Karakterisasi dan Pemurnian Enzim Selulase Kapang Endofit dari Lamun (Enhalus sp.)

i

KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN ENZIM SELULASE
KAPANG ENDOFIT DARI LAMUN (Enhalus sp.)

YULIA OKTAVIA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

ii

i

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Karakterisasi dan
Pemurnian Enzim Selulase Kapang Endofit dari Lamun (Enhalus sp.) adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan

dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Insitut
Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014
Yulia Oktavia
NIM C351110191

ii

RINGKASAN
YULIA OKTAVIA. Karakterisasi dan Pemurnian Enzim Selulase Kapang Endofit
dari Lamun (Enhalus sp.). Dibimbing oleh TATI NURHAYATI dan
KUSTIARIYAH TARMAN.
Selulase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu mendegradasi
selulosa menjadi senyawa yang lebih sederhana. Selulase terdiri atas enzim
endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukanase. Enzim selulase selama ini

dihasilkan oleh kapang yang diisolasi dari organisme dan ekosistem darat, padahal
kapang yang diisolasi dari organisme laut juga memiliki potensi untuk
menghasilkan selulase namun keberadaannya belum banyak dikaji. Selulase pada
penelitian ini dihasilkan oleh kapang endofit yang diisolasi dari lamun
(Enhalus sp.). Substrat yang digunakan yaitu limbah agar-agar. Penelitian ini
bertujuan untuk menentukan waktu produksi, mengkarakterisasi dan memurnikan
enzim selulase kapang endofit yang diisolasi dari lamun (Enhalus sp.).
Penelitian dilakukan dalam tiga tahap yaitu penentuan konsentrasi limbah
agar-agar dan waktu inkubasi kapang penghasil selulase, karakterisasi ekstrak
kasar enzim selulase, dan pemurnian enzim selulase. Parameter yang diuji yaitu
aktivitas endoglukanase, β-glukosidase, dan selulase total.
Aktivitas selulase tertinggi yaitu aktivitas endoglukanase dengan
penambahan 1,5% limbah agar-agar yang diinkubasi selama sembilan hari.
Selulase bekerja optimum pada pH 4 dan suhu 60 oC dengan substrat CMC.
Perhitungan kinetika enzim menunjukkan nilai Km enzim endoglukanase sebesar
0,244% dengan Vmaks 0,052 U/mL. Ion logam Hg2+ dengan konsentrasi 5 mM
menghambat aktivitas enzim endoglukanase hingga 74%. Pengendapan untuk
mendapatkan aktivitas spesifik tertinggi yaitu penambahan aseton dengan
kejenuhan 10%. Pemurnian dilakukan menggunakan kromatografi filtrasi gel
Sephadex G-100. Hasil penentuan bobot molekul enzim endoglukanase diperoleh

empat bobot molekul yaitu 217,96 kDa, 163,15 kDa, 129,41 kDa, dan 76,84 kDa.
Kelipatan pemurnian enzim endoglukanase setelah pemurnian meningkat
17,571 kali
Kata kunci : kapang endofit, lamun, limbah agar-agar, selulase

iii

SUMMARY
YULIA OKTAVIA. Characterization and purification of cellulase isolated from
seagrass (Enhalus sp.) endophytic fungus. Supervised by TATI NURHAYATI
and KUSTIARIYAH TARMAN.
Cellulase is an extracellular enzyme that can degrading cellulose into simple
compound. Cellulase consist of endoglucanase, exoglucanase, and β-glucanase.
Cellulase is commonly produced by fungi that isolated from organisms and
terrestrial ecology, while the fungi isolated from marine organisms also have the
potential to produce cellulase but the study still less. In this research cellulase was
produced by endophytic fungi that isolated from seagrass (Enhalus sp.). The
substrates used to produce this enzyme was waste of agar industry. The objectives
of this reseach were to determine the period of cellulase production, characterize
and purify the fungal cellulase.

The research was conducted in three steps including determining the
concentration of agar waste and incubation period of fungi to produce cellulase,
characterization of the crude extract of cellulase, and purification of cellulase.
Parameters of assay were endoglucanase, β-glucosidase, and cellulase total
activity.
The highest cellulase activity was represented as endoglucanase activity by
the addition of 1.5% waste of agar industry incubated for nine days. Cellulase
works optimally at pH 4 on 60 °C with 1% of CMC substrate. Determination of
enzyme kinetics showed Km value of endoglucanse obtained for 0.244% with Vmax
value 0.052 U/mL. Ion Hg2+ 5 mM inhibited endoglucanase activity to 74%. The
best precipitation to obtain the highest specific activity by addition aceton on 10%
saturated. Purification was done by gel filtration chromatography Sephadex G-100
The results of the determination the molecular weights endoglucanase obtained
four molecular weights namely 217.96 kDa, 163.15 kDa, 129.41 kDa, and
76.84 kDa. Purify of endoglucanase increase to 17,571 fold.
Keywords : agar waste, cellulase, endophytic fungi, seagrass

iv

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

v

KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN ENZIM SELULASE
KAPANG ENDOFIT DARI LAMUN (Enhalus sp.)

YULIA OKTAVIA

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada

Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

vi

Penguji luar komisi pada ujian tesis: Dr Desniar, SPi, MSi

vii

Judul Tesis
Nama
NIM
Program Studi

: Karakterisasi dan Pemurnian Enzim Selulase Kapang Endofit
dari Lamun (Enhalus sp.)

: Yulia Oktavia
: C351110191
: Teknologi Hasil Perairan

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr Tati Nurhayati SPi, MSi
Ketua

Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Tati Nurhayati SPi, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian : 16 Juni 2014

Tanggal Lulus:

viii

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul
"Karakterisasi dan Pemurnian Enzim Selulase Kapang Endofit dari Lamun
(Enhalus sp.)". Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam menyelesaikan tesis ini, terutama kepada:
1. Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi dan Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi sebagai
dosen pembimbing tesis yang telah senantiasa memberikan arahan dan
bimbingan selama menyelesaikan tesis ini.
2. Bapak yang saya banggakan M. Yusuf AR, ibu yang saya cintai Sri Dahlia,

kakak-kakak yang saya sayangi Layli Diana, Agus Karsa Yudha, dan
M. Adityawarman.
3. Keluarga besar mahasiswa sekolah pascasarjana program studi Teknologi Hasil
Perairan, yang telah memberikan dorongan semangat baik selama penelitian
maupun saat penyusunan tesis ini.
4. Teman-teman dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
5. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan
Kebudayaan Republik Indonesia yang telah membiayai penelitian ini melalui
Program Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi atas nama Ketua Peneliti
Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi dengan judul "Pengembangan Teknologi
Produksi Bioetanol melalui Pemanfaatan Limbah Industri Rumput Laut dengan
Kapang Endofit Indigenous Laut Indonesia" (No. 58/IT3.41.2/L1/SPK/2013).
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penyusunan
tesis ini. Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun.
Semoga tulisan ini bermanfaat bagi pihak-pihak yang memerlukan.

