In Vitro Development Of Pancreatic Beta Cells Of Rat (Rattus Norvegicus) In Culture Medium Supplemented By Black Seed (Nigella Sativa) Extract

PERKEMBANGAN IN VITRO SEL BETA PANKREAS TIKUS
(Rattus norvegicus) DALAM MEDIUM KULTUR YANG
DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa)

DENY PUTRA ROMADHON

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Perkembangan In Vitro
Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi
Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Deny Putra Romadhon
NIM B04100092

ABSTRAK
DENY PUTRA ROMADHON. Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus
(Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam
(Nigella sativa). Dibimbing oleh KUSDIANTORO MOHAMAD dan WAHONO
ESTHI PRASETYANINGTYAS.
Nigella sativa (jintan hitam) adalah tanaman obat yang banyak digunakan
dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk diabetes melitus. Penelitian ini
bertujuan untuk menganalisis proliferasi dan deferensiasi sel-sel pankreas tikus
(Rattus norvegicus) setelah pemberian ekstrak jintan hitam secara in vitro. Sel
pankreas diisolasi dari anak tikus usia lima hari dan dikultur secara in vitro dalam
medium dulbecco modified eagle medium dengan penambahan ekstrak Nigella
sativa (NS) sebagai perlakuan (NS 0% [kontrol], NS 1%, dan NS 10%). Sel
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC selama tujuh hari dan
diamati population doubling time (PDT), persentase dan diameter pulau
Langerhans, serta ekspresi sel pankreas dalam menghasilkan insulin setelah

pewarnaan dithizone. Penelitian menunjukkan pemberian ekstrak jintan hitam
(NS) secara nyata (P < 0,05) mampu memperpendek PDT (4.66 ± 0.24, 3.98 ±
0.20, dan 3.66 ± 0.21 hari berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%),
meningkatkan persentase dan diameter pulau Langarhans (6.00 ± 1.80, 14.33 ±
3.01, dan 18.67 ± 1.25% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%),
meningkatkan diameter pulau Langerhans (66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, dan
142.77 ± 1.73 µm berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%), serta
meningkatkan persentase ekspresi sel
pankreas dalam menghasilkan insulin
(4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, dan 17.33 ± 3.21% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%,
dan NS 10%). Berdasarkan hasil keseluruhan dapat disimpulkan bahwa pemberian
ekstrak jintan hitam mampu meningkatkan proliferasi dan deferensiasi sel-sel
pankreas secara in vitro.
Kata kunci: kultur in vitro, Nigella sativa, perkembangan, sel

pankreas.

ABSTRACT
DENY PUTRA ROMADHON. In Vitro Development of Pancreatic Beta Cells of
Rat (Rattus norvegicus) in Culture Medium Supplemented by Black Seed (Nigella

sativa) Extract. Supervised by KUSDIANTORO MOHAMAD and WAHONO
ESTHI PRASETYANINGTYAS.
Nigella sativa (black seed) is a medicinal plant that is widely used for
treating various diseases, including diabetes mellitus. This study examined the
proliferation and differentiation of pancreatic cells of rats (Rattus norvegicus)
after in vitro culture in medium supplemented by Nigella sativa extracts (NS).
Pancreatic cells were isolated from five days old rat (Rattus norvegicus) and
cultured in dulbecco modified eagle medium suplemented with Nigella sativa
(NS) exstract (NS 0% [control], NS 1%, and NS 10% for treatment groups). The
cell were incubated in 5 % CO2 incubator at 37 oC for seven days and observed
cell population doubling time (PDT), percentage and diameter of Langerhans
islets, and percentage of expression the cell producing insulin in Langerhans
islets after dithizone staining. The result showed that NS significantly (p < 0.05)
decreased the population doubling time (4.66 ± 0.24, 3.98 ± 0.20, and 3.66 ± 0.21
days for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively), increased the percentage of
Langerhans islets (6.00 ± 1.80, 14.33 ± 3.01, and 18.67 ± 1.25% for NS 0%, NS
1%, and NS 10%, respectively), increased the diameter of Langerhans islets
(66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, and 142.77 ± 1.73 µm for NS 0%, NS 1%, and NS
10%, respectively), and increased the percentage of expression the
cell

producing insulin (4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, and 17.33 ± 3.21% for NS 0%, NS
1%, and NS 10%, respectively). It was concluded that the supplementation of NS
in culture medium can improve the proliferation and differentiation of pancreatic
cells in vitro.
Keywords: development, in vitro culture, Nigella sativa, pancreatic

cells.

