Aktivitas Antikanker Dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa Secara In Vitro Terhadap Sel Mcf-7 Yang Berasal Dari Berbagai Lokasi Di Indonesia.
AKTIVITAS ANTIKANKER DAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK
CABE JAWA SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MCF-7
YANG BERASAL DARI BERBAGAI LOKASI DI INDONESIA
KRISTINA MULIA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS SUMBER INFORMASI
SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Aktivitas
Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa Secara In Vitro Terhadap Sel
MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di Indonesia adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Kristina Mulia
NIM G851130271
RINGKASAN
KRISTINA MULIA. Aktivitas Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa
Secara In Vitro Terhadap Sel MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di
Indonesia. Dibimbing oleh SURYANI dan AKHMAD ENDANG ZAINAL
HASAN.
Kanker adalah penyakit mematikan yang menempati posisi kedua setelah
penyakit jantung. Salah satu penyebab penyakit kanker adalah radikal bebas yang
mengakibatkan stress oksidatif pada manusia. Antioksidan adalah senyawa yang
dapat mengurangi stress oksidatif. Aktivitas antioksidan erat hubungannya dengan
aktivitas antikanker. Diketahui bahwa selain sebagai analgetik, afrosidiak cabe
jawa juga berpotensi sebagai antikanker.
Penelitian ini mengkaji potensi antikanker dan antioksidan dari ekstrak
etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan lokasi di Indonesia yaitu Pamekasan,
Sumenep, Giritontro, Paranggupito, Air Naningan, Karang Asem dan Gianyar.
Metode yang digunakan dalam penelitian ini dimulai dengan ekstraksi cabe jawa
menggunakan etanol 70%, pengujian fitokimia, penentuan total fenol dan total
flavonoid, identifikasi senyawa kimia dengan menggunakan LC-MS/MS,
pengujian antikanker menggunakan metode MTT terhadap sel kanker payudara
MCF-7 dan pengujian antioksidan dengan menggunakan metode DPPH.
Ekstrak etanol cabe jawa menunjukkan aktivitas antioksidan paling baik
terhadap radikal bebas 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil (metode DPPH) berasal dari
lokasi Paranggubito I yaitu sebesar 217.63 µg/mL. Toksisitas terhadap sel kanker
payudara MCF-7 dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5-dipeniltetrazolium bromida yang terbaik berasal dari daerah berasal dari
daerah Air Naningan II yaitu sebesar 32.34 µg/mL. Identifikasi senyawa
menggunakan LC-MS ekstrak etanol cabe jawa mengandung senyawa paclitaxel
dan piperin.
Kata Kunci : Antikanker, Antioksidan, Piper retrofractum Vahl., Sel MCF-7
SUMMARY
KRISTINA MULIA. Anticancer Activity and Antioxidant Extract Java Chili
Extract In Vitro Against MCF-7 Cells Coming from Various Locations in
Indonesia. Supervised by SURYANI and AKHMAD ENDANG ZAINAL
HASAN.
Cancer is a deadly disease that ranks the second after heart disease. One of
the causes of cancer is free radicals causing oxidative stress in humans.
Antioxidant is compound that can reduce oxidative stress. The antioxidant activity
is closely connected with anticancer activity. It is known that in addition to being
an analgesic, aphrodisiac of Java chili also has potential as anticancer.
This study examined the potential anticancer and antioxidant from the
ethanol extract of Java chili from nine locations in Indonesia, namely Pamekasan,
Sumenep, Giritontro, Paranggupito, Air Naningan, Karang Asem and Gianyar.
The method used in this study began with the extraction of Java chili using
ethanol 70%, phytochemical testing, determination of total phenol and total
flavonoids, identification of chemical compounds using LC-MS/MS, anticancer
testing using MTT method on MCF-7 breast cancer cell line and antioxidant
testing using DPPH.
Java chili ethanol extract shows that the good antioxidant activity on free
radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH method) was coming from
Paranggubito I by 217.63 µg/mL. Of the toxicity on MCF-7 breast cancer cells
using MTT method (3-(4.5-dimetiltiazol-2-yl)-2.5-dipeniltetrazolium bromide, the
best was coming from Air Naningan II by 32.34 µg/mL. The identification of
compounds using LC-MS of Java chili ethanol extract contains paclitaxel and
piperine compounds.
Key words: Anticancer, antioxidant, Piper retrofractum Vahl., MCF-7 Cell
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AKTIVITAS ANTIKANKER DAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK
CABE JAWA SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MCF-7
YANG BERASAL DARI BERBAGAI LOKASI DI INDONESIA
KRISTINA MULIA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji luar komisi pada ujian tesis : Dr Mega Safithri SSi MSi
PRAKATA
Alhamdulillahi Rabbil „Alamin, penulis panjatkan kehadirat Allah SWT
yang telah memberikan petunjuk dan kemudahan dalam menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul “Aktivitas Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa
Secara In Vitro Terhadap Sel MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di
Indonesia”.
Penulis banyak sekali mendapatkan dukungan moral maupun material dari
berbagai pihak selama menjalani perkuliahan hingga terselesainya tesis ini.
Penulis dengan segala kerendahan hati menyampaikan ucapan terima kasih
kepada Ibu Dr Suryani SP M.Sc sebagai ketua komisi pembimbing dan Bapak Dr
Ir Akhmad Endang Zainal Hasan M.Si selaku anggota komisi pembimbing yang
telah memberikan saran dan bimbingannya dalam menyelesaikan tesis ini.
Terimakasih atas Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN)
yang diperoleh dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun
2013.
Penulis Mengucapkan terimakasih kepada keluarga tercinta (Ayah, Ibu,
Kartiko Rusadi) yang telah memberikan do‟a, semangat dan dukungannya.
Mahasiswa Pascasarjana Biokimia angkatan 2013 atas dukungan dan bantuannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Kristina Mulia
DAFTAR ISI
..........................................................................................................................................
DAFTAR TABEL ................................................................................................ vi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi .
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ vi .
1 PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
Latar Belakang............................................................................................ 1
Rumusan Masalah ...................................................................................... 2
Tujuan Penelitian ........................................................................................ 2
Manfaat Penelitian ...................................................................................... 2
Ruang Lingkup Penelitian .......................................................................... 3
2 METODE PENELITIAN .................................................................................. 4
Waktu dan Tempat....................................................................................... 4
Alat dan Bahan ............................................................................................ 4
Prosedur Penelitian ...................................................................................... 4
Analisi Data ................................................................................................. 6
3 HASIL ............................................................................................................... 7
Rendemen Cabe Jawa .................................................................................. 7
Komponen Fitokimia Ekstrak Cabe Jawa ................................................... 7
Komponen Kimia Hasil Uji LC-MS/MS ..................................................... 8
Total Fenolik ............................................................................................... 8
Total Flavonoid ........................................................................................... 9
Aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH.................................... 10
Aktivitas antikanker terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT ................. 11
4 PEMBAHASAN................................................................................................ 13
Rendemen Cabe Jawa .................................................................................. 13
Komponen Fitokimia ................................................................................... 13
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS ....................................................... 14
Total Fenolik ............................................................................................... 15
Total Flavonoid ........................................................................................... 15
Aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH.................................... 16
Aktivitas antikanker terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT ................. 17
Hubungan antara IC50 antioksidan dengan antikanker ................................ 18
5 SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 19
Simpulan ...................................................................................................... 19
Saran ............................................................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
20
23
38
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
Kandungan kimia ekstrak etanol cabe jawa
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Aktivitas antioksidan
Aktivitas sitotoksik
7
8
10
11
DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
4.