Bogor, Agustus 2014
Yulia Oktavia

ix

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI
ix
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Perumusan Masalah
2
Tujuan
2
2 METODE
4
Waktu dan Tempat

4
Bahan dan Alat
4
Prosedur Kerja
4
Penentuan Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Inkubasi Kapang
Penghasil Selulase
5
Karakterisasi Enzim Selulase
5
Pemurnian Enzim
6
Analisis
6
Pengujian Gula Pereduksi Metode DNS
6
Pengujian Konsentrasi Protein
6
Aktivitas Endoglukanase
7
Aktivitas β-glukosidase
8
Aktivitas Selulase Total
8
Pengukuran Bobot Molekul Enzim dan Zimogram
8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
9
Karakteristik Limbah Agar-agar
9
Pertumbuhan Isolat Kapang EN
10
Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Produksi
11
Karakteristik Ekstrak Kasar Enzim Selulase
14
Nilai pH Optimum Enzim Endoglukanase
14
Suhu Optimum Enzim Endoglukanase
15
Kinetika Enzim Endoglukanase
16
Pengaruh Ion Logam
16
Pemurnian Enzim Endoglukanase
17
Presipitat enzim selulase
17
Enzim Endoglukanase Murni
18
Berat Molekul Enzim dan Aktivitasnya
20
4 SIMPULAN DAN SARAN
21
Simpulan
21
Saran
21
DAFTAR PUSTAKA
22
LAMPIRAN
26
RIWAYAT HIDUP
27

x

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi kimia limbah agar-agar kertas
9
2 Perbandingan selulase isolat kapang EN dengan kapang jenis lainnya
13
3 Kelipatan pemurnian enzim selulase
19

DAFTAR GAMBAR
Halaman
................................................. 3
Roadmap penelitian enzim selulase
Diagram alir penelitian ....................................................................................... 7
Kurva pertumbuhan isolat kapang EN pada media PDB ................................. 10
Aktivitas endoglukanase pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar
terhadap lama waktu produksi ......................................................................... 11
5 Aktivitas β-glukosidase pada beberapa konsentrasi limbah agar agar
kertas terhadap lama waktu produksi .............................................................. 12
6 Aktivitas selulase total pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar kertas
terhadap lama waktu produksi .......................................................................... 12
7 Pengaruh pH terhadap aktivitas endoglukanase ............................................... 14
8 Pengaruh suhu terhadap aktivitas endoglukanase ............................................ 15
9 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim endoglukanase......... 16
10 Kurva Lineaweaver-Burk endoglukanase pada penentuan Km dan Vmaks ........ 16
11 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim endoglukanase ......................... 17
12 Pengaruh kejenuhan aseton terhadap aktivitas endoglukanase ........................ 18
13 Fraksi-fraksi hasil pemurnian filtrasi gel .......................................................... 19
14 Elektroforegram (a) dan zimogram (b) fraksi kromatografi filtrasi gel ........... 21

1
2
3
4

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi media produksi enzim ..................................................................... 26
2 Bahan-bahan untuk pengujian aktivitas selulase ............................................... 26

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Enzim selulase merupakan nama trivial kelompok enzim yang mampu
mengkatalis reaksi hidrolisis selulosa dan turunan selulosa lainnya yang
menghasilkan selooligosakarida (Shallom et al. 2003). Enzim ekstraseluler ini
terdiri atas kompleks endo-β-1,4-glukanase (CMCase, Cx selulase endoselulase,
atau carboxymethyl cellulase), kompleks ekso-β-1,4-glukanase (aviselase,
selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-1,4-glukosidase atau selobiase yang mampu
memutus ikatan β-1,4 glikosidik (Zhou et al. 2008). Enzim selulase banyak
diaplikasikan pada industri pakan ternak, makanan, pertanian, tekstil, deterjen
pencuci, dan industri kertas (Sukumaran et al. 2005). Menurut Mukhejee et al.
(2011), enzim selulase tidak hanya diaplikasikan pada berbagai industri tetapi juga
berperan penting dalam biokonversi biomassa tinggi selulosa menjadi gula dan
bioalkohol.
Beberapa penelitian telah banyak mengkaji produksi selulase baik yang
diisolasi dari makroorganisme maupun mikroorganisme. Menurut Meryandini et al.
(2009), kapang mampu menghasilkan enzim selulase. Onofre et al. (2013)
menyatakan bahwa kapang filamentous merupakan jenis kapang yang paling
banyak digunakan dalam industri untuk menghasilkan enzim selulase. Selama ini
kapang yang memproduksi enzim selulase merupakan kapang yang diisolasi dari
ekologi dan biota darat. Contohnya Rhizopus oryzae yang diisolasi dari tanah di
Jepang (Murashima et al. 2002), Aspergillus flavus S13 dan MS21 yang diisolasi
dari rayap (Purwadaria et al. 2003), Mucor circinelloides yang diisolasi dari tanah
di sekitar pembusukan jagung dan kayu (Saha 2004), Trichoderma harzianum yang
diisolasi dari hutan hujan tropis Amazon (Delabona et al. 2012), dan Fusarium
oxysporum yang diisolasi dari tumbuhan rami yang layu (Yuan et al. 2012).
Kapang yang diisolasi dari biota laut juga memiliki potensi untuk
menghasilkan enzim selulase. Kapang yang diisolasi dari biota laut biasanya berupa
kapang endofit yaitu jenis kapang yang tumbuh di dalam tanaman inangnya tanpa
menyebabkan gejala penyakit terhadap inang dan pertumbuhannya di habitat
melibatkan interaksi yang berjalan terus-menerus antara metabolisme kapang dan
inangnya (Schulz et al. 2002). Enzim selulase kapang endofit yang diisolasi dari
organisme laut keberadaannya belum banyak dikaji lebih lanjut. Berdasarkan
penelitian sebelumnya mengenai screening kapang laut endofit peghasil enzim
selulase, isolat kapang EN yang diisolasi dari lamun Enhalus sp. memiliki indeks
selulolitik tertinggi dengan nilai 1,36 dibandingkan dengan isolat kapang yang
diisolasi dari rumput laut, daun mangrove, lamun, dan spons (Andhikawati et al.
2014).
Enzim selulase banyak digunakan sebagai agen biokonversi biomassa
selulosa dalam berbagai industri. Salah satu pemanfaatan enzim selulase yaitu
untuk menghidrolisis selulosa pada pembuatan bioetanol. Produksi enzim selulase
yang dihasilkan oleh mikroorganisme membutuhkan substrat berupa selulosa yang
berfungsi untuk menginduksi produksi enzim selulase. Substrat yang biasa
digunakan contohnya bagas molases, bonggol jagung, jerami, dan sekam padi.
Substrat tersebut tinggi kandungan lignin yang dapat menghambat produksi enzim

2

sehingga dibutuhkan substrat lain yang rendah kandungan ligninnya. Substrat lain
yang rendah kandungan lignin yaitu limbah industri rumput laut.
Industri pengolahan berbasis rumput laut akan menghasilkan limbah padat
sebanyak 65-75% (Kim et al. 2007). Limbah tersebut diperoleh dari hasil produksi
agar, karagenan, dan alginat. Limbah rumput laut mengandung selulosa yang tinggi.
Selulosa yang terkandung pada limbah pengolahan agar-agar sekitar 27,38-39,45%
(Fithriani et al. 2007), sedangkan limbah pengolahan alginat mengandung selulosa
sebesar 30,27% (Sari et al. 2008). Limbah hasil pengolahan di beberapa industri
pengolahan rumput laut belum dimanfaatkan dan dapat menyebabkan pencemaran,
padahal limbah tersebut dapat dimanfaatkan sebagai substrat penghasil enzim
selulase dan diaplikasikan untuk mendegradasi selulosa limbah menghasilkan
selooligosakarida yang bisa dimanfaatkan untuk pembuatan bioetanol.