PERKEMBANGAN IN VITRO SEL BETA PANKREAS TIKUS
(Rattus norvegicus) DALAM MEDIUM KULTUR YANG
DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa)

DENY PUTRA ROMADHON

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah
Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam
Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi
PAVet dan Drh Wahono Esthi Prasetyanigtyas, MSi PAVet selaku pembimbing,
serta Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) yang telah merancang,
membimbing, dan memberikan bantuan dana penelitian. Di samping itu,
penghargaan penulis sampaikan kepada Wahyudin, AMd selaku staf dan teknisi
Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,
Devi Syafrianti, SPd, MSi, dan Ria Ceriana, SSi, MSi, serta teman-teman sesama
penelitian (Dwi Budiono, Juita Siregar, Fitri Susana, Siti Khadijah, Putri Ekandini
dan Fatimah) atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga
atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
Deny Putra Romadhon

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

ix

DAFTAR GAMBAR

ix

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

1

Perumusan Masalah

2

Manfaat Penelitian

2

TINJAUAN PUSTAKA
Jintan Hitam (Nigella sativa)

2

Pankreas

3

Kultur In Vitro

3

METODE
Waktu dan Tempat

4

Bahan

4

Alat

4

Tahapan dan Prosedur Kerja

4

Evaluasi Hasil Kultur

6

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

7

HASIL DAN PEMBAHASAN
SIMPULAN DAN SARAN

8
11

Simpulan

11

Saran

12

DAFTAR PUSTAKA

12

RIWAYAT HIDUP

14

DAFTAR TABEL
1. Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang
diberi ekstrak Nigella sativa
8
2. Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro

yang diberi ekstrak Nigella sativa
9
3. Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberi
ekstrak Nigella sativa
9
4. Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang
menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang
diberi ekstrak Nigella sativa
11

DAFTAR GAMBAR
1. Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel
pankreas
2. Pengukuran diameter pulau Langerhans
3. Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro
4. Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan
ekspresi menghasilkan insulin

7
7
8
10

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang ditemukan di
seluruh dunia, termasuk Indonesia. Penelitian epidemiologis oleh Perkumpulan
Endokrinologi Indonesia (PERKENI) menyebutkan beberapa wilayah di
Indonesia memiliki prevalensi penyakit DM yang terus meningkat setiap tahun.
Berdasarkan pola pertambahan penduduk, diperkirakan pada tahun 2020 dari 178
juta penduduk berusia di atas 20 tahun dengan asumsi prevalensi DM sebesar 4 %
akan didapatkan 7 juta pasien DM (PERKENI 2011).
Hormon insulin merupakan hormon penting yang dihasilkan oleh sel beta
pankreas dan berfungsi mengatur metabolisme glukosa dengan mengubah glukosa
dalam darah menjadi glikogen. Apabila terjadi kerusakan pada sel-sel beta
pankreas, maka akan terjadi ketidak-seimbangan kadar hormon insulin dan proses
metabolisme glukosa. Hal ini dapat menimbulkan penyakit degeneratif DM,
terutama DM tipe 1 (ADA 2013).
Terapi DM tipe 1 karena kerusakan sel beta dapat dilakukan dengan
pemberian insulin harian atau transplantasi organ pankreas. Meskipun demikian,
jumlah donor organ masih sangat sedikit dan mahal, serta efek samping dari
imunosupresan yang digunakan untuk mencegah reaksi imunologik saat
transplantasi masih menjadi kendala dalam pengobatan DM dengan teknik
transplantasi (Setiawan 2006). Alternatif lain yang menjadi pilihan dalam
pengobatan DM tipe 1 adalah dengan menggunakan obat herbal, diantaranya
adalah Nigella sativa. Terapi lain melalui penerapan bioteknologi untuk
menggantikan sel pankreas yang rusak dapat dilakukan dengan teknik kultur in
vitro dan transplantasi sel-sel hasil kultur.
Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah
satunya adalah antidiabetik (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006).
Nigella sativa mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan sel
beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003).
Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi
(Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau
sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001).
Menurut El-Dakhakhny et al. (2002) Nigella sativa mampu memperbaiki
metabolisme glukosa pada tikus model diabetes in vivo. Selain itu, Nigella sativa
mampu meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel pankreas yang rusak secara
in vivo, dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat (Kanter et al.
2003). Namun belum ada pembuktian secara empiris Nigella sativa berperan
dalam menginduksi proliferasi (pertumbuhan) serta diferensiasi (perkembangan)
sel pankreas secara in vitro.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah untuk menganalisis kemampuan ekstrak jintan
hitam (Nigella sativa) dalam menginduksi proses proliferasi (pertumbuhan) dan
diferensiasi (perkembangan) sel-sel pankreas tikus secara in vitro.

2

Perumusan Masalah
Nigella sativa telah banyak dikonsumsi masyarakat karena dipercaya
memilki berbagai khasiat, misalnya untuk mangatasi penyakit DM tipe 1. Nigella
sativa diketahui mampu meningkatkan populasi sel
pankreas serta sekresi
insulin secara in vivo, namun belum ada data empiris yang membuktikan bahwa
Nigella sativa berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan sel-sel ß pankreas
secara in vitro. Sistem kultur in vitro dapat digunakan untuk membuktikan
peranan Nigella sativa dalam menginduksi proses proliferasi (pertumbuhan) dan
diferensiasi (perkembangan) sel-sel ß pankreas.

Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan data ilmiah mengenai potensi
ekstrak Nigella sativa dalam meningkatkan proliferasi (pertumbuhan) dan
diferensiasi (perkembangan) sel-sel pankreas tikus secara in vitro berdasarkan
data-data empiris, khususnya untuk pengobatan diabetes melitus tipe 1.

TINJAUAN PUSTAKA
Jintan Hitam (Nigella sativa)
Nama atau sebutan bagi tanaman jintan hitam berbeda-beda di setiap
tempat. Di negara-negara barat tanaman ini sering disebut dengan black caraway,
black seed, dan coriander seeds. Di negara-negara Arab, tanaman ini dikenal
dengan nama habbatussauda (hitam) atau habbatuk baraka (yang diberkati).
Semantara di Persia tanaman ini dikenal dengan shonaiz, di Turki dikenal dengan
cotu siyah, dan dalam bahasa Hindi dikenal dengan nama kalounji. Di Indonesia
dan Malaysia dikenal dengan nama jintan hitam (Yulianti dan Junaedi 2006).
Tanaman jintan hitam diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom
: Plantae
Subkingdom : Traceabionta
Filum
: Spermatophyta
Subfilum
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida dicotyledon
Subkelas
: Magnoliidae
Ordo
: Ranunculales
Famili
: Ranunculalceae
Genus
: Nigella
Spesies
: Nigella sativa
Nigella sativa memiliki kandungan asam lemak tak jenuh (82.5%) lebih
banyak dibandingkan asam lemak jenuh (17.0%). Kandungan asam lemak tak
jenuh yang penting diantaranya ialah asam linoleat (55.6%), asam palmitat
(12.5%), dan asam oleat (23.4%) (Nickavar et al. 2003).

3

Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah satunya
adalah anti-diabetes (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006). Nigella
sativa diketahui mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan
sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003).
Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi
(Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau
sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001).

Pankreas
Pankreas merupakan kelenjar endokrin yang memiliki fungsi sebagai
penghasil hormon insulin dalam tubuh. Pankreas terdiri dari sel-sel yang tersusun
mengelompok atau yang disebut pulau Langerhans. Pulau Langerhans tersusun
atas berbagai macam sel-sel endokrin membentuk bingkai yang saling
beranastomose, yaitu sel alfa (α, menghasilkan glukagon), sel beta ( ,
menghasilkan insulin), sel-epsilon (δ, menghasilkan somatostatin), dan sel gamma
( , menghasilkan polipeptida pankreas) (Criscimanna et al. 2011). Pankreas juga
memiliki sel-sel duktus yaitu sel-sel progenitor yang berperan dalam neogenesis
(proliferasi dan deferensiasi) (Bonner et al. 1993, Rosenberg 1998). Pada rodensia
(mencit dan tikus), pulau-pulau Langerhans memiliki morfologi berupa kumpulan
sel berbentuk bola (spheroid), sel-sel terletak di tengah dan dikelilingi oleh selsel α, serta sel-sel tersebar di antara sel dan α (Ramiya et al. 2000).
Pankreas merupakan salah satu organ yang memiliki kemampuan terbatas
dalam melakukan proliferasi (Soria et al. 2001), namun secara in vitro sel-sel
pankreas masih memiliki kemampuan dalam melakukan proliferasi dan
diferensiasi (Demeterco et al. 2000).

Kultur In Vitro
Kultur sel didefinisikan sebagai teknik untuk menumbuhkan dan
memelihara sel-sel dari organisme multiseluler di luar tubuh dengan mengunakan
wadah khusus yang ditempatkan pada kondisi lingkungan menyerupai kondisi
tubuh, seperti: temperatur, kelembaban, nutrisi, serta kondisi bebas kontaminasi.
Tujuan dilakukan kultur sel adalah untuk digunakan dalam riset dan terapi medis
(Halim et al. 2010). Menurut Butler (2004) riset kultur sel asal hewan memiliki
beberapa tujuan, antara lain: (1) mengetahui fisiologi normal atau proses biokimia
yang terjadi dalam sel, misalnya metabolisme sel; (2) menguji pengaruh senyawa
kimiawi ataupun obat pada tipe sel yang spesifik, misalnya senyawa metabolit,
hormon, senyawa toksik, senyawa mutagenik, dan lain-lain; (3) mempelajari
kombinasi variasi tipe sel sehingga menghasilkan jaringan buatan; serta (4)
mensintesis produk biologis pada kultur sel skala besar.
Kondisi in vitro pada dasarnya diciptakan agar menyerupai kondisi in vivo,
antara lain: temperatur (37oC), pH (7.4), kadar CO2 (5%), kadar oksigen (5%),
tekanan osmosis (280-300 mOsmol/Kg), permukaan untuk perlekatan sel, nutrien,
proteksi terhadap zat toksik, hormon, dan faktor pertumbuhan (Malole 1990).
Keberhasilan suatu kultur in vitro, perlu diperhatikan komponen-komponen

4

utama, antara lain: medium, serum, antibiotik, dan faktor pertumbuhan. Medium
berperan penting untuk menciptakan suatu kondisi lingkungan yang memiliki pH,
tekanan osmotik, dan faktor pendukung lainnya yang serupa untuk pertumbuhan
dan perkembangan sel. Serum berperan penting sebagai sumber nutrisi sel.
Antibiotik diperlukan untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme yang dapat
mengganggu pertumbuhan dan bersifat patogen jika diperuntukkan untuk terapi.
Untuk menginduksi pertumbuhan, mempertahankan pluripotensi, atau
merangsang terjadinya diferensiasi, maka faktor pertumbuhan perlu ditambahkan
dalam medium kultur (Halim et al. 2010).

METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2014 di
Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi, dan Embriologi,
Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,
Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain tikus (Rattus norvegicus) strain
Sprague Dawley (SD) umur 5 hari, serbuk jintan hitam (Nigella sativa), medium
kultur dulbecco modified eagle medium suplemented (DMEM) yang dimodifikasi
dengan penambahan asam amino non-esensial (NEAA Sigma, USA), new born
calf serum (NBCS Sigma, USA), NaHCO3 (Sigma, USA), insulin transferrin
selenium (ITS Sigma, USA), dithizone (DTZ Sigma, USA), dimetil sulfoxide
(DMSO Sigma, USA), alkohol 70%, Dubelcco Phosphate Buffered Saline (DPBS
Sigma, USA), dan gentamycin.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting bedah, pinset,
mortar beserta penggerus, timbangan digital, pipet mikro, inkubator, laminar flow
(clean bench), mikroskop Olympus Ix70-S8F2 yang dilengkapi dengan kamera,
cawan petri, gelas obyek, gelas penutup, membran filter 0,22 µm, spoit 1 mL dan
10 mL, gelas ukur, gelas piala, haemositometer Improved Neubeuer, alat
penghitung, centrifuge rotor fixed, hot plate, dan vortex.
Tahapan dan Prosedur Kerja
Persiapan ekstrak Nigella sativa
Ekstrak Nigella sativa dibuat dengan cara diseduh. Sebanyak 2 mL
aquabides dididihkan terlebih dahulu, lalu sambil didinginkan dimasukkan
masing-masing 0.02 g dan 0.2 g serbuk Nigella sativa, masing-masing untuk

5

perlakuan Nigella sativa 1% dan 10%. Selanjutnya larutan ekstrak dihomogenkan
dengan menggunakan pipet dan dibiarkan sampai hingga dingin. Setelah homogen
dan dingin, larutan difilter menggunakan membran filter berpori-pori 0.22 µm.
Larutan ekstrak Nigella sativa disimpan pada suhu -4 °C dan siap untuk
digunakan.
Persiapan cawan petri
Cawan petri disertai cover glass steril direndam dengan gelatin 0.1%
sebanyak 1 mL dan didiamkan selama satu jam. Setelah satu jam, gelatin dibuang
dengan menggunakan mikropipet, selanjutnya cawan petri dibilas menggunakan
Dulbecco’s phosphate saline buffered (DPBS) yang telah dimodifikasi dengan
penambahan gentamycin 50 µg/mL. Setelah dibilas, cawan petri didiamkan
selama 5 menit hingga kering.
Masing-masing cawan petri yang telah kering dimasukkan 2 mL medium
kultur dulbecco modified eagle medium (DMEM) yang dimodifikasi dengan
penambahan NaHCO3 1%, non-essential amino acids (NEAA) 1%, gentamycin
50 µg/mL, neonatal calf bovine serum (NCBS) 10%, dan insulin transferrin
selenium (ITS) yang mengandung 5 µg/mL insulin, 10 µg/mL transferin, dan 5
µg/mL selenium.
Isolasi dan kultur sel-sel pankreas
Sel pankreas anak tikus (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley (SD)
usia 5 hari diisolasi berdasarkan metode Johansson et al. (2006) yang
dimodifikasi. Tikus dikorbankan dengan cara dianastesi dan kemudian didislokasi
leher (cervicalis dislocation). Pankreas yang diisolasi dicuci dalam larutan DPBS
yang mengandung gentamisin 50 µg/mL dan NCBS 0.1% (mPBS) sambil
dibersihkan dari selaput dan pembuluh darah. Setelah bersih, jaringan dipotongpotong kurang dari 2 mm secara manual dengan gunting steril, kemudian
didisosiasi lebih lanjut menggunakan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL
mPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Tujuan pemotongan
tersebut adalah meningkatkan luas permukaan sehingga kerja enzim kolagenase
efektif mendisosiasi dengan mengurangi jaringan ikat yang mengelilingi pulau
Langerhans (Ru et al. 2004). Selanjutnya suspensi sel pankreas dicuci dengan
sentrifugasi selama 10 menit (kecepatan 200 g) dalam medium DPBS dan
DMEM, masing-masing 3 dan 2 kali pencucian. Suspensi sel-sel pankreas yang
telah dicuci ditaman dalam cawan petri yang telah disiapkan, dengan konsentrasi
akhir 5 x 104 sel/mL.
Kultur sel dilakukan dalam inkubator CO2 5%, pada suhu 37 °C selama 7
hari. Medium kultur diperbaharui setiap 2 hari sekali, yaitu pada hari ke-2, 4, dan
6. Pada hari ke-2, 4, dan 6 (setelah medium diperbaharui) sel-sel pankreas
diinduksi dengan penambahan larutan Nigella sativa 100 µL masing-masing
untuk perlakuan 0.01 g/mL (1%) dan 0.1 g/mL (10%) dalam 2 mL medium
DMEM. Pada hari ke-6 kultur sel-sel pankreas diinduksi dengan 1 µL glukosa 26
mM. Selanjutnya kultur dievaluasi pada hari ke 7, dan dilakukan pewarnaan
dithizone (DTZ) untuk mengetahui jumlah pulau Langerhans yang
mengekspresikan produksi insulin.