Hasil rendemen ekstrak cabe jawa
Kandungan total fenolik tiap sampel
Kandungan total flavonoid tiap sampel
Kanker payudara MCF-7
7
9
10
12
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Bagan alir penelitian
--------------------------- 23
Ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 24
Rendemen ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 24
--------------------------- 25
Contoh perhitungan ekstrak etanol cabe jawa
Kandungan kimia ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 26
Absorbansi standar asam galat
--------------------------- 27
Gambar kurva standar asam galat
--------------------------- 27
Kadar total fenolik ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 28
--------------------------- 29
Absorbansi standar kuersetin
Gambar kurva standar kuersetin
--------------------------- 29
Kadar total flavonoid ekstrak etanol cabe jawa --------------------------- 30
--------------------------- 31
Hasil kromatogram LC-MS
Aktivitas antikanker ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 36
Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etanol cabe jawa -------------------- 36
Aktivitas antioksidan ekstrak etanol cabe jawa --------------------------- 37
Contoh perhitungan nilai IC50 aktivitas antioksidan ekstrak cabe jawa -- 37
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Kanker menjadi masalah kesehatan utama baik di negara maju maupun di
negara berkembang. Keberadaan makanan cepat saji, rokok, alkohol dan
kegemukan merupakan faktor resiko tinggi penyebab terjadinya penyakit kanker.
Pekerja di sektor industri, pertanian, dan tenaga kesehatan di rumah sakit sering
memakai bahan-bahan kimia yang dapat menyebabkan penyakit kanker, banyak di
antara mereka yang tidak memakai alat pelindung diri sehingga tubuh kontak
langsung dengan bahan-bahan tersebut. Bila hal ini berlangsung lama dapat
berakibat timbulnya kanker.
Kanker adalah tumor ganas yang ditandai dengan pertumbuhan abnormal
sel-sel tubuh. Menurut laporan WHO, terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker
pertahun di dunia. Penyakit kanker di Indonesia merupakan penyebab kematian
ke-6. Penyakit kanker di Amerika Serikat merupakan penyebab kematian kedua
setelah penyakit kardiovaskular. (Tjindarbumi & Mangunkusumo 2002). Kanker
payudara termasuk jenis kanker yang paling sering diderita wanita disamping
kanker kulit dan merupakan penyebab kematian kedua setelah kanker paru.
Kanker payudara di Amerika Serikat menduduki peringkat pertama (32%) dan
kematian karena kanker jenis ini mencapai 18% (King, 2000). Kanker payudara di
Indonesia menduduki peringkat kedua setelah kanker leher rahim (serviks) dan
kasusnya mencapai 17.77% (Tjindarbumi & Mangunkusumo 2002).
Salah satu penyebab penyakit kanker adalah radikal bebas yang
menyerang sel tubuh manusia. Radikal bebas diduga merupakan penyebab
kerusakan sel yang mendasari timbulnya penyakit kanker termasuk kanker
payudara (Risky & Suyatno 2014). Senyawa yang dapat menunda, menghambat
atau mencegah oksidasi bahan atau senyawa yang mudah teroksidasi oleh radikal
bebas dan mengurangi stres oksidatif adalah antioksidan (Dai 2010). Antioksidan
telah terbukti bermanfaat dalam pencegahan sel kanker (Chaudhary 2015).
Penelitian tentang obat kanker telah banyak dilakukan. Salah satunya adalah
kemoterapi dan penggunaan obat-obatan untuk menghambat tumbuhnya sel
kanker. Penggunaan obat seperti doksorubisin merupakan salah satu cara untuk
mengatasi perkembangan kanker dan mengurangi pembentukan kanker baru. Efek
samping dari pengobatan dengan doksorubisin ini adalah terjadinya kerontokan
rambut, jantung berdebar, dan menurunnya jumlah sel darah putih sebagai agen
pertahanan tubuh. Salah satu tantangan dalam pengobatan kanker adalah
meningkatkan efektivitas dan mengurangi buruknya pengaruh pengobatan utama.
Upaya yang dilakukan adalah menemukan dan mengembangkan obat berbasis
bahan alam (herbal), salah satu diantaranya adalah cabe jawa (Budiman et al.
2013).
Cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) merupakan tanaman penghasil
rempah dan fitofarmaka yang penting baik ditinjau dari pemenuhan kebutuhan
bumbu dan obat tradisional (Soleh 2003). Cabe jawa diketahui memiliki aktivitas
antikanker. Ekowati et al. (2012) menunjukkan bahwa jahe, cabe jawa dan
kombinasi jahe dan cabe jawa memiliki aktivitas sitotoksik pada sel myeloma
dengan IC50 (Inhibitory Concentration 50%) dari masing-masing 28, 36, dan 55
2
mg/ml dan sel line WiDr dengan masing-masing IC50 74, 158, dan 64 mg/ml.
Hasil penelitian tersebut membuktikan bahwa jahe (Zingiber officinale), cabe
jawa (Piper retrofractum) dan kombinasinya menunjukkan aktivitas sitotoksik,
induksi apoptosis dan ekspresi p53 dari sel HeLa, T47D (Tumor 47 Ductal), dan
sel line MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7).
Serbuk dari buah cabe jawa di Madura biasa dibubuhkan ke dalam
minuman seperti teh, susu, dan kopi (Djauhariya & Rosman 2008). Penduduk
Ulias di Ambon menggunakan buah cabe jawa sebagai rempah pengganti cabe
rawit (Heyne 1987). Cabe jawa merupakan salah satu tanaman obat unggulan
untuk dilakukan uji klinik (Dewoto 2007). Penelitian senyawa bioaktif tumbuhan
obat dan pemanfaatannya akan semakin meningkat termasuk cabe jawa (Evrizal
2013). Dilihat dari produksi, buah cabe jawa tersebar di beberapa provinsi di
Indonesia. Sentra produksi buah cabe jawa adalah Jawa Timur dan Lampung
(Evrizal 2013).
Penelitian yang telah dilakukan diduga terdapat korelasi positif antara
aktivitas antioksidan dan aktivitas antikanker. Melihat persebaran cabe jawa di
sentra produksi di Indonesia maka, perlu dilakukan penelitian yang menguji
aktivitas sitotoksik ekstrak buah cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) dari
sembilan lokasi di daerah sentra produksi yaitu berasal dari Sumenep dan
Pamekasan (Madura), Paranggupito I, Paranggupito II, Giritontro (Jawa Tengah),
Air Naningan I dan Air Naningan II (Lampung), Karang Asem dan Gianyar (Bali)
terhadap sel kanker payudara MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7), dan
aktivitas antioksidan.
Perumusan masalah
Cabe jawa memiliki potensi sebagai obat-obatan herbal yang dapat
dikembangkan sebagai alternatif pengobatan kanker yang aman. Beberapa
penelitian telah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak cabe jawa pada beberapa sel
kanker tetapi pengujian aktivitas sitotoksik dan antioksidan terhadap sel kanker
payudara MCF-7 dari berbagai lokasi di Indonesia belum dilakukan, maka
penelitian ini memanfaatkan ekstrak cabe jawa sebagai agen antikanker dan
antioksidan yang berasal dari berbagai lokasi sentra produksi di Indonesia.
