±0,14. Nilai FCR perlakuan probiotik, prebiotik dan sinbiotik masing-masing sebesar 1,414±0,13; 1,431±0,08 dan 1,305±0,08.. Respon imun pada parameter total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, serta total leukosit, menunjukkan bahwa perlakuan Sin lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya. Kata kunci : probiotik, prebiotik, sinbiotik, Lactobacillus brevis, Aeromonas hydrophila, Pangasionodon hypophthalmus

SUMMARY

YUKE ELIYANI. The Effect of Application Probiotic Lactobacillus brevis and prebiotics Oligosaccharides for immune response and resistance Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) Infected by Aeromonas hydrophila. Supervised by WIDANARNI and DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Thai catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the important

economic and cultivated fish species in Indonesia. while diseases caused by

Aeromonas hydrophila often breakout and spread in catfish farming and

sometimes cause large economic losses. Aeromonas hydrophila is a causative agent of motile aeromonad septicemia (MAS). The wide and frequent use of antibiotics in aquaculture for this diseases, has resulted in the development and spread of antibiotic resistance. The other alternative for this case were probiotics, prebiotics, and combined of probiotics and prebiotics (synbiotics). Probiotics are live microbial supplements that beneficially affect the host animal by improving its microbial balance. These strains commonly used as probiotics were Lactobacillus. Prebiotics are non-digestible food ingredients that stimulate the growth with selective of intestinal microbial like bifidogenic and lactic acidbacteria in the gastro-intestinal tract. Typically, the prebiotics consist of oligosaccharides, like fructooligosaccharide (FOS), dan galactooligosaccharide (GOS).

The aim of this study was to evaluate of probiotic Lactobacillus brevis, prebiotic Oligosaccharides and synbiotics upon the population bacteria in the intestine, immune response, survival (SR), and growth rate (SGR) of Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) which was infected by Aeromonas hydrophila.

The study was carried out at the Fish Health Laboratory, Aquaculture Department of the Faculty of Fisheries and Marine Science Bogor Agricultural University; College of Fisheries university Extension Programe; and Main Centre of Freshwater Aquaculture Development, on October – December 2012. The parameters were total number of Lactobacillus sp. in the gut, total number of erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, leucocyte, differntial leucocyte, and phagocytic activity, survival rate, growth rate, FCR (feed convertion ratio), and water quality. For in vivo test 5 (five) treatments and three replicated utilized, i.e. positive control (K(+)), negative control (K(-)), probiotic (Pro), prebiotics Oligosaccharides (Pre) and sinbiotics (Sin). One-way ANOVA was used to determine differences among the treatments. When a significant (p<0.05) difference was detected, the means were compared by use of Duncan’s multiple range test, and analysed by Xl-stat programe

The results of the characteristics test showed that the species of probiotic and pathogen were Lactobacillus brevis and Aeromonas hydrophila respectively. In vivo test was carried out in 5 (five) treatments, i.e. positive control (K(+)), negative control (K(-)), probiotic (Pro), prebiotic (Pre) and synbiotic (Sin). The results showed that the total number of Lactobacillus sp. in the gut were between

101-106 (CFU/gr) and the total number of erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, leucocyte, differntial leucocyte, and phagocytic activity have shown significant different (p<0.05) with control at the some times. The treatments of Sin, Pre, Pro and K(-) were at 100% in survival rate (SR), while K(+) was (43.33 ± 11.55)%. The growth rate showed significant different (p<0.05), with the highest value was on Sin treatment (3,37 ± 0.14)%. The FCR of Pro, Pre, and Sin were 1,414±0,13; 1,431±0,08 and 1,305±0,08. This fact suggested that Sin was better than the other treatments in immune respon at total erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, and total leucocyte.

Keywords: probiotic, prebiotic, synbiotic, Lactobacillus brevis, Aeromonas hydrophila, Pangasionodon hypophthalmus

© HAK CIPTA MILIK IPB, TAHUN 2013

HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penyusunan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

Pengaruh Pemberian Probiotik Lactobacillus brevis dan Prebiotik Oligosakarida terhadap Respon Imun dan Resistensi Benih Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus) yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila

YUKE ELIYANI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Judul Tesis : Pengaruh Pemberian Probiotik Lactobacillus brevis dan Prebiotik Oligosakarida terhadap Respon Imun dan Resistensi Benih Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus) Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila

Nama : Yuke Eliyani NRP : C151110081

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Dr.Ir.Widanarni, M.Si. Dr. Dinamella Wahjuningrum, S.Si M.Si.

Ketua Anggota

Diketahui oleh

Ketua Departemen Dekan Sekolah Pascasarjana Budidaya Perairan

Dr.Ir. Sukenda, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober sampai dengan Desember 2012 ini ialah kesehatan ikan, dengan judul Pengaruh Pemberian Probiotik Lactobacillus brevis dan Prebiotik Oligasakarida terhadap Respon Imun dan Resistensi Benih Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus) yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr.Ir. Widanarni, M.Si dan Ibu Dr. Dinamella Wahjuningrum, S.Si M.Si, selaku pembimbing, Bapak Dr.Ir. Tatag Budiardi, M.Si sebagai dosen penguji serta Bapak Dr.Ir. Kukuh Nirmala, M.Sc sebagai wakil dari program studi. Disamping itu, penulis menyampaikan terima kasih kepada Ketua Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor beserta staf; Bapak Ranta dari Laboratorium Kesehatan Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor; Bapak Ayi, Ibu Zaki, Bapak Alen, Ibu Deri dan staf Laboraturium Kesehatan Ikan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar Sukabumi, dan rekan-rekan Akuakultur 2011 yang telah membantu selama penelitian. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada suami, anak-anak serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2013

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ... xiii

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

1. PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 2

Manfaat Penelitian ... 3

Hipotesis ... 3

2. TINJAUAN PUSTAKA... 3

Probiotik Lactobacillus sp. ... 3

Prebiotik ... 4

Oligosakarida ... 4

Sinbiotik ... 5

Bakteri Aeromonas hydrophila ... 5

Ikan Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus) ... 6

Sumber. SNI 01-6483.5-2002 ... 7

Respon Imun ... 7

3. METODE PENELITIAN ... 9

Waktu dan Tempat Penelitian ... 9

Metode Penelitian ... 9

Karakterisasi bakteri ... 9

Analisis Prebiotik ... 9

Uji in vitro ... 10

Penentuan LD50 bakteri A.hydrophila ... 10

Aktivitas antagonistik ... 10

Uji in vivo ... 11

Penyiapan pakan ... 11

Kondisi ikan uji ... 11

Perlakuan probiotik, prebiotik, sinbiotik serta uji tantang ... 11

Parameter uji ... 12

Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus ... 12

Parameter darah ... 12

Kelangsungan hidup (SR) ... 13

Laju pertumbuhan bobot harian ... 14

FCR ... 14

Kualitas air ... 14

Analisis data ... 15

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 15

Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus ... 15

Total Eritrosit ... 17

Hemoglobin ... 19

Hematokrit ... 20

Total leukosit ... 21

Monosit ... 22

Limfosit ... 23

Neutrofil ... 25

Aktivitas fagositik ... 26

Tingkat Kelangsungan hidup ... 28

Laju pertumbuhan harian ... 29

Feed Conversion Ratio (FCR) ... 31

Kualitas air ... 32

5. SIMPULAN DAN SARAN ... 33

Simpulan ... 33

Saran ... 33

DAFTAR PUSTAKA ... 33

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Kualitas air optimum ikan patin siam (Pangasionodon hypophthalmus)... ... 7

Tabel 2. Kisaran parameter kualitas air selama pelaksanaan penelitian. ... 32

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Proses inflamasi (Lv-yun et al., 2013)...8

Gambar 2. Bagan alur kegiatan penelitian ... 9

Gambar 3. Skema pelaksanaan dan waktu penelitian ... 11

Gambar 4. Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus ... 15

Gambar 5. Mekanisme kerja sinbiotik (Delgado et al, 2011) ... 17

Gambar 6. Total eritrosit darah ikan uji pada berbagai perlakuan ... 18

Gambar 7. Nilai Hemoglobin ikan uji pada berbagai perlakuan. ... 19

Gambar 8. Nilai Hematokrit ikan uji pada berbagai perlakuan ... 20

Gambar 9. Total leukosit darah ikan uji pada berbagai perlakuan ... 21

Gambar 10. Konsep immunomodulatory dengan homeostatis (Viswanath, 2012) ... 22

Gambar 11. Nilai Monosit darah ikan uji pada berbagai perlakuan ... 23

Gambar 12. Nilai Limfosit ikan uji pada berbagai perlakuan ... 24

Gambar 13. Nilai Neutrofil ikan uji pada berbagai perlakuan ... 25

Gambar 14. Nilai Aktivitas fagositik darah ikan uji pada berbagai perlakuan ... 27

Gambar 15. Proses pembentukan NADH oleh L.brevis (Findrik et al., 2008) ... 28

Gambar 16. Nilai tingkat kelangsungan hidup ikan uji pada berbagai perlakuan ... 28

Gambar 17. Hemoragic pada ikan uji (ditandai lingkaran) ... 29

Gambar 19. Nilai laju pertumbuhan harian ikan uji berdasarkan panjang ... 31 Gambar 20. Nilai FCR ikan uji pada berbagai perlakuan ... 31

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Uji karakteristik L. brevis dengan metode API 50 CH ... 41 Lampiran 2. Uji karakteristik A. hydrophila dengan API 20 E ... 41 Lampiran 3. Hasil pengukuran FOS dan GOS dari prebiotik yang digunakan

dalam penelitian... 42 Lampiran 7. Total bakteri dalam usus (log CFU/gram) ... 43 Lampiran 8. Total Lactobacillus sp dalam usus (log CFU/gram) ... 44 Lampiran 9. Hasil uji Duncan terhadap total eritrosit ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 44 Lampiran 10. Hasil uji Duncan terhadap nilai hemoglobin ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 44 Lampiran 11. Hasil uji Duncan terhadap nilai hematokrit ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 44 Lampiran 12. Hasil uji Duncan terhadap total leukosit ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 45 Lampiran 13. Hasil uji Duncan terhadap nilai monosit ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 45 Lampiran 14. Hasil uji Duncan terhadap nilai limfosit ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 45 Lampiran 15. Hasil uji Duncan terhadap nilai neutrofil ikan uji pada berbagai

perlakuan ... 45 Lampiran 16. Hasil uji Duncan terhadap nilai aktivitas fagositik ikan uji pada

berbagai perlakuan... 46 Lampiran 17. Hasil uji Duncan terhadap nilai Kelangsungan hidup ikan uji pada

berbagai perlakuan... 46 Lampiran 18. Hasil uji Duncan terhadap nilai laju pertumbuhan harian ikan uji

berdasarkan bobot pada berbagai perlakuan... 46 Lampiran 19. Hasil uji Duncan terhadap pertumbuhan ikan uji berdasarkan

panjang pada berbagai perlakuan ... 46 Lampiran 20. Hasil uji Duncan terhadap nilai Nilai FCR ikan uji pada berbagai

1. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) merupakan salah satu jenis patin yang banyak dibudidayakan di Indonesia, serta menjadi salah satu komoditas unggulan sektor perikanan. Kementerian Kelautan dan Perikanan (KKP) terus memacu peningkatan produksi patin, dimana target produksi nasional pada tahun 2012 sebesar 651 ribu ton akan ditingkatkan menjadi 1107 ribu ton pada tahun 2013 (Dirjen Budidaya, 2013). Berbagai langkah terus dilakukan mulai dari perbaikan sarana dan prasarana, penyediaan induk serta benih berkualitas, serta pengelolaan komponen–komponen budidaya dalam setiap tahapan kegiatan.