6

Pewarnaan sel beta pankreas yang mensekresikan insulin
Pewarnaan sel beta pankreas dilakukan pada hari ketujuh kultur, yaitu
setelah dilakukan evaluasi persentase pulau Langerhans dan pengambilan gambar
untuk evaluasi diameter pulau Langerhans. Pewarnaan menggunakan pewarna
dithizone (DTZ) berdasarkan metode Shiroi et al. (2002).
Stok DTZ dibuat dengan melarutkan 50 mg DTZ ke dalam 5 mL dimethyl
sulfoxide. Larutan pewarnaan siap pakai dibuat dengan melarutkan 1 µL larutan
stok dalam 1 mL DPBS yang mengandung 1.25 µL/mL gentamycin dan difilter
menggunakan membran filter dengan ukuran pori-pori 0.22 µm.
Sel kultur yang akan diwarnai dicuci terlebih dahulu dalam larutan mDPBS.
Selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan cara menginkubasi sel dalam
larutan DTZ selama 15 menit pada suhu 37 °C. Setelah proses inkubasi selama 15
menit, sel dicuci dengan menggunakan larutan DPBS dan siap untuk diamati
menggunakan mikroskop. Sel beta pankreas dalam pulau Langerhans yang
mensekresikan insulin akan menunjukkan warna merah, sedangkan sel beta yang
tidak mensekresikan insulin tidak berwarna setelah dilakukan pewarnaan (Shiroi
et al. 2002).
Evaluasi Hasil Kultur
Tingkat proliferasi sel berdasarkan population doubling time
Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh
populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula (Davis 2011).
Tingkat proliferasi dievaluasi dengan menghitung jumlah sel pada saat akan
diinkubasi (H0) dan setelah kultur selama tujuh hari (H7). Pada hari ketujuh
setelah pewarnaan DTZ, medium dibuang lalu sel hasil kultur dicuci dengan
DPBS kemudian dimasukkan larutan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL
DPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Selain dilakukan
disosiasi menggunakan enzim, disosiasi dilakukan secara manual dengan
menggunakan mikropipet. Sel yang telah terdisosiasi disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 200 g. Selanjutnya sel dihitung menggunakan
hemositometer Improved Neubeuer. Perhitungan PDT dilakukan menurut Davis
(2011) dengan rumus sebagai berikut:

PDT=

1
(log ∑jumlah sel akhir- log ∑ jumlah sel awal) x 3.32
Waktu (hari)

Persentase pulau Langarhans
Penghitungan persentase pulau Langerhans terhadap sel-sel pankreas
dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 dengan alur
pengamatan seperti pada Gambar 1. Penghitungan dilakukan terhadap 100 sel-sel
pankreas yang diamati dan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan.

7

Gambar 1 Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel
pankreas.
Pengukuran diameter pulau Langerhans
Diameter pulau Langerhans dihitung dengan menggunakan mikrometer
yang diamati pada hasil foto mikroskop pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan
dilakukan pada enam pulau Langerhans pada tiap perlakuan.

Gambar 2 Pengukuran diameter pulau Langerhans. A. Pengukuran diameter pulau
Langerhans yang simetris; B. Pengukuran diameter pulau Langerhans
yang tidak simetris, penjumlahan diameter terpanjang dan terpendek
dibagi dua. Bar = 50 µm.
Penghitungan persentase ekspresi sel beta penghasil insulin
Penghitungan persentase ekspresi sel beta pada pulau Langerhans yang
menghasilkan insulin dengan pewarnaan DTZ dan diamati dengan mikroskop
pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan dilakukan terhadap 100 agregat sel-sel
pankreas dan/atau pulau Langerhans pada tiap perlakuan.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Penelitian dilakukan dengan menggunakan dua konsentrasi Nigella sativa
yaitu kontrol 2 mL DMEM tanpa penambahan Nigela sativa, 2 mL DMEM
dengan penambahan 100 µL Nigella sativa 0.01 g/mL (NS 1%) dan 2 mL DMEM
dengan penambahan 100 µL Nigella sativa 0.1 g/mL (NS 10%). Masing-masing
kelompok perlakuan memiliki tiga kali ulangan. Data kuantitatif yang diperoleh
diuji secara statistik dengan menggunakan Analysis of Varian (ANOVA) dan uji
lanjut Duncan untuk menentukan beda nyata antar perlakuan dengan selang
kepercayaan 95 %.