Pemanfaatan cabe jawa tersebut diharapkan dapat menjadi solusi alternatif sebagai
obat antikanker.
Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah
1. ekstraksi dan identifikasi komponen kimia ekstrak cabe jawa
2. pengujian kemampuan aktivitas sitotoksik dan aktivitas antioksidan dari cabe
jawa.
Manfaat penelitian
1. hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang
cabe jawa sebagai antikanker dan gambaran kepada masyarakat luas terutama
3
dalam eksplorasi serta penemuan senyawa aktif dari bahan alam sebagai
pengobatan herbal yang akan dipublikasikan dalam jurnal ilmiah.
2. secara khusus dapat mengetahui kemampuan aktivitas sitotoksik dan aktivitas
antioksidan cabe jawa.
Ruang lingkup penelitian
Penelitian ini mencakup ekstraksi etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan
lokasi di Indonesia, uji fitokimia, identifikasi menggunakan LC-MS/MS
penentuan total fenolik, penentuan total flavonoid, uji antikanker dan uji
antioksidan. Ekstrak etanol cabe jawa diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel
kanker MCF-7 dengan menggunakan metode MTT dan pengujian aktivitas
antioksidan menggunakan metode DPPH.
4
2 METODE
Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia, FMIPA IPB dan
Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata IPB. Penelitian dilakukan selama enam
bulan dari bulan Agustus 2014 sampai dengan bulan Februari tahun 2015.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneltian ini adalah buah cabe jawa
(Piper rectrofractum) dari berbagai lokasi sentra produksi yaitu Sumenep dan
Pamekasan (Madura), Paranggupito I, Paranggupito II, Giritontro (Jawa Tengah),
Air Naningan I dan Air Naningan II (Lampung), Karang Asem dan Gianyar
(Bali), pelarut DMSO, etanol 70 %, amonia, kloroform, larutan H2SO4,
CH3COOH, HCl pekat, dietilester, bubuk Mg, amilalkohol, FeCl3 1%, AlCl3, Naasetat, dan pereaksi analisis fitokimia, DPPH, doksorubisin, vitamin E (αtokoferol) dan air suling.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar, inkubator,
kulkas, pipet mikro, rotary evaporator, Shaker, pemanas gelombang mikro, plate
96 sumuran, LC-MS/MS, spektrofotometer UV-Vis, ELISA reader, dan peralatan
gelas lainnya.
Prosedur Penelitian
Ekstraksi cabe jawa (Hasan 2013)
Sebanyak 20 g serbuk cabe jawa berukuran 60 mesh dipanaskan dengan
pemanas gelombang mikro (frekuensi 2.450 MHz dan daya 800 Watt) selama 5
menit, dimaserasi dengan etanol 70% 1:20, ditutup sambil diaduk dengan orbital
shaker selama 18 jam, lalu disaring. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan
menggunakan rotavapor pada suhu 50±2 0C selama tiga jam atau hingga air dan
etanol menguap sempurna. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang dan
dihitung rendemennya. Hasil ekstraksi disimpan dalam botol gelap dan
ditempatkan di ruang yang tidak terkena sinar matahari langsung.
Rendemen ditentukan dengan rumus sebagai berikut : Rendemen (%) =
(bobot hasil ekstraksi/bobot cabe jawa) x 100.
Pengujian kualitatif komponen kimia (Harborne 1987)
Uji kualitatif cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) meliputi uji alkaloid,
flavonoid, terpenoid, steroid, saponin dan tannin.
Uji alkaloid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan dua tetes ammonia dan 5 ml kloroform lalu disaring. Filtrat hasil
5
penyaringan ditambahkan 1 ml H2SO4 2 M, kemudian fraksi asam ditambahkan
pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Keberadaan alkaloid dalam cabe jawa
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah pada pereaksi Dragendorf,
endapan putih pada pereaksi Meyer dan endapan coklat pada pereaksi Wagner.
Uji triterpenoid dan steroid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukan dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan etanol panas sebanyak 5 ml lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan
dievaporasi, kemudian ditambahkan 1 ml dietileter. Setelah diaduk hingga
homogen dengan vortex, lalu ditambahkan 1 ml H2SO4 pekat dan 1 ml
CH3COOH. Terbentuknya warna merah atau kelabu menunjukkan adanya
triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid dalam cabe jawa.
Uji flavonoid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 5 ml air, lalu dipanaskan selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan
penyaringan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan bubuk Mg, 1 ml HCl pekat, dan
1 ml amilalkohol. Kemudian diaduk sempurna sehingga timbul lapisan yang
berbeda. Warna yang terbentuk antara dua larutan amilalkohol menunjukkan
adanya flavonoid.
Uji tannin
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan 5 ml air dan disaring. Kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat
hasil penyaringan ditambahkan 3 tetes FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru atau
hijau kehitam-hitaman menunjukkan adanya tanin dalam cabe jawa.
Uji saponin
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan 5 ml air dan disaring. Kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat
hasil penyaringan dikocok dengan sempurna lalu dibiarkan selama 10 menit.
Terbentuknya buih yang stabil menunjukkan adanya saponin dalam cabe jawa.
Identifikasi senyawa kimia cabe jawa dengan LC-MS/MS (Blazies et al. 2011)
Ekstrak etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan lokasi di Indonesia di
analisis menggunakan Liquid Chromatograph-tanden Mass Spectrometry (LCMS/MS/MS) dengan tipe QMicro QAA 842. Sampel berupa cairan dimasukkan
ke fase gerak yang ada pada kolom LC dengan laju alir 0.2 mL/menit. Temperatur
kolom yang digunakan adalah 400C dan waktu akhir 35 menit. Pemisahan
senyawa kimia terjadi di dalam kolom dengan bantuan pompa. Hasil analisis
dengan LC dilanjutkan MS untuk identifikasi komponen kimia. Jenis analisis
massa yang digunakan adalah quadrupole dengan modus scan selama 5 detik.
Spektrum yang diperoleh menunjukan rasio massa dengan muatan (m/z).
Penentuan total fenolik (Pourmorad 2006)
Total fenol ditentukan oleh reagen Follin Ciocalteu. Ekstrak etanol cabe
jawa atau asam galat (standar senyawa fenolik) dicampur dengan reagen Folin
Ciocalteu 10% dan Na2CO3 1M. Campuran didiamkan selama 15 menit dan total
fenol diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 765 nm.
Kurva standar dibuat dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 35 µg/mL
larutan asam galat dalam metanol : Air 50:50 (v/v). Total nilai fenol yang
dinyatakan dalam setara asam galat (mg g-1 massa kering).
6
Penentuan total flavonoid (Sahu & Saxena 2013)
Kandungan total flavonoid ditentukan dengan pengujian menggunakan
AlCl3 yang diukur dengan metode pewarnaan. Kuersetin digunakan sebagai
standar. Sebanyak 5 mL standar atau larutan ekstrak dengan konsentrasi (0, 20,
40, 80 dan 100 µg/mL) ditambahkan dengan 0.3 ml NaNO2 5%. Setelah 5 menit
ditambahkan AlCl3 10 % sebanyak 0.3 ml. Setelah 6 menit ditambahkan 2 ml
NaOH 1M ke dalam campuran, lalu di encerkan dengan akuades sebanyak 2.4 ml.
Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 510 nm. Absorban yang
dihasilkan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dari kurva standar kuersetin.
Total flavonoid dihitung berdasarkan ekuivalen kuersetin
Pengujian aktivitas antikanker dengan metode MTT (Hasan 2013)
Doksorubisin digunakan sebagai kontrol positif dan larutan DMSO
sebagai kontrol negatif. Ekstrak dilarutkan dengan pelarut DMSO untuk dibuat
larutan stok 10%. Larutan stok dilarutkan dalam media RPMI 1640 untuk
membentuk larutan substok 1%. Pembuatan variasi konsentrasi dimulai dari 250,
100, 50, 10 dan 1 μg/ml. Larutan uji sebanyak 20 μL dengan berbagai konsentrasi
tersebut ditambahkan dalam sumur yang sudah diberikan sel kanker payudara
(MCF-7) lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC dengan kandungan 5%
CO2. Jumlah sel yang hidup dari tiap sumur dihitung menggunakan ELISA
Reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai IC50 dibuat dengan membuat
grafik antara persentase sel hidup dengan konsentrasi sampel. Persentase sel mati
dihitung dengan membandingkan persamaan: % Sel mati = (Ab-Au)/Ab x 100%,
dimana Ab: Absorbansi blank (DMSO) dan Au: Absorbansi larutan contoh.
Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Aranda 2011)
Aktivitas antioksidan dari radikal bebas DPPH secara spektrofotometri.
Ekstrak dilarutkan dalam etanol dengan variasi konsentrasi 7.625; 15.125; 32.25;
62.5; 125; 250 dan 500 µg/mL. Dalam campuran uji terkandung 80 µL ekstrak
dan 80 µL dari DPPH (dilarutkan didalam etanol). Didiamkan pada suhu kamar
dan gelap selama 30 menit. Absorbansi kemudian diukur pada panjang
gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC50, dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut:
Nilai IC50 dihiting dengan membuat grafik antara persentase
penghambatan radikal bebas dengan konsentrasi sampel.
Persen penghambatan radikal bebas : (A-B) x 100%
A
Dimana, A adalah absorbansi kontrol negatif (DPPH ditambah etanol)
dan B adalah absorbansi dari sampel (DPPH, etanol ditambah sampel)
Analisis data
Data absorbansi yang diperoleh dari uji aktivitas sitotoksik sel dan
antioksidan dinyatakan dalam IC50 (konsentrasi yang menyebabkan kematian
50% populasi sel). Selanjutnya hasil yang didapatkan pada masing-masing uji
kemudian dianalisis dengan uji Anova menggunakan software SPSS 22.
7
3 HASIL
Rendemen ekstrak cabe jawa
Ektraksi cabe jawa menggunakan pelarut etanol 70 %. Tujuan melakukan
ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat di dalam
simplisia. Hasil rendemen ekstrak cabe jawa dari sembilan lokasi berkisar 7.55 %
hingga 16.4 % (Gambar 1). Hasil rendemen tertinggi berasal dari Paranggupito I
yaitu sebesar 16.4 % dan terkecil berasal dari Sumenep yaitu sebesar 7.55 %.
Gambar 1 Hasil rendemen ekstrak cabe jawa dari berbagai lokasi
Komponen fitokimia ekstrak cabe jawa
Komponen senyawa kimia di dalam ekstrak etanol cabe jawa ditentukan
dengan pengujian fitokimia. Uji fitokimia meliputi uji keberadaan senyawa
alkaloid, flavonoid, tanin. Steroid, dan saponin. Sembilan lokasi memiliki
kandungan senyawa aktif yang tidak jauh berbeda. Lokasi Pamekasan, Sumenep
Giritontro, Paranggupito I, dan II, Karang Asem, Gianyar, Air Naningan I dan II
mendapatkan uji positif pada senyawa alkaloid, steroid, flavonoid, dan saponin
sedangkan Pamekasan dan Sumenep juga memiliki komponenn kimia tanin
(Tabel 1).
Tabel 1. Kandungan fitokimia ekstrak etanol cabe jawa
Lokasi
Pamekasan
Sumenep
Giritontro
Paranggupito I
Paranggupito II
Air Naningan I
Air Naningan II
Karang Asem
Gianyar
Alkaloid
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Golongan Senyawa
Steroid
Flavonoid
Tanin
+
+
+
+
+
+
+++
++
+++
++
+++
++
+++
++
+++
+
++
++
++
++
-
Keterangan : + = hasil positif (sedikit); ++ = sedang; +++ = banyak; - = hasil negatif
Saponin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Identifikasi komponen kimia dari sampel ekstrak cabe jawa menggunakan
LC-MS/MS. Hasil analisis berupa spektrum yang menggambarkan rasio bobot
molekul per muatan (m/z) (Lampiran 10). Sampel yang dianalisis adalah yang
berasal dari Paranggupito I, Giritontro dan Air Naningan II. Sampel tersebut
dianalisi berdasarkan uji sebelumnya yang menunjukkan paling baik pada setiap
uji. Hasil kromatogram dari ketiga sampel disajikan pada table 2.
Tabel 2 Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Lokasi Sampel
Waktu Retensi
Rumus Molekul
Paranggupito I
Giritontro
Air Naningan II
5.71
6.56
32.97
4.51
5.026
25.470
30.410
6.22
29.729
31.092
32.966
C15H12ClN30
C20H23NO4
C17H18F1N3O3
C7H51NO14
C15H12ClN30
C49H75N13O12
C19H22FN303
C20H33N3O4
C11H14ClN3O4
C49H75N13O12
C15H10O6
Berat Molekul
(m/z)
285.07
341.163
331.133
853.330
285.0667
1037.658
359.1645
379.247
382.983
1037.566
286.048
Total senyawa fenolik
Kandungan fenolik total pada masing-masing ekstrak dinyatakan sebagai
ekuivalen asam galat atau Gallic Acid Equivalent (GAE). Asam galat GAE
merupakan acuan umum untuk mengukur sejumlah senyawa fenolik yang terdapat
dalam suatu bahan. Asam galat digunakan sebagai standar, konsentrasi yang
digunakan, yaitu 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 35 mg/L, dengan persamaan kurva
standar y = 0.0352x + 0.0325 dengan R2= 0.9923.
Perlakuan sampel dibuat sama dengan metode pembuatan kurva standar.
Total fenolik dihitung berdasarkan nilai ekuivalen asam galat. Data hasil
perhitungan, yang memiliki total fenolik tertinggi adalah ekstrak cabe jawa yang
berasal dari Giritontro yaitu 41.19 mg GAE/g. Kemudian tertinggi ke dua
Parangguito I, dilanjutkan dengan Paranggupito II, Karang Asem, Sumenep,
Gianyar, Pamekasan, Air Naningan I dan Air Naningan II dengan total fenolik
berturut-turut sebagai berikut 39.35; 36.44; 29.53; 26.72; 24.57; 23.58; 23.13 dan
21.01 mg GAE/g (Gambar 2).