Perumusan Masalah
Biomassa dengan kandungan selulosa tinggi yang banyak terdapat di alam
menuntut adanya suatu agen yang mampu mendegradasinya menjadi bentuk lebih
sederhana. Limbah rumput laut merupakan salah satu biomassa yang tinggi
kandungan selulosa. Agen yang mampu mendegradasi selulosa yaitu
mikroorganisme. Mikroorganisme pendegradasi biomassa yang kaya selulosa masih
banyak didominasi oleh jenis kapang selulolitik yang diisolasi dari biota daratan,
padahal kapang laut juga mempunyai potensi yang tidak kalah dengan kapang darat
dalam menghasilkan enzim selulase. Eksplorasi mengenai enzim selulase yang
dihasilkan kapang laut masih sedikit sehingga membuat kapang laut belum dikenal
banyak orang. Oleh karena itu, informasi mengenai enzim selulase yang dihasilkan
kapang laut sangat diperlukan.

Tujuan
Penelitan ini bertujuan menentukan waktu yang tepat untuk memproduksi
enzim selulase, serta mengkarakterisasi dan memurnikan ekstrak kasar enzim
selulase yang dihasilkan oleh kapang isolat EN yang diisolasi dari lamun.

3

Selulase

Sumber karbon

Ekstraksi

Sumber enzim

bagas molases (Mahamud et al. 2012)
jerami padi (Ong et al. 2012)
bonggol jagung dan sekam padi
(Rahmadani et al. 2013)

Rhizopus oryzae diisolasi dari tanah
(Murashima et al. 2002)
Aspergillus flavus S13 dan MS21
diisolasi dari rayap
(Purwadaria et al. 2003)
Mucor circinelloides diisolasi dari
tanah di sekitar pembusukan jagung
dan kayu (Saha 2004),
Trichoderma harzianum diisolasi
dari tanah dan kayu
(Delabona et al. 2012),
Fusarium oxysporum diisolasi dari
tumbuhan rami (Yuan et al. 2012).

Karakterisasi enzim
pH dan suhu optimum
Pengaruh ion logam
Kinetika enzim

Pemurnian enzim
enzim
Macro-preMethl dan Superdex 200
(Murashima et al. 2002)
Sephadex G-100 (Iqbal et al. 2011)
DEAE-Cellulose dan Sephadex G-75
(Annamalai et al. 2012)

Sumber enzim isolat kapang
EN diisolasi dari lamun
(Enhalus sp.)

Sumber karbon
limbah agar-agar

Karakterisasi dan pemurnian
Sephadex G-100

Gambar 1 Roadmap penelitian enzim selulase;

penelitian yang dilakukan

4

2 METODE

Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan November 2012 hingga Maret 2014
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan dan Laboratorium
Bioteknologi II, Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan. Laboratorium Pendidikan dan Layanan Fakultas Kedokteran Hewan
dan Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi kapang endofit EN yang
diisolasi dari lamun Enhalus sp. yang diperoleh dari perairan Pulau Karya,
Kepulauan Seribu, limbah agar-agar kertas yang diperoleh dari Pameungpeuk
Garut, Jawa Barat, media Potato Dextrose Agar (PDA) (Difco), Potato Dextrose
Broth (PDB) (Difco). Medium yang digunakan untuk produksi enzim selulase
terdiri atas KH2PO4 (Merck), urea (Merck), MgSO4.7H2O (Merck), CaCl2.2H2O
(Merck), FeSO4.7H2O (Merck), MnSO4.H2O (Merck), ZnSO4.7H2O (Merck),
CoCl2.6H2O (Merck), Pepton (Oxoid), tween 80 (Merck).
Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian selulase yaitu aseton,
Sephadex G-100 dan bufer sitrat. Bahan kimia untuk analisis aktivitas selulase,
konsentrasi protein dan gula pereduksi meliputi pNPG (Sigma Aldrich), Na2CO3
(Merck), kertas saring (Whatman no 1), Pereaksi Bradford, DNS (Sigma Aldrich),
NaOH ((Merck), Na K Tartat (Merck), Fenol (Merck), Na2SO4 (Merck) dan
glukosa (Merck). Logam-logam yang digunakan untuk karakterisasi enzim selulase
adalah NaCl, KCl, HgCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2. Pereaksi yang digunakan untuk
analisis aktivitas selulase disajikan pada Lampiran 2.
Alat-alat yang digunakan meliputi spektrofotometer UV-VIS, sentrifuse
(Himac CR21G), mikropipet (Gibson), rotary shaker (Wishake), clean bench
(Thermo scientific), alat-alat gelas, seperangkat alat elektroforesis, pisau dan
gunting bedah, pH-meter (Thermo), waterbath inkubator (Yamato BT25).

Prosedur Kerja
Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama yaitu penentuan
konsentrasi limbah agar-agar dan waktu inkubasi kapang penghasil selulase. Tahap
ini meliputi pengujian aktivitas enzim endoglukanase, β-glukosidase dan selulase
total. Tahap kedua yaitu karakterisasi ekstrak kasar enzim selulase yang meliputi
pengujian pH dan suhu optimum, penentuan konsentrasi substrat optimum,
penentuan kinetika enzim, dan pengujian pengaruh ion logam terhadap aktivitas
enzim. Tahap ketiga yaitu pemurnian enzim selulase meliputi penentuan aktivitas
fraksi, penentuan kadar protein fraksi, penentuan bobot molekul enzim, dan
zimogram.