Keberhasilan setiap tahapan kegiatan budidaya patin dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain manajemen kesehatan ikan seperti tindak pencegahan dan penanggulangan penyakit. Salah satu penyakit pada budidaya patin adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila dan dikenal dengan motil aeromonad septicaemia (MAS). Wartono et al., (2010) menyatakan bahwa tingkat kematian benih patin akibat MAS dapat mencapai 40-80%. Bakteri A.hydrophila memproduksi faktor–faktor virulensi berupa eksotoksin yang penting dalam patogenitas, salah satunya adalah enzim proteolitik yang dapat merusak dinding intestin inang hingga terjadi oedema. Gejala serangan bakteri ini adalah penimbunan cairan dalam rongga perut (abdominal dropsy), luka pada kulit dan otot (Rey et al., 2009).

Berbagai langkah pencegahan dan penanggulangan telah dilakukan untuk mengatasi penyakit ini, salah satunya adalah penggunaan antibiotika. Namun demikian pada pelaksanaan ditingkat pembudidaya, seringkali ditemukan kasus penggunaan dosis dan waktu pemakaian antibiotika tersebut yang tidak tepat. Apabila hal ini terjadi dalam jangka waktu lama akan menimbulkan pengaruh negatif bagi ikan yang dibudidayakan berupa timbulnya resistensi patogen (Angka, 2004). Berkenaan dengan hal tersebut, maka dicari berbagai langkah alternatif, diantaranya adalah pemanfaatan probiotik dan prebiotik.

Probiotik merupakan mikroorganisma hidup, yang mempunyai pengaruh menguntungkan pada kesehatan inang dengan memperbaiki keseimbangan mikrobiota intestinal. Efektivitas probiotik ditentukan oleh kemampuannya dalam memberikan efek menguntungkan bagi inang karena sifatnya yang tidak patogenik, tidak toksik serta juga kemampuannya bertahan dan melakukan kegiatan metabolisma dalam usus (Douglas dan Sanders, 2008). Penggunaan probiotik dalam lingkup akuakultur dapat diaplikasikan dengan mencampurkannya dalam pakan, dengan harapan dapat menyeimbangkan kondisi mikrobiota dalam saluran pencernaan sehingga diharapkan dapat menurunkan pengaruh serangan patogen (Verschuere et al., 2000). Oleh karena itu bakteri probiotik harus dapat mengatasi berbagai hambatan fisiologis seperti asam lambung sehingga dapat mencapai dan bertahan hidup dalam usus. Bakteri ini dari dalam usus membantu meningkatkan kesehatan inang dengan cara mengaktifkan sel-sel kekebalan, dan mengurangi jumlah bakteri yang merugikan.

Bakteri yang dapat digunakan sebagai probiotik diantaranya adalah dari golongan Lactobacillus. Park et al., (2008) dan Reid (2008) menyatakan bahwa

terdapat paling tidak beberapa jenis bakteri dari golongan Lactobacillus yang termasuk agen probiotik yaitu L. bulgaricus, L. casei, L. delbrueckii subsp. lactis, L. plantarum, dan L. sakei. Bucio et al., (2004) menyatakan bahwa L. brevis memiliki kemampuan untuk membentuk zona bening dalam melakukan penghambatan bakteri A.hydrophila. Daya hambat ini terjadi karena L. brevis dapat memproduksi H2O2 yang mampu menghambat aktivitas beberapa bakteri,

baik dari gram positif maupun negatif. Adapun kerusakan yang ditimbulkan adalah denaturasi enzim serta gangguan permeabilitas sel. Vendrell et al., (2008) menyatakan bahwa penambahan probiotik L.plantarum CLFP238 dan Leuconostoc mesenteroides CLFP 196 ke dalam pakan, dapat menghambat serangan penyakit Lactococcosis pada ikan rainbouw trout.

Prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dicerna oleh inang, dapat difermentasi oleh mikrobiota saluran pencernaan, mampu secara selektif menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan (Merrifield et al., 2010). Ada beberapa jenis prebiotik antara lain fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS) serta inulin (Patel dan Goyal, 2012). Prebiotik juga secara tidak langsung dapat memberikan efek imunologi. Probiotik dapat menggunakan prebiotik dalam menstimulasi sejumlah sel yang terlibat dalam respon imun spesifik (Gibson dan Roberfroid, 1995). Zhou et al., (2010) menyatakan bahwa penambahan prebiotik fructooligosaccharides, galactooligosaccharides, mannanoligosaccharides, galacto-gluco-mannans pada

pakan, dapat meningkatkan respon imun pada juvenil red drum.

Patterson dan Burkholder (2003) serta Rastall (2010) menyatakan bahwa prebiotik umumnya berasal dari golongan oligosakarida. Beberapa jenis oligosakarida yang memiliki potensi sebagai prebiotik antara lain adalah fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS), transgalacto– oligosaccharides (TOS), lactulose, serta inulin. Buentello et al., (2010) menyatakan bahwa penggunaan FOS dalam pakan juvenil red drum (Sciaenops ocellatus) menstimulasi respon imun non-spesifik seperti aktivitas lisozym serta produksi superoksid anion dari makrofag ginjal. Davis et al., (2010) mengemukakan bahwa penggunaan GOS dapat menstimulasi perbanyakan bakteri Lactobacillus sp. pada inangnya .

Gabungan dari probiotik dan prebiotik dikenal dengan sebutan sinbiotik seperti halnya bakteri Lactobacillus sp. dengan oligosakarida (FOS). Keuntungan dari pencampuran kedua bahan ini adalah adanya peningkatan daya tahan hidup bakteri probiotik karena telah tersedianya nutrisi yang spesifik untuk kebutuhannya. Hasil penelitian Merrifield et al., (2010), menunjukkan bahwa suplemen sinbiotik (kombinasi probiotik dari golongan bakteri asam laktat dan prebiotik oligosakarida), berpengaruh positif pada pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan ikan salmon

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh pemberian probiotik L.brevis, prebiotik oligosakarida dan kombinasinya terhadap populasi bakteri pada usus, respon imun, kelangsungan hidup dan pertumbuhan benih ikan patin siam yang diinfeksi A.hydrophila.

Manfaat Penelitian

Pemberian probiotik L.brevis dan prebiotik oligosakarida diharapkan dapat digunakan sebagai alternatif pencegahan infeksi A.hydrophila pada budidaya ikan patin siam. Selain hal tersebut, diharapkan juga dapat diperoleh informasi metoda pengaplikasiannya di lapangan.

Hipotesis

Pemberian probiotik L.brevis dan prebiotik oligosakarida pada pakan dapat mencegah infeksi A. hydrophila pada ikan patin siam.

2. TINJAUAN PUSTAKA

Probiotik Lactobacillus sp.

Bakteri probiotik merupakan mikroorganisme non-patogen, mampu mentoleransi garam empedu serta nilai pH rendah, dapat hidup dan berkembang biak pada sistem pencernaan, membentuk koloni di permukaan epitel usus, serta dapat menghasilkan enzim pencernaan secara ekstraseluler. Selain itu probiotik mampu menjaga keseimbangan mikroba dalam usus, mengeliminasi mikrooganisme yang merugikan, dapat diproduksi secara masal, serta dapat berada dalam kondisi stabil selama masa penyimpanan (Merrifield et al., 2010).

Lebih lanjut Hernandez et al., (2012) menyatakan bahwa salah satu jenis bakteri probiotik adalah golongan Lactobacillus yang memiliki kemampuan untuk hidup dan berkembang biak dalam sistem pencernaan (toleran terhadap enzim amilase, nilai pH rendah, serta bertahan terhadap sekresi garam empedu). Lactobacillus merupakan bakteri gram positif berbentuk batang, memiliki karakter tergantung spesies seperti obligat/fakultatif dan homo/heterofermentatif. Lactobacillus merupakan kelompok bakteri heterogenus yang terdiri dari 135 spesies dan 27 subspesies (Bernardeau et al., 2008).

Lactobacillus spp. merupakan bakteri probiotik yang telah menjadi konsumsi umum manusia (Vincenti, 2010). Lactobacillus berperan sebagai imunomodulator. Imunomodulator bisa diartikan sebagai agen yang mampu memodifikasi atau mempengaruhi fungsi sistem imunitas tubuh. Peran imunomodulator sendiri ada dua, yakni sebagai imunosupressan atau penekan sistem imun yang berlebihan dan sebagai imunostimulan, yakni menguatkan sistem daya tahan tubuh (Touraki, 2012).

Rammelsberg dan Radler (1990) menyatakan bahwa L.brevis B37 memiliki kemampuan menghasilkan bakteriosin dengan nama brevicin 37. Bakteriosin merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri, sehingga mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain terutama yang memiliki kekerabatan erat secara filogenik.

L. paracasei memiliki tingkat penghambatan bakteri Aeromonas paling tinggi diantara bakteri probiotik dari genus lain (Sica et al., 2012). Saat ini telah diperoleh 202 strain bakteri asam laktat yang diisolasi dari saluran pencernaan udang-udang liar dewasa yang telah diseleksi terhadap kemampuan antibakterinya melawan Vibrio harveyi. Ternyata spesies yang paling tinggi kemampuan antibakterinya terhadap Vibrio harveyi adalah L. plantarum (Kongnum dan

Hongpattarakere, 2012), yang juga memiliki kemampuan memproteksi ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) yang diinfeksi Lactococcus garvieae terutama di saluran pencernaan ikan tersebut (Sánchezet al., 2011).