Hasil uji statistika terhadap total senyawa fenolik menunjukkan perbedaan
yang nyata (p
CABE JAWA SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MCF-7
YANG BERASAL DARI BERBAGAI LOKASI DI INDONESIA
KRISTINA MULIA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS SUMBER INFORMASI
SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Aktivitas
Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa Secara In Vitro Terhadap Sel
MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di Indonesia adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Kristina Mulia
NIM G851130271
RINGKASAN
KRISTINA MULIA. Aktivitas Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa
Secara In Vitro Terhadap Sel MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di
Indonesia. Dibimbing oleh SURYANI dan AKHMAD ENDANG ZAINAL
HASAN.
Kanker adalah penyakit mematikan yang menempati posisi kedua setelah
penyakit jantung. Salah satu penyebab penyakit kanker adalah radikal bebas yang
mengakibatkan stress oksidatif pada manusia. Antioksidan adalah senyawa yang
dapat mengurangi stress oksidatif. Aktivitas antioksidan erat hubungannya dengan
aktivitas antikanker. Diketahui bahwa selain sebagai analgetik, afrosidiak cabe
jawa juga berpotensi sebagai antikanker.
Penelitian ini mengkaji potensi antikanker dan antioksidan dari ekstrak
etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan lokasi di Indonesia yaitu Pamekasan,
Sumenep, Giritontro, Paranggupito, Air Naningan, Karang Asem dan Gianyar.
Metode yang digunakan dalam penelitian ini dimulai dengan ekstraksi cabe jawa
menggunakan etanol 70%, pengujian fitokimia, penentuan total fenol dan total
flavonoid, identifikasi senyawa kimia dengan menggunakan LC-MS/MS,
pengujian antikanker menggunakan metode MTT terhadap sel kanker payudara
MCF-7 dan pengujian antioksidan dengan menggunakan metode DPPH.
Ekstrak etanol cabe jawa menunjukkan aktivitas antioksidan paling baik
terhadap radikal bebas 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil (metode DPPH) berasal dari
lokasi Paranggubito I yaitu sebesar 217.63 µg/mL. Toksisitas terhadap sel kanker
payudara MCF-7 dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5-dipeniltetrazolium bromida yang terbaik berasal dari daerah berasal dari
daerah Air Naningan II yaitu sebesar 32.34 µg/mL. Identifikasi senyawa
menggunakan LC-MS ekstrak etanol cabe jawa mengandung senyawa paclitaxel
dan piperin.
Kata Kunci : Antikanker, Antioksidan, Piper retrofractum Vahl., Sel MCF-7
SUMMARY
KRISTINA MULIA. Anticancer Activity and Antioxidant Extract Java Chili
Extract In Vitro Against MCF-7 Cells Coming from Various Locations in
Indonesia. Supervised by SURYANI and AKHMAD ENDANG ZAINAL
HASAN.
Cancer is a deadly disease that ranks the second after heart disease. One of
the causes of cancer is free radicals causing oxidative stress in humans.
Antioxidant is compound that can reduce oxidative stress. The antioxidant activity
is closely connected with anticancer activity. It is known that in addition to being
an analgesic, aphrodisiac of Java chili also has potential as anticancer.
This study examined the potential anticancer and antioxidant from the
ethanol extract of Java chili from nine locations in Indonesia, namely Pamekasan,
Sumenep, Giritontro, Paranggupito, Air Naningan, Karang Asem and Gianyar.
The method used in this study began with the extraction of Java chili using
ethanol 70%, phytochemical testing, determination of total phenol and total
flavonoids, identification of chemical compounds using LC-MS/MS, anticancer
testing using MTT method on MCF-7 breast cancer cell line and antioxidant
testing using DPPH.
Java chili ethanol extract shows that the good antioxidant activity on free
radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH method) was coming from
Paranggubito I by 217.63 µg/mL. Of the toxicity on MCF-7 breast cancer cells
using MTT method (3-(4.5-dimetiltiazol-2-yl)-2.5-dipeniltetrazolium bromide, the
best was coming from Air Naningan II by 32.34 µg/mL. The identification of
compounds using LC-MS of Java chili ethanol extract contains paclitaxel and
piperine compounds.
Key words: Anticancer, antioxidant, Piper retrofractum Vahl., MCF-7 Cell
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AKTIVITAS ANTIKANKER DAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK
CABE JAWA SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MCF-7
YANG BERASAL DARI BERBAGAI LOKASI DI INDONESIA
KRISTINA MULIA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji luar komisi pada ujian tesis : Dr Mega Safithri SSi MSi
PRAKATA
Alhamdulillahi Rabbil „Alamin, penulis panjatkan kehadirat Allah SWT
yang telah memberikan petunjuk dan kemudahan dalam menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul “Aktivitas Antikanker dan Antioksidan Ekstrak Cabe Jawa
Secara In Vitro Terhadap Sel MCF-7 yang Berasal dari Berbagai Lokasi di
Indonesia”.
Penulis banyak sekali mendapatkan dukungan moral maupun material dari
berbagai pihak selama menjalani perkuliahan hingga terselesainya tesis ini.
Penulis dengan segala kerendahan hati menyampaikan ucapan terima kasih
kepada Ibu Dr Suryani SP M.Sc sebagai ketua komisi pembimbing dan Bapak Dr
Ir Akhmad Endang Zainal Hasan M.Si selaku anggota komisi pembimbing yang
telah memberikan saran dan bimbingannya dalam menyelesaikan tesis ini.
Terimakasih atas Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN)
yang diperoleh dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun
2013.
Penulis Mengucapkan terimakasih kepada keluarga tercinta (Ayah, Ibu,
Kartiko Rusadi) yang telah memberikan do‟a, semangat dan dukungannya.
Mahasiswa Pascasarjana Biokimia angkatan 2013 atas dukungan dan bantuannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2015
Kristina Mulia
DAFTAR ISI
..........................................................................................................................................
DAFTAR TABEL ................................................................................................ vi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi .
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ vi .
1 PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
Latar Belakang............................................................................................ 1
Rumusan Masalah ...................................................................................... 2
Tujuan Penelitian ........................................................................................ 2
Manfaat Penelitian ...................................................................................... 2
Ruang Lingkup Penelitian .......................................................................... 3
2 METODE PENELITIAN .................................................................................. 4
Waktu dan Tempat....................................................................................... 4
Alat dan Bahan ............................................................................................ 4
Prosedur Penelitian ...................................................................................... 4
Analisi Data ................................................................................................. 6
3 HASIL ............................................................................................................... 7
Rendemen Cabe Jawa .................................................................................. 7
Komponen Fitokimia Ekstrak Cabe Jawa ................................................... 7
Komponen Kimia Hasil Uji LC-MS/MS ..................................................... 8
Total Fenolik ............................................................................................... 8
Total Flavonoid ........................................................................................... 9
Aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH.................................... 10
Aktivitas antikanker terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT ................. 11
4 PEMBAHASAN................................................................................................ 13
Rendemen Cabe Jawa .................................................................................. 13
Komponen Fitokimia ................................................................................... 13
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS ....................................................... 14
Total Fenolik ............................................................................................... 15
Total Flavonoid ........................................................................................... 15
Aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH.................................... 16
Aktivitas antikanker terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT ................. 17
Hubungan antara IC50 antioksidan dengan antikanker ................................ 18
5 SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 19
Simpulan ...................................................................................................... 19
Saran ............................................................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
20
23
38
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
Kandungan kimia ekstrak etanol cabe jawa
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Aktivitas antioksidan
Aktivitas sitotoksik
7
8
10
11
DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
4.