5

Penentuan Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Inkubasi Kapang
Penghasil Selulase
Kapang yang ditumbuhkan pada media PDB diinkubasi selama 7 hari pada
suhu kamar dengan goyangan 120 rpm, kemudian dipindahkan ke labu Erlenmeyer
500 mL yang berisi 200 mL media produksi enzim (Muthuvelayudham dan
Viruthagiri 2006) (Lampiran 1) dengan sumber karbon yaitu limbah agar-agar
dalam beberapa konsentrasi (0,5; 1,0; 1,5; 2,0%) yang diinkubasi dengan goyangan
120 rpm selama 3-21 hari pada suhu kamar. Supernatan sebagai enzim kasar
diperoleh dengan cara sentrifugasi pada 5000 g selama 20 menit pada suhu 4 oC
(Tang et al. 2012). Aktivitas selulase total diukur menurut metode Mandels et al.
(1976), endoglukanase (Mandels et al. 1976), dan β-glukosidase diukur menurut
metode Grover et al. (1977). Pengukuran aktivitas enzim dimulai pada hari ketiga
dengan interval pengamatan setiap tiga hari. Konsentrasi sumber karbon dan waktu
inkubasi yang dapat menghasilkan aktivitas optimum dipakai untuk tahap penelitian
selanjutnya.
Karakterisasi Enzim Selulase
Karakterisasi enzim selulase dilakukan untuk mengetahui pH optimum, suhu
optimum, konsentrasi optimum substrat, kinetika enzim, dan pengaruh beberapa
logam terhadap aktivitas kerja enzim.
Penentuan pH Optimum
Nilai pH optimum enzim selulase ditentukan dengan metode Lee et al.
(2007). Sebanyak 0,5 mL enzim ditambahkan 0,5 mL CMC 1% (b/v) dalam sediaan
50 mM bufer sitrat (pH 3,0-6,0) dan Tris-HCl (pH 7,0-9,0). Campuran dalam pH
bufer yang beragam diinkubasi pada suhu 50 oC selama 30 menit dan aktivitas
selulase diuji dengan metode DNS.
Penentuan Suhu Optimum
Suhu optimum enzim untuk menghidrolisis CMC dalam 50 mM bufer pH
optimum diukur dengan menggunakan metode Lee et al. (2007). Campuran enzim
dan CMC 1% diinkubasi selama 30 menit dengan perbedaan suhu (30-80 oC).
Larutan DNS ditambahkan untuk menghentikan reaksi.
Kinetika Enzim
Kinetika enzim ditentukan menggunakan CMC dengan konsentrasi yang
berbeda yaitu: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25%. Sebanyak 0,5 mL enzim dan 0,5 mL
substrat dalam 50 mM bufer pH optimum diinkubasi selama 30 menit pada suhu
optimum. Jumlah gula pereduksi yang dihasilkan diukur dengan metode DNS. Satu
unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 µmol
glukosa per menit. Konstanta Michaelis-Menten (Km) dan kecepatan maksimum
(Vmaks) ditentukan dengan plot Lineweaver-Burk.
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Selulase (Lee et al. 2007)
Pengaruh berbagai logam terhadap aktivitas selulase diukur dengan sediaan
ion logam. Logam yang digunakan yaitu KCl, NaCl, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, HgCl2.
Konsentrasi setiap bahan aditif yaitu 5 mM. Logam dilarutkan dalam 50 mM bufer

6

sitrat (pH optimum). Campuran dengan berbagai bahan aditif diinkubasi pada suhu
dan pH optimum selama 30 menit.
Pemurnian Enzim
Pemurnian dilakukan untuk menghilangkan pengotor sehingga diperoleh
enzim yang lebih murni dengan aktivitas spesifik yang lebih tinggi. Pemurnian
selulase diawali dengan mengendapkan ekstrak kasar menggunakan aseton dingin
(-20 oC) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80% berdasarkan Scopes (1994).
Pengendapan dilakukan dengan menambahkan aseton ke dalam ekstrak kasar dan
diaduk selama 15 menit kemudian didiamkan selama semalam pada suhu 4 oC.
Pemisahan pelet dilakukan dengan sentrifugasi pada 13000 g selama 10 menit pada
suhu 4 oC. Pelet dilarutkan dalam bufer sitrat 50 mM pH optimum. Enzim tersebut
dimurnikan kembali dengan mengacu pada metode Adekele et al. (2012). Enzim
dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel dengan matriks Sephadex G-100.
Fraksi yang dihasilkan diukur aktivitas dan kadar proteinnya.
Penentuan Berat Molekul dan Aktivitas Enzim
Ekstrak kasar, hasil pengendapan, dan fraksi filtrasi gel diuji menggunakan
elektroforesis untuk mendapatkan elektroforegram dan zimogram guna menentukan
berat molekul enzim selulase dan aktivitas selulolitiknya. Penentuan bobot molekul
dilakukan berdasarkan metode Adeleke et al. (2012) dan zimogram berdasarkan
metode Van Dyk et al. (2010).

Analisis
Pengujian Gula Pereduksi Metode DNS
Penentuan gula pereduksi dilakukan dengan cara spektrofotometri
menggunakan pereaksi DNS dan gula standar glukosa (Miller 1960). 0,5 mL
larutan gula standar dan 0,5 mL bufer direaksikan dengan 1,5 mL pereaksi DNS
kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit lalu didinginkan hingga
suhu kamar. Setelah dingin dibaca pada spektrofotometer pada panjang gelombang
550 nm. Cara yang sama dilakukan terhadap sampel sebanyak 0,5 mL. Persamaan
reaksi dari larutan standar glukosa dibuat berdasarkan nilai absorbansinya terhadap
konsentrasi glukosa. Kadar glukosa sampel didapat dengan cara memasukkan nilai
absorbansinya ke persamaan regresi yang didapatkan.
Pengujian Konsentrasi Protein (Bradford 1976)
Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 25 mg
coomassie brilliant blue G-250 dalam 12,5 mL etanol 95%, lalu ditambahkan
dengan 25 mL asam fosfat 85% (b/v). Akuades ditambahkan hingga 0,5 liter jika
telah larut sempurna dan disaring dengan kertas saring Whatman 1 sesaat sebelum
digunakan.
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan cara
0,1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan
sebanyak 5 mL pereaksi Bradford, diinkubasi selama 5 menit dan diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Demikian juga untuk larutan
standar dilakukan seperti larutan sampel dengan konsentrasi 0,01-0,1 mg/mL dari

7

larutan stok BSA konsentrasi 2 mg/mL. Nilai absorbansi yang didapat kemudian
dimasukkan ke dalam kurva standar bradford untuk menentukan konsentrasi protein
yang terkandung dalam sampel.
Kapang

Limbah
agar-agar



Penentuan kondisi produksi
enzim
waktu inkubasi: 3-21hari
limbah: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%
(goyangan 120 rpm)




Endoglukanase
(Mendels et al. 1976)
β-glukosidase
(Grover et al. 1977)
Selulase total
(Mendels et al. 1976)

kondisi produksi
terpilih

Produksi enzim selulase

Ekstrak kasar
enzim selulase

Pengendapan dengan Aseton
10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80%

Karakterisasi enzim selulase






Nilai pH: 3-9
Suhu: 30-80 oC
Pengaruh ion logam:
Na+, K+, Ca2+, Mn2+,
Zn2+, Co2+, Hg2+
Kinetika enzim

Pelet




Endoglukanase
(Mendels et al.
1976)
Protein
(Bradford 1976)

Pemurnian
Sephadex G-100

Enzim murni

Gambar 2 Diagram alir penelitian

Aktivitas Endoglukanase (Mandels et al. 1976)
Penentuan aktivitas endoglukanase dilakukan menurut metode Mandels et al.
(1976). Sebanyak 0,5 mL larutan enzim dan 0,5 mL larutan CMC 1% dalam bufer
diinkubasi pada suhu 50 oC selama 30 menit. Untuk menghentikan reaksi