Probiotik Pediococcus acidilactici dan L.casei sudah diberikan melalui pakan dengan kepadatan 106 – 107 CFU gram-1 pada larva kakap (Lamari et al., 2012). Penelitian terakhir menunjukkan bahwa L. plantarum, L.acidophilus, dan Saccharomyces cerevisiae yang ditambahkan ke dalam pakan dan bertindak sebagai imunostimulan mampu meningkatkan pertumbuhan, efisiensi pakan, biokimia darah, kelangsungan hidup dan respon imun non-specifik dari olive flounder yang diinfeksi Uronema marinum (Harikrishnan et al., 2011). Penggunaan probiotik melalui Artemia (Mahdhi et al., 2012) dan melalui mikroenkapsulasi menggunakan alginate, polisakarida dan protein (Cook et al., 2012) telah diujikan dengan hasil yang positif.

Prebiotik

Prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dicerna oleh inang, dapat difermentasi oleh mikrobiota saluran pencernaan serta mampu secara selektif menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan. Menurut Gropper et al., (2009), prebiotik berperan sebagai substrat untuk meningkatkan pertumbuhan bakteri menguntungkan atau yang bermanfaat bagi kesehatan inang sehingga menghambat perkembangan bakteri patogen.

Prebiotik umumnya merupakan golongan polisakarida dan oligosakarida. Bahan ini dapat mendorong pertumbuhan bakteri asam laktat dalam usus. Inulin, fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), lactulosa dan polydextosa adalah bahan-bahan prebiotik (Patel dan Goyal, 2012).

Mekanisme penghambatan patogen oleh prebiotik terbagi menjadi dua, yaitu secara langsung dan tidak langsung (Rastall, 2005). Penghambatan patogen secara langsung adalah karena prebiotik dapat memblok sisi reseptor pelekatan patogen pada mukosa usus, sehingga patogen tidak dapat melekat pada mukosa usus. Penghambatan secara tidak langsung adalah karena prebiotik dapat meningkatkan pertumbuhan probiotik seperti Lactobacillus. Asam laktat dan asam organik lain yang diproduksi oleh bakteri tersebut diketahui memiliki sifat penghambatan terhadap bakteri patogen

Analisis secara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa prebiotik tidak dicerna oleh enzim pencernaan, tetapi difermentasi oleh bakteri anaerob dalam usus besar. Prebiotik yang telah difermentasi dalam usus besar menghasilkan asam lemak rantai pendek (SCFA), menstimulasi pertumbuhan berbagai bakteri termasuk Lactobacillus dan dapat menghasilkan gas. Fortifikasi menggunakan Lactobacillus (probiotik) dan prebiotik dapat memperbaiki efek perlindungan usus besar terhadap berbagai mikroorganisme patogen dalam usus (Wang, 2009).

Oligosakarida

Oligosakarida merupakan gula dengan 3 hingga 20 unit sakarida. Oligosakarida merupakan rantai pendek polisakarida. Karakteristik senyawa oligosakarida adalah : a) terdiri dari susunan monosakarida antara lain glukosa, xylose dan fruktosa, b) memiliki ikatan glikosida, c) memiliki berat molekul yang rendah dibawah polisakarida, dan d) tidak dapat dihidrolisa dan diserap usus halus (Cobas et al., 2011).

FOS secara kimiawi adalah senyawa β-D-fruktans rantai pendek atau sedang, terikat dengan ikatan β-2-1 glikosidik, tidak dapat diuraikan oleh enzim pencernaan mamalia. Salah satu biota yang dapat mencerna FOS adalah Lactobacillus karena memiliki α–galaktosidase sehingga mampu memutus ikatan α –galaktosa. FOS diketahui dapat meningkatkan pertumbuhan probiotik Enterococcus faecium, L. plantarum, dan L. casei strain shirota. FOS memiliki nilai DP (derajat polimerisasi) lebih rendah daripada inulin, yaitu berkisar antara 2-8 (Franck dan De Leenher, 2005).

GOS diproduksi dengan memperpanjang rantai dimer laktosa menggunakan enzym β-galactosidase. Molekul GOS merupakan hasil sintesis yang memanfaatkan aktivitas enzim β-galaktosidase dari laktosa (reaksi transgalaktosilasi). β–galaktosidase adalah kelompok enzim hidrolitik dan telah banyak digunakan oleh berbagai industri produk olahan untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa (Delgado et al., 2011). Bahan ini mampu mempengaruhi pola pertumbuhan probiotik Lactobacillus, Streptococcus dan Bifidobacterium (Cobas et al., 2011), serta merupakan prebiotik alternatif yang sangat baik bagi pertumbuhan strain Lactobacillus di usus (Hernandez et al., 2012) .

Sinbiotik

Sinbiotik merupakan penggabungan antara prebiotik dan probiotik. Keuntungan dari sinbiotik ini adalah pertumbuhan dari probiotik menjadi lebih baik karena terlebih dahulu telah mendapat pakan dari prebiotik. Hasil penelitian Merrifield et al., (2010) menunjukkan bahwa suplemen sinbiotik (kombinasi probiotik dari golongan bakteri asam laktat dan prebiotik oligosakarida), berpengaruh positif pada pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan ikan salmon

Penggunaan FOS (0,25% dan 0,5%) serta Bacillus subtilis (1,82x107 CFU/ml) pada ikan sea cucumber (Apostichopus japonicus) yang diinfeksi oleh bakteri Vibrio splendidus, menunjukkan adanya peningkatan pertumbuhan harian, total coelomocytes counts (TCC), phagocytosis, serta resistensi terhadap Vibrio splendidus (Qin et al., 2010). Gabungan antara Bacillus subtilis (kepadatan 107sel/gram) dan inulin (1%) pada ikan gilthead sea bream (Sparus aurata L) memberikan tingkat oedema serta inflamasi usus yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol, sehingga proses kearah homeostatis akan lebih cepat (Rebeca et al., 2013).

Proses pencampuran sinbiotik kedalam pakan memerlukan kondisi stabil terutama suhu dan pH (Charalampopoulos dan Rastall, 2012). Salah satu yang dilakukan dalam pencampuran ini adalah dengan enkapsulasi probiotik dengan kombinasi prebiotik–calcium-alginate melalui freeze-drying (Shamekhi et al., 2012). Proses mikroenkapsulasi bakteri probiotik menggunakan matriks polimer, akan meningkatkan kemampuan bertahan probiotik tersebut terhadap reaksi-reaksi dalam saluran gastrointestinal, sehingga kemungkinan probiotik mencapai usus dalam kondisi hidup akan lebih tinggi (Michael et al., 2012).

Bakteri Aeromonas hydrophila

Bakteri dinyatakan sebagai A.hydrophila apabila memenuhi kriteria sebagai berikut: test pewarnaan gram menunjukkan hasil reaksi gram negatif,

bentuk batang pendek, uji motilitas menunjukkan reaksi motil, uji oksidasi menunjukkan reaksi positif oksidatif, uji oksidatif fermentatif hasilnya positif 0/F dan pada uji RS hasilnya positif (SNI 7303:2009 ). Rey et al., (2009) menyatakan bahwa hasil uji karakteristik biokimia bakteri A. hydrophila adalah : oxidase (+), catalase (+), urea (–), citrate (–), diffusable pigment (–), motility (+), ornithine decarboxylase (–), fermentasi mannitol (+), hidrolisis esculin (+) dan produksi gas dari glukosa (+).

Angka (2004) menyatakan bahwa A.hydrophila menghasilkan eksotoksin dan endotoksin yang berbeda untuk setiap galurnya. Endotoksin dari bakteri ini dapat menyebabkan hemoragic, fever serta kematian. Serangan bakteri ini menimbulkan terjadinya peningkatan frekuensi pernafasan, kehilangan keseimbangan dan pendarahan di bagian abdominal. Beberapa gejala dari serangan A.hydrophila berupa ulcera, exophthalmia, serta abdominal distension

(Gopalakannan dan Arul, 2006 ).

Martha et al., (2011) menyatakan bahwa A.hydrophila merupakan bakteri penyebab penyakit motile aeromonad septicaemia (MAS) pada ikan gilthead seabream (Sparus aurata). Penyuntikan ikan ini dengan menggunakan bakteri A.hydrophila dengan kepadatan 107 sel/ml dan 108 sel/ml menimbulkan penurunan aktivitas imun selular yang terdiri dari phagocytosis, respiratory burst activity and peroxidase leucocyte content. Beberapa gen dari organ ginjal, hati, usus, yang terdiri dari gen TLR, NCCRP-1, HEP, TCR, IgM, MHC-IIα, IL-1β, C3, CSF-1R, juga mengalami perubahan akibat infeksi A,hydrophila.

Chao et al., (2013) menyatakan bahwa lendir berfungsi sebagai pertahanan tubuh paling awal terhadap serangan bakteri. Penyuntikan dengan menggunakan

bakteri A.hydrophila pada ikan blue catfish (ictalurus punctatus) menyebabkan

bereaksinya 1155 jenis gen yang terdapat pada lendir. Hasil pemeriksaan menunjukkan, bahwa gen-gen tersebut berkaitan dengan berbagai sistem tubuh ikan uji seperti regulasi, respon terhadap anioksidan, apoptosis, serta mekanisma imun.

Ikan Patin Siam (Pangasionodon hypophthalmus)

Ikan patin siam atau Pangasius hypophthalmus merupakan sinonim dari Pangasionodon hypophthalmus (SNI 7551:2009) memiliki sistematika sebagai berikut:

Filum : Chordata Kelas : Pisces Ordo : Ostariophysi Subordo : Siluroidea Famili : Pangasidae Genus : Pangasionodon

Spesies : Pangasionodon hypophthalmus.

Ikan patin siam memiliki kelebihan dibanding ikan lain, yakni pertumbuhan cepat, bersifat omnivora dan memerlukan tepung ikan serta minyak ikan dalam jumlah sedikit dalam pakannya (Little et al., 2012). Kelebihan lain ikan ini adalah walaupun sudah lebih dari 20 generasi dari domestikasi pertamanya ternyata secara genetik antara ikan yang dibudidaya dengan yang

masih asli di alam tidak berbeda (Na-Nakorn dan Moeikum, 2009) sehingga pertumbuhan dari ikan ini tetap stabil dari waktu ke waktu.