Hasil rendemen ekstrak cabe jawa
Kandungan total fenolik tiap sampel
Kandungan total flavonoid tiap sampel
Kanker payudara MCF-7
7
9
10
12
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Bagan alir penelitian
--------------------------- 23
Ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 24
Rendemen ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 24
--------------------------- 25
Contoh perhitungan ekstrak etanol cabe jawa
Kandungan kimia ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 26
Absorbansi standar asam galat
--------------------------- 27
Gambar kurva standar asam galat
--------------------------- 27
Kadar total fenolik ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 28
--------------------------- 29
Absorbansi standar kuersetin
Gambar kurva standar kuersetin
--------------------------- 29
Kadar total flavonoid ekstrak etanol cabe jawa --------------------------- 30
--------------------------- 31
Hasil kromatogram LC-MS
Aktivitas antikanker ekstrak etanol cabe jawa
--------------------------- 36
Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etanol cabe jawa -------------------- 36
Aktivitas antioksidan ekstrak etanol cabe jawa --------------------------- 37
Contoh perhitungan nilai IC50 aktivitas antioksidan ekstrak cabe jawa -- 37
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Kanker menjadi masalah kesehatan utama baik di negara maju maupun di
negara berkembang. Keberadaan makanan cepat saji, rokok, alkohol dan
kegemukan merupakan faktor resiko tinggi penyebab terjadinya penyakit kanker.
Pekerja di sektor industri, pertanian, dan tenaga kesehatan di rumah sakit sering
memakai bahan-bahan kimia yang dapat menyebabkan penyakit kanker, banyak di
antara mereka yang tidak memakai alat pelindung diri sehingga tubuh kontak
langsung dengan bahan-bahan tersebut. Bila hal ini berlangsung lama dapat
berakibat timbulnya kanker.
Kanker adalah tumor ganas yang ditandai dengan pertumbuhan abnormal
sel-sel tubuh. Menurut laporan WHO, terdapat lebih dari 10 juta kasus kanker
pertahun di dunia. Penyakit kanker di Indonesia merupakan penyebab kematian
ke-6. Penyakit kanker di Amerika Serikat merupakan penyebab kematian kedua
setelah penyakit kardiovaskular. (Tjindarbumi & Mangunkusumo 2002). Kanker
payudara termasuk jenis kanker yang paling sering diderita wanita disamping
kanker kulit dan merupakan penyebab kematian kedua setelah kanker paru.
Kanker payudara di Amerika Serikat menduduki peringkat pertama (32%) dan
kematian karena kanker jenis ini mencapai 18% (King, 2000). Kanker payudara di
Indonesia menduduki peringkat kedua setelah kanker leher rahim (serviks) dan
kasusnya mencapai 17.77% (Tjindarbumi & Mangunkusumo 2002).
Salah satu penyebab penyakit kanker adalah radikal bebas yang
menyerang sel tubuh manusia. Radikal bebas diduga merupakan penyebab
kerusakan sel yang mendasari timbulnya penyakit kanker termasuk kanker
payudara (Risky & Suyatno 2014). Senyawa yang dapat menunda, menghambat
atau mencegah oksidasi bahan atau senyawa yang mudah teroksidasi oleh radikal
bebas dan mengurangi stres oksidatif adalah antioksidan (Dai 2010). Antioksidan
telah terbukti bermanfaat dalam pencegahan sel kanker (Chaudhary 2015).
Penelitian tentang obat kanker telah banyak dilakukan. Salah satunya adalah
kemoterapi dan penggunaan obat-obatan untuk menghambat tumbuhnya sel
kanker. Penggunaan obat seperti doksorubisin merupakan salah satu cara untuk
mengatasi perkembangan kanker dan mengurangi pembentukan kanker baru. Efek
samping dari pengobatan dengan doksorubisin ini adalah terjadinya kerontokan
rambut, jantung berdebar, dan menurunnya jumlah sel darah putih sebagai agen
pertahanan tubuh. Salah satu tantangan dalam pengobatan kanker adalah
meningkatkan efektivitas dan mengurangi buruknya pengaruh pengobatan utama.
Upaya yang dilakukan adalah menemukan dan mengembangkan obat berbasis
bahan alam (herbal), salah satu diantaranya adalah cabe jawa (Budiman et al.
2013).
Cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) merupakan tanaman penghasil
rempah dan fitofarmaka yang penting baik ditinjau dari pemenuhan kebutuhan
bumbu dan obat tradisional (Soleh 2003). Cabe jawa diketahui memiliki aktivitas
antikanker. Ekowati et al. (2012) menunjukkan bahwa jahe, cabe jawa dan
kombinasi jahe dan cabe jawa memiliki aktivitas sitotoksik pada sel myeloma
dengan IC50 (Inhibitory Concentration 50%) dari masing-masing 28, 36, dan 55
2
mg/ml dan sel line WiDr dengan masing-masing IC50 74, 158, dan 64 mg/ml.
Hasil penelitian tersebut membuktikan bahwa jahe (Zingiber officinale), cabe
jawa (Piper retrofractum) dan kombinasinya menunjukkan aktivitas sitotoksik,
induksi apoptosis dan ekspresi p53 dari sel HeLa, T47D (Tumor 47 Ductal), dan
sel line MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7).
Serbuk dari buah cabe jawa di Madura biasa dibubuhkan ke dalam
minuman seperti teh, susu, dan kopi (Djauhariya & Rosman 2008). Penduduk
Ulias di Ambon menggunakan buah cabe jawa sebagai rempah pengganti cabe
rawit (Heyne 1987). Cabe jawa merupakan salah satu tanaman obat unggulan
untuk dilakukan uji klinik (Dewoto 2007). Penelitian senyawa bioaktif tumbuhan
obat dan pemanfaatannya akan semakin meningkat termasuk cabe jawa (Evrizal
2013). Dilihat dari produksi, buah cabe jawa tersebar di beberapa provinsi di
Indonesia. Sentra produksi buah cabe jawa adalah Jawa Timur dan Lampung
(Evrizal 2013).
Penelitian yang telah dilakukan diduga terdapat korelasi positif antara
aktivitas antioksidan dan aktivitas antikanker. Melihat persebaran cabe jawa di
sentra produksi di Indonesia maka, perlu dilakukan penelitian yang menguji
aktivitas sitotoksik ekstrak buah cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) dari
sembilan lokasi di daerah sentra produksi yaitu berasal dari Sumenep dan
Pamekasan (Madura), Paranggupito I, Paranggupito II, Giritontro (Jawa Tengah),
Air Naningan I dan Air Naningan II (Lampung), Karang Asem dan Gianyar (Bali)
terhadap sel kanker payudara MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7), dan
aktivitas antioksidan.
Perumusan masalah
Cabe jawa memiliki potensi sebagai obat-obatan herbal yang dapat
dikembangkan sebagai alternatif pengobatan kanker yang aman. Beberapa
penelitian telah menguji aktivitas sitotoksik ekstrak cabe jawa pada beberapa sel
kanker tetapi pengujian aktivitas sitotoksik dan antioksidan terhadap sel kanker
payudara MCF-7 dari berbagai lokasi di Indonesia belum dilakukan, maka
penelitian ini memanfaatkan ekstrak cabe jawa sebagai agen antikanker dan
antioksidan yang berasal dari berbagai lokasi sentra produksi di Indonesia.