8

ditambahkan pereaksi DNS sebanyak 1,5 ml, dan dipanaskan dalam air mendidih
selama 5 menit. Perhitungan untuk mendapatkan aktivitas enzim endoglukanase
dibuat berdasarkan 1 µmol glukosa = 0,18 mg dan 1 unit aktivitas endoglukanase
adalah 1 µmol glukosa yang dihasilkan per menit. Apabila lama inkubasi dilakukan
selama 30 menit maka 1 mg glukosa yang dihasilkan per mL =
Unit
Unit
1
=
= 0,185 ×
menit.mg glukosa
30 × 0,18 menit.mg glukosa
Satu unit endoglukanase (U/mL) =

mg glukosa × 0,185
mL

Aktivitas β-glukosidase (Grover et al. 1977)
Aktivitas β-glukosidase diukur dengan menggunakan p-NPG sebagai substrat.
Penentuan aktivitas enzim dilakukan sebagai berikut: 0,5 mL substrat p-NPG
20 mM dicampurkan dengan 1 mL bufer sitrat 50 mM pH 5 kemudian diinkubasi
pada suhu 30 oC selama 5 menit. Sebanyak 0,5 mL enzim ditambahkan dan
diinkubasi selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 mL
Na2CO3 0,2 M. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 400 nm. Aktivitas
enzim β-glukosidase dihitung menurut persamaan:
Aktivitas β-glukosidase (U/mL) =

(As-Ao) × 4 (mL) × fp
18,1 × 0,5 (mL) × 15(menit)

Aktivitas Selulase Total (Mandels et al. 1976)
Pereaksi yang dibutuhkan untuk pengujian ini sama dengan yang digunakan
pada pengujian endoglukanase. Hanya pada pengujian aktivitas selulase total
digunakan kertas saring Whatman no 1 ukuran 1 x 6 cm (50 mg) sebagai substrat.
Penentuan nilai aktivitas enzim dilakukan sebagai berikut: filtrat enzim sebanyak
0,5 mL dan larutan bufer sebanyak 1,0 mL beserta kertas saring diinkubasi selama
satu jam pada suhu 50 oC. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 mL pereaksi
DNS dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Penentuan gula pereduksi
apabila diinkubasi selama satu jam, maka 1 mg glukosa yang dihasilkan per mL
1
filtrat =
= 0,0925 unit, sehingga:
60×0,18
Satu unit selulase total (IU/mL) =

mg glukosa ×0,0925
mL

Pengukuran Bobot Molekul Enzim (Adeleke et al. 2012) dan Zimogram
(Van Dyk et al. 2010)
Metode SDS-PAGE yang dikerjakan dalam penelitian ini menggunakan 4%
stacking gel dan 8% gel akrilamid. Pewarnaan yang dilakukan adalah Silver
staining. Deteksi SDS-PAGE dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis
dari cetakan dan diukur jarak migrasi bromphenol blue.
Elektroforesis untuk zimogram dilakukan dengan merenaturasi gel akrilamid
dengan merendam gel di dalam 2,5% Triton X-100 selama satu jam sambil
digoyang konstan. Gel ditiriskan dan direndam dalam 50 mM bufer sitrat pH
optimum selama 2 jam pada suhu 60 oC, kemudian gel diwarnai dengan 0,1%

9

congo red selama 30 menit, selanjutnya direndam dengan 1 M NaCl selama
15 menit (perendaman dilakukan sebanyak 3 kali). Aktivitas selulase terlihat berupa
zona bening. Zona bening diukur di sekitar pita yang terbentuk dibandingkan
dengan penanda berat molekul sehingga dapat diketahui berat molekul enzim
selulase yang dapat menghidrolisis substrat CMC pada gel akrilamid.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik Limbah Agar-agar
Limbah agar-agar kertas digunakan sebagai sumber karbon untuk
memproduksi enzim selulase. Limbah hasil pengolahan ini terlebih dahulu
dikeringkan kemudian dihaluskan menggunakan hammer mill dan disk mill,
selanjutnya diayak dengan menggunakan ayakan 100 mesh. Pengecilan ukuran
partikel limbah ini diharapkan untuk memperluas permukaan sehingga
mempermudah kapang dalam memanfaatkan limbah ini sebagai sumber karbon
dalam menghasilkan enzim. Hasil analisis komposisi kimia limbah agar-agar kertas
setelah dikeringkan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kimia limbah agar-agar kertas
Komposisi
Selulosa
Hemiselulosa
Lignin
Abu
Air

Limbah agar-agar (% bk)
30,18
13,78
5,76
28,19
9,91

Hasil analisis kimia limbah agar-agar kertas menunjukkan bahwa kandungan
selulosa limbah tinggi dan lignin yang rendah sehingga limbah agar-agar ini
berpotensi sebagai substrat yang digunakan mikroorganisme untuk menghasilkan
enzim selulase. Limbah agar-agar merupakan biomassa yang tidak hanya
mengandung selulosa murni tetapi juga mengandung hemiselulosa dan lignin
membentuk lignoselulosa. Menurut Rahmadani et al. (2013), Limbah cenderung
berupa selulosa amorf, umumnya selulase lebih mudah menghidrolisis bagian
amorf selulosa dibandingkan bagian kristalin.
Perbedaan sumber karbon yang digunakan sebagai induser penghasil selulase
akan mempengaruhi aktivitas enzim selulase yang dihasilkan, hal ini dipengaruhi
persentase komposisi penyusun sumber karbon. Lignin yang terdapat pada
biomassa berpengaruh terhadap pelepasan dan hidrolisis polisakarida. Lignin yang
melindungi selulosa tersusun atas makromolekul fenolik. Makromolekul tersebut
dihubungkan oleh ikatan arilalkil dan eter yang bersifat tahan terhadap hidrolisis
(Sethi et al. 2013). Lignin dapat menghalangi terjadinya interaksi enzim dengan
selulosa sehingga akan perpengaruh terhadap glukosa yang dihasilkan.

10

Pertumbuhan Isolat Kapang EN
Kapang mempunyai masa pertumbuhan yang bervariasi dengan beberapa fase
pertumbuhan sesuai aktivitas metabolismenya. Aktivitas metabolisme akan
menurun setelah kapang melewati fase puncak pertumbuhannya. Kurva
pertumbuhan kapang diperoleh dengan mengukur biomassa kering kapang dalam
waktu tertentu pada media PDB. Fase-fase pertumbuhan tersebut sangat
berpengaruh terhadap enzim yang dihasilkan oleh kapang. Enzim yang dihasilkan
berfungsi untuk membantu dalam menguraikan makanan menjadi lebih sederhana
yang kemudian dimanfaatkan untuk pertumbuhan dan perbanyakan sel pada fase
eksponensial. Iqbal et al. (2011) menyatakan bahwa enzim selulase yang dihasilkan
oleh kapang filamentous digunakan untuk melakukan aktivitas selulolitik yang
diperlukan untuk pertumbuhan. Kurva pertumbuhan isolat kapang EN dapat dilihat
pada Gambar 3.
Berat kering misellia (g)