8

HASIL DAN PEMBAHASAN
Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh
populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula. Semakin kecil
nilai PDT, maka semakin cepat proliferasi sel yang terjadi (Davis 2011). Hasil
PDT kultur sel pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat
pada Tabel 1 dan Gambar 3.
Tabel 1 Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang
diberi ekstrak Nigella sativa
Population doubling time (PDT)*
Ulangan
Kontrol
NS 1 %
NS 10 %
1
4.47
3.96
3.47
2
4.58
3.79
3.61
3
4.93
4.18
3.88
Rata-rata
4.66 ± 0.24a
3.98 ± 0.20b
3.66 ± 0.21c
* Penghitungan berdasarkan metode Davis (2011).
Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).

Gambar 3 Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro. (A,B) NS
0% (kontrol), (C,D) NS 1%, dan (E,F) NS 10%. (A,C,E) kultur
pankreas pada H-0, (B,D,F) kultur pankreas pada H-7. Tanda panah
solid = sel pankreas, tanda panah kosong = pulau Langerhans. Bar = 20
µm.

9

Nilai PDT pada kontrol adalah 4.66 ± 0.24 hari, sedangkan nilai PDT pada
pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing secara berturutturut adalah 3.98 ± 0.20 dan 3.66 ± 0.21 hari. Pemberian ekstrak Nigella sativa
pada kultur sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu memperkecil
nilai PDT jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Nilai PDT yang semakin
kecil menandakan pemberian ekstrak Nigella sativa dapat meningkatkan
proliferasi pada sel pankreas yang dikultur secara in vitro.
Persentase pulau Langerhans yang terbentuk menunjukkan peningkatan
pada setiap peningkatan konsentrasi Nigella sativa jika dibandingkan dengan
kontrol (p < 0.05). Hasil persentase pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 2.
Persentase pulau Langerhans yang terbentuk pada kontrol adalah 6.00 ± 1.80%,
sedangkan persentase pulau Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa
1% dan 10% masing-masing adalah 14.33 ± 3.01% dan 18.67 ± 1.25%.
Diameter pulau Langerhans setelah pemberian Nigella sativa pada kultur
sel-sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu meningkatkan diameter
pulau Langerhans jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Hasil evaluasi
diameter pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 3. Diameter pulau
Langerhans pada kontrol adalah 66.11 ± 2.09 µm sedangkan diameter pulau
Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing
adalah sebagai berikut 101.66 ± 0.83 µm dan 142.77 ± 1.73µm.
Tabel 2 Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro
yang diberi ekstrak Nigella sativa
Ulangan
1
2
3
Rata-rata

Pulau Langerhans terhadap Sel Pankreas (%)
Kontrol
NS 1%
NS 10%
5.5
14.0
17.5
4.5
11.5
18.5
8.0
17.5
20.0
a
b
6.00 ± 1.80
14.33 ± 3.01
18.67 ± 1.25c

Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).

Tabel 3 Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberi
ekstrak Nigella sativa
Ulangan
1
2
3
Rata-rata

Diameter Pulau Langerhans (µm)
Kontrol
NS 1%
NS 10%
68.33
100.83
140.83
65.83
102.50
143.33
64.16
101.66
144.16
a
b
66.11 ± 2.09
101.66 ± 0.83
142.77 ± 1.73c

Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).

10

Berdasarkan nilai PDT, persentase, dan diameter pulau Langerhans, ekstrak
Nigella sativa mampu meningkatkan proliferasi dan perkembangan sel-sel
pankreas secara in vitro. Menurut Kanter et al. (2003) Nigella sativa mampu
meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel pankreas yang rusak secara in vivo,
dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat. Beberapa zat aktif yang
terkandung dalam jintan hitam adalah thymoquinone dan seng (Zn).
Thymoquinone mempunyai efek antidiabetik yang mampu menurunkan kadar
glukosa darah (El-Dakhakhny et al. 2002). Thymoquinone merupakan komponen
utama dalam minyak Nigella sativa yaitu hampir 50%. Zat ini diketahui dapat
memperbaiki kerusakan sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi
insulin (Kanter et al. 2003). Seng (Zn) adalah kelompok zat gizi mikro yang
dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil untuk memelihara kehidupan optimal.
Seng dalam tubuh berperan dalam berbagai aktifitas enzim, pembelahan dan
pertumbuhan, diferensiasi sel, serta stabilitas fungsi berbagai jaringan tubuh
(Hidayat 1999, Paik 2001).
Hasil persentase pewarnaan dithizone (DTZ) pada kultur primer sel-sel
pankreas secara in vitro menunjukkan tidak seluruh pulau Langerhans yang
terbentuk dalam kultur mampu terwarnai dengan pewarnaan DTZ. Hal ini
disebabkan tidak semua sel pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans aktif
menghasilkan insulin. Gambar ekspresi sel pankreas terhadap pewarnaan DTZ
pada kultur sel-sel pankreas dapat dilihat pada Gambar 4, sedangkan hasil
persentase ekspresi sel
pankreas terhadap pewarnaan DTZ pada kultur sel
pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat pada Tabel 4.