Ikan patin siam merupakan ikan yang telah memasyarakat. Beberapa kriteria Standar Nasional Indonesia (SNI) untuk ikan ini diantaranya untuk kriteria pakan memiliki kandungan protein minimal 25%, tidak mengandung antibiotika dan bahan lain yang berbahaya. Adapun kriteria kualitas air untuk ikan patin siam, tercantum dalam Tabel 1.

Tabel 1 Kualitas air optimum ikan patin siam (Pangasius hypophthalmus)

Parameter Satuan Kisaran Optimum

Suhu o_{C 25 – 30}

pH 6,5 – 8,5

Oksigen terlarut mg/l > 4

Ammoniak (NH3) mg/l < 0,01

Kecerahan Cm 25 _– 80

Sumber. SNI 01-6483.5-2002

Respon Imun

Tort dan Mackenzie (2003) menyatakan bahwa sistem imun terbagi menjadi dua, yaitu spesifik dan spesifik. Mekanisme sistem imun non-spesifik merupakan mekanisme awal dari sistem imun, tidak dibutuhkan adanya paparan patogen sebelumnya, serta mampu memberikan respon secara cepat. Bergljót (2006) menyatakan bahwa imun non spesifik terdiri dari mekanisma fisik yaitu lendir dan sisik, humoral serta selular. Komponen-komponen humoral diantaranya adalah bahan penghambat pertumbuhan patogen, berbagai enzim penghancur dinding sel, komplemen, opsonin, lektin, dan sitokin. Iwama (1996) menyatakan bahwa sistem imun spesifik terdiri dari humoral seperti sel B yang berhubungan dengan pembentukan antibodi, serta mekanisme selular yang diantaranya adalah sel T (T helper, T cytotoksik).

Kollner et al., (2001) menyatakan bahwa sistem imun pada ikan dibentuk oleh jaringan limfoid, dimana jaringan ini menyatu dengan mieloid sehingga disebut jaringan limfomieloid. Organ–organ limfomieloid terdiri dari ginjal depan, thymus serta limpa. Ginjal depan berfungsi sebagai organ endokrin yang mengatur keseimbangan dan juga merupakan organ utama untuk interaksi hormon-hormon; untuk sistem imun berperan dalam produksi kelompok sel darah putih atau leukosit. Leukosit terdiri dari granulosit (neutrofil, eosinofil, basofil) dan agranulosit (limfosit, monosit, trombosit). Monosit dan neutrofil berfungsi sebagai bagian dari aktivitas fagositik, yaitu berperan sebagai makrofag, sedangkan limfosit lebih berperan ke arah pembentukan antibodi (Iwama, 1996). Hasil penelitian Yuexin et al., (2013) menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai aktivitas fagositik pada juvenil sea cucumber (Apostichopus japonicas)

dengan perlakuan penambahan yeast Hanseniaspora opuntiae C21, dan diuji

tantang dengan menggunakan Vibrio splendidus.

Holen et al., (2011) menyatakan bahwa leukosit yang diisolasi dari ginjal bagian depan ikan atlantik salmon (Salmo salar) yang diberi pakan dengan

sumber lemak berbeda, menunjukkan adanya perubahan pada nilai IL-1β,

TNF-α, serta Cox2 . Lv-yun et al., (2013) menyatakan bahwa IL-1β dan TNF-α turut

berperan dalam mekanisma inflamasi.

Organ limfomieloid lainnya adalah thymus yang berfungsi antara lain membentuk limfosit T, CD4+, sel T, serta CD8+. Selain itu thymus mengkoordinir tanggapan ketahanan dan penting untuk menahan bakteri intraseluler. CD8+ dapat membunuh sel terinfeksi virus dan pada saat bergabung dengan sel B akan mempertahankan kemampuannya dalam menghasilkan antibodi (Kollner et al., 2001). Hasil penelitian Hideaki et al., (2011) menunjukkan bahwa CD4+ dan CD8+ pada ikan ginbuna crucian carp (Carassius auratus langsdorfii) hanya ditemukan di bagian organ thymus.

Limpa merupakan organ limfomieloid selain ginjal dan thymus. Organ ini

berperan dalam pembentukan eritrosit serta mampu menangkap berbagai material antigen (Kollner et al., 2001). Hasil penelitian Antenor et al., (2012) menunjukkan bahwa eritrosit memiliki korelasi positif dengan hemoglobin serta hematokrit pada ikan fat snook (Centropomus parallelus). Iwama (1996) menyatakan bahwa suplai sel darah yang diantaranya adalah eritrosit akan meningkat ke lokasi tempat terjadi mekanisma inflamasi. Lv-yun et al., (2013) menyatakan hal yang sama, bahwa sel-sel darah akan bergerak cepat ke arah lokasi tempat terjadinya inflamasi (Gambar 1).

.

3. METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Oktober sampai dengan Desember 2012 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Institut Pertanian Bogor; Sekolah Tinggi Perikanan Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor; dan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar Sukabumi.

Metode Penelitian

Kegiatan Penelitian meliputi persiapan bakteri probiotik dan A.hydrophila, analisis prebiotik (oligosakarida), uji in vitro, dan uji in vivo. Alur kegiatan penelitian yang dilaksanakan ditampilkan pada Gambar 2.

Gambar 2. Bagan alur kegiatan penelitian Karakterisasi bakteri

Karakterisasi bakteri Lactobacillus sp. dan A.hydrophila yang dilakukan menggunakan media API 50 CH dan API 20 E yang terdiri dari 49 dan 27 uji biokimia. Hasil uji karakterisasi bakteri menunjukkan spesies bakteri yang digunakan untuk probiotik adalah L.brevis (Lampiran 1) dan untuk uji tantang adalah A.hydrophila (Lampiran 2).

Analisis Prebiotik

Analisis kandungan oligosakarida dalam sampel prebiotik dilakukan dengan Metoda HPLC (AOAC, 1999). Kolom yang digunakan adalah bondclone 10 µm NH2, dengan detektor refractive index berlaju alir 1-1.2 ml/menit. Fase

gerak yang digunakan adalah asetonitril dan air dengan perbandingan asetonitril : air = 80 : 20. Volume sampel yang diinjeksikan adalah 20 µl. Standar gula yang digunakan adalah fruktooligosakarida (FOS),dan galaktooligosakarida (GOS).

Setiap puncak yang terbentuk menunjukkan satu jenis komponen gula. Waktu retensi dari setiap komponen gula dibandingkan dengan waktu retensi dari

standar gula.Waktu retensi yang hampir sama menunjukkan jenis komponen yang diperkirakan sama. Konsentrasi komponen gula dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut:

Keterangan:

CP = Konsentrasi sampel ( % ) Cs = Konsentrasi standar ( % ) Ap = Luas areal sampel As = Luas areal standar Fp = Faktor pengenceran V = volume larutan akhir

Ws = Berat sampel (gram) dalam berat kering

Dari hasil perhitungan diketahui bahwa nilai prebiotik FOS dan GOS yang diperoleh sebesar 3.448 g/100 g dan 1.08 g/100 g (Lampiran 3).

Uji in vitro

Penentuan LD50 bakteri A.hydrophila

Benih ikan patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) dengan panjang rata–rata 9,1±0,19 cm dipelihara dalam dua belas akuarium. Padat tebar ikan adalah 10 ekor per akuarium. Penginfeksian A.hydrophila dilakukan dengan cara disuntik secara intra muskular sebanyak 0,1 ml/ekor ikan, dengan kepadatan bakteri 106, 107, 108 dan 109 CFU/ml. Pengamatan mortalitas ikan uji dilakukan selama tujuh hari. Penghitungan LD50 menggunakan metode Reed dan Muench (1938). Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai LD50 sebesar 107 CFU/ml (Lampiran 4).

Aktivitas antagonistik

Aktivitas antagonistik L. brevis diuji terhadap A.hydrophila dengan metode Bauer-Kirby (1966). Isolat A.hydrophila dan L.brevis diencerkan hingga masing-masing memiliki tingkat kekeruhan sekitar 107CFU/ml. Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. A. hydrophila disebar pada media TSA sebanyak 100 µl. Kertas cakram (Whatman antibiotic asay paper) berdiameter 5 mm diletakkan di bagian permukaan media TSA kemudian ditetesi suspensi L. brevis sebanyak 10 µl dan sebagai kontrol dalam perlakuan ini digunakan larutan fisiologis. Selanjutnya media berinokulan ini diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam. Pengukuran zona bening yang terbentuk dilakukan menggunakan jangka sorong pada 4 posisi diamater lingkaran dari setiap kertas cakram. Hasil yang diperoleh kemudian dirata-ratakan. Aktivitas antagonistik bakteri termasuk dalam kriteria sedang (Bucio et al., 2004) dengan rata-rata diameter zona hambat yang terbentuk sebesar 5.87 ± 0.43 mm (Lampiran 5 dan 6)

Uji in vivo Penyiapan pakan

Pakan yang digunakan dalam penelitian adalah pakan komersil dengan kandungan protein 28%. Bakteri probiotik dengan konsentrasi 107 CFU/ml sebanyak 1% (Putra, 2010), dan prebiotik sebanyak 2% (Mathious et al., 2006) dicampurkan pada pakan, serta menggunakan perekat berupa putih telur sebanyak 2%. Pakan selanjutnya dikering-anginkan selama satu jam untuk mengurangi kelembaban.

Kondisi ikan uji

Ikan uji yang digunakan adalah benih ikan patin siam berukuran panjang rata-rata 9,1±0,19 cm, berasal dari unit hatchery Sekolah Tinggi Perikanan ,Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor. Ikan uji dipelihara dalam akuarium berukuran 90 x 40 x 40 cm3dengan kepadatan 10 ekor per akuarium. Sebelum diberi perlakuan, ikan diadaptasikan terlebih dahulu selama 14 hari.

Perlakuan probiotik, prebiotik, sinbiotik serta uji tantang

Ikan uji diberi pakan secara at satiation dengan frekuensi tiga kali per hari yaitu pada pukul 7.00, 12.00 dan 17.00. Pemberian probiotik, prebiotik, sinbiotik dilakukan 1 kali per hari pada siang hari selama 30 hari pemeliharaan.