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

Hari

Gambar 3 Kurva pertumbuhan isolat kapang EN pada media PDB
Berdasarkan Gambar 3 dapat dilihat bahwa fase lag kapang terjadi hingga
hari ke-3. Kapang memproduksi enzim yang berfungsi untuk mendegradasi
substrat yang ada di lingkungannya pada fase lag. Fase eksponensial merupakan
fase percepatan pertumbuhan. Fase eksponensial kapang EN terjadi pada hari ke-3
hingga hari ke-12. Pemanenan enzim dapat dilakukan pada fase eksponensial pada
pola kurva pertumbuhannya (Gandjar et al. 2006). Fase stasioner terjadi mulai pada
hari ke-12. Pada fase stasioner, jumlah sel yang hidup sama dengan jumlah sel yang
mati, pada fase ini pula metabolit sekunder diproduksi. Berdasarkan kurva
pertumbuhan tersebut diduga waktu yang tepat untuk mengekstrak enzim selulase
terjadi pada fase eksponensial yaitu hari ke-3 hingga hari ke-12.
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Bhat dan Maheshwari (1987)
menyatakan bahwa fase eksponensial kapang Trichoderma reesei terjadi mulai hari
ke-2 hingga hari ke-4. Fase stasioner terjadi mulai pada hari ke-4. Sporotrichum
thermophile tidak mengalami fase lag dan fase stasioner terjadi pada hari ke-2.
Trichoderma reesei dan Sporotrichum thermophile memiliki fase pertumbuhan
yang lebih cepat dibandingkan dengan isolat kapang EN. Hal ini disebabkan oleh
sumber karbon yang digunakan lebih sederhana yaitu glukosa.

11

Konsentrasi Limbah Agar-agar dan Waktu Produksi
Enzim Selulase
Penentuan konsentrasi limbah agar-agar dan waktu inkubasi dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi dan waktu inkubasi yang tepat untuk menghasilkan enzim
selulase dengan aktivitas tertinggi. Aktivitas selulase ditentukan dengan mengukur
aktivitas enzim penyusun selulase yaitu endoglukanase, β-glukosidase, dan selulase
total. Da silva et al. (2005) menyatakan bahwa sistem pemecahan selulosa menjadi
glukosa terdiri dari tiga jenis enzim penyusun selulase yaitu endo-β-1,4-glukanase,
ekso-β-1,4-glukanase, dan β-glukosidase. Pengaruh konsentrasi limbah agar-agar
kertas dan lama waktu inkubasi terhadap aktivitas endoglukanase, β-glukosidase
dan selulase total yang dihasilkan dari kapang isolat EN dapat dilihat pada Gambar
4, 5, dan 6. Aktivitas enzim endoglukanase mewakili aktivitas pemecahan ikatan
glikosidik secara acak terhadap selulosa. Enzim β-glukosidase menunjukkan
aktivitas pemecahan yang menghasilkan glukosa sedangkan selulase total diukur
untuk melihat kerja sinergis beberapa enzim penyusun selulase dalam
menghasilkan glukosa (Deswal et al. 2011).
0.040
Aktivitas (U/mL)

0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
0

3

6

9

12

15

18

21

24

Hari ke-

Gambar 4 Aktivitas endoglukanase pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar
terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%; ─▲─ 1,5%;
─x─ 2,0%)
Aktivitas endoglukanase diuji menggunakan substrat CMC. Enzim
endoglukanase merupakan komponen enzim penyusun selulase yang pertama kali
bekerja untuk memecah selulosa rantai panjang. Menurut Jahangeer et al. (2005),
enzim endoglukanase aktif bekerja pada daerah amorf selulosa dan menghasilkan
selooligosakarida. Aktivitas endoglukanase akan meningkat dengan semakin
panjangnya rantai selulosa yang akan dihidrolisis. Gambar 4 memperlihatkan
aktivitas tertinggi enzim endoglukanase yaitu 0,031 U/mL terjadi pada penambahan
limbah agar-agar 1,5% dengan lama waktu inkubasi sembilan hari. Aktivitas
endoglukanase terus meningkat seiring semakin lamanya waktu inkubasi, namun
aktivitas menurun setelah diinkubasi melebihi waktu optimumnya. Penurunan
aktivitas endoglukanase pada hari ke-12 diduga rantai panjang selulosa limbah
agar-agar telah terpotong menjadi rantai selulosa yang lebih pendek dengan derajat

12

polimerisasi yang lebih rendah sedangkan enzim endoglukanase hanya aktif bekerja
pada selulase rantai panjang dengan derajat polimerisasi tinggi.

Aktivitas (U/mL)

0.004
0.003
0.002
0.001
0.000
0

3

6

9

12

15

18

21

24

Hari-ke

Aktivitas (U/mL)

Gambar 5 Aktivitas β-glukosidase pada beberapa konsentrasi limbah agar agar
kertas terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%;
─▲─ 1,5%; ─x─ 2,0%)

0.016
0.014
0.012
0.010
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000

0

3

6

9

12

15

18

21

24

Hari ke-

Gambar 6 Aktivitas selulase total pada beberapa konsentrasi limbah agar-agar
kertas terhadap lama waktu produksi (─♦─ 0,5%; ─■─ 1,0%;
─▲─ 1,5%; ─x─ 2,0%)
Aktivitas β-glukosidase diuji dengan menggunakan substrat p-NPG. Enzim
β-glukosidase akan bekerja optimum setelah enzim-enzim penyusun selulase
lainnya bekerja dan menghasilkan komponen selulosa yang sederhana misalnya
selobiosa. Lee et al. (2008) menyatakan bahwa β-glukosidase hanya akan bekerja
memecah selobiosa untuk menghasilkan glukosa. Gambar 5 memperlihatkan bahwa
aktivitas enzim β-glukosidase tertinggi (0,0036 U/mL) terdapat pada penambahan
limbah agar-agar 1,5% dengan lama waktu inkubasi lima belas hari. Aktivitas βglukosidase tertinggi terjadi pada inkubasi selama 15 hari diduga selobiosa yang
dihasilkan oleh enzim penyusun selulase lainnya telah terakumulasi sehingga enzim
β-glukosidase bekerja lebih aktif pada hari ke-15. Oleh sebab itulah pada inkubasi
sebelum 15 hari aktivitas β-glukosidase rendah.