Gambar 4 Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan
ekspresi menghasilkan insulin. A. Pulau Langerhans dengan sel beta
negatif ekspresi insulin, B. Pulau Langerhans dengan sel beta positif
ekspresi insulin. Pewarnaan dithizone. Bar = 30 µm
Hasil persentase ekspresi sel
pankreas terhadap pewarnaan dithizone
(DTZ) pada kontrol adalah 4.67 ± 0.57%, sedangkan pada pemberian ekstrak
Nigella sativa 1% dan 10% secara berturut-turut adalah sebagai berikut 9.67 ±
2.08% dan 17.33 ± 3.21%. Pemberian ekstrak Nigella sativa pada kultur sel-sel
pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu meningkatkan ekspresi insulin
pada sel pulau Langerhans terhadap pewarnaan DTZ jika dibandingkan dengan
kontrol (p < 0.05). Selain itu, warna merah yang dihasilkan memiliki tingkat
intensitas yang berbeda, hal ini disebabkan adanya perbedaan konsentrasi atau
jumlah seng yang terkandung di dalam sel pulau Langerhans.

11

Tabel 4 Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang
menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang
diberi ekstrak Nigella sativa
Sel Pankreas yang positif dithizone (%)
Ulangan
NS 1%
NS 10%
Kontrol
1
5
8
16
2
5
9
21
3
4
12
15
a
b
Rata-rata
4.67 ± 0.57
9.67 ± 2.08
17.33 ± 3.21c
Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);
NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).
Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).

Diferensiasi menggambarkan struktur dan fungsi sel dan jaringan yang
berkembang menjadi karakteristik sel yang lebih khusus. Diferensiasi terjadi
apabila ada interaksi antar berbagai sel (McGeady et al. 2006). Sel yang
mengalami diferensiasi terus berkembang dan terdiferensiasi menjadi jaringan,
organ, dan sistem. Pewarnaan insulin dalam penelitian ini dapat menggambarkan
proses terjadinya diferensiasi sel pankreas dalam kultur in vitro.
Dithizone (DTZ) adalah pewarnaan khusus sel
pankreas dengan cara
mengikat seng (zinc-binding subtance) pada insulin, sehingga menghasilkan
warna merah muda hingga merah tua pada sel-sel yang mengandung seng (Shiroi
et al. β00β). Sel pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans merupakan sel
yang mengandung seng. Seng dalam sel
pankreas berperan penting dalam
mengikat insulin sehingga membentuk dimer maupun heksamer yang
memudahkan penyimpanan insulin dalam secretory vesicles sel
pankreas
(Chausmer 1998, Garnuszek et al. 2000).
Tingginya persentase ekspresi insulin oleh sel beta pada pulau Langerhans
yang diberi perlakuan dipengaruhi oleh adanya senyawa-senyawa kimia yang
dikandung Nigella sativa. Salah satu kandungan nutrisi yang cukup tinggi
dikandung Nigella sativa adalah seng. Seng berfungsi sebagai bagian dari enzim
atau sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratu jenis enzim (Almatsier
2001). Seng berperan dalam sintesis, penyimpanan, dan sekresi hormon insulin
dan glukagon pada pankreas, namun tidak berperan secara langsung terhadap
aktivitas insulin. Selain itu, seng juga berperan dalam proses diferensiasi sel (Paik
2001).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) berpotensi
melitus secara in vitro. Ekstrak Nigella sativa secara
population doubling time, meningkatkan persentasi
Langerhans, serta meningkatkan persentase ekspresi sel
setelah kultur in vitro.

sebagai anti-diabetes
nyata mempersingkat
dan diameter pulau
beta penghasil insulin

12

Saran
Perlu dilakukan analisa fraksi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) yang
memiliki potensi meningkatkan perkembangan sel beta pankreas setelah kultur in
vitro, analisa kandungan insulin pada conditional medium yang dihasilkan dari
kultur in vitro, serta analisa mengenai toksisitas ekstrak jintan hitam (Nigella
sativa) secara in vitro dan in vivo.

UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan bagian dan didanai dari penelitian Hibah
Kompetensi DIKTI a.n Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) dengan kontrak
nomor: 035/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2013.