Penelitian terdiri dari lima perlakuan dengan masing-masing terdiri dari tiga ulangan sebagai berikut (Gambar 3):

Perlakuan K(-) : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan prebiotik namun tidak diinfeksi A.hydrophila (kontrol -) Perlakuan K(+) : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan

prebiotik serta diinfeksi A.hydrophila (kontrol +)

Perlakuan Pro : Pemberian pakan dengan penambahan probiotik sebesar 1% (Putra, 2010) dan diinfeksi A.hydrophila

Perlakuan Pre : Pemberian pakan dengan penambahan prebiotik sebesar 2% (Mahious et al., 2006) dan diinfeksi A.hydrophila

Perlakuan Sin : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik (probiotik sebesar 1 % dan prebiotik sebesar 2%) dan diinfeksi A.hydrophila

Parameter uji

Parameter uji yang diamati selama penelitian adalah jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri pada usus, total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total leukosit, diferensial leukosit, kelangsungan hidup, pertumbuhan, FCR benih ikan patin siam serta kualitas air.

Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus

Pengukuran jumlah bakteri Lactobacillus sp. dan total bakteri dalam usus ikan uji dilakukan pada hari ke-30, ke-32, serta ke-40. Usus diambil dan dihomogenkan dalam larutan NaCl (0.85%). Selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dengan menggunakan larutan NaCl 0,85%. Perhitungan bakteri menggunakan metoda total plate ( Li et al., 2009) dengan media spesifik Lactobacillus yaitu MRS agar (Man Rogosa Sharpe Agar) serta media untuk total bakteri yaitu TSA (Trypticase soy agar).

Parameter darah

Pengukuran parameter darah dilakukan pada saat awal, hari 30, hari ke-31, hari ke-34, hari ke-36, dan hari ke-38. Adapun parameter darah yang diamati adalah sebagai berikut:

Total eritrosit (Blaxhall dan Daisley, 1973 )

Darah dihisap dengan pipet pengukur sel darah merah yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 1 setelah itu ditambahkan larutan Hayem’s sampai skala 101. Pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan membentuk angka delapan selama 3–5 menit sehingga darah tercampur dengan merata. Selanjutnya dua tetes pertama dari larutan darah dalam pipet dibuang kemudian larutan darah yang ada (tersisa) dalam pipet diteteskan pada haemocytometer tipe Neubauer untuk selanjutnya ditutup dengan gelas penutup. Penghitungan jumlah sel darah merah dilakukan menggunakan mikroskop binokuler dengan pembesaran 400x. Jumlah eritrosit dihitung menurut persamaan berikut:

Hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake, 1977)

Darah dihisap dengan pipet sahli sampai mencapai 20 mm3 atau 0.2 ml lalu ujung pipet dibersihkan dengan tissue. Darah dalam pipet dipindahkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10 (merah), kemudian diaduk dan dibiarkan selama 3 sampai 5 menit. Selanjutnya akuades ditambahkan sampai warna darah dan HCl dalam tabung seperti warna larutan standar yang ada pada Hb–meter. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat permukaan cairan dan dicocokan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala jalur gr % (kuning) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah.

Hematokrit (Anderson dan Siwicki, 1993)

Salah satu ujung tabung mikrohematokrit dicelupkan ke dalam tabung yang berisi darah sehingga darah merambat secara kapiler. Ketika rambatan mencapai ¾ bagian tabung maka ujung tabung ditutup dengan cara menancapkan

ujung tabung ke dalam crytoceal kira–kira sedalam 1 mm. Tabung hematokrit tersebut selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit, lalu dilakukan pengukuran panjang bagian darah yang mengendap (a) dan panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung (b). Adapun kadar hematokrit dihitung dengan persamaan berikut:

Total leukosit (Blaxhall dan Daisley, 1973)

Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk berwana putih sampai skala 0.5. Selanjutnya ditambahkan larutan Turk’s sampai skala 11 kemudian pipet diayunkan membentuk angka 8 selama 3–5 menit sehingga darah tercampur secara merata. Dua tetes pertama larutan darah dibuang dari dalam pipet, kemudian darah yang masih ada dalam pipet diteteskan ke dalam haemocytometer dan selanjutnya ditutup dengan gelas penutup. Penghitungan sel leukosit dilakukan dengan menggunakan mikrokop pada pembesaran 400x. Jumlah leukosit dihitung dengan persamaan berikut:

Diferensial leukosit (Blaxhall dan Daisley, 1973)

Darah diteteskan pada gelas objek bagian kanan atas, selanjutnya gelas objek yang lain diletakkan diatas tetesan darah sampai membentuk sudut sekitar 30o kemudian ditarik sampai darah menyebar sepanjang tepi gelas objek pertama. Ulasan dikering-udarakan kemudian direndam dalam larutan Giemsa (1:20) selama 15-20 menit. Hasil perendaman selanjutnya dibilas dengan akuades, ditutup dengan gelas penutup dan diamati menggunakan mikroskop. Penghitungan dilakukan terhadap jenis-jenis leukosit dan dihitung persentasenya.

Aktivitas fagositik (Anderson dan Siwicki, 1993)

Darah sebanyak 50µ dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, ditambahkan 50µ suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam PBS (107). Campuran tersebut dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Selanjutnya dari campuran tersebut diambil sebanyak 5 µl untuk dibuat preparat ulas. Preparat ini difiksasi dengan methanol selama 5 menit lalu dikeringkan, kemudian direndam dalam larutan Giemsa selama 15 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop. Aktivitas fagositik didasarkan pada persentase dari 100 sel fagosit yang menunjukkan aktifitas fagositik.

Kelangsungan hidup (SR)

Penghitungan kelangsungan hidup ikan uji dilakukan pada akhir pemberian pakan perlakuan (hari ke-30), serta pada akhir uji tantang (hari ke-40). Perhitungan ini dilakukan dengan menggunakan rumus berdasarkan Effendie (1979).

Keterangan :

SR = Derajat kelangsungan hidup (%)

Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan (ekor) No = Jumlah ikan pada awal pemeliharaan (ekor)

Laju pertumbuhan bobot harian

Sampling pertumbuhan ikan uji dilakukan setiap dua minggu. Perhitungan pertumbuhan harian dilakukan menggunakan rumus berdasarkan Huismann (1987).

Keterangan :

α = laju pertumbuhan bobot harian (%) Wt = bobot rata – rata akhir ( gr/ekor ) Wo = bobot rata – rata awal ( gr/ekor ) T = waktu (hari)

Pertumbuhan panjang

Sampling pertumbuhan ikan uji dilakukan setiap dua minggu. Perhitungan pertumbuhan panjang dilakukan menggunakan rumus berdasarkan Effendie (1979): P = Lt – Lo

Keterangan:

P = pertumbuhan panjang (cm)

Lt = panjang rata-rata ikan di akhir pemeliharaan (cm) Lo = panjang rata-rata ikan di awal pemeliharaan (cm)

FCR

Pengukuran FCR dilakukan setelah selesai pemberian pakan perlakuan pada hari ke-30. Perhitungan yang digunakan berdasarkan NRC (1993). FCR = ΣF/(∆B+BD) ; BD=0

Keterangan :

ΣF = jumlah pakan (gram)

∆B = Perubahan biomassa ikan (gram) BD = biomassa ikan mati (gram)

Kualitas air

Pengukuran kualitas air dilakukan sebanyak tiga kali yaitu pada awal pemeliharaan (hari 0), setelah perlakuan probiotik, prebiotik, sinbiotik (hari ke-30) dan setelah uji tantang (hari ke-40). Parameter yang diamati terdiri dari kandungan oksigen terlarut (DO), suhu, NH3, serta pH.

Analisis data

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor. Data dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan 95%. Apabila terdapat perbedaan maka analisis data dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program Xl-stat.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus

Hasil perhitungan jumlah Lactobacillus sp. serta total bakteri di usus ditampilkan pada Gambar 4 dan Lampiran 8. Populasi Lactobacillus sp. muncul pada perlakuan probiotik dan sinbiotik, dan diduga dari jenis L.brevis, karena kedua perlakuan ini diberikan asupan L. brevis. Sedangkan pada perlakuan lainnya diduga jumlah Lactobacillus sp. kurang dari dari 102 (CFU/gram) yang merupakan batas pengamatan pada penelitian ini. Bucio et al., (2004) menyatakan bahwa L.brevis strain 18 f ditemukan pada usus bagian atas.

Total bakteri diperoleh dengan jumlah yang hampir sama di semua perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa walaupun tanpa pemberian probiotik, terdapat indigenous bakteri dalam usus ikan uji. Berdasarkan hasil yang diperoleh, terlihat bahwa pada perlakuan probiotik dan sinbiotik, bakteri yang dominan ditemukan adalah dari jenis Lactobacillus sp. yang diduga merupakan L brevis.

Pemanfaatan berbagai jenis prebiotik oleh probiotik bersifat spesifik, tergantung dari kemampuan probiotik menghasilkan enzim yang dapat

memetabolisma prebiotik (Manning et al., 2004). Probiotik dan prebiotik harus

dapat bertahan sampai di usus untuk dapat meningkatkan sistem imun inang, FOS

dan GOS memiliki derajat polimerisasi (DP) antara 2-7. Derajat polimerisasi (DP)

adalah jumlah unit monomer pada makromolekul atau molekul oligomer dalam suatu blok atau rantai. Kemampuan bakteri asam laktat (BAL) dalam memfermentasi oligosakarida dengan DP>10 hanya setengah dari kecepatan fermentasi oligosakarida dengan DP<10 (Gibson dan Angus, 2000). GOS dapat

difermentasi oleh BAL yang memiliki enzim β-galaktosidase (seperti

Lactobacillus sp.), sedangkan FOS dapat difermentasi oleh probiotik yang memiliki enzim β-fruktosidase. Enzim ini merupakan enzim ekstraseluler yang

bersifat induktif. Enzim induktif adalah enzim yang ada dalam sel dalam jumlah

yang tidak tetap, tergantung ada atau tidaknya pemicu, dalam hal ini adalah FOS serta GOS.

Jumlah bakteri Lactobacillus sp. di usus pada perlakuan sinbiotik menunjukkan nilai yang lebih besar dari perlakuan probiotik, hal ini diduga adanya asupan nutrisi bagi probiotik berupa FOS dan GOS sehingga meningkatkan daya hidup bagi probiotik. Delgado et al., (2011) menjelaskan proses kerja penggabungan probiotik dan sinbiotik (sinbiotik) dalam Gambar 5.

Dari Gambar 5 terlihat bahwa terlebih dahulu prebiotik dimetabolisma oleh probiotik dan menghasilkan asam lemak rantai pendek (SCFA) yang terdiri acetik (C2:0), propionic (C3:0) serta butyric (C4:0). Keberadaan SCFA akan menurunkan pH pada kolon usus, sehingga menimbulkan kondisi yang tidak sesuai untuk kebutuhan patogen. Selain hal tersebut, SCFA merupakan nutrisi yang dapat diserap oleh sistem pencernaan inang.