13

Pengukuran aktivitas selulase total dilakukan untuk mengukur aktivitas
campuran beberapa enzim penyusun selulase dalam menghidrolisis bahan yang
mengandung selulosa dan menghasilkan glukosa sebagai produk akhir. Penentuan
aktivitas enzim selulase total dilakukan dengan menggunakan kertas saring
Whatman no 1 sebagai substrat dalam pengujiannya. Aktivitas selulase total
menggambarkan pengaruh sinergis enzim endoglukanase, eksoglukanase, dan
β-glukosidase. Gambar 6 memperlihatkan aktivitas enzim selulase tertinggi yaitu
0,013 U/mL terdapat pada penambahan limbah agar-agar 1,5% dengan lama
inkubasi sembilan hari. Aktivitas mengalami kenaikan hingga hari ke-9 dan
mengalami penurunan setelah inkubasi melebihi hari ke-9. Aktivitas selulase total
yang dihasilkan masih rendah dikarenakan substrat yang digunakan merupakan
selulosa tidak larut sehingga diperlukan waktu reaksi yang lebih lama agar enzim
dapat berdifusi ke dalam serat selulosa. Aktivitas enzim selulase yang dihasilkan
oleh beberapa jenis kapang disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Perbandingan selulase isolat kapang EN dengan kapang jenis lainnya
Enzim

Kapang

Endoglukanase Penicillium occitanis
Aspergillus heteromorphus
Trichoderma resesei
Aspergillus niger
Isolat kapang EN
β-glukosidase Penicillium occitanis
Penicillium janthinellum
Isolat kapang EN
Selulase total
Trichoderma resesei RUT C30
Aspergillus heteromorphus
Aspergillus niger
Helminthosporium sp.
Cladosporium sp.
Isolat kapang EN

Aktivitas
(U/mL)
23
83
2,63
11,3
0,031
21
2,3
0,0036
2,27
3,2
12,4
42,61
40,36
0,013

Sumber karbon

Referensi

Pulp kertas
Jerami gandum
Sekam gandum
Kulit pisang
Limbah agar
Pulp kertas
Bagas tebu
Limbah agar
Karton
Jerami gandum
Kulit pisang
Jerami padi
Jerami padi
Limbah agar

Belghith et al. (2001)
Singh et al. (2009)
Maurya et al. (2012)
Jadhav et al. (2013)
Belghith et al. (2001)
Adsul et al (2004)
Szijarto et al. (2004)
Singh et al. (2009)
Jadhav et al. (2013)
Sivaramanan (2014)
Sivaramanan (2014)

Aktivitas endoglukanase, β-glukosidase, dan selulase total yang dihasilkan
oleh isolat kapang EN masih sangat rendah dibandingkan dengan aktivitas enzim
yang dihasilkan oleh kapang jenis lain (Tabel 2). Beberapa perlakuan dapat
digunakan untuk meningkatkan aktivitas selulase kapang EN. Peningkatan aktivitas
selulase yang telah dilakukan pada beberapa mikroorganisme antara lain:
mengoptimasi sumber nutrisi kapang berupa sumber karbon dan sumber nitrogen
dalam memproduksi selulase Fomitopsis sp. (Deswal et al. 2011) dan Bacillus
amyoliquefaciens DL-3 (Lee et al. 2008), optimasi produksi selulase Marinobacter
sp. MSI032 dengan mengoptimasi perbedaan suhu, pH, dan pemberian ion logam
yang mempengaruhi aktivitas selulase (Shanmughapriya et al. 2010), mutasi
Trichoderma sp dengan mensuspensikan spora ke dalam larutan mutagen ethidium
bromide (EtBr) dan ethyl methane sulfonate (EMS) (Mursyid et al. 2007).
Limbah agar-agar dalam produksi enzim selulase berfungsi sebagai sumber
karbon yang berguna untuk merangsang mikroorganisme untuk mengekskresikan
enzim selulase ke lingkungan. Penambahan konsentrasi limbah agar-agar di bawah
1,5% menyebabkan terbatasnya sumber karbon sehingga pertumbuhan tidak
optimal dan aktivitas enzim rendah. Penambahan konsentrasi limbah di atas 1,5%

14

menyebabkan penurunan aktivitas selulase. Hal ini disebabkan meningkatnya
konsentrasi limbah agar-agar yang ditambahkan akan menimbulkan masalah
sirkulasi oksigen sehingga pertumbuhan kapang terganggu. Menurut Saropah et al.
(2012), semakin banyak sumber karbon dalam media pertumbuhan maka selulase
yang dihasilkan semakin meningkat, akan tetapi sumber karbon yang berlebihan
dapat menghambat pertumbuhan sel karena akan mengurangi jumlah oksigen dalam
media sehingga menurunkan produksi selulase.

Karakteristik Ekstrak Kasar Enzim Selulase
Karakterisasi enzim selulase dilakukan pada ekstrak kasar enzim selulase.
Karakterisasi ini meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, pengaruh ion
logam dan pengaruh konsentrasi substrat. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas
enzim selulase total menggunakan substrat kertas saring Whatman no 1,
endoglukanase menggunakan substrat CMC, dan β-glukosidase menggunakan
substrat p-NPG terlihat bahwa aktivitas tertinggi yaitu endoglukanase sehingga
untuk karakterisasi ekstrak kasar enzim selulase ini menggunakan CMC sebagai
substrat.
Nilai pH Optimum Enzim Endoglukanase
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH, maka dari itu diperlukan bufer dengan
pH tertentu supaya enzim dapat bekerja optimum. Enzim merupakan molekul
amfoter yang mengandung sejumlah besar kelompok asam dan basa terutama
terdapat pada permukaan. Muatan-muatan pada kelompok-kelompok tersebut akan
berubah berdasarkan konstanta disosiasi asam terhadap pH lingkungannya.
Perubahan-perubahan yang terjadi pada muatan-muatan oleh pH dapat berpengaruh
terhadap aktivitas, stabilitas struktural dan daya kelarutan enzim (Chaplin dan
Bukle 1990). Penentuan pH optimum dilakukan dengan penambahan bufer pada
rentang pH 3-9. Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa pH
disajikan pada Gambar 7.

Aktivitas (U/mL)

0.050
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
0

2

4

pH

6

8

10

Gambar 7 Pengaruh pH terhadap aktivitas endoglukanase
Berdasarkan Gambar 7 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas pada
pH 4 dan pH tersebut merupakan pH optimum aktivitas ekstrak kasar
endoglukanase dengan aktivitas 0,042 U/mL. Aktivitas ekstrak kasar
endoglukanase mengalami penurunan pada pH 5 dan menurun drastis hingga pH 9.

15

Harshvardhan et al. (2013) menyatakan bahwa enzim selulase yang diuji
menggunakan substrat CMC aktif pada kisaran pH 3-9. Hasil penelitian
Thongekkaew et al. (2008) menunjukkan pH optimum endoglukanase Pichia
pastoris yaitu 3,5. Menurut Yuan et al. (2012), endoglukanase yang dihasilkan oleh
Fusarium oxysporum sangat reaktif pada pH 4,5-5,5. Menurut Rastogi et al. (2010)
enzim yang mampu bertahan pada kondisi asam digolongkan ke dalam enzim
asidofil.