DAFTAR PUSTAKA
[ADA] American Diabetes Association. 2013. Diagnosis and classification of
diabetes mellitus. Diabetes Care. 36 Suplemen 1: S67-S74.
[PERKENI] Perkumpulan Endokrinologi Indonesia. 2011. Konsensus
Pengelolaan dan Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia 2011.
[tempat tidak diketahui].
Almatsier S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka
Utama.
Bonner WS, Baxter LA, Schuppin GT. 1993. A second pathway for regeneration
of adult exocrine and endocrine pancreas. A possible recapitulation of
embryonic development. Diabetes. 42(12):1715-1720.
Butler M. 2004. Animal Cell Culture and Technology. Cornwall (UK): Bios
Scientific Publishers.
Chausmer AB. 1998. Zinc, insulin and diabetes. J Am Coll Nutr. 17(2):109-115.
Criscimanna A, Bertera S, Esni F, Trucco M, Bottino R. 2011. The enigma of cell regeneration in the adult pancreas: self-renewal versus neogenesis, type
1 diabetes complications. Gastroenterology. 141:1451-1462.
Davis JM. 2011. Animal Cell Culture Essential Methods. Chichester (UK): John
Wiley and Sons Ltd.
Demeterco C, Beattie GM, Dib AS, Lopes AD, Hayek A. 2000. A role for activin
A and beta cellulin in human fetal pancreatic cell differentiation and growth.
J Clin Endocrinol Metab. 85(10): 3892-3897.
El-Dakhakhny M, Mady N, Lembert N, Ammon HP. 2002. The hypoglycemic
effect of Nigella sativa oil is mediated by extra pancreatic actions. Planta
Med. 68(5):465-466.
Garnuszek P, Licinka I, Mroek A, Wardawa A, Fiedor PS, dan Mazurek AP.
2000. Identification of transplanted pancreatic islet cell by radioactive
dithizone-[131]-histamine conjugate, preliminary report. Nucl Med Rev Cent
East Eur. 3(1):61-63.

13

Hidayat A. 1999. Seng (zinc): Esensial bagi kesehatan. J Kedokter Trisakti.
18(1):19-26.
Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T, Setiawan B. 2010. Stem
Cell: Dasar Teori & Aplikasi Klinis. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.
Johansson M, Matsson G, Anderson A, Jansson L, Carlsson P. 2006. Islet
endothelial cell and pancreatic cell proliferation: studies in vitro and during
pregnancy in adult rat. Endocrinology. 147(5):2315-2324.
Kanter M, Meral I, Yener H, Ozbek H, Demir H. 2003. Partial
regeneration/proliferation of the beta-cell in islet of Langerhans by Nigella
sativa in streptozotocin-induced diabetic rats. Tohoku J Exp Med.
201(4):213-219.
Malole MBM. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
McGeady TA, Quinn PJ, FitzPatrick S, Ryan MT, Cahalan S. 2006. Veterinary
Embriology. Oxford (UK): Blackwell Publishing.
Nickavar B, Mojab F, Javidnia K, Amoli MAR. 2003. Chemical composition of
the fixed and volatile oils of Nigella sativa L. from Iran. Z Naturforsch.
58:629-631.
Paik IK. 2001. Application of chelated minerals in animal production. Asian-Aust
J Anim Sci. 14:191-198.
Ramiya VK, Maraist M, Arfors KE, Schatz DA, Peck AB, Cornelius JG. 2000.
Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from
pancreatic stem cells. Nat Med. 6(3):278-282.
Rosenberg L. 1998. Induction of islet cell neogenesis in the adult pancreas: the
partial duct obstruction model. Microsc Res Tech. 43(4):337-346.
Ru AH, Peng FR, Xia L, Xiao LY, Hai PQ, Ying DZ. 2005. Isolation, cultivation
and identification of pancreatic stem/progenitor cells in rabbit. J Agricul
Biotechnol. 3(2):89-94.
Setiawan B. 2006. Aplikasi terapeutik sel stem embrionik pada berbagai penyakit
degeneratif. Cermin Dunia Kedokteran. 153:5-8.
Shiroi A, Yoshikawa M, Yokota H, Fukui H, Ishizaka S, Tatsumi K, Takahashi Y.
2002. Identification of insulin-production cell derived from embrionic stem
cell by zinc-chelating dithizone. Stem Cell. 20(4):284-292.
Soria B, Skoudy A, Martin F. 2001. From stem cells to beta cells: new strategies
in cell therapy of diabetes mellitus. Diabetologia. 44:407-415.
Yulianti S, Junaedi E. 2006. Sembuhkan Penyakit dengan Habbatus Sauda (Jintan
Hitam). Tangerang (ID): Agromedia Pustaka.

.

14

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nganjuk pada tanggal 16 Maret 1992, merupakan
putra pertama dari dua bersaudara dari Bapak Supeno dan Ibu Sri Anik. Jenjang
pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis di antaranya lulusan SDN
Kedondong 1 Nganjuk tahun 2004, lulusan SMP Negeri 3 Nganjuk tahun 2007,
dan lulusan SMA Negeri 2 Nganjuk tahun 2010. Penulis melanjutkan pendidikan
dan diterima di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk Institut Pertanian Bogor (USMI) tahun 2010 dengan
memperoleh beasiswa Bidik Misi IPB. Selama perkuliahan penulis aktif dalam
kegiatan organisasi Himpunan Minat Profesi Ruminansia (2011-2013) sebagai
anggota.