Nayak (2010) menyatakan bahwa usus merupakan organ tempat probiotik tumbuh, untuk kemudian berasosiasi dengan jaringan lymphoid mengaktivasi sistem imun atau gut associated lymphoid tissue (GALT). Pada usus ikan tidak ditemukan Peyers’s patches, sekresi Ig-A, antigen-sel M transport. Namun demikian, dalam usus ikan banyak ditemukan sel limphoid, macrophaga, granulocyte serta sekresi Ig-B.

Gambar 5. Mekanisme kerja sinbiotik (Delgado et al., 2011)

Pada ikan teleostei ginjal merupakan organ limfoid penting. Secara umum ginjal ikan terdiri dari tiga bagian yaitu ginjal anterior, bagian tengah, dan posterior. Ginjal anterior merupakan situs yang memiliki kapasitas hematopoietik tertinggi tetapi memiliki fungsi renal yang terbatas. Pada ginjal ditemukan adanya limfosit mirip sel B dan sel T yang menunjukkan peran jaringan limfoid ginjal dalam mekanisme pertahanan tubuh. Organ limfoid sekunder meliputi limpa dan jaringan limfoid yang berasosiasi dengan intestinum (gut-associated lymphoid tissue, GALT)

(Irianto 2005).

Parameter darah Total Eritrosit

Eritrosit merupakan salah satu parameter gambaran darah yang diamati dalam penelitian ini dan hasil pengukurannya ditampilkan pada Gambar 6 dan Lampiran 9.

Berdasarkan Gambar 6 terlihat bahwa pada minggu pertama jumlah eritrosit ikan masih sama pada setiap perlakuan sebesar 1,14±0,00 (x106 sel/ml), kemudian terjadi peningkatan pada hari ke-30 (setelah 30 hari pemberian probiotik, prebiotik, sinbiotik). Kenaikan ini berlanjut sampai hari ke-31, dan mengalami penurunan pada hari ke 34 (tiga hari setelah uji tantang dengan menggunakan bakteri A.hydrophila), kemudian mengalami kenaikan kembali pada hari ke 36 dan 38 kecuali pada K+.

Gambar 6. Total eritrosit (x106 sel/ml) darah ikan uji pada berbagai perlakuan Pada hari ke-30 terjadi peningkatan eritrosit pada semua perlakuan, dengan nilai tertinggi terjadi pada perlakuan sinbiotik sebesar 2,33±0,10 (x106 sel/ml) disusul oleh perlakuan probiotik, prebiotik, K+ dan K- dengan masing – masing nilai eritrosit sebesar 2,14±0,12 (x106 sel/ml) ; 2,11±0,03 (x106 sel/ml); 1,95±0,04(x106 sel/m) dan 1,91±0,06 (x106 sel/ml). Berdasarkan uji lanjut Duncan diketahui bahwa pada hari ke-30 terdapat beda nyata antara sinbiotik, prebiotik dan probiotik dengan K+ dan K-. Tingginya nilai eritrosit pada perlakuan sinbiotik diduga disebabkan oleh adanya asupan oligosakarida (FOS dan GOS) yang dirombak oleh probiotik menjadi asam lemak rantai pendek sebagai tambahan nutrisi bagi ikan. Delgado et al., (2011) menyatakan bahwa probiotik dan prebiotik merupakan bagian dari imunonutrition disamping asam lemak omega 3, asam amino (arginine, tourine, glutamine, cysteine), serta mikronutrien (selenium, zinc). Berdasarkan hal tersebut diduga terjadi peningkatan kualitas nutrisi sehingga mempengaruhi jumlah eritrosit pada ikan yang memperoleh perlakuan sinbiotik.

Kumar et al., (2013) menyatakan bahwa eritrosit sebagai bagian terbesar dari sel darah memiliki jumlah bervariasi, berkisar antara (1.05-3.0)x106 sel/ml. Rata-rata eritrosit pada berbagai perlakuan memiliki nilai bervariasi namun berada pada kisaran normal untuk ikan.

Eritrosit terus menurun pada hari ke-34 pada empat perlakuan kecuali pada K(-) sebesar 2,17±0,06 (x106 sel/ml), hal ini terjadi karena pada K(-) tidak dilakukan penyuntikan dengan A.hydrophila. Nilai eritrosit pada perlakuan sinbiotik, probiotik, prebiotik serta K(+) masing-masing adalah sebesar 2,20±0,01 (x106 sel/ml); 1,94±0,02 (x106 sel/ml), 1,94±0,02 (x106 sel/ml) serta 1,79±0,07 (x106 sel/ml). Penurunan nilai eritrosit diduga disebabkan produk ekstraseluler yang dihasilkan oleh A.hydrophila, seperti aerolysin, α- dan β-haemolysin, enterotoksin, protease, haemaglutinin serta adhesin (Rey et al., 2009). Produk ini berkaitan dengan tingkat virulensi dari bakteri tersebut.

Hemoglobin

Hemoglobin (Hb) merupakan bagian dari eritrosit yang memiliki kemampuan mengangkut oksigen untuk diedarkan ke seluruh tubuh. Kadar hemoglobin selama penelitian ditampilkan dalam Gambar 7 dan Lampiran 10.

Gambar 7. Nilai hemoglobin ikan uji pada berbagai perlakuan.

Nilai hemoglobin pada awal perlakuan menunjukkan nilai yang sama untuk semua perlakuan yaitu sebesar 6,80±0,00. Peningkatan nilai hemoglobin pada semua perlakuan terjadi pada hari ke-30. Puncak kenaikan nilai hemoglobin terjadi pada hari ke-31, hasil uji Duncan menunjukkan terdapat beda nyata antara perlakuan sinbiotik, prebiotik, perobiotik dengan K(-) dan K(+). Nilai masing-masing perlakuan adalah sebesar 11.92±0,76; 11,87±0,64; 11,27±12; 10,04±0,12; serta 9,87±0,12. Hemoglobin mengalami peurunan nilai mulai hari ke-34. Hasil perhitungan nilai hemoglobin pada hari ke-36 menunjukkan bahwa perlakuan Sin memberikan nilai yang berbeda nyata dengan Pre, Pro serta kontrol (+). Hal ini diduga bahwa ikan uji dengan perlakuan Sin tingkat pemulihannya lebih cepat dibandingkan perlakuan lainnya.

Perlakuan Sin, memberikan nilai hemoglobin yang tinggi dibandingkan kontrol, hal ini merupakan suatu indikasi bahwa lemak rantai pendek (SCFA) yang merupakan hasil metabolisma probiotik terhadap prebiotik memberikan kontribusi dalam menentukan jumlah hemoglobin dalam eritrosit mengingat hemoglobin adalah bentuk protein yang didalamnya terdapat ikatan Fe yang disebut dengan heme.

Penurunan hemoglobin mulai hari ke-34 diduga disebabkan oleh infeksi A.hydrophila, hal ini sesuai dengan pernyataan Harikrisnan et al., (2012) bahwa salah satu penyebab penurunan hemoglobin adalah inklusi virus, kista hemoglobin dan hemoparasit. Rey et al., (2009) menyatakan bahwa produk ekstraseluler (aerolysin, α- dan β-haemolysins yang dihasilkan oleh A.hydrophila strain KJ 99, mampu menurunkan kadar protein terlarut dalam darah, menyebabkan terjadinya perubahan pada hemodinamika darah ikan mulai dari dinding abdominal, peritoneum sampai dengan gastointestinal.

Hematokrit

Hematokrit merupakan nilai perbandingan antara jumlah eritrosit dengan plasma darah. Hasil perhitungan hematokrit ditampilkan pada Gambar 8 dan Lampiran 11.

Gambar 8. Nilai hematokrit ikan uji pada berbagai perlakuan

Jumlah hematokrit pada awal pengambilan sampel memberikan nilai yang sama pada semua perlakuan yaitu sebesar 16,00±0,00. Peningkatan hematokrit terjadi pada hari ke-30 dan ke-31, dan hasil uji lanjut Duncan menunjukkan terjadi beda nyata antara perlakuan sinbiotik, prebiotik, probiotik dengan K(+) serta K(-). Penurunan nilai hematokrit terjadi pada hari 34. Nilai hematokrit pada hari ke-38 menunjukkan bahwa perlakuan Sin lebih baik dari Pre, Pro serta K(+). Hal ini menunjukan bahwa kondisi hematokrit pada ikan uji perlakuan Sin, mencapai tingkat recovery yang lebih cepat dibandingkan perlakuan lainnya.

Peningkatan nilai hematokrit sejalan dengan peningkatan hemoglobin serta eritrosit, diduga hal ini terjadi karena adanya peningkatan kualitas asupan nutrisi berupa SCFA selama 30 hari pada perlakuan sinbiotik dan prebiotik, yang secara langsung akan meningkatkan jumlah eritrosit, dan kemudian akan berdampak pada peningkatan hematokrit. Hasil yang sama diperoleh pada penelitian Tanbiyaskur (2011) pada ikan nila dengan perlakuan pemberian probiotik berupa NP5 serta prebiotik dari golongan oligosakarida, menunjukkan adanya korelasi peningkatan hematokrit dengan eritrosit serta hemoglobin.

Penurunan nilai hematokrit pada hari ke-34 terjadi pada empat perlakuan yang diberikan infeksi A.hydrophila. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Ziskowski et al., (2008) bahwa infeksi bakteri dapat menurunkan jumlah hematokrit pada ikan winter flounder (Pseudopleuronectes americanus).

Pola penurunan kadar hematokrit perlakuan K(+) ternyata didukung pula oleh menurunnya kandungan eritrosit perlakuan K(+) pada waktu pengamatan yang sama, yaitu mulai hari ke-34, diduga hal ini terjadi akibat stress oleh infeksi A.hydrophila. Eric et al., (2012) menyatakan bahwa stress menyebabkan penurunan nilai hematokrit pada ikan carcharhinid shark (Rhizoprionodon

terraenovae). Perlakuan K(-) yang merupakan kontrol negatif memiliki pola nilai hematokrit yang stabil dibandingkan perlakuan lainnya, hal ini karena pada kontrol negatif tidak dilakukan penyuntikan A.hydrophila sehingga tidak terjadi respon tubuh akibat infeksi.