Pemanfaatan cabe jawa tersebut diharapkan dapat menjadi solusi alternatif sebagai
obat antikanker.
Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah
1. ekstraksi dan identifikasi komponen kimia ekstrak cabe jawa
2. pengujian kemampuan aktivitas sitotoksik dan aktivitas antioksidan dari cabe
jawa.
Manfaat penelitian
1. hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang
cabe jawa sebagai antikanker dan gambaran kepada masyarakat luas terutama
3
dalam eksplorasi serta penemuan senyawa aktif dari bahan alam sebagai
pengobatan herbal yang akan dipublikasikan dalam jurnal ilmiah.
2. secara khusus dapat mengetahui kemampuan aktivitas sitotoksik dan aktivitas
antioksidan cabe jawa.
Ruang lingkup penelitian
Penelitian ini mencakup ekstraksi etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan
lokasi di Indonesia, uji fitokimia, identifikasi menggunakan LC-MS/MS
penentuan total fenolik, penentuan total flavonoid, uji antikanker dan uji
antioksidan. Ekstrak etanol cabe jawa diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap sel
kanker MCF-7 dengan menggunakan metode MTT dan pengujian aktivitas
antioksidan menggunakan metode DPPH.
4
2 METODE
Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia, FMIPA IPB dan
Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata IPB. Penelitian dilakukan selama enam
bulan dari bulan Agustus 2014 sampai dengan bulan Februari tahun 2015.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneltian ini adalah buah cabe jawa
(Piper rectrofractum) dari berbagai lokasi sentra produksi yaitu Sumenep dan
Pamekasan (Madura), Paranggupito I, Paranggupito II, Giritontro (Jawa Tengah),
Air Naningan I dan Air Naningan II (Lampung), Karang Asem dan Gianyar
(Bali), pelarut DMSO, etanol 70 %, amonia, kloroform, larutan H2SO4,
CH3COOH, HCl pekat, dietilester, bubuk Mg, amilalkohol, FeCl3 1%, AlCl3, Naasetat, dan pereaksi analisis fitokimia, DPPH, doksorubisin, vitamin E (αtokoferol) dan air suling.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar, inkubator,
kulkas, pipet mikro, rotary evaporator, Shaker, pemanas gelombang mikro, plate
96 sumuran, LC-MS/MS, spektrofotometer UV-Vis, ELISA reader, dan peralatan
gelas lainnya.
Prosedur Penelitian
Ekstraksi cabe jawa (Hasan 2013)
Sebanyak 20 g serbuk cabe jawa berukuran 60 mesh dipanaskan dengan
pemanas gelombang mikro (frekuensi 2.450 MHz dan daya 800 Watt) selama 5
menit, dimaserasi dengan etanol 70% 1:20, ditutup sambil diaduk dengan orbital
shaker selama 18 jam, lalu disaring. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan
menggunakan rotavapor pada suhu 50±2 0C selama tiga jam atau hingga air dan
etanol menguap sempurna. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang dan
dihitung rendemennya. Hasil ekstraksi disimpan dalam botol gelap dan
ditempatkan di ruang yang tidak terkena sinar matahari langsung.
Rendemen ditentukan dengan rumus sebagai berikut : Rendemen (%) =
(bobot hasil ekstraksi/bobot cabe jawa) x 100.
Pengujian kualitatif komponen kimia (Harborne 1987)
Uji kualitatif cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.) meliputi uji alkaloid,
flavonoid, terpenoid, steroid, saponin dan tannin.
Uji alkaloid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan dua tetes ammonia dan 5 ml kloroform lalu disaring. Filtrat hasil
5
penyaringan ditambahkan 1 ml H2SO4 2 M, kemudian fraksi asam ditambahkan
pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Keberadaan alkaloid dalam cabe jawa
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah pada pereaksi Dragendorf,
endapan putih pada pereaksi Meyer dan endapan coklat pada pereaksi Wagner.
Uji triterpenoid dan steroid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukan dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan etanol panas sebanyak 5 ml lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan
dievaporasi, kemudian ditambahkan 1 ml dietileter. Setelah diaduk hingga
homogen dengan vortex, lalu ditambahkan 1 ml H2SO4 pekat dan 1 ml
CH3COOH. Terbentuknya warna merah atau kelabu menunjukkan adanya
triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid dalam cabe jawa.
Uji flavonoid
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 5 ml air, lalu dipanaskan selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan
penyaringan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan bubuk Mg, 1 ml HCl pekat, dan
1 ml amilalkohol. Kemudian diaduk sempurna sehingga timbul lapisan yang
berbeda. Warna yang terbentuk antara dua larutan amilalkohol menunjukkan
adanya flavonoid.
Uji tannin
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan 5 ml air dan disaring. Kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat
hasil penyaringan ditambahkan 3 tetes FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru atau
hijau kehitam-hitaman menunjukkan adanya tanin dalam cabe jawa.
Uji saponin
Sebanyak 100 mg cabe jawa dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan 5 ml air dan disaring. Kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat
hasil penyaringan dikocok dengan sempurna lalu dibiarkan selama 10 menit.
Terbentuknya buih yang stabil menunjukkan adanya saponin dalam cabe jawa.
Identifikasi senyawa kimia cabe jawa dengan LC-MS/MS (Blazies et al. 2011)
Ekstrak etanol cabe jawa yang berasal dari sembilan lokasi di Indonesia di
analisis menggunakan Liquid Chromatograph-tanden Mass Spectrometry (LCMS/MS/MS) dengan tipe QMicro QAA 842. Sampel berupa cairan dimasukkan
ke fase gerak yang ada pada kolom LC dengan laju alir 0.2 mL/menit. Temperatur
kolom yang digunakan adalah 400C dan waktu akhir 35 menit. Pemisahan
senyawa kimia terjadi di dalam kolom dengan bantuan pompa. Hasil analisis
dengan LC dilanjutkan MS untuk identifikasi komponen kimia. Jenis analisis
massa yang digunakan adalah quadrupole dengan modus scan selama 5 detik.
Spektrum yang diperoleh menunjukan rasio massa dengan muatan (m/z).
Penentuan total fenolik (Pourmorad 2006)
Total fenol ditentukan oleh reagen Follin Ciocalteu. Ekstrak etanol cabe
jawa atau asam galat (standar senyawa fenolik) dicampur dengan reagen Folin
Ciocalteu 10% dan Na2CO3 1M. Campuran didiamkan selama 15 menit dan total
fenol diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 765 nm.
Kurva standar dibuat dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 35 µg/mL
larutan asam galat dalam metanol : Air 50:50 (v/v). Total nilai fenol yang
dinyatakan dalam setara asam galat (mg g-1 massa kering).
6
Penentuan total flavonoid (Sahu & Saxena 2013)
Kandungan total flavonoid ditentukan dengan pengujian menggunakan
AlCl3 yang diukur dengan metode pewarnaan. Kuersetin digunakan sebagai
standar. Sebanyak 5 mL standar atau larutan ekstrak dengan konsentrasi (0, 20,
40, 80 dan 100 µg/mL) ditambahkan dengan 0.3 ml NaNO2 5%. Setelah 5 menit
ditambahkan AlCl3 10 % sebanyak 0.3 ml. Setelah 6 menit ditambahkan 2 ml
NaOH 1M ke dalam campuran, lalu di encerkan dengan akuades sebanyak 2.4 ml.
Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 510 nm. Absorban yang
dihasilkan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dari kurva standar kuersetin.
Total flavonoid dihitung berdasarkan ekuivalen kuersetin
Pengujian aktivitas antikanker dengan metode MTT (Hasan 2013)
Doksorubisin digunakan sebagai kontrol positif dan larutan DMSO
sebagai kontrol negatif. Ekstrak dilarutkan dengan pelarut DMSO untuk dibuat
larutan stok 10%. Larutan stok dilarutkan dalam media RPMI 1640 untuk
membentuk larutan substok 1%. Pembuatan variasi konsentrasi dimulai dari 250,
100, 50, 10 dan 1 μg/ml. Larutan uji sebanyak 20 μL dengan berbagai konsentrasi
tersebut ditambahkan dalam sumur yang sudah diberikan sel kanker payudara
(MCF-7) lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC dengan kandungan 5%
CO2. Jumlah sel yang hidup dari tiap sumur dihitung menggunakan ELISA
Reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai IC50 dibuat dengan membuat
grafik antara persentase sel hidup dengan konsentrasi sampel. Persentase sel mati
dihitung dengan membandingkan persamaan: % Sel mati = (Ab-Au)/Ab x 100%,
dimana Ab: Absorbansi blank (DMSO) dan Au: Absorbansi larutan contoh.
Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Aranda 2011)
Aktivitas antioksidan dari radikal bebas DPPH secara spektrofotometri.
Ekstrak dilarutkan dalam etanol dengan variasi konsentrasi 7.625; 15.125; 32.25;
62.5; 125; 250 dan 500 µg/mL. Dalam campuran uji terkandung 80 µL ekstrak
dan 80 µL dari DPPH (dilarutkan didalam etanol). Didiamkan pada suhu kamar
dan gelap selama 30 menit. Absorbansi kemudian diukur pada panjang
gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC50, dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut:
Nilai IC50 dihiting dengan membuat grafik antara persentase
penghambatan radikal bebas dengan konsentrasi sampel.
Persen penghambatan radikal bebas : (A-B) x 100%
A
Dimana, A adalah absorbansi kontrol negatif (DPPH ditambah etanol)
dan B adalah absorbansi dari sampel (DPPH, etanol ditambah sampel)
Analisis data
Data absorbansi yang diperoleh dari uji aktivitas sitotoksik sel dan
antioksidan dinyatakan dalam IC50 (konsentrasi yang menyebabkan kematian
50% populasi sel). Selanjutnya hasil yang didapatkan pada masing-masing uji
kemudian dianalisis dengan uji Anova menggunakan software SPSS 22.
7
3 HASIL
Rendemen ekstrak cabe jawa
Ektraksi cabe jawa menggunakan pelarut etanol 70 %. Tujuan melakukan
ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat di dalam
simplisia. Hasil rendemen ekstrak cabe jawa dari sembilan lokasi berkisar 7.55 %
hingga 16.4 % (Gambar 1). Hasil rendemen tertinggi berasal dari Paranggupito I
yaitu sebesar 16.4 % dan terkecil berasal dari Sumenep yaitu sebesar 7.55 %.
Gambar 1 Hasil rendemen ekstrak cabe jawa dari berbagai lokasi
Komponen fitokimia ekstrak cabe jawa
Komponen senyawa kimia di dalam ekstrak etanol cabe jawa ditentukan
dengan pengujian fitokimia. Uji fitokimia meliputi uji keberadaan senyawa
alkaloid, flavonoid, tanin. Steroid, dan saponin. Sembilan lokasi memiliki
kandungan senyawa aktif yang tidak jauh berbeda. Lokasi Pamekasan, Sumenep
Giritontro, Paranggupito I, dan II, Karang Asem, Gianyar, Air Naningan I dan II
mendapatkan uji positif pada senyawa alkaloid, steroid, flavonoid, dan saponin
sedangkan Pamekasan dan Sumenep juga memiliki komponenn kimia tanin
(Tabel 1).
Tabel 1. Kandungan fitokimia ekstrak etanol cabe jawa
Lokasi
Pamekasan
Sumenep
Giritontro
Paranggupito I
Paranggupito II
Air Naningan I
Air Naningan II
Karang Asem
Gianyar
Alkaloid
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Golongan Senyawa
Steroid
Flavonoid
Tanin
+
+
+
+
+
+
+++
++
+++
++
+++
++
+++
++
+++
+
++
++
++
++
-
Keterangan : + = hasil positif (sedikit); ++ = sedang; +++ = banyak; - = hasil negatif
Saponin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Identifikasi komponen kimia dari sampel ekstrak cabe jawa menggunakan
LC-MS/MS. Hasil analisis berupa spektrum yang menggambarkan rasio bobot
molekul per muatan (m/z) (Lampiran 10). Sampel yang dianalisis adalah yang
berasal dari Paranggupito I, Giritontro dan Air Naningan II. Sampel tersebut
dianalisi berdasarkan uji sebelumnya yang menunjukkan paling baik pada setiap
uji. Hasil kromatogram dari ketiga sampel disajikan pada table 2.
Tabel 2 Komponen kimia hasil uji LC-MS/MS
Lokasi Sampel
Waktu Retensi
Rumus Molekul
Paranggupito I
Giritontro
Air Naningan II
5.71
6.56
32.97
4.51
5.026
25.470
30.410
6.22
29.729
31.092
32.966
C15H12ClN30
C20H23NO4
C17H18F1N3O3
C7H51NO14
C15H12ClN30
C49H75N13O12
C19H22FN303
C20H33N3O4
C11H14ClN3O4
C49H75N13O12
C15H10O6
Berat Molekul
(m/z)
285.07
341.163
331.133
853.330
285.0667
1037.658
359.1645
379.247
382.983
1037.566
286.048
Total senyawa fenolik
Kandungan fenolik total pada masing-masing ekstrak dinyatakan sebagai
ekuivalen asam galat atau Gallic Acid Equivalent (GAE). Asam galat GAE
merupakan acuan umum untuk mengukur sejumlah senyawa fenolik yang terdapat
dalam suatu bahan. Asam galat digunakan sebagai standar, konsentrasi yang
digunakan, yaitu 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 35 mg/L, dengan persamaan kurva
standar y = 0.0352x + 0.0325 dengan R2= 0.9923.
Perlakuan sampel dibuat sama dengan metode pembuatan kurva standar.
Total fenolik dihitung berdasarkan nilai ekuivalen asam galat. Data hasil
perhitungan, yang memiliki total fenolik tertinggi adalah ekstrak cabe jawa yang
berasal dari Giritontro yaitu 41.19 mg GAE/g. Kemudian tertinggi ke dua
Parangguito I, dilanjutkan dengan Paranggupito II, Karang Asem, Sumenep,
Gianyar, Pamekasan, Air Naningan I dan Air Naningan II dengan total fenolik
berturut-turut sebagai berikut 39.35; 36.44; 29.53; 26.72; 24.57; 23.58; 23.13 dan
21.01 mg GAE/g (Gambar 2).
Hasil uji statistika terhadap total senyawa fenolik menunjukkan perbedaan
yang nyata (p