Aktivvitas (U/mL)

Suhu Optimum Enzim Endoglukanase
Suhu merupakan faktor yang mempengaruhi laju katalisis reaksi enzimatis.
Kenaikan suhu hingga batas tertentu dapat meningkatkan aktivitas enzimatis
sampai pada kondisi suhu optimum, namun kenaikan suhu yang berlebih dapat
menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Penentuan suhu optimum dilakukan pada
suhu 30-80 oC. Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa suhu
disajikan pada Gambar 8.
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
0

20

40

60

80

100

Suhu (oC)

Gambar 8 Pengaruh suhu terhadap aktivitas endoglukanase
Hasil pengukuran aktivitas endoglukanase pada beberapa suhu
memperlihatkan aktivitas endoglukanase meningkat seiring dengan peningkatan
suhu hingga suhu optimum terjadi pada suhu 60 oC dengan aktivitas 0,042 U/mL.
Penurunan aktivitas terjadi dimulai pada suhu 70 oC. Hasil penelitian Yuan et al.
(2012) menunjukkan bahwa suhu optimum endoglukanase yang dihasilkan dari
Fusarium oxysporum yaitu 60 oC. Adekele et al. (2012) menyatakan bahwa
aktivitas optimum enzim endoglukanase Bacillus coagulans Co4 terjadi pada suhu
60 oC. Kenaikan suhu melebihi suhu optimum dapat mengakibatkan menurunnya
aktivitas enzim.
Panas yang ditimbulkan akibat kenaikan suhu dapat mempercepat reaksi dan
meningkatkan kecepatan molekul karena bertambahnya energi kinetik yang
mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dan substrat sehingga
memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi. Kenaikan suhu melebihi suhu
optimum menyebabkan protein enzim dan substrat mengalami perubahan
konformasi yang bersifat detrimental. Perubahan konformasi substrat
mengakibatkan gugus reaktif mengalami hambatan dan tidak dapat lagi memasuki
sisi aktif enzim (Suhartono 1989).

16

Kinetika Enzim Endoglukanase
Mekanisme kerja enzim ditentukan oleh jumlah atau konsentrasi substrat
yang tersedia. Hasil penelitian menyebutkan konsentrasi substrat yang memberikan
aktivitas endoglukanase optimum adalah 1%. Penambahan konsentrasi di bawah
1% menunjukkan aktivitas enzim yang terus meningkat. Penambahan konsentrasi
di atas 1% memperlihatkan aktivitas enzim tidak mengalami kenaikan (Gambar 9).
Kanti (2003) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat yang rendah, kecepatan
reaksi enzim meningkat secara tajam. Kecepatan reaksi enzim mulai menurun dan
mencapai batas kecepatan maksimum ketika ditambahkan substrat dengan
konsentrasi lebih besar dari nilai Km.

Aktivitas (U/mL)

0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1.5

Konsentrasi Substrat (%)

Gambar 9 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim endoglukanase
30

1/V

20
y = 4,665x + 19,08
R² = 0,984

10
0
0

1

[1/S]

2

3

Gambar 10 Kurva Lineaweaver-Burk endoglukanase pada penentuan Km dan Vmaks
Konstanta Michaelis (Km) dan kecepatan maksimum reaksi (Vmaks)
merupakan dua parameter kinetika enzim. Kinetika enzim berdasarkan persamaan
Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa nilai Km enzim selulase sebesar 0,244%
dengan Vmaks 0,052 U/mL. Trivedi et al. (2011) menyatakan bahwa nilai Km enzim
selulase Bacillus flexus yang diisolasi dari rumput laut sebesar 0,618%. Bacillus sp.
dan Geobacillus sp. sebesar 0,108% dan 0,311% Rastogi et al. (2010). Menurut
Saropah et al.(2012), nilai Km berfungsi sebagai ukuran konstanta disosiasi suatu
enzim. Selulase bakteri selulolitik yang diisolasi dari bekatul memiliki nilai Km
sebesar 1,694% dengan Vmaks 0,0086 U/mL.
Pengaruh Ion Logam
Beberapa ion logam ditambahkan pada reaksi uji aktivitas selulase isolat EN
untuk mengetahui pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase. Ion logam dapat

17

meningkatkan atau menurunkan aktivitas setelah berinteraksi dengan enzim.
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase dapat dilihat pada Gambar 11.

Aktivitas relatif (%)

140
120
100
80
60
40
20
0

Ion logam

Gambar 11 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim endoglukanase
Konsentrasi ion logam yang digunakan yaitu 5 mM. Aktivitas relatif enzim
endoglukanase tanpa penambahan ion logam yaitu 100%. Ion logam Na+, Mn2+,
dan K+ sedikit meningkatkan aktivitas relatif menjadi 105,22%, 102,61%, dan
123,48%. Ion logam Ca2+, Co2+, dan Zn2+ sedikit menurunkan aktivitas relatif
menjadi 83,48%, 64,35%, dan 93,31%. Penurunan aktivitas relatif enzim hingga
74% terjadi pada penambahan ion logam Hg2+ dengan aktivitas relatif yang tersisa
26%.
Hasil penelitian Yin et al. (2010) menunjukkan bahwa ion Na+, K+, dan Mn2+
pada konsentrasi 5 mM menghasilkan aktivitas relatif lebih tinggi dibandingkan
kontrol. Penelitian yang dilakukan oleh Smriti dan Sanwal (1999) menyatakan ion
Hg2+ merupakan penghambat yang kuat terhadap aktivitas enzim selulase yang diuji
menggunakan substrat CMC. Menurut Lee et al. (2008), yaitu aktivitas relatif
endoglukanase yang tersisa setelah penambahan ion Hg2+ sebesar 23,7%. Yin et al.
(2010) menyatakan penurunan aktivitas endoglukanase akibat penambahan ion
logam Hg2+ memperlihatkan bahwa sisi aktif enzim selulase memiliki gugus SH.
Menurut Lee et al. (2008), inhibisi oleh ion Hg2+ bukan hanya disebabkan berikatan
dengan gugus thiol tetapi juga akibat adanya interaksi dengan residu triptofan atau
gugus karboksil pada asam amino enzim.
Pemurnian Enzim Endoglukanase
Presipitat Enzim Endoglukanase
Enzim kasar hasil optimasi dengan aktivitas tertinggi selanjutnya dipresipitasi
dengan menambahkan aseton. Presipitasi merupakan penambahan senyawa yang
hanya menggumpalkan protein dan tidak menggumpalkan bahan lain sehingga
dengan sendirinya akan memisahkan dan lebih memurnikan enzim yang dihasilkan
(Suhartono 1989). Presipitasi dapat dilakukan dengan penambahan garam misalnya
amonium sulfat, polimer misalnya polyethylene glycol (PEG), atau pelarut organik
misalnya aseton atau alkohol (Scopes 1994).

18

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Presipitan yang digunakan pada penelitian ini yaitu pelarut organik aseton.
Pemakaian aseton terbukti dapat mempertahankan stabilitas enzim, enzim yang
diendapkan dengan pelarut organik biasanya relatif lebih murni (Suhartono 1989).
Penambahan aseton ke suatu ekstrak yang berisi protein dapat menimbulkan
presipitasi protein. Penambahan pelarut organik menurunkan konstanta dielektrik
larutan sehingga kelarutan protein menurun (Harris 1989). Menurut Adeleke et al.
(2012), presipitasi dengan penambahan aseton dapat menghasilkan aktivitas enzim
yang lebih baik dibandingkan dengan penambahan amonium sulfat. Pengaruh
kejenuhan aseton terhadap aktivitas enzim pada pelet setelah mengalami
pengendapan disajikan pada Gambar 12.
0.450
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
0

10

20

30

40

50

60

70

80

Konsentrasi Kejenuhan Aseton (%)

Gambar 12 Pengaruh kejenuhan aseton terhadap aktivitas endoglukanase
Berdas