Total leukosit

Ikan-ikan teleostei memiliki respon imun bawaan dan respon imun adaptif. Sel darah putih atau leukosit merupakan bagian dari sistem pertahanan tubuh ikan yang bersifat non-spesifik termasuk di dalamnya monosit, granulosit dan sel-sel cytotoxic non-spesifik (Fraser et al., 2012). Hasil pengukuran nilai total leukosit dapat dilihat pada Gambar 9 dan lampiran 12.

Gambar 9. Total leukosit (x106 _{sel/ml) darah ikan uji pada berbagai perlakuan} Leukosit total darah ikan uji pada awal pengukuran menunjukkan nilai yang sama yaitu 0,93±0,00. Peningkatan leukosit terjadi mulai hari ke-30 disemua perlakuan, dan hasil uji Duncan menunjukkan bahwa terdapat beda nyata antara sinbiotik dan prebiotik dengan kontrol. Hari ke-34 memberikan nilai leukosit tertinggi disemua perlakuan, dengan masing-masing nilai untuk sinbiotik, prebiotik, probiotik, K(-) serta K(+) adalah 2,05±0,04 (x106 sel/ml); 2,00±0,03(x106 sel/ml) ; 1,87±0,01 (x106 sel/ml); 1,86±0,02 (x106 sel/ml) serta 1,51±0,04 (x106 sel/ml). Hasil uji Duncan menunjukkan beda nyata antara sinbiotik serta prebiotik dengan K(+). Nilai leukosit pada hari ke-36 menunjukkan bahwa perlakuan Sin berbeda nyata dengan perlakuan lainnya, hal ini menunjukkan bahwa leukosit ikan uji pada perlakuan Sin lebih cepat kembali pada kondisi pemulihan dibandingkan perlakuan lainnya.

Peningkatan nilai leukosit pada perlakuan sinbiotik dan prebiotik di hari ke-34 menunjukkan adanya upaya ikan untuk mengatasi infeksi A.hydrophila yang ditandai dengan peningkatan jumlah sistem pertahanan tubuh non-spesifiknya yakni leukosit. Hal ini sesuai dengan Rawling et al., (2012) yang menyatakan bahwa leukosit memegang peranan penting dalam sistem imun bawaan ikan dan tingkat keberadaannya dapat dijadikan sebagai bio-indiakator status kesehatan ikan.

Nilai leukosit mengalami penurunan mulai hari ke-36, namun dari hasil uji Duncan terlihat bahwa nilai perlakuan sinbiotik sebesar 1,78 ±0,02 (x106 sel/ml) berbeda nyata dengan perlakuan prebiotik, probiotik, K(-) dan K(+) yang masing-masing memiliki nilai leukosit sebesar 1,66±0,04 (x106 sel/ml); 1,55±0,03 (x106 sel/ml); 1,52±0,06 (x106 sel/ml)serta 1,51±0,05 (x106 sel/ml).

Perlakuan sinbiotik dan prebiotik menunjukkan nilai yang tinggi dibandingkan tiga perlakuan lainnya, hal ini diduga karena asupan FOS dan GOS mampu mendukung proses imunomodulatory pada tubuh inang, sehingga pengembalian kondisi tubuh atau recovery ke keadaan homeostatis dapat berlangsung lebih baik (Gambar 10).

Gambar 10. Konsep immunomodulatory dengan homeostatis (Viswanath, 2012) Berdasarkan Gambar 10 terlihat bahwa nutrisi dan bahan aditif yang termasuk pada jenis imuunonutrien akan mendukung proses aktifasi dari sistem imun non spesifik humoral yang diantaranya adalah cytokines, acute phase protein, serta sistem imun non spesifik selular. Proses lainnya yang turut dipengaruhi adalah pelepasan nutrien yang mempengaruhi respon metabolisma. Hasil akhir yang diharapkan adalah berlangsungnya proses homeostatis dalam tubuh ikan.

Diferensial Leukosit

Parameter diferensial leukosit yang diamati pada penelitian ini meliputi monosit, limfosit, serta neutrofil. Nilai yang diperoleh reltif bervariasi pada setiap perlakuan.

Monosit

Monosit merupakan parameter mononuklear disamping makrofag yang berhubungan dengan sistem imun non-spesifik pada proses fagositik dan bekerja sama dengan komponen imun lainnya seperti neutrofil, mast sel, makrofag, B lymposit, T lymposit, interleukin (Lv-yun, 2013). Hasil dari perhitungan monosit ditampilkan pada Gambar 11 dan Lampiran 13.

Gambar 11. Nilai monosit darah ikan uji pada berbagai perlakuan

Monosit pada pengambilan sampel awal menunjukkan nilai yang sama pada semua perlakuan yaitu 3,00±0,00 kemudian mengalami peningkatan pada hari ke-30, dan mencapai nilai tertinggi pada hari ke-34. Berdasarkan hasil uji Duncan, terdapat beda nyata antara perlakuan sinbiotik, probiotik, dengan K(-) dan K(+) pada hari ke-34 dengan masing-masing nilai sebesar 6,87±0,58; 6,33±0,58; 5,07±0,55; dan 5,01±0,58. Penurunan monosit terjadi mulai hari ke-36, hasil uji Duncan menunjukkan pada hari ke-36 tidak menunjukan perbedaan yang nyata antara sinbiotik dengan K(+).

Peningkatan nilai monosit pada hari ke 34 menunjukkan sudah adanya pengaruh dari infeksi A.hydrophila pada K(+), probiotik, prebiotik serta sinbiotik, sehingga terjadi penambahan jumlah monosit dalam darah ikan, hal ini terkait dengan peran monosit sebagai makrofag yaitu sel fagosit utama untuk menghancurkan partikel asing dan jaringan mati.

Penurunan monosit mulai hari ke-36 diduga terjadi karena sel monosit mulai keluar dari sirkulasi darah, selanjutnya masuk ke jaringan yang terinfeksi dengan berdiferensiasi menjadi makrofag yang berperan dalam memfagosit dan menyajikan antigen kepada sel limfosit.

Limfosit

Limfosit merupakan sel yang berfungsi mengenali berbagai antigen, baik intraselular maupun ekstraselular. Sel ini berperan utama dalam sistem imun spesifik Hasil perhitungan limfosit ditampilkan pada Gambar 12 dan Lampiran 14.

Gambar 12. Nilai limfosit ikan uji pada berbagai perlakuan

Nilai limfosit pada pengamatan awal menunjukkan nilai yang sama pada semua perlakuan yaitu sebesar 65,00±0,00. Peningkatan mulai terjadi setelah tiga puluh hari pemberian pakan perlakuan, hasil uji Duncan menunjukkan beda nyata antara perlakuan sinbiotik, prebiotik, probiotik dengan K(-) dan K(+), masing-masing sebesar 70,67±2,08; 69,67±1,53; 68,67±1,15; 65,00±1,73 serta 64,33±0,58. Penurunan limfosit terjadi pada hari ke 31, namun hasil uji lanjut menunjukkan terdapat beda nyata antara perlakuan dengan kontrol, dengan nilai sebesar 66,67±0,58; 67,33±1,15; 65,57±1,15; 64,67±0,58; serta 64,33±0,58. Penurunan limfosit diduga tubuh ikan memberi respon tanggap kebal terhadap adanya infeksi A.hydrophila yang masuk ke dalam tubuh.

Limfosit, terdiri dari sel T pada imunitas selular, dan sel B pada imunitas humoral. Sel CD4+ dan T helper pada imunitas humoral akan bereaksi dengan sel B merangsang proliferasi dan diferensiasi sel. Sel CD4+ pada imunitas seluler berfungsi mengaktifkan makrofag untuk menghancurkan mikroba intraseluler (Iwama, 1996). Perkembangan sel B dan Sel T berawal dari sel induk sumsum tulang, jalur sel B akan masuk ke sumsum tulang selanjutnya sel B akan matang dan masuk ke darah, sedangkan jalur sel T akan masuk ke thimus, sel T matang dan masuk ke darah dan limfa, Sel T dan sel B akan mengenali benda asing (antigen) serta membedakannya dengan jaringan sendiri berkat adanya T cel reseptor (TCR).

Pengolahan antigen merupakan proses yang penting untuk merangsang limfosit selanjutnya, karena reseptor pada sel limfosit akan mengenali antigen berdasarkan susunan asam amino dalam rantai peptide. Antigen hasil pengolahan akan dipresentasikan bersama-sama dengan molekul protein MHC (major histicompatibility complex) tertentu membentuk struktur yang unik pada permukaan sel makrofag dan dapat dikenali oleh reseptor sel T (TcR). Castro et al., (2011) menyatakan bahwa pengenalan struktur ini oleh sel limfosit T (termasuk beberapa komplemen seperti CD4, CD8, CD3, CD28, CTLA4), mengakibatkan sel-sel imun berproliferasi dan berdiferensiasi, menjadi sel yang memiliki kompetensi imunologik dan mampu bereaksi dengan antigen tersebut.

Fraser et al., (2012) menyatakan bahwa pada ikan salmon sel–B umumnya banyak ditemukan di ginjal, darah dan limpa; yang berperan dalam produksi antibodi dan fagositik. Pohlenz et al., (2012) menyatakan bahwa perbanyakan limfosit ditentukan oleh keberadaan asam amino, dan limfosit berperan dalam diferensiasi plasma sel dan sintetis imunoglobulin.

Berbeda dengan monosit, limfosit tidak bersifat fagositik tetapi berperan penting dalam pembentukan antibodi (Bratawidjaja, 2006). Pernyataan ini merupakan penjelasan dari data pada berbagai perlakuan, bahwa nilai terendah terjadi pada waktu setelah uji tantang. Diduga pada kondisi ini yang bekerja secara dominan adalah monosit sehingga differensiasi leukosit yang terjadi didominasi oleh monosit sehingga jumlah limfosit relatif berkurang. Pada hari ke-36 dan ke-38, dianggap merupakan kondisi pemulihan yang sebelumnya telah dijelaskan dan hal ini terlihat dari nilai limfosit yang meningkat, karena pada kondisi tersebut sel mulai membentuk antibodi agar ikan lebih tahan dari infeksi A. hydrophila berikutnya.

Neutrofil

Granulosit merupakan bagian dari leukosit dan diketahui terdiri dari 3 tipe, yakni neutrofil, eosinofil dan basofil. Neutrofil dan eonisofil adalah yang umum ditemui dalam banyak spesies ikan sedangan basofil jarang ditemui. Neutrofil adalah sel fagositik pertama yang tiba di lokasi infeksi dan beperan dalam pembunuhan serta degradasi mikroorganisme sebagaimana yang dilakukan dalam penyembuhan luka (Fraser et al., 2012). Hasil pengukuran neutrofil ditampilkan pada Gambar 13 dan Lampiran 15.

Gambar 13. Nilai neutrofil ikan uji pada berbagai perlakuan

Nilai neutrofil pada awal pengambilan sampel menunjukkan nilai yang sama yaitu 4,00±0,00. Peningkatan neutrofil terjadi mulai hari ke-31 dan mencapai puncaknya pada hari ke-34 dan hasil uji lanjut memberikan beda nyata antara perlakuan sinbiotik, prebiotik, probiotik dengan K(+). Neutrofil pada hari ke-30 tidak menunjukkan beda nyata, diduga hal ini terjadi karena pada hari ke-30

Lampiran 13. Hasil uji Duncan terhadap nilai aktivitas fagositik ikan uji pada berbagai perlakuan

Hari Perlakuan

K(+) K(-) Pro Pre Sin

Awal 70.00±0.00a 70.00±0.00a 70.00±0.00a 70.00±0.00a 70.00±0.00a 30 72.33±3.79c 72.67±2.31c 75.33±1.15bc 82.00±6.93ab 83.33±2.31a 31 70.67±3.06b 71.33±2.52b 78.67±6.43ab 81.67±1.53a 83.00±6.08a 34 90.33±4.51a 72.33±3.06b 90.67±8.33a 92.67±3.06a 95.33±3.06a 36 90.00±6.93a 73.67±4.73b 88.00±5.29a 89.33±6.43a 92.67±1.15a 38 88.67±5.77a 75.33±1.15b 82.67±4.16ab 81.33±3.21ab 85.33±6.43a Lampiran 14. Hasil uji Duncan terhadap nilai Kelangsungan hidup ikan uji pada berbagai perlakuan

Perlakuan Rataan Perbedaan

K(-) 100.00±0.00 a

Pre 100.00±0.00 a

Sin 100.00±0.00 a

Pro 100.00±0.00 a

K(+) 43.33±11.55 b

Lampiran 15. Hasil uji Duncan terhadap nilai laju pertumbuhan harian ikan uji berdasarkan bobot pada berbagai perlakuan

Perlakuan Rataan Perbedaan Sin 3,370±0.14 a

Pre 3,047±0.10 b

Pro 3,001±0,20 b

K(+) 2,578±0,13 C

K(-) 2,505±0,07 C

Lampiran 16. Hasil uji Duncan terhadap pertumbuhan ikan uji berdasarkan panjang pada berbagai perlakuan

Perlakuan Rataan Perbedaan Sin 3,80±0,35 a

Pre 3,13±0,50 ab

Pro 3,03±0,25 b

K(+) 2,10±0,44 c

Lampiran 17. Hasil uji Duncan terhadap nilai Nilai FCR ikan uji pada berbagai perlakuan

Perlakuan Rataan Perbedaan

K(-) 1.731±0.06 a

K(+) 1.664±0.10 a

Pre 1.431±0.08 b

Pro 1.414±0.13 b

RINGKASAN

YUKE ELIYANI. Pengaruh pemberian probiotik Lactobacillus brevis dan

prebiotik oligosakarida terhadap respon imun dan resistensi benih patin siam

(Pangasionodon hypophthalmus) yang diinfeksi Aeromonas hydrophila.

Dibimbing oleh WIDANARNI dan DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Patin siam (Pangasionodon hypophthalmus) merupakan salah satu jenis

patin yang banyak dibudidayakan di Indonesia, serta memiliki nilai ekonomis yang tinggi. Salah satu penyakit pada budidaya patin adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila dandikenaldengan motile

aeromonad septicaemia (MAS). Tindak pencegahan dan penanggulangan telah

dilakukan untuk mengatasi penyakit ini, salah satunya adalah penggunaan antibiotika, namun seringkali dalam penggunaannya tidak sesuai dosis dan waktu penggunaan, sehingga menimbulkan resistensi patogen. Berkenaan dengan hal tersebut, maka dicari berbagai langkah alternatif, diantaranya adalah pemanfaatan probiotik, prebiotik, serta gabungan probiotik dan prebiotik (sinbiotik). Probiotik merupakan mikroorganisma hidup, yang mempunyai pengaruh menguntungkan pada kesehatan inang dengan memperbaiki keseimbangan mikrobiota intestinal. Bakteri yang dapat digunakan sebagai probiotik diantaranya adalah dari golongan

Lactobacillus. Prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dicerna

oleh inang, mampu secara selektif menstimulasi pertumbuhan bakteri pencernaan seperti Bifodobacteria dan bakteri asam laktat, dan biasanya berasal dari golongan

oligosakarida, diantaranya adalah fructooligosaccharide (FOS), dan

galactooligosaccharide (GOS).

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh pemberian probiotik Lactobacillus brevis, prebiotik oligosakarida dan gabungannya terhadap

jumlah bakteri Lactobacillus sp. dan total bakteri dalam usus, respon imun,

kelangsungan hidup dan pertumbuhan benih patin siam yang diinfeksi Aeromonas hydrophila.

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Oktober sampai dengan Desember 2012 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Institut Pertanian Bogor; Sekolah Tinggi Perikanan Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor; dan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar Sukabumi. Kegiatan penelitian meliputi persiapan bakteri probiotik dan A.hydrophila, analisis prebiotik (oligosakarida), uji in vitro, dan uji

in vivo. Parameter uji yang diamati selama penelitian adalah jumlah Lactobacillus

sp. dan total bakteri pada usus, total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total leukosit, diferensial leukosit, kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan FCR benih ikan patin siam serta kualitas air. Penelitian terdiri dari lima perlakuan dengan masing-masing tiga ulangan, yaitu kontrol (+), kontrol (-), pemberian probiotik (Pro), pemberian prebiotik (Pre), pemberian probiotik ditambah prebiotik (Sin). Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor. Data dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan 95%. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan maka analisis data dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program Xl-stat.

Hasil karakterisasi bakteri menunjukkan bahwa jenis probiotik dan patogen masing–masing adalah Lactobacillus brevis dan Aeromonas hydrophila.

Bakteri Lactobacillus sp. ditemukan di usus pada perlakuan probiotik dan

sinbiotik dengan kisaran jumlah 101 sampai 106 (CFU/gram). Total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total leukosit, diferensial leukosit, aktivitas fagositik perlakuan, berbeda nyata (p<0.05) dengan kontrol pada beberapa waktu pengamatan. Tingkat kelangsungan hidup perlakuan Sin, Pre, Pro serta K(-) menunjukkan nilai sebesar 100%, sedangkan K(+) sebesar 43,33 ± 11,55. Laju pertumbuhan harian terbaik dicapai pada perlakuan pemberian sinbiotik sebesar 3,370±0,14. Nilai FCR perlakuan probiotik, prebiotik dan sinbiotik masing-masing sebesar 1,414±0,13; 1,431±0,08 dan 1,305±0,08.. Respon imun pada parameter total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, serta total leukosit, menunjukkan bahwa perlakuan Sin lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya. Kata kunci : probiotik, prebiotik, sinbiotik, Lactobacillus brevis, Aeromonas

SUMMARY

YUKE ELIYANI. The Effect of Application Probiotic Lactobacillus brevis and

prebiotics Oligosaccharides for immune response and resistance Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) Infected by Aeromonas hydrophila.

Supervised by WIDANARNI and DINAMELLA WAHJUNINGRUM.

Thai catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the important

economic and cultivated fish species in Indonesia. while diseases caused by

Aeromonas hydrophila often breakout and spread in catfish farming and

sometimes cause large economic losses. Aeromonas hydrophila is a causative

agent of motile aeromonad septicemia (MAS). The wide and frequent use of

antibiotics in aquaculture for this diseases, has resulted in the development and spread of antibiotic resistance. The other alternative for this case were probiotics, prebiotics, and combined of probiotics and prebiotics (synbiotics). Probiotics are live microbial supplements that beneficially affect the host animal by improving its microbial balance. These strains commonly used as probiotics were

Lactobacillus. Prebiotics are non-digestible food ingredients that stimulate the

growth with selective of intestinal microbial like bifidogenic and lactic acidbacteria in the gastro-intestinal tract. Typically, the prebiotics consist of oligosaccharides, like fructooligosaccharide (FOS), dan galactooligosaccharide

(GOS).

The aim of this study was to evaluate of probiotic Lactobacillus brevis, prebiotic Oligosaccharides and synbiotics upon the population bacteria in the intestine, immune response, survival (SR), and growth rate (SGR) of Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) which was infected by Aeromonas

hydrophila.

The study was carried out at the Fish Health Laboratory, Aquaculture Department of the Faculty of Fisheries and Marine Science Bogor Agricultural University; College of Fisheries university Extension Programe; and Main Centre of Freshwater Aquaculture Development, on October – December 2012. The parameters were total number of Lactobacillus sp. in the gut, total number of

erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, leucocyte, differntial leucocyte, and phagocytic activity, survival rate, growth rate, FCR (feed convertion ratio), and water quality. For in vivo test 5 (five) treatments and three replicated utilized, i.e. positive control (K(+)), negative control (K(-)), probiotic (Pro), prebiotics

Oligosaccharides (Pre) and sinbiotics (Sin). One-way ANOVA was used to

determine differences among the treatments. When a significant (p<0.05)

difference was detected, the means were compared by use of Duncan’s multiple

range test, and analysed by Xl-stat programe

The results of the characteristics test showed that the species of probiotic and pathogen were Lactobacillus brevis and Aeromonas hydrophila respectively.

In vivo test was carried out in 5 (five) treatments, i.e. positive control (K(+)), negative control (K(-)), probiotic (Pro), prebiotic (Pre) and synbiotic (Sin). The results showed that the total number of Lactobacillus sp. in the gut were between

101-106 (CFU/gr) and the total number of erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, leucocyte, differntial leucocyte, and phagocytic activity have shown significant different (p<0.05) with control at the some times. The treatments of Sin, Pre, Pro and K(-) were at 100% in survival rate (SR), while K(+) was (43.33 ± 11.55)%. The growth rate showed significant different (p<0.05), with the highest value was on Sin treatment (3,37 ± 0.14)%. The FCR of Pro, Pre, and Sin were 1,414±0,13; 1,431±0,08 and 1,305±0,08. This fact suggested that Sin was better than the other treatments in immune respon at total erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, and total leucocyte.

Keywords: probiotic, prebiotic, synbiotic, Lactobacillus brevis, Aeromonas hydrophila, Pangasionodon hypophthalmus